CN116675784A - 具有α-葡萄糖苷酶抑制作用的牡蛎糖胺聚糖及制备方法 - Google Patents

具有α-葡萄糖苷酶抑制作用的牡蛎糖胺聚糖及制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术天然活性物质提取领域，具体公开了一种具有α‑葡萄糖苷酶抑制作用的牡蛎糖胺聚糖及制备方法。所述的牡蛎糖胺聚糖通过以下步骤制得：先通过复合酶酶解得到牡蛎糖胺聚糖酶解液，再对酶解液采用阳离子交换层析柱去除杂蛋白和杂多糖，之后采用阴离子交换层析柱精细纯化，得到所述的牡蛎糖胺聚糖。该制备方法通过酶解条件的控制，获得较高的糖胺聚糖提取率；通过分离纯化，去除蛋白及糖类杂质，获得具有良好α‑葡萄糖苷酶抑制活性的糖胺聚糖分子片段。

Description

具有α-葡萄糖苷酶抑制作用的牡蛎糖胺聚糖及制备方法
技术领域
本发明属于生物技术天然活性物质提取领域，具体涉及一种具有α-葡萄糖苷酶抑制作用的牡蛎糖胺聚糖及制备方法。
背景技术
糖胺聚糖(Glycosaminoglycan,GAGs)：又称为酸性粘多糖，是一类由己糖醛酸和己糖胺重复单元构成的长线性杂多糖阴离子聚合物(角质素除外)，结构复杂，具有极性和带负电荷的分子。海洋动物特别是贝类中体内含有一定量的天然糖胺聚糖，但其往往与蛋白质相结合，形成复杂的蛋白聚糖。因此，其中糖胺聚糖提取的关键在于切断糖肽链，降解核心肽链，进而分离得到所需的糖胺聚糖。从海洋动物中提取得到的糖胺聚糖一般存在较多杂质，往往需要经过脱色、脱脂、除蛋白、除杂多糖等纯化步骤才能得到纯度较高的糖胺聚糖。目前，现有生物中天然糖胺聚糖的提取通常采用非降解法(水或盐溶液浸提)和降解法(酶解法、碱法提取)。其中非降解法适用于体内只含有一种糖胺聚糖且与其他组织连接不稳固的生物，得率低，杂质高，使用场景受到很大的限制。降解法采用酸、碱等化学试剂或酶等生物试剂裂解蛋白等生物大分子，使糖胺聚糖释放出来，但是化学试剂的使用会引入新的杂质，容易造成环境的二次污染，且容易破坏糖胺聚糖的活性结构，在实际应用中受到很大的限制；而酶解法提取牡蛎糖胺聚糖是利用蛋白酶对于肽键和糖肽键的特异性降解作用，水解蛋白质，释放出GAGs，因其提取条件温和、安全性较高、能够最大限度地保持糖胺聚糖原有的活性结构等特点而具有较为广阔的应用前景。
中国专利CN102372788B公开一种四角蛤蜊糖胺聚糖的提取制备方法，通过枯草杆菌中性蛋白酶和胰蛋白酶的酶解作用得到酶解液后，将酶解液煮沸离心得清液，加活性炭脱色，真空抽滤，硅藻土助滤，醇沉得粗糖胺聚糖，之后通过离心、透析后醇沉配制1％糖液，加入5％十六烷基三甲基溴化铵，离心，将沉淀溶于氯化钾溶液中，得解离液，再醇沉，透析，醇沉获得高纯度糖胺聚糖。该方法反应条件温和、得率及纯度高，粗糖胺聚糖得率达1.3％以上，纯度达95％以上。但该提取方法繁琐，且对α-葡萄糖苷酶活性的抑制能力不能满足实际生产要求。
现有技术中的提取方法得到的糖胺聚糖中含有较多的蛋白、糖类等杂质，会影响糖胺聚糖生物活性的发挥，需要进行纯化，尽量提高糖胺聚糖的纯度。中国专利CN103044565A公开一种提取黑海参糖胺聚糖的方法。其包括下列步骤：步骤一：黑海参预处理；步骤二：碱解黑海参体壁；步骤三：双酶酶解黑海参体壁；步骤四：酶解完毕后，用三氯乙酸去除双酶酶解液中的蛋白质；步骤五：用乙醇沉淀黑海参糖胺聚糖；步骤六：干燥黑海参糖胺聚糖粗糖；步骤七：依次用纤维素离子交换柱层析法和凝胶柱纯化黑海参糖胺聚糖；步骤八：双氧水脱色；步骤九：用乙酸钾沉淀黑海参糖胺聚糖；步骤十：干燥黑海参糖胺聚糖精糖。该发明能够平衡黑海参糖胺聚糖得率与纯度的关系，提高黑海参糖胺聚糖的纯度。
但是现有技术中缺少一种使牡蛎糖胺聚糖得率高且α-葡萄糖苷酶活性抑制率高的牡蛎糖胺聚糖提取与纯化方法。
