KR20150009441A

KR20150009441A - 인간 배아줄기세포에서 유래된 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 함유하는 간섬유화 또는 간경화 예방 및 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20150009441A
Application number: KR1020140082822A
Authority: KR
Inventors: 이은주; 김효수
Original assignee: 서울대학교병원
Priority date: 2013-07-11
Filing date: 2014-07-03
Publication date: 2015-01-26
Also published as: KR101669124B1; JP2016525098A; US20160151420A1; EP3020405B1; EP3020405A1; CN105555282A; CN105555282B; WO2015005614A1; JP6129418B2; EP3020405A4

Abstract

본 발명은 인간 배아줄기세포에서 유래된 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 함유하는 간섬유화 또는 간경화 예방 및/또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 구체적으로, 인간 배아줄기세포에서 유래된 중간엽 줄기세포가 간 섬유화에 대한 방지 효과가 있음을 확인하였으며, 따라서 인간 배아줄기세포에서 유래된 중간엽 줄기세포는 간 보호 및, 간섬유화 또는 간경화 예방 및 치료용 조성물, 또는 건강기능식품의 유효성분으로 유용하게 이용될 수 있다.

Description

인간 배아줄기세포에서 유래된 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 함유하는 간섬유화 또는 간경화 예방 및 치료용 조성물{Composition for prevention and treatment of liver fibrosis or liver cirrhosis comprising of mesenchymal stem cells derived from human embryonic stem cells as an active ingredient}

본 발명은 인간 배아줄기세포에서 유래된 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 함유하는 간섬유화 및 간경화 예방 및 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

간은 다양한 기능을 수행하는 장기의 일종으로, 최근 간질환 발병과 간질환에 의한 사망이 점차 증가하고 있다. 우리 나라의 간질환 추세는 예전까지 B형이나 C형 간염 환자가 많았지만 현재는 구미 지역과 마찬가지로 간염성 간질환보다는 알콜 등에 의한 질환 환자가 늘어나고 있으며, 여성의 사회 활동이 많아져 여성의 음주 기회 또한 늘어나므로 여성 질환자도 예전에 비해 증가하고 있는 추세이다. 이러한 추세에 발맞추어 세계적으로 간질환 치료제에 대한 연구가 활발히 진행 중이다.

일반적으로 간 경화(liver cirrhosis)란 만성적인 간 질환의 최종 상태를 의미하며, 이러한 간 경화의 주원인은 간염 바이러스 감염, 알콜 중독, 담즙산 분비 장애, 약물 중독, 알레르기, 철분의 과잉 침착 등으로 다양하다.

간세포는 재생 능력이 강하여 어느 정도 파괴되어도 다시 재생에 의하여 보수될 수 있으나, 어느 시점이 되면 재생이 되지 않고 섬유화되어 버리고 섬유성분이 되어 버리면 간은 굳어져 버린다. 이렇게 간의 구조가 변하여 원상태로 돌아갈 수 없게 굳어진 것을 간 경화라 한다.

간 경화에 이르는 간 섬유화의 과정은 지속적인 자극에 대항하여 나타나는 반응으로서 이는 상처 치유 과정과 유사하게 1) 급성 염증, 2) 콜라겐을 비롯한 세포 외막 매트릭스(ECM, extracellular matrix) 구성 성분들의 합성, 3) 조직 재구성(상흔 형성)의 3단계로 나눌 수 있다(Ramadori R, Knittel R, and Saile B. (1998) Fibrosis and Altered Matrix Synthesis Digestion 59 :372-375). 세포 외막 매트릭스의 구성성분은 콜라겐, 매트릭스 당단백질(피브로넥틴, 라미닌 등), 프로테오글리칸 등으로 구성되어 있으나 주성분은 콜라겐이다. 간 세포가 파괴된 후, 새로운 간 세포로 조직 재구성을 하는 과정에서 세포질과 세포 외막 등 완벽한 세포 구조를 이루지 못하고 세포의 골격 구조를 유지하게 하는 세포 외막 매트릭스만 발달하게 되어, 간세포의 세포 외막 매트릭스의 주성분인 콜라겐이 과도하게 침착되게 되고 섬유화된 콜라겐에 의해서 간 조직이 딱딱하게 굳어지면서 간경화에 이르게 되는 것이다.

간 섬유증은 만성 염증 상태에 있는 간 조직이 손상과 재생을 반복하여, 조직 중에 콜라겐 등과 같은 결합 조직이 과도하게 축적됨으로써, 간 조직에 흉터(scar)가 생기는 질환을 의미한다.

일반적으로, 간 섬유증은 간경변과는 달리 가역적(reversible)이고, 얇은 원섬유(thin fibril)로 구성되며, 결절(nodule) 형성이 없다. 또한, 간 손상의 원인이 소실되면 정상회복이 가능할 수 있다. 그러나, 이러한 간 섬유증 기작이 반복적으로 지속되면, 결합 조직간의 교차결합(crosslinking)이 증가하여 두꺼운 원섬유(thick fibril)가 축적되며, 간소엽의 정상구조를 상실하여 결절을 형성하는 것을 특징으로 하는 비가역적인(irreversible) 간경변으로 진행된다.

