CN113209116A

CN113209116A - 一种糖苷类化合物在制备用于治疗急性肝衰竭药物中的应用

Info

Publication number: CN113209116A
Application number: CN202010068934.4A
Authority: CN
Inventors: 张勇慧; 尹杰
Original assignee: Huazhong University of Science and Technology
Current assignee: Huazhong University of Science and Technology
Priority date: 2020-01-21
Filing date: 2020-01-21
Publication date: 2021-08-06

Abstract

本发明属于医药领域，提供了一种用于治疗急性肝衰竭的药物，本发明发现化合物金线莲苷(Kinsenoside(3‑(R)‑3‑β‑D‑Glucopyranosyloxybutanolide)能够有效阻止急性肝衰竭的发展，在小鼠肝衰竭模型中，该化合物具有改善肝功能和氧化应激损伤、降低炎性因子分泌等活性，同时通过保护线粒体结构完整性抑制肝细胞凋亡,从而有显著的保肝活性，能作为治疗急性肝衰竭的药物用于治疗急性肝衰竭。

Description

一种糖苷类化合物在制备用于治疗急性肝衰竭药物中的应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，涉及治疗肝脏疾病的药物，具体涉及治疗急性肝衰竭的药物，即披露了一种糖苷类化合物在制备用于治疗急性肝衰竭药物中的应用。

背景技术

急性肝衰竭(Acute Liver Failure，ALF)是一种比较少见的预后凶险的疾病，其临床特点是起病和进展迅速，主要表现为严重的、原发性的肝损伤及明显的意识和凝血功能障碍，因此在临床上具有重要意义(参考文献：姜泓，白雪帆.急性肝衰竭研究进展[J].临床肝胆病杂志)。东西方学者对基础肝病及急性发作重视程度的侧重点也存在一定差异，2017年《欧洲肝病学会急性(爆发性)肝衰竭治疗实践指南》将慢性自身免疫性肝炎、Wilson病和Budd-Chiari综合征出现肝性脑病急性表现的患者也视为急性肝衰竭(参考文献：韩涛,刘磊.进一步加强肝衰竭的临床与基础研究[J].临床肝胆病杂志)。关于急性肝衰竭的发病率和患病率的可靠数据不易统计，因为它没有明显的早期症状而且进展迅速，但可以从以下数据中窥见一斑：在发达国家，每年ALF的发病率不足0.5/10万人；在美国，每年发病人数约2000人；在欧洲，ALF大约占所有肝移植患者的8％。由于部分患者在送至专科医院/中心救治前即已病故，估计实际发病率高于目前的报道(参考文献：

E,Mas A,MataM.Acute liver failure in Spain:Analysis of 267cases[J].LiverTransplantation)。ALF的病因在全球不同国家和不同地区差别较大。在发达国家，应用肝毒性药物特别是过量服用APAP(对乙酰氨基酚)是ALF的主要病因，而在发展中国家，肝炎病毒感染，特别是甲型、乙型和戊型肝炎病毒的感染，是导致ALF的主要原因(参考文献：姜泓，白雪帆.急性肝衰竭研究进展[J].临床肝胆病杂志)。目前，临床对于急性肝衰竭的研究重点放在肝移植、人工肝、干细胞治疗等方面。在诊治方面虽然有一些进展，但仍缺乏确定有效的药物，现有的水飞蓟素等药物药效不佳，而肝移植手术的成本太高。因此，探索研究开发一种治疗急性肝衰竭的有效药物，是该领域长期以来的重要课题。

天然产物是药物最常见的来源，据统计，从上世纪八十年代年至今，每年30-40％的上市药物直接或间接来源于天然产物，其中2010年，天然产物相关来源的药物比例高达50％。植物次生代谢产物的种类极为丰富，随着近年对其研究的不断增多，越来越多活性强的化合物被发现，为新药的研发奠定了一定的基础。本发明旨在从天然产物中寻找治疗急性肝衰竭的有效药物。

发明内容

本发明的任务是提供一种治疗急性肝衰竭药物。

实现本发明的技术方案是：本发明提供的治疗急性肝衰竭的药物是金线莲苷(Kinsenoside(3-(R)-3-β-D-Glucopyranosyloxybutanolide))，英文简称KD。

