CN112198259A - 一种液质联用同时测定多种氨基酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及氨基酸检测技术领域,一种液质联用同时测定多种氨基酸的方法,其特征在于,包含有如下步骤:(1)氨基酸提取过程:小穗样品磨碎后,加入无菌水,常温超声后离心,加入二氯甲烷去除色素等脂溶性杂质,取上清水相转移至一新离心管内,通过滤膜过滤后作为待测样品备用;(2)氨基酸成分测定:采用液相色谱‑质谱联用仪对步骤(1)得到的样品进行9种氨基酸的测定。本发明实现了一次提取、检测多种氨基酸化合物。
Description
技术领域
本发明属于氨基酸测定技术领域,更具体地说,特别涉及一种液质联用同时测定多种氨基酸的方法。
背景技术
植物中氨基酸途径是必不可少的,是各类蛋白质合成前体。同时前人研究表明,与赤霉病耐药性相关的代谢组学研究清楚地表明,氨基酸水平的提高与疾病耐受性的提高有关。蛋白质是生命体的基础物质之一,氨基酸作为蛋白质的基本单位,在植物遭遇非生物胁迫或者生物胁迫时起着重要的作用。在非生物胁迫中,发现氨基酸的可作为渗透保护物由于非酶抗氧化作用,可以提高抗性(Sarvajeet et al., 2010)。在关于锥栗栗疫病的抗性研究中发现受到病原菌侵染后,氨基酸的含量均减少,其中脯氨酸起着至关重要的作用,与抗感病性紧密相关(郭文硕等,2002)。在萝卜的芜菁花叶病毒的抗性研究中发现,抗病品种的叶片中的蛋氨酸含量明显高于感病品种,后期在子叶中天冬氨酸、脯氨酸、蛋氨酸迅速提高,这与萝卜抗芜菁花叶病毒抗性的增强成正相关(王爱民等,1991)。同时研究发现氨基酸对植物抗生物胁迫的影响有可能是由于氨基酸对致病真菌生长代谢的影响而引起。研究发现半胱氨酸和苏氨酸能明显抑制白念珠菌的生长。
前人使用氨基酸自动分析仪进行测定:分别取样本3 mL于水解管中,加入3 mL浓盐酸后,再加入6 mol/L稀盐酸至10 mL,并加入3滴~4滴苯酚混匀。将水解管置于冷冻剂中冷冻2 min~4 min后,抽真空1 min~3 min,再充入高纯度氮气,重复3次,在充氮气的情况下,密封水解管,置于110℃电热鼓风干燥箱中水解22 h后,冷却至室温(25℃)。将水解液转移至50 mL容量瓶,用去离子水定容至刻度线后,取1 mL于称量瓶,使用蒸发仪在40℃~50℃环境下干燥,残留物用1 mL去离子水溶解后,再次干燥。将二次干燥的残留物溶于1 mLpH值为2.20的样品稀释缓冲液中,通过0.22μm滤膜过滤制得样品测定液备用。该方法操作复杂,制样时间过长。
前人使用柱前衍生化配合HPLC对氨基酸进行定性定量检测,准确量取混合氨基酸标准溶液及样品溶液200 μL,分别置于1.5 mL的EP管中,依次加入20μL 正亮氨酸内标溶液、100 μL三乙胺乙腈溶液及100 异硫氰酸苯酯乙腈溶液,摇匀,室温静置衍生1 h。衍生结束后加人400 μL正己烷,震荡摇匀,静置10 min,取下层溶液(PITC-AA) 200 μL,用600 μL超纯水稀释,混合均匀后用0.45μm针式过滤器过滤。过滤后溶液通过HPLC检测。该方法操作复杂,使用异硫氰酸苯酯等衍生化试剂有较强毒性,且构建衍生化反应条件的三乙胺会影响色谱柱的柱效,后续使用出峰峰形和峰宽都会受到影响。
发明内容
为了解决上述技术问题,本发明提供了一种液质联用同时测定多种氨基酸的方法。本发明实现了一次提取、检测多种氨基酸化合物。
本发明解决技术问题的技术方案是:一种液质联用同时测定多种氨基酸的方法,包含有如下步骤:
(1)氨基酸提取过程:
小穗样品磨碎后,加入无菌水,常温超声后离心,加入二氯甲烷去除色素等脂溶性杂质,取上清水相转移至一新离心管内,通过滤膜过滤后作为待测样品备用;
(2)氨基酸成分测定
采用液相色谱-质谱联用仪对步骤(1)得到的样品进行9种氨基酸的测定。
进一步的,所述离心条件为13000prm离心5分钟。
进一步的,所述提纯条件为二氯甲烷。
进一步的,所述超声时间为30分钟。
进一步的,所述滤膜孔径为0.22µm。
进一步的,所述步骤(2)中的液相条件为:色谱柱:Thermo HYPERSIL GOLD C18 色谱柱(2.1×150, 3µm);柱温:35℃;流动相:A: 0.1%甲酸溶液,B:甲醇;
