CN112662711A - 菊糖芽孢乳杆菌及发酵制备d-乳酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一株菊糖芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus inulinus)DJ01 CCTCC NO:M2020763，于2020年11月19日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址湖北省武汉市武昌区八一路299号。该菊糖芽孢乳杆菌DJ01能够利用水稻秸秆粉进行发酵，并且通过控制水稻秸秆粉中硅元素含量，使得其促进菊糖芽孢乳杆菌发酵酶链降解水稻秸秆粉中碳水化合物，促进其有效转化成为D‑乳酸，从而提高对秸秆的利用率，实现资源的有效利用，环保又经济。
Description
技术领域
本发明涉及发酵制备D-乳酸的技术领域，尤其涉及一种菊糖芽孢乳杆菌及发酵制备D-乳酸的方法。
背景技术
乳酸根据其旋光性可分为D-乳酸和L-乳酸。L-乳酸可被人体降解，故被广泛应用于食品、医疗、化工等行业。而D-乳酸无法被人体降解，目前多用于化工行业，用于农药中间体等，对其光学纯度要求非常高，一般要在99.5％以上。D-乳酸的生产，一般以玉米等淀粉类农产品为原料，以左旋乳芽孢杆菌或德氏乳杆菌为菌种，通过微生物发酵的方法生产。随着国家限塑令的逐步实施，市场对可降解材料的需求越来越大。以L-乳酸或D-乳酸为原料合成的聚乳酸，是非常理想的可降解材料，也是目前主要的可降解原材料之一。随着聚乳酸需求量的上升，如果一直用玉米等作为原料生产D-乳酸，必然对国家粮食安全构成威胁。
发明内容
有鉴于此，有必要提供一种菊糖芽孢乳杆菌及其发酵产D-乳酸的方法，以实现环保而经济的工业化大规模生产。
本发明第一方面，提供一株菊糖芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus inulinus)DJ01，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2020763。
本发明第二方面，提供一种采用所述的菊糖芽孢乳杆菌发酵制备D-乳酸的方法，包括发酵种子的制备，D-乳酸发酵和提取D乳酸的步骤。
具体的，发酵种子制备过程中采用的培养基配方为，葡萄糖10g/升，牛肉膏4g/升，碳酸钙0.5g/升，硫酸镁0.5g/升，琼脂20g/升，pH6～7。
具体的，D-乳酸发酵过程具体包括以下步骤：
S1、水稻秸秆粉碎、过筛，氢氧化钠溶液浸泡后，经超声处理后取出，干燥，得到水稻秸秆粉；
S2、采用发酵种子制备得到的种子液接种大型发酵容器中，以S1步骤得到水稻秸秆粉配制发酵培养基，置于35～40℃培养箱中搅拌不通气培养50～80h，所述发酵培养基中水稻秸秆粉的含量为45～100g/L。
进一步的的，所述发酵培养基还包含酵母浸粉8～15g/L和碳酸钙45～65g/L。
具体的，S1步骤中，碱液浓度为0.5～2mol/L，处理时间为1.5～4h。
具体的，S1步骤中，超声处理条件为：0.8～2.2W/cm2，30～40min。
具体的，S1步骤得到的水稻秸秆粉中含有5～11％wt的硅元素。
有益效果：
本发明提供的菊糖芽孢乳杆菌能够利用水稻秸秆粉进行发酵，并且通过控制水稻秸秆粉中硅元素含量，使得其促进菊糖芽孢乳杆菌发酵酶链降解水稻秸秆粉中碳水化合物，促进其有效转化成为D-乳酸，从而提高对秸秆的利用率，实现资源的有效利用，环保又经济。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明实施例提供一种菊糖芽孢乳杆菌DJ01(Sporolactobacillus inulinusDJ01)CCTCC NO:M2020763，属于芽孢乳杆菌属。其16S rDNA序列如SEQ ID No.1所示。序列在Genbank上进行Blast比对，鉴定结果表明，本菌株与菊糖芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus inulinus)高度同源，确定并命名为菊糖芽孢乳杆菌DJ01，其于2020年11月19日，在中国典型培养物保藏中心保藏，武汉市武昌珞珈山，邮编：430072，保藏地址湖北省武汉市武昌区八一路299号。
该菊糖芽孢乳杆菌DJ01(Sporolactobacillus inulinus)具有下述性质：
1)形态特征：杆状、单个或成对，可形成内生孢子，少量周生鞭毛，运动。在含有葡萄糖、酵母膏、牛肉膏、蛋白豚的琼脂平板上形成细小的针状菌落。
2)生理生化特征：革兰氏阳性，微耗氧。不形成吲哚、不液化明胶，不还原硝酸盐，石蕊牛奶不变。
3)能利用果糖、葡萄糖、菊糖、棉子糖、麦芽糖、甘露糖、海藻糖、半乳糖和蔗糖产酸，不能利用木糖、阿拉伯糖产酸。
4)10℃以下和45℃以上不生长，最适生长温度35～40℃。
本发明实施例提供的采用菊糖芽孢乳杆菌DJ01对水稻秸秆发酵产D-乳酸的方法，包括发酵种子的制备，D-乳酸发酵和提取D乳酸的步骤。
其中，发酵种子制备过程中采用的培养基配方为，葡萄糖10g/升，牛肉膏4g/升，碳酸钙0.5g/升，硫酸镁0.5g/升，琼脂20g/升，pH6～7。
