CN107247105A - 一种固相萃取‑高效液相色谱‑串联质谱法检测茶叶中高氯酸盐的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种固相萃取‑高效液相色谱‑串联质谱法用于茶叶中高氯酸盐的检测方法，属于分析检测领域。该方法利用乙酸水提取、弱阴离子交换的固相萃取柱净化，结合高效液相色谱‑串联质谱检测技术分离和分析茶叶中高氯酸盐的含量，具有基质净化程度高、灵敏度高、定性定量准确的优点。茶叶中高氯酸盐的方法回收率为97.8%‑101.8%，相对标准偏差小于10.0%，最低定量限为0.01 mg/kg，可用于茶叶中高氯酸盐的检测。

Description

一种固相萃取-高效液相色谱-串联质谱法检测茶叶中高氯酸 盐的方法

技术领域

本发明属于检测技术领域，具体涉及一种固相萃取-高效液相色谱-串联质谱法检测茶叶中高氯酸盐的方法。

背景技术

高氯酸盐水溶性高、稳定性好、在土壤和矿物质上的吸附弱，容易扩散，是一种持久性污染物。多年来，高氯酸盐被大量生产并广泛用于火箭推进剂、烟花制造、军火工业等领域。1997年，高氯酸盐在水中被首次检测到；随后，在牛奶、蔬菜、水果等食品中也陆续发现了高氯酸盐污染，引起了人们的广泛关注。因为高氯酸盐干扰人体甲状腺对碘离子的吸收，影响甲状腺激素合成，从而阻碍儿童中枢神经发育，对孕妇、胎儿及新生儿存在较大的潜在威胁。

茶叶作为健康饮品在国内外广受欢迎，其质量安全尤为重要。2015年研究者首次在茶叶中发现了高氯酸盐，引起了人们对茶叶质量安全的强烈关注。据此，欧洲食品安全局（EFSA）推荐0.75 mg/kg为茶叶国际贸易的临时限量值。

高氯酸盐的分析方法主要有离子色谱（IC）、离子色谱串联质谱（IC-MS/MS）、液相色谱质谱联用（LC-MS）、液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）。

但上述方法多用于基质简单的样品，如水、牛奶等，不适用于基质复杂的样品，如茶叶。茶叶中已分离鉴定出了700多种内含物质，包括生物碱、多酚、氨基酸等，丰富的内含成分使得茶叶中高氯酸盐的鉴定尤为困难。目前，仅有少数方法包括IC-MS/MS、LC-MS/MS结合同位素内标法被用于茶叶中高氯酸盐的检测。虽然LC-MS/MS较IC-MS/MS更为通用，但同位素内标价格高昂不易得。

发明内容

本发明旨在设计提供一种固相萃取净化技术快速测定茶叶中高氯酸盐残留量的方法。该方法利用弱阴离子交换的固相萃取柱高效净化了茶叶萃取液中的共提物，石墨化碳液相柱有效分离高氯酸盐和茶叶杂质。该方法在回收率、检出限及精密度等方面均能满足国内外茶叶中残留限量要求，可为茶叶中高氯酸盐残留量的测定提供技术支持。