간질환은 그 원인이 다양하지만, 만성화될 경우 결국 그 원인과는 상관없이 공통적으로 간 섬유증 내지 간경변에 이르게 된다. 간질환은 초기 자각증세가 없어 조기 진단이 어렵고, 일반적으로 만성에 이르러서야 발견되기 때문에, 그 치료가 쉽지 않고, 사망률이 높아 사회적인 문제를 야기하고 있다. 또한, 효능이 우수한 치료제는 아직 개발되지 않았다.

당 업계에서 간 섬유증의 발병 기작은 세포, 사이토카인(cytokine) 및 결합조직(extracellular matrix, ECM) 간의 복잡한 상호작용에 의해 유발되는 것으로 알려져 있다. 간 섬유화시 ECM의 과다생성은 간 내 대식세포인 쿠퍼세포(Kupffer cell)가 활성화됨으로써 분비되는 여러 사이토카인에 의해 간 성상세포(hepatic stellate cell, HSC)의 활성화가 촉진되고 활성화된 간 성상세포에서 결합조직의 생성이 증가됨으로써 야기되는 것으로 알려져 있다.

간 성상세포는 1876년 쿠퍼(Kupffer)에 의해 발견되었고, 이토(Ito)에 의해 기술되었으며, 1971년 웨이크(Wake)에 의해 정립되었다. 간 성상세포는 동모양혈관 내피세포와 간 세포사이의 딧세강(space of Disse)에 위치한 세포로서 별모양을 하고 있어서 간 성상세포, 이토 세포(Ito cell), 비타민 A를 함유하고 있는 지방소적 (lipid droplet)을 갖고 있어서 비타민 A 저장 세포(vitamin A storing cell), 지방 저장 세포(fat storing cell) 또는 동양구조유사 간 지질세포(perisinusoidal hepatic lipocyte) 등의 여러 가지로 명명되었으나 1990년대 말에 공식용어로 간성상세포(hepatic stellate cell, HSC)라 결정되어 현재까지 사용되고 있다.

쿠퍼 세포는 여러 독성물질에 의해 손상된 간세포를 식작용(phagocytosis)함으로써 활성화되거나 또는 독성물질에 의해 직접 활성화되어 형질발현 성장인자-베타(transforming growth factor-β TGF-beta), 혈소판-유도된 성장인자 (platelet-derived growth factor; PDGF) 등의 사이토카인을 분비하며, 이들 사이토카인에 의 해 쿠퍼세포 자기 자신이 다시 활성화(autocrine)된다. 또한, 쿠퍼세포가 분비한 사이토카인들에 의해 간 조직내 동모양혈관 내피세포(sinusoidal endothelial cell) 및 간 성상세포가 활성화된다. 활성화된 간 성상세포에 의해 분비되는 4형 콜라겐나아제(collagenase type IV)와 증가된 콜라겐 생산에 의해 세포외 기질(extracellular matrix; ECM)의 정상구성비율이 깨지면서 기저막 ECM(basement membrane-like matrix, 예를 들어 4형 콜라겐)은 분해되고, 세포간 ECM (interstitial type matrix, 예를 들어 1형 및 3형 콜라겐)은 서로 꼬여 소섬유상 콜라겐(fibril-forming collagen)을 형성한 후 딧세강(space of Disse)에 축적되며, 분해된 기저막 ECM 및 축적된 세포간 ECM에 의해서 간성상세포가 활성화된다.

또한, 활성화된 간 성상세포는 콜라겐분해효소(Metalloproteinase; MMP)의 활성 억제물질인 마크로글로불린(macroglobulin) 및 TIMP 등의 생성을 촉진시켜, 과도하게 생성되는 세포간 ECM의 분해도 억제한다. 딧세강에 축적된 세포간 ECM에 의해 혈액과 간 세포간의 물질교환이 저해됨으로써, 간 세포는 영양물질의 공급 및 독성물질의 배출이 어렵게 되고, 간세포 역시 지속적으로 손상된다. 이러한 일련의 반응이 반복되면서 간조직 중에 결합조직이 축적되면서, 간섬유화 내지 간경화가 유발된다.

현재 간섬유증에 대한 연구는 ECM에 대한 연구, 이에 관여하는 세포와 각종 세포간의 관계, 세포의 활성화 기전, 각종 사이토카인 및 항섬유화제 (antifibrogenic agents)에 대한 연구 등 여러 가지 방면으로 활발히 진행되고 있으며, 간섬유증의 조기 진단방법 및 치료제 개발을 목표로 하고 있다. 특히, 과다축적된 결합 조직의 생산을 수반하는 간섬유화 및 간경화의 가장 큰 유발원인이 간 성상세포의 활성화라는 것이 밝혀지면서, 현재 성상세포(stellate cell)의 활성 및 활성화를 억제할 수 있는 약물 개발에 대한 연구가 지속되고 있다.