其中，D-乳酸发酵过程具体包括以下步骤：
S1、水稻秸秆粉碎、过筛，于45～55℃条件下浸泡于氢氧化钠溶液中1.5～4h后，取出，干燥，得到水稻秸秆粉；
S2、采用发酵种子制备得到的种子液接种大型发酵容器中，以S1步骤得到水稻秸秆粉配制发酵培养基，置于35～40℃培养箱中搅拌不通气培养50～80h，所述发酵培养基中水稻秸秆粉的含量为45～100g/L。
进一步的，发酵培养基还包含酵母浸粉10g/L和碳酸钙60g/L。
更进一步的，S1步骤得到的水稻秸秆粉中含有5～11％wt的硅元素。
为对发酵过程中培养基及各发酵条件的实施例进行统计和分析，将各实施例列入表1中。表1中种子培养基列，Z1表示的配方为：葡萄糖10g/升，牛肉膏4g/升，碳酸钙0.5g/升，硫酸镁0.5g/升，琼脂20g/升，pH6～7；Z2表示的配方为常规的方法，具体参见Kosaki.M.:Production of high optical purity D-lactic acid(P).US5466588,1995-11-14文献报道。表1中浓度S1步骤条件依次为处理温度，氢氧化钠浓度(0.5～2mol/L)、碱液浸泡处理时间(1.5～4h)、超声强度(0.8～2.2W/cm2)及超声处理时间(30～40min)。表1中的发酵培养基列，F1表示50～100g/L水稻秸秆粉，酵母浸粉10g/L和碳酸钙60g/L，F1后的百分数为水稻秸秆粉中的硅元素含量；F2表示50g/L玉米秸秆粉(采用与S1步骤相同的处理方法)，120g/L葡萄糖和60g/L蛋白陈的发酵培养基配方，F2表示的培养基中硅元素为0.5～1.5％；发酵培养基列还示出了水稻秸秆粉中硅元素含量(硅元素含量可采用氟硅酸钾容量法或其他现有方法进行测定)。表1中发酵条件列依次为发酵控制温度和发酵时间。
表1
发酵结束后，HPLC法检测发酵液中D-乳酸和L-乳酸浓度，测定乳酸的浓度、D-乳酸的光学纯度以及糖D-乳酸转化率。
糖D-乳酸转化率＝发酵完成时D-乳酸质量/秸秆粉中总糖分量×100％；
其中，秸秆粉中总糖分量是指水稻秸秆粉或玉米秸秆粉中碳水化合物总量。总糖含量采用3,5-二硝基水杨(DNS)显色法测定。
表2
由表1和2可知：
1、表1中，实施例2～4相对于实施例1改变了S1步骤处理条件；实施例5～6相对于实施例3改变了发酵培养基的条件；实施例7～8相对于实施例3改变了发酵条件；对比例1相对于实施例1改变了种子培养基；对比例2～5相对于实施例1改变了S1步骤处理条件，且不在本发明限定的范围内，导致了其使用的水稻秸秆粉中硅元素不在本发明限定的范围内；对比例6相对于实施例1使用了F2作为培养基；对比例7～8相对于实施例1改变了发酵条件，且不再本发明限定的范围内。
2、表2中，实施例与对比例制备的D-乳酸光学程度相差不大。但是，实施例1得到发酵液乳酸浓度和糖D-乳酸转化率均显著高于对比例2～6，这表明本发明提供的种子培养基能够获得更高的发酵乳酸浓度，同时还可有效利用秸秆粉中碳水化合物产D-乳酸。具体的，实施例1相对于对比例2～6，由于对比例2～6中使用的秸秆粉硅元素含量处理不合理，导致其参与菊糖芽孢乳杆菌发酵利用时，不能有效地吸收转化其内部的碳水化合物，这可能与硅元素对发酵过程中菊糖芽孢乳杆菌发酵酶链降解这些碳水化合物有关，使得其能够充分降解秸秆粉中的纤维素等碳水化物，提高其有效转化成为D-乳酸。另外，虽然对比例7～8的发酵条件不合理，但是其利用水稻秸秆粉其中硅元素控制在本发明限定的范围内，使得其糖D-乳酸转化率仍然显著高于对比例2～6。
综上所述，本发明提供的菊糖芽孢乳杆菌能够利用水稻秸秆粉进行发酵，并且通过控制水稻秸秆粉中硅元素含量，使得其促进菊糖芽孢乳杆菌发酵酶链降解水稻秸秆粉中碳水化合物，促进其有效转化成为D-乳酸，从而提高对秸秆的利用率，实现资源的有效利用，环保又经济。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 武汉市大江绿创新材料科技有限责任公司
<120> 菊糖芽孢乳杆菌及发酵制备D-乳酸的方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1459
<212> DNA
<213> Sporolactobacillus inulinus
<400> 1
ggacgggggc ggctgctata gatgcagtcg agcgcacatg aagggagctt gctcccggac 60
gtgagcggcg gatgggtgag taacacgtgg gcaacctgcc tgtaagacgg ggataacttc 120
gggaaaccgg agctaatacc ggataatccc tcgcaccgca tggtgcgagg ttgaaagatg 180
gtttcggcca tcacttacag atgggcccgc ggtgcattag ttagttggcg gggtaacggc 240
ccaccaagac cgcgatgcat agccgacctg agagggtgat cggccacatt gggactgaga 300
cacggcccaa actcctacgg gaggcagcag tagggaatct tccacaatgg acgaaagtct 360