发明内容
除非上下文另有明确指示，否则如本文所用的单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括单数和复数指示物。通过端点表述的数值范围包括在对应范围内的所有数值和分数，以及所表述的端点。
本发明针对现有技术存在的问题，提供了一种具有α-葡萄糖苷酶抑制作用的牡蛎糖胺聚糖及制备方法。该制备方法通过酶解条件的控制，获得较高的糖胺聚糖提取率；通过分离纯化，去除蛋白及糖类等杂质，获得具有良好α-葡萄糖苷酶抑制活性的糖胺聚糖分子片段。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明提供了一种具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的牡蛎糖胺聚糖，其特征在于：先通过复合酶酶解得到牡蛎糖胺聚糖酶解液，再对酶解液采用阳离子交换层析柱去除杂蛋白和杂多糖，之后采用阴离子交换层析柱精细纯化，得到所述的牡蛎糖胺聚糖。
优选地，所述的复合酶包括胰蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶中的至少两种；所述复合酶的添加量为2.20wt％-3.40wt％。
优选地，所述的复合酶为中性蛋白酶和胰蛋白酶；所述中性蛋白酶和胰蛋白酶的质量比为1:1-1:1.5。
优选地，所述酶解的条件为：温度为45℃-55℃，时间为3.5h-4.5h，pH为7.8-8.3。
优选地，所述阳离子交换层析柱为强阳离子交换层析柱。
进一步优选地，所述阳离子交换层析柱为聚苯乙烯-二乙烯苯带磺酸基阳离子交换层析柱。
优选地，所述阳离子交换层析柱的上样条件为：上样流速0.2-0.4cm/min，上样溶液pH为2.6-3.5，上样体积0.51-0.92CV。
优选地，所述阴离子交换层析柱为弱阴离子交换层析柱。
进一步优选地，所述阴离子交换层析柱为二乙基氨基乙基阴离子交换层析柱和/或大孔弱碱性苯乙烯系阴离子交换层析柱。
优选地，所述阴离子交换层析柱的上样溶液pH为7.0-9.0。
本发明还提供了一种上述牡蛎糖胺聚糖的制备方法，包括以下步骤：
S1、提取：通过复合酶酶解提取得到牡蛎糖胺聚糖酶解液；
S2、纯化：对酶解液采用阳离子交换层析柱去除杂蛋白和杂多糖，之后采用阴离子交换层析柱精细纯化，得到所述的牡蛎糖胺聚糖。
本发明还提供了一种上述的牡蛎糖胺聚糖或上述的牡蛎糖胺聚糖的制备方法制备得到的牡蛎糖胺聚糖在制备降血糖功能食品、保健品或药物中的应用。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明对酶解法进行了改进，改进后的复合酶解方法使牡蛎糖胺聚糖提取率提高；本发明中使用732阳离子交换树脂进行纯化，相较于其他大孔树脂，具有特异性吸附作用，能够去除蛋白及糖类等杂质；本发明通过离子交换层析柱精细纯化，能够获得具有良好α-葡萄糖苷酶抑制活性的糖胺聚糖分子片段。
附图说明
图1为不同单一酶的添加量对牡蛎糖胺聚糖提取率的影响图，其中A为中性蛋白酶添加量对牡蛎糖胺聚糖提取率的影响，B为胰蛋白酶添加量对牡蛎糖胺聚糖提取率的影响，C为碱性蛋白酶添加量对牡蛎糖胺聚糖提取率的影响；
图2为不同复合酶的添加量对牡蛎糖胺聚糖提取率的影响图，其中A为中性蛋白酶和胰蛋白酶作为复合酶的添加量对牡蛎糖胺聚糖提取率的影响；B为中性蛋白酶和碱性蛋白酶作为复合酶的添加量对牡蛎糖胺聚糖提取率的影响；
图3为中性蛋白酶和胰蛋白酶不同质量比对牡蛎糖胺聚糖提取率的影响图；
图4为起始pH对牡蛎糖胺聚糖提取率的影响图；
图5为酶解时间对牡蛎糖胺聚糖提取率的影响；
图6为酶解温度对牡蛎糖胺聚糖提取率的影响；
图7为732型阳离子交换层析柱的吸附动力曲线图；
图8为上样流速对阳离子交换层析柱吸附效果的影响图；