하지만, 요즘 사용되고 있는 약물들은 매우 다양하나 대부분이 간염 등의 간질환에 쓰이는 것들이고 이들 중에는 임상에서 사용 시 부작용을 유발하거나 높은 비용의 것이 많다.

한편, 줄기세포(stem cell)는 생물 조직을 구성하는 다양한 세포들로 분화(differentiation)할 수 있는 세포로서 배아, 태아 및 성체의 각 조직에서 얻을 수 있는 분화되기 전 단계의 미분화 세포들을 총칭한다. 줄기세포는 분화 자극(환경)에 의하여 특정 세포로 분화가 진행되며, 분화가 완료되어 세포분열이 정지된 세포와는 달리 세포분열에 의해 자신과 동일한 세포를 생산(self-renewal)할 수 있어 증식(proliferation; expansion)하는 특성이 있으며, 다른 환경 또는 다른 분화 자극에 의해 다른 세포로도 분화될 수 있어 분화에 유연성(plasticity)을 가지고 있는 것이 특징이다.

줄기세포는 그 분화능에 따라 만능(pluripotency), 다분화능(multipotency) 및 단분화능(unipotency) 줄기세포로 나눌 수 있다. 만능줄기세포(pluripotent stem cells)는 모든 세포로 분화될 수 있는 잠재력(totiportent)을 지닌 전분화능(pluripotency)의 세포로서 배아줄기세포 (embryonic stem cell, ES cell) 및 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cells, iPS) 등이 이에 해당된다. 다분화능 및/또는 단분화능 줄기세포로는 성체 줄기세포를 예로 들 수 있다.

배아줄기세포는 배아 발생 초기인 포배기(blastocyte)의 세포내괴(inner cell mass)로부터 형성되며, 모든 세포로 분화가능한 잠재력(totipotent)을 가지고 있어 어떠한 조직 세포로도 분화될 수 있으며, 또한 사멸하지 않고(immortal) 미분화상태에서 배양가능하며, 성체 줄기 세포와 달리 배세포(germ cell)의 제조도 가능하므로 다음 세대로 유전될 수 있는 특징을 가지고 있다(Thomson et al., Science, 282: 1145-1147, 1998; Reubinoff et al., Nat. Biotechnol., 18: 399-404, 2000).

인간 배아줄기세포는 인간 배아 형성시 세포내괴(inner cell mass) 만을 분리하여 배양함으로써 제조되는데, 현재 전 세계적으로 만들어진 인간 배아줄기세포는 불임시술 뒤 남은 냉동 배아로부터 얻어진 것이다. 모든 세포로 분화될 수 있는 전분화능을 가진 인간 배아줄기세포를 세포치료제로 이용하기 위한 다양한 시도가 이루어져 왔지만 아직 암 발생의 위험과 면역거부반응의 높은 벽을 완전히 제어하지 못하고 있는 실정이다.

최근 이러한 문제점을 극복하기 위한 대안으로 면역조절기능과 함께 암발생의 위험성이 없는 중간엽 줄기세포가 제시되고 있다. 중간엽 줄기세포는 지방세포, 골세포, 연골세포, 근육세포, 신경세포, 심근세포 등으로의 분화가 가능한 다능성을 가진 세포로 면역 반응을 조절하는 기능도 가지고 있는 것으로 보고되어 있다. 중간엽 줄기세포는 다양한 조직에서 분리 및 배양이 가능하나 각 기원에 따른 능력 및 세포표면 표지자가 조금씩 다르기 때문에 중간엽 줄기세포를 명확히 정의하는 것은 용이하지 아니하다. 다만 골세포, 연골세포, 근육세포로 분화가 가능하며, 소용돌이 모양의 형태를 가지고, 기본적인 세포표면 표지자인 CD73(+), CD105(+), CD34(-) 및 CD45(-)를 발현하는 경우 일반적으로 중간엽 줄기세포로 규정하고 있다.

이러한 중간엽 줄기세포를 세포치료제로 이용하기 위해서는 재생의학 및/또는 세포 치료 분야에서 요구되는 최소 세포수(약 1X10⁹ 정도)를 만족시켜야 하는데, 적정조건을 잡고 기준을 정하는 실험까지 고려한다면 필요한 세포 수는 더욱 늘어나게 된다. 종래의 중간엽 줄기세포 배양시스템이 가지고 있는 이러한 문제점들을 해결하기 위한 가장 이상적인 대안은 인간 만능줄기세포를 이용하여 중간엽 줄기세포를 생산하는 것이다. 그러나, 현재까지 인간 만능줄기세포에서 중간엽 줄기세포로의 분화 유도는 많은 비용과 농도 조절이 필요한 특정 사이토카인(예를 들어 BMP, bFGF)에 의한 유도과정 또는 xeno pathogen 의 위험이 있는 xono feeder(OP9 마우스 세포주)로의 유도와 이후 특정 마커(예를 들어 CD73)로의 분류(sorting)를 필요로 하였다. 따라서, 중간엽 줄기세포가 재생의약 및 세포치료 분야에서 이상적인 세포치료제로 사용되는 데에는 한계가 있었다.

