KR20050022591A - 맥주 발효 폐효모액을 이용한 미생물 셀룰로오스의 제조방법 - Google Patents

맥주 발효 폐효모액을 이용한 미생물 셀룰로오스의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 미생물 셀룰로오스(bacterial cellulose)를 생성능을 가진 미생물을 맥주 발효 폐효모액에서 배양하는 것을 특징으로 하는 미생물 셀룰로오스의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면,맥주 발효 폐효모액을 사용할 경우, 셀룰로오스를 생산하지 않는 돌연변이주(Cel- mutant)의 발생을 억제하고 덩이 형태의 미생물 셀룰로오스를 생산하도록 유도하여 미생물 셀룰로오스의 생산수율과 분리공정의 효율성을 극대화하는 것이 가능하고, 셀룰로오스 생산에 소요되는 원가를 절감할 수 있다.

Description

맥주 발효 폐효모액을 이용한 미생물 셀룰로오스의 제조방법 {Method for Producing Bacterial Cellulose Using the Waste of Beer Fermentation Broth}
본 발명은 미생물 셀룰로오스(bacterial cellulose)를 생성하는 미생물을 발효폐액에서 배양하는 것을 특징으로 하는 미생물 셀룰로오스의 제조방법에 관한 것이다.
미생물 셀룰로오스를 생산할 수 있는 미생물로는 아세토박터 (Acetobacter) 속, 아그로박테리움 (Agrobacterium) 속, 리조비움 (Rhizobium) 속, 슈도모나스 (Pseudomonas) 속, 사르시나 (Sarcina) 속 등이 보고되어 있다. 이 중 아세토박터 속은 진핵생물에서 발견되는 세포벽 고분자 (cell wall polymer)가 아닌 세포외 섬유소 (extracellular fibril)로서 분비되는 셀룰로오스를 대량으로 생산할 수 있어 많은 연구가 이루어지고 있다.
아세토박터 속이 생산하는 미생물 셀룰로오스는 식물유래 셀룰로오스에서는 찾아볼 수 없는 독특한 특성으로 인하여 식품으로서 뿐만 아니라 고부가가치 신소재 산업에서 매우 중요한 화제가 되고 있다. 미생물 셀룰로오스는 단기간 대량생산이 가능하고 섬유 결정도, 보수성, 성형성 그리고 인장강도 등이 높기 때문에 산업적으로 여러 용도로 개발되고 있으며 최근에는 화장 패드, 의료용 패드, 효소 고정화 담체, 종이 코팅제 등으로 이용되고 있다. 특히, 미국특허 제5274199와 제4912049에는 각각 미생물 셀룰로오스를 이용한 음향 진동판 제조방법과 인공피부 제조방법이 개시되어 있으며, 대한민국특허 제2003-0015399 및 제1997-0014612에는 각각 미생물 셀룰로오스를 이용한 식이섬유와 식이음료의 제조방법이 개시되어 있다.
이상과 같이 미생물 셀룰로오스는 우수한 물리적 특성으로 인하여 산업용 소재, 식품 소재 등에 다양하게 활용될 수 있으며, 특히 환경 친화적 소재라는 점은 무한한 개발 가능성과 다양성을 가지고 있다.
그러나 미생물에 의해 생산되어지는 셀룰로오스는 생산수율이 비교적 낮고 원가가 높아 현재까지 미생물 셀룰로오스의 응용은 스피커 진동판 등의 고부가가치 상품에 제한되어 있었다.
또한 미생물 셀룰로오스를 생산하기 위해서는 정치배양 보다는 교반배양이 더 경제적이나 일반적으로 미생물 셀룰로오스 생산 균주는 진탕 또는 교반배양을 실시할 경우 배양기내에서 발생하는 전단응력(shear stress)으로 인하여 셀룰로오스를 생산하지 못하는 돌연변이주(Cel- mutant)가 발생하고, 이 돌연변이주는 미생물 셀룰로오스 생산균주보다 증식속도가 빠르기 때문에 연속적인 통기 교반 배양에서는 생산주가 도태되어 비생산주가 배양의 주체로 되는 문제(Valla, S. and Kjosbakken, J., J. General Microb. 128:1401-8, 1981)로 인하여 종래에는 생산성이 매우 낮지만 긴 배양시간과 많은 노동력을 필요로 하는 정치배양을 이용하여 미생물 셀룰로오스를 생산하였다.
따라서 교반배양 조건에서도 전술한 변이주(Cel- mutant)가 발생되지 않거나 발생빈도를 감소시킬 수 있는 배양조건의 개발 및 미생물 셀룰로오스의 생산원가를 절감시킬 수 있는 배지대체 물질의 개발이 절실하게 필요한 실정이다.
한편, 펩톤, 효모추출물, 포도당, 구연산, 에탄올 등을 포함하는 배지에서 아세토박터 자일러넘을 교반배양하여 미생물 셀룰로오스를 생산하는 방법이 알려져 있으나, 이는 셀룰로오스 생산 배지로 고가의 펩톤, 효모 추출물 등을 사용하여 경제성이 낮은 단점이 있다 (대한민국 특허공개 1998-067009).
이에, 본 발명자들은 전단응력이 있는 배양 조건에서도 셀룰로오스를 생산하지 못하는 돌연변이주(Cel- mutant)의 발생 없이 미생물 셀룰로오스를 경제적으로 생산하는 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, 배양배지로 폐효모 발효액을 이용한 결과, 고수율로 미생물 셀룰로오스의 제조가 가능하다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명의 목적은 전단응력이 있는 배양 조건에서도 셀룰로오스를 생산하지 못하는 돌연변이주(Cel- mutant)의 발생 없이 미생물 셀룰로오스를 생산하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 산업적 생산에 적합한 미생물 셀룰로오스의 연속 제조방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 