图9为上样溶液pH对阳离子交换层析柱吸附效果的影响图；
图10为上样体积对阳离子交换层析柱吸附效果的影响图；
图11为阴离子交换层析柱的筛选图；
图12为上样溶液pH对阴离子交换层析柱的影响图；
图13为DEAE非线性梯度洗脱曲线图；
图14为不同浓度的牡蛎糖胺聚糖、纯化组分与阿卡波糖的α-葡萄糖苷酶抑制效果图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行说明，以使本发明技术方案更易于理解、掌握，但本发明并不局限于此，描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都应当属于本发明保护的范围。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
需要说明的是，无特殊说明，本发明中的％代表质量百分比；CV代表柱体积。
本发明中732型阳离子交换层析柱(CAS：9002-23-7)属于聚苯乙烯-二乙烯苯带磺酸基阳离子交换层析柱；DEAE阴离子交换层析柱(CAS：57407-08-6)属于二乙基氨基乙基类阴离子交换层析柱；D301阴离子交换层析柱(CAS：201615-38-5)属于大孔弱碱性苯乙烯系阴离子交换层析柱。
实施例1牡蛎糖胺聚糖的提取与纯化
1、材料预处理
新鲜福建牡蛎，经去壳、清洗、沥干、冻干、研磨成粉、过筛(80目)备用。
2、牡蛎糖胺聚糖提取工艺
准确称取10g牡蛎干粉，按料液比1：15加水，调节酶解液pH至2，离心除蛋白(10000r/min，10min)，取上清液将其pH调节至7，旋转蒸发浓缩上清液至原体积的1/3，在60％乙醇(V/V)4℃条件下沉淀24h后7500r/min离心10min收集沉淀，分别用无水乙醇、丙酮洗涤两次，于50℃真空干燥获得牡蛎糖胺聚糖，经阿利新蓝比色法测定其含量，计算糖胺聚糖提取率，公式如下。
牡蛎糖胺聚糖提取工艺的优化通过单因素实验和响应面实验，确定最佳牡蛎糖胺聚糖提取工艺。单因素实验通过改变蛋白酶种类、单一酶添加量、复合酶之比、起始pH、复合酶添加量、酶解温度、酶解时间为影响因素。
3、单因素试验
称取10g牡蛎干粉，按照步骤2的方法进行酶解提取，分析蛋白酶种类、单一酶添加量、复合酶之比、起始pH、复合酶添加量、酶解温度和酶解时间对牡蛎中糖胺聚糖提取率的影响。单因素变量依次选取蛋白酶种类(中性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、碱性蛋白酶)、单一酶添加量(0.60％、0.80％、1.00％、1.20％、1.40％)、复合酶之比(1：1.5、1：1.2、1：1、1：0.83、1：0.66)、复合酶起始pH(6.5、7.0、7.5、8.0、8.5)、复合酶添加量(1.00％、1.60％、2.20％、2.80％、3.40％)、酶解时间(1、2、3、4、5h)、酶解温度(30、40、50、60、70℃)，分别考察各因素对牡蛎糖胺聚糖提取率的影响，以确定最优水平。具体结果如图1-6所示，同一图片中不同字母表示P<0.05。
4、响应面优化实验
测试不同提取条件的提取率。通过Box-Behnken中心组合试验设计原理，以中性蛋白酶添加量、胰蛋白酶添加量、酶解温度三个因素，确定最优提取工艺为：复合酶种类为中性蛋白酶和胰蛋白酶，复合酶添加量为2.20％，中性蛋白酶与胰蛋白酶的质量比＝1:1.2，复合酶起始pH＝8，酶解时间为4h，酶解温度为50℃，得到牡蛎糖胺聚糖酶解液。
5、牡蛎糖胺聚糖的离子交换纯化工艺研究
(1)树脂预处理
大孔吸附树脂：称取适量D101、AB-8及NKA-9共三种大孔吸附树脂，分别浸泡于95％乙醇溶液中24h，用去离子水冲洗至无醇味，备用。