본 발명은 상기와 같이 종래 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 인간 배아줄기세포에서 유래된 중간엽 줄기세포를 이용하여 간섬유화 또는 간경화 예방 및/또는 치료용 약학 조성물, 또는 건강기능식품을 개발하고자 한다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 인간 배아줄기세포에서 유래된 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 함유하는 간섬유화 또는 간경화 예방 및/또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 인간 배아줄기세포에서 유래된 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 함유하는 간섬유화 또는 간경화 개선 및/또는 예방용 건강기능식품을 제공한다.

또한, 본 발명은 인간 배아줄기세포에서 유래된 중간엽 줄기세포를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 간섬유화 또는 간경화 치료 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 인간 배아줄기세포에서 유래된 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 하여 간섬유화 또는 간경화 치료에 이용하는 용도를 제공한다.

본 발명의 중간엽 줄기세포는 그 유전적 배경의 상이함과 무관하게 모든 인간 만능줄기세포에서 분화가능하고, 특히 인간 배아줄기세포에서 분화가 유도되고 증식 배양되며 대량생산이 가능할 뿐 아니라, 종래의 골수 유래 중간엽 줄기세포에 비하여 간섬유화 방지에 우수한 효과가 있어 간섬유화 또는 간경화를 예방 및 치료할 수 있는 세포 치료제, 또는 건강기능식품의 유효성분으로 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은, 실험 동물에 TAA 및 중간엽 줄기세포 처리 간격, 샘플 수득 과정을 요약 정리한 모식도를 나타낸 그림이다.
도 2는, 무처리 정상군(TAA - /E-MSC -), TAA를 처리하여 간섬유화가 유발된 실험군(TAA + /E-MSC -) 및 TAA를 처리하여 간섬유화 유발 후 중간엽 줄기세포를 주입한 실험군(TAA + /E-MSC +)의 간조직에 대하여 MT 염색을 수행한 결과이다. 이때, 도 2a는 MT 염색결과를 현미경으로 확인한 결과이고, 도 2b는 섬유화 정도를 수치로 정량화한 그래프이다.
도 3은, 무처리 정상군(TAA - /E-MSC -), TAA를 처리하여 간섬유화가 유발된 실험군(TAA + /E-MSC -) 및 TAA를 처리하여 간섬유화 유발 후 중간엽 줄기세포를 주입한 실험군(TAA + /E-MSC +)의 간조직에 대하여 Picro Sirius red staining를 수행한 결과이다.
도 4는, 무처리 정상군(Normal), TAA를 처리하여 간섬유화가 유발된 실험군(TAA only) 및 TAA를 처리하여 간섬유화 유발 후 중간엽 줄기세포를 주입한 실험군(TAA + E-MSC)의 간조직에 대하여 인간 특이적 항체인 HLA-abc를 이용한 immunohistochemistry를 수행한 결과이다.
도 5는, 도 4의 결과중 TAA를 처리하여 간섬유화 유발 후 중간엽 줄기세포를 주입한 실험군(TAA + E-MSC)에서 인간 특이적 항체인 HLA-abc에 반응한 부분을 확대 관찰한 결과이다.
도 6은, 무처리 정상군(TAA - /E-MSC -), TAA를 처리하여 간섬유화가 유발된 실험군(TAA + /E-MSC -) 및 TAA를 처리하여 간섬유화 유발 후 중간엽 줄기세포를 주입한 실험군(TAA + /E-MSC +)의 간조직에 대하여, 간 독성화 파라미터인 AST/ALT를 나타낸 결과이다.
도 7은, 무처리 정상군(Normal), TAA를 처리하여 간섬유화가 유발된 실험군(TAA), TAA를 처리하여 간섬유화 유발 후 인간 배아줄기세포 유래의 중간엽 줄기세포를 주입한 실험군(TAA + E-MSC), 및 TAA를 처리하여 간섬유화 유발 후 골수 유래의 중간엽 줄기세포를 주입한 실험군(TAA + BM-MSC)의 간조직에 대하여 MT 염색을 수행하고 관찰 후 정량평가한 결과이다.

본 발명자들은 인간 만능줄기세포, 특히 인간 배아줄기세포에서 중간엽 줄기세포를 다량 확보하고, 얻어진 중간엽 줄기세포가 간 섬유화에 대한 방지 효과가 있음을 확인하고, 이를 통해 인간 배아줄기세포에서 유래된 중간엽 줄기세포가 간 보호 및, 간섬유화 또는 간경화 예방 및 치료용 조성물의 유효성분으로 유용하게 적용될 수 있음을 규명하고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 인간 배아줄기세포에서 유래된 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 함유하는 간섬유화 또는 간경화 예방 및/또는 치료용 조성물을 제공한다.