所述的一种固相萃取-高效液相色谱-串联质谱法检测茶叶中高氯酸盐的方法，其特征在于包括以下步骤：

1）样品的提取及净化：取粉碎后的茶样，经0.1-1.0%乙酸水提取后，采用弱阴离子交换的固相萃取柱去除杂质，得到待测样品溶液，备用；

2）标准溶液的配制：将高氯酸盐标准溶液1000 mg/L，分别用0.1-1.0%甲酸甲醇逐级稀释得到5-100 mg/L 浓度的加标用标准溶液，备用；

3）配制基质加标溶液：取不含高氯酸盐的空白待测样品溶液，然后加入高氯酸盐加标用标准溶液，配制成一系列的基质加标溶液，备用；

4）样品分析：将步骤1）中待测样品溶液，采用石墨化碳色谱柱对待测组分进行分离，三重四级杆串联质谱检测样品中高氯酸盐含量；

5）绘制基质加标曲线：采用步骤4）检测条件测定步骤3）配制的不同浓度的基质加标样品溶液，得到基质加标曲线，利用基质外标法同时实现定性定量分析。

所述的一种固相萃取-高效液相色谱-串联质谱法检测茶叶中高氯酸盐的方法，其特征在于所述的步骤1）中样品的提取具体包括：取粉粹茶叶样品1 g于50 mL 聚四氟乙烯离心管，加入25 mL 0.1-1.0% 乙酸水，超声提取30 min；6000 r/min离心5 min；取5 mL上清液，加入0.1-1mL甲酸酸化，待净化。

所述的一种固相萃取-高效液相色谱-串联质谱法检测茶叶中高氯酸盐的方法，其特征在于所述的步骤1）中样品的净化具体包括：取弱阴离子交换的固相萃取柱CleanertPWAX，依次用甲醇和水活化，取上述待净化液至SPE柱，再依次用5 mL5-50 %甲酸甲醇、水淋洗SPE柱，将SPE柱真空抽干后，用10 mL 5-50 %氨水甲醇洗脱，收集洗脱液，旋转蒸发至近干，氮气吹干；0.1 %甲酸甲醇定容1 mL，过0.22 μm有机膜，供LC-MS/MS测定。

所述的一种固相萃取-高效液相色谱-串联质谱法检测茶叶中高氯酸盐的方法，其特征在于所述的步骤4）中

液相色谱条件为：色谱柱：Thermo Hypercarb石墨化碳色谱柱，规格2.1 x 100 mm，5 μm；流速：0.25 mL/min；流动相：A为 0.1%甲酸甲醇，B为10 mmol/L乙酸铵水溶液，A:B为20:80；等度洗脱时间：5 min；进样量：5 μL；色谱柱温度：25-40 ℃；

质谱条件为：电喷雾离子源，负离子扫描多级反应检测方式，电喷雾电压为0.1-4 kV；离子源温度：150 ℃；雾化气为氮气，流速650 L/h；气帘气为氮气，流速40 L/h；辅助加热气为氮气，温度350℃；监测离子对m/z：99.0 > 83.0、101.0 > 85.0。

本发明建立了固相萃取-超高效液相色谱-电喷雾串联质谱法测定茶叶中高氯酸盐的检测方法，样品用乙酸水超声提取，提取溶液经弱阴离子交换固相萃取柱净化，使用石墨化碳色谱柱分离；在等度条件下分析，目标化合物在多反应检测模式下以保留时间和离子对信息比较进行定性分析，外标法定量，本方法对茶叶基质净化效果好、分析速度快、灵敏度高、重现性好，为评价茶叶中高氯酸盐残留量提供了新的检测方法。

附图说明

图1为不同色谱柱分离后高氯酸盐（0.01 mg/L）基质标样质谱图；

图2为不同固相萃取柱净化茶叶提取溶液后的总离子流图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例来进一步说明。此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例一：质谱条件的建立

全扫描方式获得高氯酸盐的母离子m/z 99、101，分别对应于³⁵ClO₄ ^-、³⁷ClO₄ ^-，其离子丰度比为3:1，与氯离子的同位素丰度比值相同（³⁵Cl：³⁷Cl=3:1）。以上述两个离子作为母离子，获得最优去簇电压2 V；施加碰撞能量，分别获得特征子离子m/z 83、85及最优碰撞能量100 V，且子离子丰度比m/z 83:85接近3:1。选择离子丰度较高的m/z 99 > 83离子通道作为定量离子对，m/z 101 > 85作为定性离子对。质谱图见图1。