洗脱梯度:0-0.2 min,A=96 %;0.2-3.1min,A递减至65 %;3.1-5.8min,A递减至23%,5.8-8.7min,A递减至0%,8.7-8.8min,A递增至96 %;8.8-10min, A=96%;流速:0.15mL/min;进样体积:5µl。
进一步的,包含有如下步骤:所述步骤(2)的质谱条件为:正离子模式:喷雾电压:3.8 kv;鞘气:40;辅助气:10;离子传输管温度:350℃。微扫数:1;AGC target: 2e5。
本发明使用液相质谱仪联用,解决了HPLC检测化合物的局限,避免了GC-MS测定需衍生化的繁琐;采用简化的一次性提取,无需使用萃取小柱(KamilStastny,HanaStepanovaet,al,. 2019)以及前处理衍生化,且正负离子同时采集,利于快速检测的推广应用。
本发明利用Q- Orbitrap高分辨率和高质量精确度的优势,首次同时测定九种氨基酸,使用外标法做标准曲线,实现代谢物的绝对定量,提高实验的准确性。
本发明使用高效液相仪与Q Exactive™ 组合型四极杆 Orbitrap 质谱仪联用,解决了HPLC检测化合物的局限,避免了GC-MS测定需衍生化的繁琐;采用简化的一次性提取,无需使用萃取小柱以及前处理衍生化,操作简便,干扰因素少,使用样品量少,且正负离子同时采集,并将测样时间缩短,利于快速检测的推广应用。
附图说明
图1所示是甘氨酸的标准曲线;
图2所示是组氨酸的标准曲线;
图3所示是精氨酸的标准曲线;
图4所示是丙氨酸的标准曲线;
图5所示是丝氨酸的标准曲线;
图6所示是苏氨酸的标准曲线;
图7所示是半膀氨酸的标准曲线;
图8所示是蛋氨酸的标准曲线;
图9所示是脯氨酸的标准曲线;
图10所示是不同小麦品种中精氨酸的绝对定量;
图11所示是9种小麦中甘氨酸的绝对定量;
图12所示是9种小麦中半膀氨酸的绝对定量;
图13所示是9种小麦中蛋氨酸的绝对定量;
图14所示是9种小麦中脯氨酸的绝对定量;
图15所示是9种小麦中丙氨酸的绝对定量;
图16所示是9种小麦中组氨酸的绝对定量;
图17所示是9种小麦中丝氨酸的绝对定量;
图18所示是9种小麦中苏氨酸的绝对定量。
具体实施方式:
本发明所使用:仪器品牌:THERMO FISHER(赛默飞)
仪器名称:Ultimate-3000超高效液相色谱
Q Exactive™ 组合型四极杆 Orbitrap质谱仪
实施例1:
氨基酸提取过程:
小麦小穗样品经过液氮冷冻,磨碎后,每100mg样品加入1.0ml无菌水,常温超声30min,加入1mL二氯甲烷,4℃混匀30min,4℃离心,转速为13000prm,离心5min,取上层水相转移至一新的离心管内,过0.22μm的滤膜过滤后即可对多种氨基酸进行色谱分离。
液相条件:
色谱柱:Thermo HYPERSIL GOLD C18 色谱柱(2.1×100, 3µm);
柱温:35℃;
流动相:A: 0.1%甲酸溶液,B:甲醇;
洗脱梯度:0-0.2 min,A=96 %;0.2-3.1min,A递减至65 %;3.1-5.8min,A递减至23%,5.8-8.7min,A递减至0%,8.7min-8.8min,A递增至96%;8.8-10min, A=96%;
流速:0.15mL/min;
进样体积:5µl
质谱条件:
正离子模式:喷雾电压: 3.8 kv;鞘气:40;辅助气:10;离子传输管温度:350℃。微扫数:1;AGC target: 2e5;9种氨基酸的质谱参数见表1.
表1 目标化合物 MRM 质谱分析参数表
Figure 1 The LC/MS based MRM parameters of the selected compounds
采用上述方法,对氨基酸标准品进行检测,得到9种氨基酸标准品线性方程、检出限和定量限见表2,线性方程绘制成标准曲线如图1-9所示,说明本方法在浓度范围0.1-2.0ng/μL内线性关系良好;9种氨基酸回收率见表3,回收率在84.5%-102.3%之间,说明本方法精确度较好。
表2 方法确证中的线性范围,检出限和定量限
Figure 2 Linearity, coefficients of determination, LODs, LOQs of theproposed method.