상기 중간엽 줄기세포는 하기의 방법을 통해 생산되는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다: a) 인간 만능줄기세포에서 배아체를 형성하는 단계; 및 b) 상기 배아체를 조직배양접시에 부착 후 자연적으로 중간엽 줄기세포로 분화를 유도하는 단계; 및 c) 상기 분화유도된 중간엽 줄기세포를 유지 및 증식 배양하는 단계.

또한, 상기 인간 만능줄기세포에서 배아체를 형성하는 단계는 당업계에 공지된 일반적인 방법에 따라 수행할 수 있으며, 예를 들면, 인간 만능줄기세포를 단백질 분해 효소 처리 후, bFGF(basic Fibroblast Growth Factor)가 없는 배아줄기세포 배지에서 평판 또는 부유 상태로 배양할 수 있다.

또한, 상기 중간엽 줄기세포는 하기의 방법을 통해 생산되는 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지는 않는다:

a) 인간 만능줄기세포를 12 내지 16일 간 배양하여 배아체를 형성하는 단계;

b) 상기 배아체를 FBS (fetal bovine serum) 가 첨가된 basal DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 성분을 포함한 배지로 배양하여 중간엽줄기세포로 분화를 유도하는 단계; 및

c) 상기 중간엽 줄기세포의 동일성을 유지하면서 증식 배양시키는 단계.

본 발명에서 사용된 용어 '줄기세포'는 조직 및 기관의 특수화된 세포를 형성하도록 비제한적으로 재생할 수 있는 마스터 세포를 지칭한다. 줄기세포는 발달가능한 만능성 또는 다능성 세포이다. 줄기세포는 2개의 딸 줄기세포, 또는 하나의 딸줄기세포와 하나의 유래('전이(transit)') 세포로 분열될 수 있으며, 이후에 조직의 성숙하고 완전한 형태의 세포로 증식된다. 이러한 줄기세포는 다양한 방법으로 분류할 수 있다. 그 중 가장 흔히 이용되는 방법 중 하나는 줄기세포의 분화능에 따른 것으로 3배엽으로의 분화가 가능한 만능줄기세포(pluripotent stem cells)와 특정 배엽 이상으로의 분화로 한정되는 다분화능 줄기세포(mutipotent stem cells) 및 특정배엽만으로의 분화가 가능한 단분화능 줄기세포(unipotent stem cells)로 나눌 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어 '만능줄기세포'라 함은 생체를 구성하는 3가지 배엽(germ layer) 모두로 분화될 수 있는 다기능성을 지닌 줄기세포를 지칭하며, 일반적으로 배아줄기세포와 유도만능줄기세포(iPS)가 이에 해당된다. 성체줄기세포는 다분화능 또는 단분화능 줄기세포로 구분할 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어 '분화(differentiation)'는 세포가 분열 증식하여 성장하는 동안에 서로 구조나 기능이 특수화되는 현상, 즉 생물의 세포, 조직 등이 각각에게 주어진 일을 수행하기 위하여 형태나 기능이 변해가는 것을 말한다. 일반적으로 비교적 단순한 계(系)가 둘 이상의 질적으로 다른 부분계(部分系)로 분리되는 현상이다. 예를 들면, 개체발생에서 처음에 동질적이었던 알 부분 사이에 머리나 몸통 등의 구별이 생기거나 세포에도 근세포라든가 신경세포 등의 구별이 생기는 것과 같이 처음에 거의 동질이었던 어떤 생물계의 부분 사이에 질적인 차이가 생기는 것, 또는 그 결과로서 질적으로 구별할 수 있는 부분 또는 부분계로 나누어져 있는 상태를 분화라고 한다.

만능줄기세포를 bFGF(basic Fibroblast Growth Factor)를 제거한 배아줄기세포 배양 배지에서 평판 또는 지지체 없이 부유 상태로 배양시키면 분화 유도체가 생성될 수 있다. 이러한 방법으로 만들어지는 분화 유도체는 특이적 유도 인자에 따라 내배엽, 중간엽, 외배엽의 개체 형성시 필요한 모든 세포로의 분화가 가능함이 보고된 것으로 만능줄기세포의 전능성을 나타내는 체외에서의 증명 방법 중의 하나이다.

본 발명에서 사용된 용어 '세포 치료제'는 사람으로부터 분리, 배양 및 특수한 조작을 통해 제조된 세포 및 조직으로 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품(미국 FDA규정)으로서, 세포 혹은 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가, 동종, 또는 이종세포를 체외에서 증식, 선별하거나 다른 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 지칭한다.

본 발명의 인간 배아줄기세포에서 유래된 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 함유하는 간섬유화 또는 간경화 예방 및/또는 치료용 조성물은 세포 단독 혹은 배양기에서 배양된 상태로 환자의 생체 내로 주입될 수 있는데, 예를 들어 린드발 등 (1989, Arch. Neurol. 46: 615-31) 또는 더글라스콘치올카(Douglas Kondziolka, Pittsburgh, 1998)가 발표한 임상방법을 이용할 수 있다. 상기 제제에는 상기 인간 배아줄기세포에서 유래된 중간엽 줄기세포로부터 초기 분화된 지방, 골, 근육, 신경, 연골 및 심근세포 외에 약학적으로 허용 가능한 통상의 담체를 포함할 수 있고, 주사제의 경우 보존제, 무통화제, 가용화제 또는 안정화제 등이 있고, 국소투여용 제제의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제 또는 보존제 등이 포함될 수 있다.