gatggagcaa cgccgcgtga gcgaagaagg ttttcggatc gtaaagctct gttgccggag 420
aagaacgagt gccagaggaa atgctggtgc tgtgacggta tccggccaga aagccacggc 480
taactacgtg ccagcagccg cggtaatacg taggtggcaa gcgttgtccg gaattattgg 540
gcgtaaagcg cgcgcaggcg gcttcttaag tctgatgtga aatcttgcgg ctcaaccgca 600
aaaggtcatt ggaaactggg gagcttgagt gcagaagagg agagtagaat tccacgtgta 660
gcggtgaaat gcgtagagat gtggaggaat accagtggcg aaggcggctc tctggtctgt 720
tactgacgct gaggtgcgaa agcatgggga gcaaacagga ttagataccc tggtagtcca 780
tgccgtaaac gatgaatgct aggtgttagg ggggtccaac cccttagtgc tgaagttaac 840
acattaagca ttccgcctgg ggagtacgac cgcaaggttg aaactcaaag gaattgacgg 900
gggcccgcac aagcagtgga gcatgtggtt taattcgaag caacgcgaag aaccttacca 960
ggtcttgaca tcctctgaca agtctagaga taggccgttc cccttcgggg gacagagtga 1020
caggtggtgc atggttgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg ttgggttaag tcccgcaacg 1080
agcgcaaccc ttgatcttag ttgccagcat taagttgggc actctaaggt gactgccggt 1140
gacaaaccgg aggaaggtgg ggatgacgtc aaatcatcat gccccttatg atctgggcta 1200
cacacgtgct acaatgggcg gtacaaaggg cagcgaaacc gcaaggtcaa gccaatccca 1260
taaagccgcc cccagttcgg attgcaggct gcaactcgcc tgcatgaagc cggaattgct 1320
agtaatcgcg gatcagcatg ccgcggtgaa tccgttcccg ggccttgtac acaccgcccg 1380
tcacaccacg agagtttgta acacccgaag tcggtgtggg aacctttatg gacccagccg 1440
ccgaagggga cgaagggtg 1459
Claims (8)
1.一株菊糖芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus inulinus)DJ01，其特征在于，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2020763。
2.采用权利要求1所述的菊糖芽孢乳杆菌发酵制备D-乳酸的方法，其特征在于，包括发酵种子的制备，D-乳酸发酵和提取D乳酸的步骤。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，发酵种子制备过程中采用的培养基配方为：葡萄糖10g/升，牛肉膏4g/升，碳酸钙0.5g/升，硫酸镁0.5g/升，琼脂20g/升，pH6～7。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，D-乳酸发酵过程具体包括以下步骤：
S1、水稻秸秆粉碎、过筛，氢氧化钠溶液浸泡后，经超声处理后取出，干燥，得到水稻秸秆粉；
S2、采用发酵种子制备得到的种子液接种大型发酵容器中，以S1步骤得到水稻秸秆粉配制发酵培养基，置于35～40℃培养箱中搅拌不通气培养50～80h，所述发酵培养基中水稻秸秆粉的含量为45～100g/L。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基还包含酵母浸粉8～15g/L和碳酸钙45～65g/L。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，S1步骤中，碱液浓度为0.5～2mol/L，处理时间为1.5～4h。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，S1步骤中，超声处理条件为：0.8～2.2W/cm2，30～40min。
8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，S1步骤得到的水稻秸秆粉中含有5～11％wt的硅元素。
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