化合物 | 线性方程 | R² | LOD(nmol/l) | LOQ(nmol/l) |
Histidine | y = 4E+07x - 407355 | 0.9995 | 1.5 | 5 |
Glycine | y = 376016x - 4416.4 | 0.9988 | 3 | 10 |
Serine | y = 7E+06x + 178236 | 0.9984 | 2 | 6 |
Threonine | y = 1E+07x - 93947 | 0.9992 | 5 | 18 |
Arginine | y = 7E+06x - 27808 | 0.9985 | 7 | 19 |
Alanine | y = 3E+06x + 4386 | 0.9974 | 1 | 3 |
Cysteine | y = 4E+06x - 327192 | 0.9933 | 0.7 | 2 |
Methionine | y = 3E+07x - 704235 | 0.9994 | 1.8 | 5 |
Proline | y = 4E+07x - 812664 | 0.999 | 6 | 10 |
表3 氨基酸分析方法的方法确证结果
Figure 3 Results for analytes in validation study for amino acid
化合物 | 回收率 | 日内精密度 | 日间精密度 |
Histidine | 88.3% | 1.2% | 2.3% |
Glycine | 92.5% | 3.2% | 5.2% |
Serine | 102.3% | 0.8% | 4.7% |
Threonine | 90.6% | 4.8% | 9.1% |
Arginine | 84.5% | 2.04% | 9.2% |
Alanine | 93.3% | 1.1% | 8% |
Cysteine | 96.7% | 3.8% | 8.4% |
Methionine | 91.7% | 1.4% | 6.9% |
Proline | 95.2% | 0.8% | 10% |
采用上述方法,对赤霉菌接菌0、3、6、9天的苏麦3号(sm,抗性品种)和山农20(SN,易感品种)样品进行了9种氨基酸的绝对定量。预期中,各种氨基酸含量应该在受到胁迫后出现增长。实验结果表明,甘氨酸(Gly)、蛋氨酸(Met)、精氨酸(Arg)、脯氨酸(Pro)、丙氨酸(Ala)、半胱氨酸(Cys)随着接菌时间的延长含量呈增长趋势,苏氨酸(Thr)、组氨酸(His)也在接菌后出现含量增长。实际检测结果符合理论推理结果,说明本方法在实际应用中可行性强。
Claims (7)
1.一种液质联用同时测定多种氨基酸的方法,其特征在于,包含有如下步骤:(1)氨基酸提取过程:
小穗样品磨碎后,加入无菌水,常温超声后离心,加入二氯甲烷去除色素等脂溶性杂质,取上清水相转移至一新离心管内,通过滤膜过滤后作为待测样品备用;
(2)氨基酸成分测定
采用液相色谱-质谱联用仪对步骤(1)得到的样品进行9种氨基酸的测定。
2.根据权利要求1所述的一种液质联用同时测定多种氨基酸的方法,其特征在于:所述离心条件为13000rpm离心5分钟。
3.根据权利要求1所述的一种液质联用同时测定多种氨基酸的方法,其特征在于:所述提纯条件为二氯甲烷。
4.根据权利要求1所述的一种液质联用同时测定多种氨基酸的方法,其特征在于:所述超声时间为30分钟。
5.根据权利要求1所述的一种液质联用同时测定多种氨基酸的方法,其特征在于:所述滤膜孔径为0.22µm。
6.根据权利要求1所述的一种液质联用同时测定多种氨基酸的方法,其特征在于:所述步骤(2)中的液相条件为:色谱柱:Thermo HYPERSIL GOLD C18 色谱柱(2.1×100, 3µm);柱温:35℃;流动相:A: 0.1%甲酸溶液,B:甲醇;
洗脱梯度:0-0.2 min,A=96 %;0.2-3.1min,A递减至65 %;3.1-5.8min,A递减至23%,5.8-8.7min,A递减至0%,8.7-8.8min,A递增至96 %;8.8-10min, A=96%;流速:0.15mL/min;进样体积:5µl。
7.如权利要求1-2所述的一种液质联用同时测定多种氨基酸的方法,其特征在于,包含有如下步骤:所述步骤(2)的质谱条件为:正离子模式:喷雾电压: 3.8 kv;鞘气:40;辅助气:10;离子传输管温度:350℃。微扫数:1;AGC target: 2e5。
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