본 발명의 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태일 수 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물은 비경구로 투여할 수 있고, 정맥 내, 피하, 복강 내 투여 또는 국소 적용이 가능하며, 바람직하게는 심장내 주사(intracardiac injection) 형태로 투여될 수 있다. 본 발명에 따른 조성물의 비경구 투여용 조성물(예, 주사제)은 약제학적으로 허용 가능한 담체, 예를 들어, 멸균 정제수, 약 pH 7의 완충액, 또는 생리식염수 중에 분산 및/또는 용해시켜 생체 내에 주입될 수 있으며, 필요할 경우, 보존제, 안정화제 등과 같은 통상의 첨가제를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명에서 주입되는 중간엽 줄기세포의 양은 이에 크게 제한되지 않으나, 10⁴내지 10¹⁰cell/회로 투여될 수 있으며, 바람직하게는 10⁵내지 10⁹cell/회로 투여될 수 있으며, 가장 바람직하게는 5×10⁷cell/회로 투여될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 용량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 '예방'은 본 발명의 조성물의 투여로 간섬유화 또는 간경화를 억제시키거나 진행을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어 '치료' 및 '개선'은 본 발명의 조성물의 투여로 간섬유화 또는 간경화가 호전 또는 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

본 명세서에서 달리 정의되지 않은 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는다.

본 발명의 조성물은 간섬유화 또는 간경화를 치료, 예방 또는 처리하는데 통상적으로 사용되어온 치료법과 병용하여 투여될 수 있다.

본 발명의 인간 배아줄기세포에서 유래된 중간엽 줄기세포를 식품 첨가물로 사용할 경우, 이를 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합량은 그의 사용 목적 (예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다.　일반적으로, 인간 배아줄기세포에서 유래된 중간엽 줄기세포는 식품 또는 음료의 제조시에 원료에 대하여 각각 0.0001 내지 30 중량%, 바람직하게는 0.1 내지 10 중량%의 양으로 첨가될 수 있으나, 첨가되는 양은 목적에 따라 얼마든지 조절이 가능하다. 상기 식품의 종류에 특별한 제한은 없다.　인간 배아줄기세포에서 유래된 중간엽 줄기세포를 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 초코렛,캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[ 실시예 ]

실시예 1. 인간 배아줄기세포 유래 중간엽 줄기세포의 제조

본 발명의 인간 배아줄기세포 유래 중간엽 줄기세포는 하기의 방법에 의해 제작 및 배양하였다.

(1) 배아체 형성

미분화 상태로 유지되던 서울대병원 인간 배아줄기세포(동양인#1, 남성, STO feeder)에 대하여 단백질분해효소(dispase, 2mg/ml)로 처리하고 미세 작업으로 분리한 다음 bFGF가 없는 배아줄기세포 배지에서 부유 상태로 14일간 배양하였다.

(2) 중간엽 줄기세포로의 분화 유도

14일간의 부유 배양으로 만들어진 배아체를 조직 배양 접시에 부착시킨 다음 자연적으로 중간엽 줄기세포의 분화를 유도하였다. 상기 배아체를 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)에 FBS(fetal bovine serum)를 첨가(10% v/v)한 배지에서 16일간 배양하면서 중간엽 줄기세포의 분화유도를 관찰하였다.

(3) 분화유도된 중간엽 줄기세포의 유지 및 증식 배양

상기 실시예 1-(2)에서 배아체 부착 후 16일간 배양하여 분화유도된 중간엽 줄기세포에 대하여 효소(Trypsin-EDTA, 0.25% Trypsin with EDTA 4Na)를 처리하고 단일 세포로 해체시킨 다음 다시 조직 배양 접시에 부착시켰다. 이 후 배양액 총 500㎖ 중 hEGF 0.5㎖ (human Epidermal Growth Factor), VEGF 0.5㎖ (Vascular Endothelial Growth Factor), hFGF-B 2㎖ (human Fibroblast Growth Factor-basic), IGF-1 0.5㎖ (Insulin-like Growth Factor), 히드로코르티손 (hydrocortisone) 0.2㎖ 및 아스코르브산 0.5㎖ 과 기본 배지 470㎖이 첨가된 배지 (EGM-2MV, CC4147, Lonza) 를 이용하여 37℃에서 유지 및 증식 배양시켰다.

실시예 2. 인간 배아줄기세포 유래의 중간엽 줄기세포의 간섬유화 방지 효과

상기 실시예 1에서 제조된 중간엽 줄기세포를 이용하여 간섬유화 방지 효과가 있는 지를 확인하기 위하여, 실험 동물에 간섬유화 유발 물질로 알려진 Thioacetamide (TAA; C₂H₅NS)를 처리하여 간경변을 유발하고, 중간엽 줄기세포를 intra cardiac 주입법으로 적용하여 간섬유화가 완화되는지의 여부를 확인하였다.