阳离子交换树脂：称取适量732型阳离子交换树脂置于去离子水中自然沉降，将上清液中的漂浮物倾去，再加水混匀清洗，重复上述操作直至浸泡液澄清无褐色；再加入树脂4倍量的1mol/L氢氧化钠搅拌、浸泡24h，去碱液用蒸馏水反复洗至近中性；随后加入树脂4倍量的1mol/L盐酸搅拌、浸泡24h，去酸液用蒸馏水反复洗至近中性。
(2)树脂筛选
准确称取D101、AB-8、NKA-9大孔树脂及732型阳离子交换树脂各5g，加入50mL质量浓度5mg/mL的牡蛎糖胺聚糖酶解液，25℃条件下振荡24h(120r/min)，测定上清液中牡蛎糖胺聚糖浓度、蛋白质浓度。计算糖胺聚糖保留率、蛋白脱除率及脱色率，权重以上三个因素(综合评分＝0.2×蛋白脱除率+0.4×糖胺聚糖保留率+0.2×脱色率)，综合选取732型阳离子交换树脂进行深入研究，具体树脂筛选结果如表1所示。糖胺聚糖保留率、蛋白脱除率、脱色率计算公式如下：
式中：N0表示溶液中糖胺聚糖的初始浓度，mg/mL；N1表示吸附后溶液中糖胺聚糖的浓度，mg/mL；M0表示溶液中蛋白质的初始浓度，mg/mL；M1表示吸附后溶液中蛋白质的浓度，mg/mL；Q0表示溶液初始吸光度值；Q1表示吸附后溶液的吸光度值。
表1树脂筛选结果
(3)静态吸附试验
称取732型树脂5g，加入牡蛎糖胺聚糖溶液50mL，25℃条件下水浴振荡24h(120r/min)。间隔一定时间取样一次，测定上清液中糖胺聚糖和蛋白质浓度，计算得到蛋白吸附量。以吸附时间为横坐标，蛋白吸附量、糖胺聚糖保留率为纵坐标，绘制732型树脂对牡蛎糖胺聚糖溶液中糖胺聚糖和蛋白质的静态吸附动力学曲线，如图7所示。蛋白吸附量公式如下：
式中：M0表示溶液中蛋白质的初始浓度，mg/mL；M1表示吸附后溶液中蛋白质的浓度，mg/mL；V1表示样品液体积，mL；W表示树脂质量，g。
从图7中可以看出，蛋白吸附量随时间的延长增速较快，达到4h后，吸附量基本不再增加，此时树脂对牡蛎糖胺聚糖酶解液中蛋白质的吸附基本达到了动态平衡。说明732型阳离子交换树脂对牡蛎糖胺聚糖酶解液中的蛋白质吸附作用较快。
(4)动态吸附实验
称取3份经预处理的732阳离子树脂60g，湿法装柱后上样。样品中蛋白质浓度为570μg/mL，上样体积为1.02CV，考察上样流速(0.2、0.4、0.6、0.8、1cm/min)、上样溶液pH(1、2、3、4、5)对吸附量的影响；样品中蛋白质浓度为570μg/mL，上样体积为2.04CV，以0.4cm/min的流速上样，收集流出液(10mL/管)，测定蛋白质质量浓度，考察上样体积对树脂吸附量的影响。
上样流速对732型树脂吸附牡蛎糖胺聚糖溶液的影响如图8所示。随上样流速的增大，树脂对蛋白质的吸附量减少，这是因为流速过快，溶液中蛋白质与树脂接触不充分，故流出液中蛋白质浓度增加，树脂脱蛋白效果变差；流速慢，有利于树脂与蛋白质充分接触。综合考虑糖胺聚糖保留率和蛋白脱除率，选取动态纯化上样流速为0.4cm/min。
上样溶液pH对732型树脂吸附牡蛎糖胺聚糖溶液的影响如图9所示。随着pH逐渐增大，糖胺聚糖保留率呈现上升趋势；pH1-3范围内，蛋白脱除率呈现上升趋势，上样溶液pH为3时，达到最佳效果，随后呈下降趋势。综合考虑糖胺聚糖保留率和蛋白脱除率，选取动态纯化上样溶液pH为3.0。
上样体积对732型树脂吸附牡蛎糖胺聚糖溶液的影响如图10所示。流出液浓度在1-40管范围内呈现逐渐增加趋势，在第8管时流出液中蛋白质的浓度几乎保持不变。当流出液中蛋白质浓度达到初始样品浓度的10％时，认为树脂吸附蛋白质处于饱和状态，此时为最佳上样体积。第7管收集液中蛋白浓度达到上样浓度的10％，因此选择上样体积为0.71CV。
