CN111189939A - 一种利用超高效液相色谱-串联质谱检测植物内源游离氨基酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用超高效液相色谱‑串联质谱检测植物内源游离氨基酸的方法，包括：取植物组织，粉碎后加入提取液提取，提取完成后用有机相滤膜对提取液进行过滤，得到检测样品；利用超高效液相色谱‑串联质谱对检测样品进行分析，得到植物组织中内源游离氨基酸的种类和含量；其中，所述的提取液由甲醇、水和甲酸组成，其中甲醇、水和甲酸的体积比为70～80:29～19:1。本发明的方法具有灵敏度高、前处理方法简单、可检测的氨基酸浓度范围宽、基质干扰小、回收率高且准确度和精密度高、检测时间短等优点，适用于多类植物组织中内源游离氨基酸的检测和确证。

Description

一种利用超高效液相色谱-串联质谱检测植物内源游离氨基 酸的方法

技术领域

本发明涉及波谱分析技术领域，尤其涉及一种利用超高效液相色谱-串联质谱检测植物内源游离氨基酸的方法。

背景技术

氨基酸是构成蛋白质的基本单位，它参与生物的新陈代谢和生理过程，氨基酸分析在农业、食品科学、医学研究中有广泛而重要的作用。因此，对氨基酸分析方法的研究与改进具有重要意义。桃果实中的游离氨基酸含量是构成桃风味尤其是鲜味的主体物质，氨基酸参与桃果实香气的形成，是决定桃果实品质的重要指标，因此，分析桃果实中游离氨基酸的种类与含量对于桃果实的鲜食品质和营养品质评价具有十分重要的意义。

氨基酸分析方法自1958年实现自动化以后，其检测技术也逐渐发展，灵敏度、准确度和自动化程度都在逐渐提高。由于氨基酸不具有分光检测所需的生色基团，用色谱方法进行检测时需对氨基酸进行柱前或柱后衍生，但衍生化操作步骤繁琐，耗时耗力，而且对衍生化合物的稳定性难以进行直观的评判，某些氨基酸衍生反应的完全程度也难以保证。同时衍生反应还可能生成非目标衍生物，这些都会影响氨基酸的准确测定。全自动氨基酸分析仪也同样存在氨基酸衍生的问题。

目前采用非衍生化LC-MS方法对氨基酸进行定量分析，常用的方法是在反向色谱分离的流动相中添加离子对试剂(七氟丁酸、十三氟庚酸等)以达到氨基酸在反相色谱柱有效保留和分离，但这种方法使用的离子对试剂严重抑制质谱响应信号，极大影响ESI源待测物的离子化效率，导致低丰度氨基酸难以检测。此外，生物组织类型多，不同的组织其化学组成、物理性质都不尽相同，相应的，其氨基酸组成含量的测定方法也不尽相同。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用超高效液相色谱-串联质谱检测植物内源游离氨基酸的方法，前处理方法简单，可以快速、准确的同时测定样品中的多种游离氨基酸含量，线性范围广、回收率高、重现性好。

一种利用超高效液相色谱-串联质谱检测植物内源游离氨基酸的方法，包括：

(1)取植物组织，粉碎后加入提取液进行提取，提取完成后用有机相滤膜过滤，将提取液稀释，得到含有内源游离氨基酸的检测样品；

(2)利用超高效液相色谱-串联质谱对检测样品进行分析，得到植物组织中内源游离氨基酸的种类和数量；其中，所述的提取液由甲醇、水和甲酸组成，其中甲醇、水和甲酸的体积比为70～80：29～19：1。

优选的，甲醇、水和甲酸的体积比为80：19：1。

提取液的使用量影响游离氨基酸的提取效果，优选的，所述的植物组织与提取液的料液比(g/ml)为1：15～20。

提取时，先超声提取15～20min，再12000rpm离心10min,取上清液过0.22μm有机相滤膜。超声波产生的振动作用加强了内源游离氨基酸的释放、扩散和溶解，提高提取效率，但是超声时间不宜过长。因提取方法不仅可以充分提取植物组织中的游离氨基酸，也能提取出糖、酸、酚类物质等成分，样品基质中杂质含量过高会影响检测的准确性，因此，在检测前需要稀释提取液5～20倍，优选的，将提取液稀释10倍，得到含有内源游离氨基酸的检测样品。

所述的超高效液相色谱使用的色谱柱是ACQUITY UPLC HSS T3，规格:2.1mm*100mm,1.8μm。

为尽量避免杂质和离子的影响，实验中所用的水选用超纯水，有机溶剂选用LC-MS级。

超高效液相色谱的流动相A：超纯水，含0.1％甲酸；B：乙腈，含0.1％甲酸，梯度洗脱条件如下表，柱温设置为30℃，进样量1μl。

步骤(2)中，所述的内源游离氨基酸为甘氨酸、L-丙氨酸、β-丙氨酸、γ-氨基丁酸、L-丝氨酸、L-脯氨酸、L-缬氨酸、L-苏氨酸、L-半胱氨酸、顺式-4-羟基-L-脯氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-天冬氨酸、L-天冬酰胺、L-谷氨酰胺、L-赖氨酸、L-谷氨酸、L-甲硫氨酸、L-组氨酸、L-苯丙氨酸、L-精氨酸、L-酪氨酸、L-间酪氨酸和L-色氨酸中的数种。