Thioacetamide (TAA; C₂H₅NS)는 세포의 괴사와 사멸을 유도하는 CCl4나 D-galactosamine와 유사한 간 독소의 일종으로 핵에서 세포질로의 RNA의 이동을 방해하여 결과적으로는 세포막의 손상과 세포의 구조적, 기능적 파괴를 유도하는 것으로 알려져 있다.

구체적으로, 면역결핍 생쥐(nude mice, male, 8~12주령, 오리엔트바이오)에 TAA를 intraperitoneal injection으로 200 mg/kg body wt, in 0.9% normal saline solution 농도로 일주일에 3회 처리하는 방법으로 3주간 계속적으로 섬유화를 유발하였다. 이후, 상기 실시예 1에서 제조된 중간엽 줄기세포를 첫 번째 TAA 처리 24시간 후 5X10⁴ 세포를 intra cardiac injection 으로 단회 투여하였고, 마지막 TAA 처리 24시간 후, 조직을 샘플링하여 분석하였다(도 1). 샘플링된 조직은 ① 육안을 통한 조직의 뭉쳐짐 정도를 확인하고, ② 조직 슬라이드를 이용한 섬유화 염색(Masson Trichrome)을 수행하여 섬유화의 경감 정도를 비교하였으며, ③ 사람 세포 특이적 발현 인자인 HLA-abc를 이용한 immunohistochemistry로 주입된 중간엽 줄기세포의 잔존 유무를 확인하였으며, ④ 간독성 지표인 AST/ALT를 측정하였다.

2-1. 섬유화( Masson Trichrome ; MT ) 염색

간세포의 섬유화가 진행될 때 콜라겐이 합성되어 손상 부위를 메우게 되는데, MT 염색은 콜라겐과 반응하여 푸른색으로 발색하게 하여 섬유화 부분을 표지하게 되며, 상기 얻어진 조직 샘플을 이용하여 MT 염색을 통해 섬유화 정도를 확인하였다.

구체적으로, MT 염색은 하기와 같은 방법을 이용하여 수행하였다.

파라핀에 고정된 조직의 슬라이드를 탈파라핀 과정을 거친 다음, Bouin 액에 다시 고정하고, Weigert 철헤마톡실린/Biebrich scarlet-acid fuchsin-aniline blue액 또는 2% light green 후 관찰하였다. 섬유화된 조직은 청색으로 나타나고, 세포질, 근육, 케라틴은 적색으로 나타나며, 세포핵은 흑갈색으로 나타나게 된다.

그 결과, 도 2a 및 도 2b에 나타난 바와 같이, 무처리 정상군(TAA - /E-MSC -)과 비교하여 TAA 처리에 의해 간섬유화가 유발된 군(TAA + /E-MSC -)에서 증가된 푸른색 부분이, 중간엽 줄기세포 처리군(TAA + /E-MSC +)에서 현저히 감소하였음을 확인할 수 있었다.

또한, 도 2a에서 확인할 수 있듯이, TAA 처리로 간섬유화가 유발된 조직에서 간이 섬유화에 따라 멍울이 지며 표면적으로 굴곡이 형성됨이 관찰되었고, 이러한 현상이 중간엽 줄기세포의 주입에 의해 완화되는 것을 관찰하였다.

2-2. Picro Sirius red staining

간세포의 섬유화가 진행될 때 콜라겐이 합성되어 손상 부위를 메우게 되는데, Picro Sirius 염색은 섬유성 콜라겐과 반응하여 붉은색으로 발색하게 하여 섬유화 부분을 표지하게 되며, 상기 얻어진 조직 샘플을 이용하여 Picro Sirius 염색을 통해 섬유화 정도를 확인하였다. Picro Sirius red 염색은 MT 염색과 마찬가지로 섬유화를 확인할 수 있는 방법으로, 이들 두가지 염색방법을 이용하여 섬유화 억제 정도를 이중 검안한 것이다.

구체적으로, picro-sirius red 염색은 파라핀 조직 슬라이드에서 파라핀을 제거 후 picro-sirius red를 1시간 동안 염색 후 물로 세척하고 탈수 및 고정 과정을 통하여 공지의 방법으로 얻을 수 있다.

그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 무처리 정상군(TAA - /E-MSC -)과 비교하여 TAA 처리에 의해 간섬유화가 유발된 군(TAA + /E-MSC -)에서 증가된 붉은색 부분이, 중간엽 줄기세포 처리군(TAA + /E-MSC +)에서 현저히 감소하였음을 확인할 수 있었다.

2-3. HLA - abc IHC 염색

상기 실시예 2-1 및 2-2에서 확인된 간섬유화 경감 효과가 동물에 주입한 인간 중간엽 줄기세포에 의한 것인지의 여부를 확인하기 위하여, 인간 세포 특이적 발현 인자인 HLA-abc를 이용한 immunohistochemistry를 수행하였으며, 이를 통해 간섬유화 경감 효과가 나타난 조직 샘플에서 중간엽 줄기세포의 잔존 유무를 확인하였다.