最终确定上样流速0.4cm/min，上样溶液pH 3.0，上样体积0.71CV，得到牡蛎糖胺聚糖初步纯化液，检测牡蛎糖胺聚糖初步纯化液的糖胺聚糖质量浓度和蛋白质质量浓度发现，可使糖胺聚糖质量浓度从0.727mg/mL提高到2.345mg/mL，提高了3.22倍。蛋白质质量浓度由0.570mg/mL降低至0.181mg/mL。
6、牡蛎糖胺聚糖的层析柱纯化工艺研究
(1)阴离子交换层析柱的确定
选择DEAE和Q两种不同性质的阴离子交换层析柱对步骤5得到的牡蛎糖胺聚糖初步纯化液进行精制纯化。配制10mg/mL样品溶液，0.45μm滤膜后以2.60cm/min的流速上样，进样量1.0mL，流动相：纯水洗脱2个柱体积，0-2mol/L氯化钠溶液线性梯度洗脱10个柱体积，2mL/管收集流出液。最后用阿利新蓝比色法逐管检测，绘制阴离子交换层析柱洗脱曲线，确定纯化效果较好的层析柱用于后续实验。
层析柱的筛选如图11所示，可以看出，Q层析柱分离纯化得到的峰型宽，收集液中所测得的糖胺聚糖吸光度值较低；DEAE层析柱分离纯化得到的峰型窄且糖胺聚糖吸光度值高。因此选择DEAE层析柱做后续纯化实验。
(2)上样溶液pH
选择纯化效果较好的DEAE层析柱，考察上样溶液pH(4、6、8、10、12)对纯化效果的影响。配制10mg/mL样品溶液，0.45μm滤膜后以2.60cm/min的流速上样，进样量1.0mL，分别设置纯水洗脱2个柱体积，0-2mol/L氯化钠溶液作为流动相进行线性梯度洗脱10个柱体积，2mL/管收集流出液。最后用阿利新蓝比色法逐管检测，绘制上样溶液pH洗脱曲线，确定效果较好的上样溶液pH。
上样溶液pH对DEAE层析柱精制纯化牡蛎糖胺聚糖溶液的影响如图12所示，可以看出，上样溶液pH偏碱性时，能够得到明显的峰型，当上样溶液pH为8时，分离组分的峰型相对狭窄，均一。因此，选择上样溶液pH为8。
(3)线性梯度洗脱
配制50mg/mL样品溶液，过滤膜(0.45μm)，以1mL/min的流速上样，用蒸馏水洗脱2个柱体积，0-1mol/L氯化钠溶液线性梯度洗脱10个柱体积，4mL/管收集流出液。最后用阿利新蓝比色法逐管检测，绘制牡蛎糖胺聚糖酶解液线性梯度洗脱曲线，确定流动相的浓度范围为0、0.2mol/L、0.4mol/L和0.6mol/L氯化钠溶液。
(4)非线性梯度洗脱
配制50mg/mL样品溶液，过滤膜(0.45μm)，以1mL/min的流速上样，根据线性梯度洗脱得到的流动相浓度，分别设置0、0.2、0.4、0.6mol/L氯化钠溶液4个梯度，分别洗脱2、4、4、4个柱体积，4mL/管收集流出液。最后用阿利新蓝比色法逐管检测，绘制牡蛎糖胺聚糖酶解液非线性梯度洗脱曲线，如图13所示。合并同一洗脱组分，电渗析脱盐，浓缩、冷冻干燥即得牡蛎糖胺聚糖纯化样品。
通过确定的层析柱纯化工艺为：层析柱DEAE；上样溶液pH为8；流动相为0、0.2mol/L、0.4mol/L、0.6mol/L氯化钠溶液4个梯度，分别洗脱2、4、4、4个柱体积。从图13的DEAE非线性梯度洗脱曲线，可以明显看出有两个峰型，为分离出的3个组分，分别命名为组分一、组分二和组分三。分离纯化的主要组成成分如表2。
表2分离纯化的主要组成成分
效果例牡蛎糖胺聚糖α-葡萄糖苷酶活性抑制研究
采用PNPG法，分析纯化组分牡蛎糖胺聚糖体外α-葡萄糖苷酶活性抑制情况，具体步骤为：取实施例1步骤6的最优工艺分离得到的牡蛎糖胺聚糖纯化组分一、组分二和组分三以及实施例1步骤4得到的牡蛎糖胺聚糖酶解液粗品作为样品，分别用0.1mol/L PBS缓冲溶液(pH6.8)配制成不同浓度的溶液(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/mL)，分别取上述不同浓度的样品溶液50μL于96孔中，加入50μL 5.0mmol/L PNPG均匀后37℃下孵育10min，再加入100μL 0.1U/mL的α-葡萄糖苷酶溶液，于酶标板恒温37℃孵育20min。以PBS缓冲溶液(pH6.8)代替牡蛎糖胺聚糖纯化组分溶液作为空白组，PBS缓冲溶液代替α-葡萄糖苷酶为样品对照组，于405nm波长处测定吸光度值，分别为A样品、A空白和A样品对照。以阿卡波糖作为阳性对照，用同样方法测定阿卡波糖为样品的吸光度值。通过以下公式计算样品与阿卡波糖的抑制率(IR)。具体结果如图14所示。