从兰科3种常见的开唇兰属植物——花叶开唇兰、恒春金线莲和金线兰等开唇兰中提取得到的金线莲苷(KD)为金线莲的主要药理活性成分，KD含量约为金线莲干重的15％(参考文献：王建栋，王红珍，张爱莲等.金线莲苷研究进展[J].中国医院药学杂志)。金线莲苷药理活性较为广泛的，糖尿病、高血脂、肝损伤、内皮细胞损伤、骨质疏松作用、炎症等方面都具有十分可观的应用前景(参考文献：何春年，王春兰，郭顺星等.兰科开唇兰属植物的化学成分和药理活性的研究[J].中国药学杂志)。对于金线莲苷的保肝护肝活性研究，文献报道，KD有用于自身免疫性肝炎的潜力。KD可明显减轻由淋巴细胞浸润和促炎细胞因子引起的肝组织病理损伤，可减轻刀豆蛋白A诱导的T细胞介导的肝炎和负载肝癌细胞(DC/Hepa1-6)的树突状细胞(DC)诱导的小鼠AIH(参考文献：Xiang M,et al.Effects ofkinsenoside,a potential immunosuppressive drug for autoimmune hepatitis,onDCs-CD8(+)T cells communication[J].Hepatology)。

目前，对于金线莲苷的应用仅见研究性报道，该化合物尚无正式药物上市，针对采用D-氨基半乳糖联合脂多糖(D-GalN+LPS)腹腔注射这种经典的急性肝衰竭模型造模研究更是尚未开展。本专利申请发明人针对这一问题，对治疗D-氨基半乳糖联合脂多糖(D-GalN+LPS)腹腔注射所致急性肝衰竭模型的治疗作用进行了探讨，并取得了较显著的成果。

金线莲苷属于糖苷类化合物，金线莲苷的结构式如式1所示：

本发明研究使用的金线莲苷购买自上海同田生物技术股份有限公司，纯度>98.0％。HPLC测定KD纯度色谱图见图3。

以下为核磁共振谱图鉴定KD数据。

本专利申请本发明人通过对化合物金线莲苷的治疗急性肝衰竭活性进行评价，发现该化合物能够有效阻止急性肝衰竭的发展，改善肝功能和氧化应激损伤、降低炎性因子分泌等活性，同时改善模型带来的严重肝出血，能作为治疗急性肝衰竭的。以金线莲苷(Kinsenoside(3-(R)-3-β-D-Glucopyranosyloxybutanolide)为活性成分加上制药学上可接受的载体、添加剂或/和赋形剂能制成用于治疗急性肝衰竭的药物制剂。

附图说明

图1：运用H&E组织染色、生化试剂盒(ALT、AST、MDA、SOD)、流式细胞因子测定等方法验证KD对急性肝衰竭的保护作用。图1中：

A.小鼠肝脏外观。造模后，相对于对照组，模型组小鼠肝脏大量出血肿胀，呈现异常的黑红色，KD和水飞蓟素能明显改善肝脏的出血与肿胀。

B.小鼠肝体比变化。根据肝脏重量/体重的值，进行肝脏肿胀的量化，证实了KD和水飞蓟素能改善肝脏的出血增重。

C.H&E染色图片。苏木精-伊红(H&E)染色结果显示，在高剂量组(400mg/kg KD)、中剂量组(200mg/kg KD)和低剂量组(100mg/kg KD)中，KD均可减轻肝脏组织病理学损伤,高剂量效果极佳,肝脏出血情况大大改善。

D.E.试剂盒肝功能检查。结果提示，模型组血清谷丙转氨酶(ALT)，谷草转氨酶(AST)水平较对照组上升，KD与水飞蓟素组ALT、AST升高被抑制。

F.G.试剂盒检测氧化应激损伤。模型组脂质过氧化反应产物丙二醛MDA表达上升，超氧化物歧化酶(SOD)活性下降，给予KD治疗可以有效保护治疗组小鼠肝脏，免受这些氧化应激损伤。

H.I.J.流式细胞因子测试试剂盒测定各组的炎性因子。结果显示，KD高剂量组、中剂量组和低剂量组小鼠炎性因子的升高被抑制，即KD在本模型中具有显著的抗炎作用，在某些指标中效果优于阳性药。

图2：采用Western blot、透射电镜、Tunel荧光染色等方法确诊KD对于肝衰竭过程中肝细胞凋亡的抑制作用。图2中：

A.透射电镜观察小鼠肝脏线粒体结构。结果显示，模型组小鼠肝脏内线粒体结构被大量破坏，线粒体内膜断裂，给予KD后，小鼠肝脏线粒体结构被保护，线粒体的功能得到保留。

B.透射电镜观察小鼠肝脏内质网结构。观察到模型组广泛的内质网应激和内质网扩张及囊泡化，而KD能下调此过程而起到肝保护作用。

C.Tunel荧光染色验证肝细胞凋亡抑制。结果显示，KD可抑制肝细胞异常凋亡而改善肝衰竭。蓝色荧光为DAPI作为内参，绿色荧光为Tunel阳性。

D.E.Western blot实验检测凋亡蛋白。结果显示，造模后凋亡Marker蛋白PARP(Poly ADP-Ribose Polymerase)、C-C3(Cleaved Caspase-3)显著上升，KD能下调凋亡蛋白，减轻肝细胞异常凋亡,保护肝脏。