구체적으로, 인간 특이적 발현 항원 HLA-abc을 이용한 IHC 염색은 하기와 같은 방법을 통해 수행하였다.

항원-항체반응 후 biotin 이차 항체를 처리하였으며, streptavidin-HRP 처리 후 substrate-charmogen solution으로 염색하여 갈색으로 발색시켰다. 구체적으로, Vectorlab R.T.U Kit(Vector, cat#PK-7800)의 IHC kit을 사용하여 진행하였으며, HLA-abc는 Abcam에서 구입하여 사용하였고, 이차 항체는 kit에 포함된 pan-specific universal secondary antibody를 사용하였으며, DAB(Vectorlab NOVA red DAB substrate kit cat#SK-4800)을 이용하여 발색하였다.

그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 정상군(Normal)과 TAA 처리로 간섬유화를 유발한 군(TAA only)의 간 조직에서는 갈색 반응이 관찰되지 않았으나, TAA 처리로 간섬유화 유발 후 중간엽 줄기세포를 주입한 군(TAA + E-MSC)의 간 조직에서는, 항원-항체 반응이 일어났음을 나타내는 갈색반응이 관찰되었으며, 이를 확대 관찰하여, 처리된 중간엽 줄기세포의 engraft를 확인하였다(도 5).

2-4. 간독성 파라미터(AST 및 ALT) 측정

상기 실시예 2-1 내지 2-3에서 확인된 간섬유화 진행에 따른 간독성 경감 효과를 더욱 확인하기 위하여, 무처리 정상군(TAA - /E-MSC -), TAA를 처리하여 간섬유화가 유발된 실험군(TAA + /E-MSC -) 및 TAA를 처리하여 간섬유화 유발 후 중간엽 줄기세포를 주입한 실험군(TAA + /E-MSC +)의 간조직에 대하여, 간독성 파라미터인 AST(Aspartate aminotransferase) 및 ALT(Alanine aminotransferase)를 측정하였다.

Aminotransferase는 어떤 조직에도 존재하는 효소로 세포 내 활성치는 혈청 내 효소 활성치보다 크다. 따라서 조직에 장애가 생기면 혈중으로 효소가 유출하여 혈청 효소 활성은 증가한다. 그러나 이 효소들의 분자량은 크기 때문에(약 10만 Da) 장애를 받은 세포에서 혈류 중으로 이행하는 데는 제약을 받아 혈중으로 유출이 쉬운 구조를 갖는 간, 심근, 근육, 혈구에 장애가 있으면 혈청 효소 활성은 증가하지만 다른 장기에 손상이 있으면 거의 증가하지 않는다.

AST 및 ALT의 측정은 공지의 방법, 즉 혈액을 채취 후 혈장을 분리하여 혈장에서의 AST와 ALT의 기질의 분해시 일어나는 반응에 첨가된 발색시약의 변화도로 효소 활성을 수치화하는 방법을 이용하였다.

그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, 21일째 기준으로, TAA 처리로 간섬유화를 유발한 군의 AST 및 ALT는 정상군에 비해 유의적으로 증가하는데 비하여, 간섬유화 유발 후 중간엽 줄기세포를 주입한 실험군의 AST 및 ALT는 유의적으로 저하됨을 확인하였다.

이를 통해, 본 발명의 중간엽 줄기세포가 간섬유화 예방 및 치료에 우수한 효과를 나타냄을 확인할 수 있다.

실시예 3. 인간 배아줄기세포 및 골수 유래의 중간엽 줄기세포의 효과 비교

상기 실시예 1에서 제조된 인간배아줄기세포 유래의 중간엽 줄기세포와, 골수 유래의 중간엽 줄기세포에 대하여, 간섬유화 경감 효과를 비교평가하였다.

인간배아줄기세포 유래의 중간엽 줄기세포 대신 골수 유래의 중간엽 줄기세포를 이용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 2-1의 방법과 동일하게 MT 염색을 수행하였다.

그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, TAA를 처리하여 간섬유화 유발 후, 인간 배아줄기세포 유래의 중간엽 줄기세포를 주입한 실험군(TAA + E-MSC)이, 골수 유래의 중간엽 줄기세포를 주입한 실험군(TAA + BM-MSC)에 비하여, 푸른색으로 염색되는 부분이 더욱 감소하였는 바, 간섬유화 경감효과가 더 우수함을 알 수 있었다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims

인간 배아줄기세포에서 유래된 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 함유하는 간섬유화 또는 간경화 예방 및/또는 치료용 약학 조성물.
인간 배아줄기세포에서 유래된 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 함유하는 간섬유화 또는 간경화 개선 및/또는 예방용 건강기능식품.
인간 배아줄기세포에서 유래된 중간엽 줄기세포를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 간섬유화 또는 간경화 치료 방법.