根据图14结果可知，牡蛎糖胺聚糖酶解液粗品及纯化组分对α-葡萄糖苷酶的抑制能力呈明显的量效关系，在0.2-1.0mg/mL浓度范围内，随着糖胺聚糖浓度的增大，其对α-葡萄糖苷酶的抑制作用增强。当牡蛎糖胺聚糖酶解液及三个组分的浓度为1mg/mL时，对α-葡萄糖苷酶抑制率达到最大值，分别为42.65％、64.63％、67.95％和48.72％，经纯化后的组分一和组分二的糖胺聚糖含量在25％以上，相较牡蛎糖胺聚糖酶解液粗品具有显著性差异(P<0.05)对α-葡萄糖苷酶的抑制效果能够显著性提高，其具有良好的降血糖功效；而组分三的糖胺聚糖含量在25％以下，相较牡蛎糖胺聚糖酶解液粗品，虽然能够提高对α-葡萄糖苷酶的抑制率，但是效果不显著。
最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，均不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.一种具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的牡蛎糖胺聚糖，其特征在于：通过以下步骤制得：先通过复合酶酶解得到牡蛎糖胺聚糖酶解液，再对酶解液采用阳离子交换层析柱去除杂蛋白和杂多糖，之后采用阴离子交换层析柱精细纯化，得到所述的牡蛎糖胺聚糖。
2.根据权利要求1所述的牡蛎糖胺聚糖，其特征在于：所述的复合酶包括胰蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶中的至少两种；所述复合酶的添加量为2.20wt％-3.40wt％。
3.根据权利要求2所述的牡蛎糖胺聚糖，其特征在于：所述的复合酶为中性蛋白酶和胰蛋白酶；所述中性蛋白酶和胰蛋白酶的质量比为1:1-1:1.5。
4.根据权利要求1所述的牡蛎糖胺聚糖，其特征在于：所述酶解的条件为：温度为45℃-55℃，时间为3.5h-4.5h，pH为7.5-8.5。
5.根据权利要求1所述的牡蛎糖胺聚糖，其特征在于：所述阳离子交换层析柱为强阳离子交换层析柱；所述阴离子交换层析柱为弱阴离子交换层析柱。
6.根据权利要求5所述的牡蛎糖胺聚糖，其特征在于：所述阳离子交换层析柱为聚苯乙烯-二乙烯苯带磺酸基阳离子交换层析柱；所述阴离子交换层析柱为二乙基氨基乙基阴离子交换层析柱和/或大孔弱碱性苯乙烯系阴离子交换层析柱。
7.根据权利要求1所述的牡蛎糖胺聚糖，其特征在于：所述阳离子交换层析柱的上样条件为：上样流速0.2-0.4cm/min，上样溶液pH为2.6-3.5，上样体积0.51-0.92CV。
8.根据权利要求1所述的牡蛎糖胺聚糖，其特征在于：所述阴离子交换层析柱的上样溶液pH为7.0-9.0。
9.权利要求1-8任一项所述的牡蛎糖胺聚糖的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1、提取：通过复合酶酶解提取得到牡蛎糖胺聚糖酶解液；
S2、纯化：对酶解液采用阳离子交换层析柱去除杂蛋白和杂多糖，之后采用阴离子交换层析柱精细纯化，得到所述的牡蛎糖胺聚糖。
10.权利要求1-8任一项所述的牡蛎糖胺聚糖或权利要求9所述的牡蛎糖胺聚糖的制备方法制备得到的牡蛎糖胺聚糖在制备降血糖功能食品、保健品或药物中的应用。
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