优选的质谱条件如下表所示：

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)样品前处理方法简单可靠，提取得到的样品能够满足分析要求，可用于多种植物组织中内源游离氨基酸的检测、分析和确证。

(2)本发明选择ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱进行色谱分离，在不使用离子对试剂的前提下，能够提高氨基酸在色谱柱上的保留，10min内即可完成24种游离氨基酸的同时检测，较已有的LC-MS检测方法时间更短，而且具有回收率高、重复性好、灵敏度高等优点，保证了定性和定量结果的可靠性。

(3)本发明不需要将样品进行衍生化，也不需要使用内标试剂，操作简单，极其省时。

附图说明

图1为不同流速下色谱条件的优化过程中的XIC图；

图2为24种氨基酸检测定性离子MS/MS图谱；

图3为24种氨基酸标准品(312.5ng/ml)MRM谱图；

图4为提取的24种氨基酸标准品单独的色谱峰；

图5为样品内源游离氨基酸检测MRM谱图；

图6为桃样品中游离氨基酸的含量测定结果。

具体实施方式

本发明结合附图和实施例作进一步的说明，但下述实施例不是对本发明的限制。

实施例1

一、试验仪器与试剂

分析研磨机(德国IKA A11 basic)

超声波清洗机(昆山舒美KQ-500DE)

台式高速离心机(Eppendorf 5424)

超高效液相色谱质谱联用仪(AB SCIEX

5500LC-MS/MS系统)

液相色谱柱ACQUITY UPLC HSS T3，2.1mm*100mm,1.8μm(美国Waters公司)

1ml无菌注射器(医用级)，有机滤头(上海安谱，0.22μm)

标准品甘氨酸、L-丙氨酸、β-丙氨酸、γ-氨基丁酸、L-丝氨酸、L-脯氨酸、L-缬氨酸、L-苏氨酸、L-半胱氨酸、顺式-4-羟基-L-脯氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-天冬氨酸、L-天冬酰胺、L-谷氨酰胺、L-赖氨酸、L-谷氨酸、L-甲硫氨酸、L-组氨酸、L-苯丙氨酸、L-精氨酸、L-酪氨酸、L-间酪氨酸和L-色氨酸(上海源叶生物科技有限公司)

二、样品前处理

(1)将桃果肉切成约1cm³的小块，液氮速冻后，置于预冷的分析研磨机，迅速研磨；

(2)称取0.1g研磨好的桃果肉粉末于装有1.9ml提取液的2ml棕色避光离心管中，涡旋混匀2min，超声提取15min(室温，300W)，12000rpm离心10min后,取上清液过0.22μm有机相滤膜，滤液稀释10倍后供UPLC-MS/MS上机测定。

三、标准品的配置

标准品甘氨酸、L-丙氨酸、β-丙氨酸、γ-氨基丁酸、L-丝氨酸、L-脯氨酸、L-缬氨酸、L-苏氨酸、L-半胱氨酸、顺式-4-羟基-L-脯氨酸、L-谷氨酰胺、L-赖氨酸、L-组氨酸、L-苯丙氨酸和L-精氨酸的母液使用超纯水配制；标准品L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-天冬氨酸、L-天冬酰胺、L-谷氨酸、L-甲硫氨酸、L-酪氨酸和L-间酪氨酸的母液使用0.1M HCl水溶液配制；L-色氨酸的母液使用乙腈/水(体积比3：5)配制；配成1mg/ml的标准品母液，用80％甲醇稀释配成10μg/ml的混合标准溶液。取稀释配成10μg/ml的混合标准溶液，加入80％甲醇依次2倍等比稀释如下：

4℃保存，备用。标准品母液-20℃保存。

四、植物游离氨基酸测试条件的优化

通过标准品调谐试验，对植物内源游离氨基酸的测定条件进行优化。

(1)色谱条件的优化

美国Waters

system色谱柱：ACQUITY UPLC HSS T3，2.1mm*100mm,粒径1.8μm；

柱温：30℃；

样品温度：8℃；

进样体积：1μl；

洗脱程序：

分别考察了流速0.3ml/min、0.2ml/min、0.1ml/min下，待检测的24种氨基酸的出峰时间和峰宽(图1a～图1d所示)，经试验表明，0.1ml/min的低流速能使待测氨基酸的出峰时间全部在2min之后，这可以有效的降低基质效应，但0.1ml/min的恒速下，色氨酸出峰峰宽过宽，峰形不好，将5.1min-8.0min的流速调至0.3min，可优化色氨酸的峰形，最终得到的洗脱程序如上表所示。