图3：HPLC测定KD纯度色谱图。

具体实施方式

实施例1

金线莲苷(kinsenosid；KD)治疗急性肝衰竭作用

购入SPF级雄性C57鼠60只，饲养于华中科技大学同济医学院SPF级实验动物中心，给予标准饮食和饮水，房间温度控制在23±2℃，适应喂养7天后开始灌胃给药。实验中涉及小鼠的实验方案经华中科技大学同济医学院动物实验伦理委员会批准。小鼠分组为空白组(Control group，蒸馏水灌胃)、模型组(Model group，蒸馏水灌胃)、高剂量组(KD-400group,400mg/kg KD)、中剂量组(KD-200group,200mg/kg KD)和低剂量组(KD-100group,100mg/kg KD)，每组十只。隔天称量小鼠体重，持续灌胃，共10天,最后一次灌胃1h后开始腹腔注射(对照组注射等量生理盐水)，腹腔注射剂量为氨基半乳糖(D-GalN，500mg/kg)+脂多糖(LPS，Escherichia coli 0111：B4，5ug/kg)，均购于Sigma-Aldrich。

实验结果显示，造模后，相对于对照组，模型组小鼠肝脏大量出血肿胀，呈现异常的黑红色，KD和水飞蓟素能明显改善肝脏的出血与肿胀(见图1.A)。根据肝脏重量/体重的值，进行肝脏肿胀的量化，证实了KD和水飞蓟素能改善肝脏的出血增重(见图1.B)。苏木精-伊红(H&E)染色结果显示，在高剂量组、中剂量组和低剂量组中，KD均可减轻肝脏组织病理学损伤,高剂量效果极佳,肝脏出血情况大大改善(见图1.C)。

在急性肝衰竭病程发展过程中，肝细胞被大量破坏，伴有转氨酶的急剧上升。肝功能检查结果提示，模型组血清谷丙转氨酶(ALT)，谷草转氨酶(AST)水平较对照组上升，KD与水飞蓟素组ALT、AST升高被抑制(见图1.D和图1.E)；模型组脂质过氧化反应产物丙二醛MDA表达上升，超氧化物歧化酶(SOD)活性下降，给予KD治疗可以有效保护治疗组小鼠肝脏，免受这些氧化应激损伤(见图1.F和图1.G)。在本模型导致的急性肝衰竭病程发展过程中，伴有炎性因子的急剧升高，造模后常见TNF-α、IL-12p70、IFN-γ等的急剧飙升。使用流式细胞因子测试试剂盒测定各组的炎性因子，结果显示，KD高剂量组、中剂量组和低剂量组小鼠炎性因子的升高被抑制，即KD在本模型中具有显著的抗炎作用，在某些指标中效果优于阳性药(见图1.H、图1.I、图1.J)。

采用透射电镜观察小鼠肝脏线粒体结构,发现模型组小鼠肝脏线粒体结果被大量破坏,线粒体内膜断裂，给予KD后，小鼠肝脏线粒体结构被保护，线粒体的功能得到保留；于此同时，观察到模型组广泛的内质网应激和内质网扩张及囊泡化，而KD能下调此过程(见图2.A、图2.B)。采用Tunel荧光染色验证，结果显示，KD可抑制肝细胞异常凋亡而改善肝衰竭(见图2.C)。采用Western blot实验检测正常组、模型组和KD高剂量组凋亡蛋白的表达，结果显示，造模后凋亡Marker蛋白PARP(Poly ADP-Ribose Polymerase)、C-C3(CleavedCaspase-3)显著上升,KD能下调凋亡蛋白,减轻肝细胞异常凋亡,保护肝脏(见图2.D、图2.E)。

实验结论：金线莲苷对急性肝衰竭具有较好的治疗作用，能够有效阻止急性肝衰竭的发展，改善肝脏损伤，其机制在于该化合物可降低纤维化标志基因表达、改善肝功能和氧化应激损伤、降低炎性因子分泌等活性。

Claims

1.金线莲苷(Kinsenoside(3-(R)-3-β-D-Glucopyranosyloxybutanolide)在制备用于治疗急性肝衰竭药物中的应用。

2.一种用于治疗急性肝衰竭的药物制剂，其特征在于，含有有效量的金线莲苷(Kinsenoside(3-(R)-3-β-D-Glucopyranosyloxybutanolide)和制药学上可接受的载体、添加剂或/和赋形剂。

3.权利要求1或2中所述的金线莲苷(Kinsenoside(3-(R)-3-β-D-Glucopyranosyloxybutanolide)为式1所示的化合物。