实施例二：液相条件的建立

高氯酸盐是亲水性强极性化合物，在C18等反相色谱柱上保留弱，在死时间流出。本发明对比了亲水色谱柱和石墨化碳色谱柱对高氯酸盐的保留。高氯酸盐在CORTECS UPLCHILIC (2.1 x 100 mm, 1.6 μm)色谱柱上的保留时间为0.97 min，但其与茶叶提取液中的杂质（1.36 min）难以达到基线分离（图1）。调整流动相不能在提高保留行为的同时，使高氯酸盐与杂质有效分离。高氯酸盐在Thermo Hypercarb column (2.1 x 100 mm, 5 μm) 色谱柱上的保留能力强，不同缓冲盐体系的保留时间不同，从1.76 min到10.1 min不等。流动相为0.1 %甲酸甲醇：10 mM乙酸铵水溶液=2:8，流速为0.25 mL/min时，高氯酸盐的洗脱时间短（1.76 min，图1），且能与茶叶杂质达到有效分离。

实施例三：提取溶剂的优化

文献调研发现酸常被用于辅助高氯酸盐的提取，本发明考察了0.2 %乙酸水溶液、0.1%甲酸甲醇，利用相同的固相萃取柱（如C18、Cleannert TPT、Cleanert pesti-carb SPE、HLB、Cleanert PWAX）净化后利用UPLC-MS/MS检测分析，发现0.2%乙酸水的提取效果更好。

实施例四：固相萃取柱的选择

本发明考察了不同固相萃取柱对茶叶提取液的净化效果，不同固相萃取柱净化茶叶提取溶液后的总离子流图如图2，不同SPE的净化过程参照已有文献。弱阴离子交换固相萃取柱Cleanert PWAX净化后的总离子流图更接近于溶剂标样，而其他四种固相萃取柱（C18、Cleannert TPT、Cleanert pesti-carb SPE、HLB）净化后的总离子流图更趋向于未净化的茶叶提取液，说明弱阴离子交换固相萃取柱对茶叶基质的净化效果比其他SPE柱更有效。弱阴离子交换固相萃取柱Cleanert PWAX净化前在茶叶提取液中加甲酸酸化得到的高氯酸盐回收率比不酸化的高。

实施例五：检测方法

1）样品的提取及净化：取粉粹茶叶样品1 g于50 mL 聚四氟乙烯离心管，加入25 mL0.1-1.0% 乙酸水，超声提取30 min；6000 r/min离心5 min；取5 mL上清液，加入0.1-1mL甲酸酸化，待净化；取弱阴离子交换的固相萃取柱Cleanert PWAX，依次用甲醇和水活化，取上述待净化液至SPE柱，再依次用5 mL 5-50 %甲酸甲醇、水淋洗SPE柱，将SPE柱真空抽干后，用10 mL 5-50 %氨水甲醇洗脱，收集洗脱液，旋转蒸发至近干，氮气吹干；0.1 %甲酸甲醇定容1 mL，过0.22 μm有机膜，供LC-MS/MS测定；

2）标准溶液的配制：将高氯酸盐标准溶液1000 mg/L，分别用0.1-1.0%甲酸甲醇逐级稀释得到5-100 mg/L 浓度的加标用标准溶液，备用；

3）配制基质加标溶液：取不含高氯酸盐的空白待测样品溶液，然后加入高氯酸盐加标用标准溶液，配制成一系列的基质加标溶液，备用；

4）样品分析：将步骤1）中待测样品溶液，采用石墨化碳色谱柱对待测组分进行分离，三重四级杆串联质谱检测样品中高氯酸盐含量；

液相色谱条件为：色谱柱：Thermo Hypercarb石墨化碳色谱柱，规格2.1 x 100 mm，5 μm；流速：0.25 mL/min；流动相：A为 0.1%甲酸甲醇，B为10 mmol/L乙酸铵水溶液，A:B为20:80；等度洗脱时间：5 min；进样量：5 μL；色谱柱温度：25-40 ℃；

质谱条件为：电喷雾离子源，负离子扫描多级反应检测方式，电喷雾电压为0.1-4 kV；离子源温度：150 ℃；雾化气为氮气，流速650 L/h；气帘气为氮气，流速40 L/h；辅助加热气为氮气，温度350℃；监测离子对m/z：99.0 > 83.0、101.0 > 85.0；