(2)质谱条件的优化

离子源：电喷雾ESI，正离子；

扫描模式：多反应监测MRM；

离子喷雾电压(IS)：5500V；

Gas 1(GS1)：55psi；

Gas 2(GS2)：55psi；

气帘气(CUR)：35psi；

离子源温度(TEM):550℃；

表1游离氨基酸的质谱分析条件

在电喷雾质谱、正离子监测模式下，分别对定量离子对、去簇电压(DP)、碰撞能量(CE)等进行了充分的优化，选取经碰撞后所得丰度较高的子离子作为定量和定性离子，并确定其最佳碰撞能量的去簇电压值。标准品的裂解质谱图(图2)，最终所选择确定的母离子、子离子和碰撞能量等参数如表1所示。

利用优化后的色谱质谱条件，UPLC-MS/MS进样分析得到混合标准品(312.5ng/ml)的MRM色谱图如图3所示。

五、方法学验证

标准曲线和定量限

利用上述优化后的色谱质谱条件，取不同质量浓度的混合标准品溶液进行UPLC-MS/MS测定，以峰面积(y)对相应的质量浓度(x)作图，获得它们的标准曲线，并求出相应的线性回归方程及相关系数，结果见表2。

表2游离氨基酸标准品的回归方程、相关系数、线性范围、检测限和定量限

结果表明：24种氨基酸在较宽的质量浓度范围内具有良好的线性关系，相关系数r均在0.991以上。按3倍信噪比计算得到各标准品在样品中的检出限和以10倍信噪比计算得到定量限，结果见表2。

精密度的测定

日内精密度的考察：选取低(L)、中(M)、高(H)点浓度的混合标准品溶液各1份，连续进样6次测定，如下表3所示，24种氨基酸峰面积的RSD(％)在0.29～14.71之间，表明本方法的日内精密度良好。

日间精密度的考察：选取低(L)、中(M)、高(H)点浓度的混合标准品溶液各1份，连续3天进样测定，如下表3所示，24种氨基酸峰面积的RSD(％)在0.07～15.44之间，表明本方法的日间精密度良好。

表3 24种氨基酸的日内精密度和日间精密度

回收率的测定

取已分装的桃果实游离氨基酸提取液样本18份，分为3组，分别加入样本中含量的50％、100％、200％的标准品溶液，制备待测样本溶液，进行测定，回收率计算方程：回收率(％)＝(测得含量-样本含量)/加入量*100％。样本中浓度低于定量限的氨基酸回收率测定时，取分装的样本6份，不分组，往样品中加入标准品的量按该标准品最低定量限浓度*2*样本溶液体积计算。结果见表4，桃果实中检测到的23种氨基酸的回收率都在70％以上，除了L-谷氨酸，其它22种氨基酸的回收率均在80％以上，RSD范围为0.06～9.32。

表4桃果实中检测到的23种氨基酸的回收率

实施例2方法的应用

应用实施例1优化后的参数方法对采后保鲜贮藏0-28d的黄桃果肉取样，进行内源游离氨基酸的测定，最终样品的MRM色谱图如图5所示，游离氨基酸的含量测定结果见图6。可以看出，本方法通过样品的预处理及UPLC-MS/MS测定条件的选择，在植物组织中实现了不同种类游离氨基酸的同时测定，方法的定量限、回收率和精密度均满足分析要求，方法简便，分析效率高。

Claims (10)

1.一种利用超高效液相色谱-串联质谱检测植物组织内源游离氨基酸的方法，其步骤包括：

(1)取植物组织，粉碎后加入提取液进行提取，提取完成后用有机相滤膜过滤，将提取液稀释，得到含有内源游离氨基酸的检测样品；

(2)利用超高效液相色谱-串联质谱对检测样品进行分析，得到植物组织中内源游离氨基酸的种类和数量；其中，所述的提取液由甲醇、水和甲酸组成，其中甲醇、水和甲酸的体积比为70～80：29～19：1。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，甲醇、水和甲酸的体积比是80：19：1。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的植物组织与提取液的料液比为1g：15～20ml。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中提取时，先超声提取15～20min，再12000rpm离心10min,取上清液过0.22μm有机相滤膜。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中将提取液稀释5～20倍。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中将提取液稀释10倍。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，超高效液相色谱的流动相A：超纯水，含0.1％甲酸；B：乙腈，含0.1％甲酸，梯度洗脱条件如下：

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，超高效液相色谱使用的色谱柱是ACQUITYUPLC HSS T3，规格:2.1mm*100mm,1.8μm。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的内源游离氨基酸为甘氨酸、L-丙氨酸、β-丙氨酸、γ-氨基丁酸、L-丝氨酸、L-脯氨酸、L-缬氨酸、L-苏氨酸、L-半胱氨酸、顺式-4-羟基-L-脯氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-天冬氨酸、L-天冬酰胺、L-谷氨酰胺、L-赖氨酸、L-谷氨酸、L-甲硫氨酸、L-组氨酸、L-苯丙氨酸、L-精氨酸、L-酪氨酸、L-间酪氨酸和L-色氨酸中的数种。

10.如权利要求7所述的方法，其特征在于，质谱条件如下：

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