5）绘制基质加标曲线：采用步骤4）检测条件测定步骤3）配制的不同浓度的基质加标样品溶液，得到基质加标曲线，利用基质外标法同时实现定性定量分析。

利用上述UPLC-MS/MS测定茶叶中高氯酸盐的含量，基质标样在0.002～0.1 mg/L浓度范围内的峰面积与浓度成线性相关，标准曲线为y = 8586.4 x + 18.05 (R2 =0.9989)。茶叶中高氯酸盐残留量按以下公式计算，处理结果须扣除空白值：

式中：X_i──样品中高氯酸盐的残留量，单位为毫克每千克；

C_i──从标准曲线上得到高氯酸盐的溶液浓度，单位为毫克每升；

V──样液最终定容体积，单位为毫升；

m──最终样液所代表的试样质量，单位为克。

本方法回收率实验设定了3个添加浓度，按本方法所确定的实验条件，对每个添加浓度进行了5个平行，回收率、精密度、最低定量限结果见表1。

表1 样品添加浓度及回收率范围

以上所述为本发明的较佳实施例，不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种固相萃取-高效液相色谱-串联质谱法检测茶叶中高氯酸盐的方法，其特征在于包括以下步骤：

1）样品的提取及净化：取粉碎后的茶样，经0.1-1.0%乙酸水提取后，采用弱阴离子交换的固相萃取柱去除杂质，得到待测样品溶液，备用；

2）标准溶液的配制：将高氯酸盐标准溶液1000 mg/L，分别用0.1-1.0%甲酸甲醇逐级稀释得到5-100 mg/L 浓度的加标用标准溶液，备用；

3）配制基质加标溶液：取不含高氯酸盐的空白待测样品溶液，然后加入高氯酸盐加标用标准溶液，配制成一系列的基质加标溶液，备用；

4）样品分析：将步骤1）中待测样品溶液，采用石墨化碳色谱柱对待测组分进行分离，三重四级杆串联质谱检测样品中高氯酸盐含量；

5）绘制基质加标曲线：采用步骤4）检测条件测定步骤3）配制的不同浓度的基质加标样品溶液，得到基质加标曲线，利用基质外标法同时实现定性定量分析。

2.如权利要求1所述的一种固相萃取-高效液相色谱-串联质谱法检测茶叶中高氯酸盐的方法，其特征在于所述的步骤1）中样品的提取具体包括：取粉粹茶叶样品1 g于50 mL 聚四氟乙烯离心管，加入25 mL 0.1-1.0% 乙酸水，超声提取30 min；6000 r/min离心5 min；取5 mL上清液，加入0.1-1mL甲酸酸化，待净化。

3.如权利要求1所述的一种固相萃取-高效液相色谱-串联质谱法检测茶叶中高氯酸盐的方法，其特征在于所述的步骤1）中样品的净化具体包括：取弱阴离子交换的固相萃取柱Cleanert PWAX，依次用甲醇和水活化，取上述待净化液至SPE柱，再依次用5 mL 5-50 %甲酸甲醇、水淋洗SPE柱，将SPE柱真空抽干后，用10 mL 5-50 %氨水甲醇洗脱，收集洗脱液，旋转蒸发至近干，氮气吹干；0.1 %甲酸甲醇定容1 mL，过0.22μm有机膜，供LC-MS/MS测定。

4.如权利要求1所述的一种固相萃取-高效液相色谱-串联质谱法检测茶叶中高氯酸盐的方法，其特征在于所述的步骤4）中

液相色谱条件为：色谱柱：Thermo Hypercarb石墨化碳色谱柱，规格2.1 x 100 mm，5 μm；流速：0.25 mL/min；流动相：A为 0.1%甲酸甲醇，B为10 mmol/L乙酸铵水溶液，A:B为20:80；等度洗脱时间：5 min；进样量：5 μL；色谱柱温度：25-40 ℃；

质谱条件为：电喷雾离子源，负离子扫描多级反应检测方式，电喷雾电压为0.1-4 kV；离子源温度：150 ℃；雾化气为氮气，流速650 L/h；气帘气为氮气，流速40 L/h；辅助加热气为氮气，温度350℃；监测离子对m/z：99.0 > 83.0、101.0 > 85.0。