맥주 공장의 산업 폐기물인 폐효모액을 배지 대체물질로 이용하여 미생물 셀룰로오스를 제조하는 방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은, 아세토박터 (Acetobacter) 속, 글루콘아세토박터 (Gluconacetobacter) 속, 아그로박테리움 (Agrobacterium) 속, 리조비움 (Rhizobium) 속, 슈도모나스 (Pseudomonas) 속 및 사르시나 (Sarcina) 속으로 구성된 군에서 선택된 셀룰로오스 생성능을 가지는 미생물을 맥주 발효 폐효모액을 함유하는 배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는 미생물 셀룰로오스의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 미생물은 글루콘아세토박터 한세니 (Gluconacetobacter hansenii) PJK (KCTC 10505BP)인 것을 특징으로 할 수 있고, 배양은 연속적 회분배양 방식인 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 연속적 회분배양은 (a) 셀룰로오스 생성능을 가진 미생물을 전배양한 후 배양 상등액을 맥주 발효 폐효모액에 접종하는 단계; (b) 맥주 발효 폐효모액에서 상기 미생물을 배양하여 덩이 형태의 미생물 셀룰로오스를 생산하는 단계; (c) 상기 배양 상등액의 일부를 새로운 맥주 발효 폐효모액에 접종하는 단계; (d) 상기 접종된 배양액으로부터 미생물 셀룰로오스를 생산하는 단계; 및 (e) 상기 (c) 및 (d) 단계를 반복하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 또한, 글루콘아세토박터 한세니 (Gluconacetobacter hansenii) PJK (KCTC 10505BP)를 0.5 내지 15%(v/v)의 에탄올을 함유하는 배지에서 배양하는 것을 특징으로하는 미생물 셀룰로오스의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 의하면, 에탄올을 함유하는 배지에 상기 미생물을 배양함으로써 배양액 중 셀룰로오스를 생산하지 않는 돌연변이주(Cel- mutant)의 발생을 억제하고 덩이 형태의 미생물 셀룰로오스를 생산하도록 유도하여 미생물 셀룰로오스의 생산수율과 분리공정의 효율성을 극대화하는 것이 가능하다. 또한 미생물 셀룰로오스 생산을 위한 연속배양공정을 수행함으로써 미생물 셀룰로오스의 생산성을 극대화하는 것이 가능하다. 또한, 맥주공장의 산업 폐기물인 폐효모액의 상등액을 배지로 이용하여 상기 미생물로부터 미생물 셀룰로오스를 생산함으로써 생산비용 절감하는 것이 가능하다.
본 발명에 있어서, 배지중에 에탄올 농도가 0.5%(v/v) 미만인 경우에는 셀룰로오스를 생산하지 못하는 돌연변이주(Cel- mutant)의 발생을 억제하기 곤란한 문제점이 있고, 15%(v/v)를 초과하는 경우에는 미생물 성장이 저하되어 생산성이 떨어지는 문제점이 있다.
본 발명은 또한, 셀룰로오스 생성능을 가지는 글루콘아세토박터 한세니 (Gluconacetobacter hansenii) PJK (KCTC 10505BP)를 제공한다.
이하, 본 발명에 대하여 상세히 설명한다.
본 발명에서는 먼저 부패한 사과로부터 미생물 셀룰로오스를 생산할 수 있는 단일 미생물을 분리하였으며 16S rDNA 전체서열분석(complete sequencing) 방법으로 1376bp의 염기서열(서열 1)을 분석한 후, 16S rDNA 유사도와 계통수를 분석한 결과 상기 미생물은 글루콘아세토박터 한세니 (Gluconacetobacter hansenii)로 동정되었으며, 글루콘아세토박터 한세니 (Gluconacetobacter hansenii)PJK로 명명하고, 2003년 8월 11일자로 생명공학연구원에 기탁하였다 (KCTC 10505BP).
상기 미생물을 전배양한 후 배양 상등액을 1%(v/v) 에탄올이 포함된 새로운 배지와 에탄올이 포함되지 않은 새로운 배지에 각각 접종하여 진탕 배양함으로써 전단응력의 환경 하에서 미생물 셀룰로오스 미생산 변이주의 발생빈도를 확인하였다. 이때 배양액을 한천배지에 도말한 후 배양하여 얻어진 콜로니(colony)의 형태로부터 미생물 셀룰로오스 미생산 변이주의 발생빈도를 확인하였다.
그 결과 에탄올이 포함된 배지에서 성장한 미생물은 미생물 셀룰로오스 미생산 변이주로의 발생빈도가 감소됨을 확인하였다. 그리고, 에탄올이 포함된 배지에서 생산된 미생물 셀룰로오스는 회수 및 분리하기 쉬운 덩이형태로 생성되었으며 셀룰로오스의 생산수율 또한 증가됨을 확인하였다.
또한 상기 배양액의 상등액을 에탄올이 포함된 새로운 배지에 접종하여 배양하고 이러한 과정을 연속적으로 실시한 결과, 미생물 셀룰로오스의 연속생산 공정이 가능함을 확인하였다.
맥주 공장의 산업 폐기물인 폐효모액의 상등액을 배지로 이용하여 상기 미생물을 배양한 결과 미생물 셀룰로오스 생산배지에서 생성된 미생물 셀룰로오스의 생산성과 유사한 결과를 나타내었으며 배양 기간 동안 미생물 셀룰로오스 미생산 변이주가 거의 발생하지 않음을 확인하였다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 구체적으로 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 오로지 본 발명을 구체적으로 설명하는 것으로 이들 실시예에 의해 본 발명을 한정하는 것은 아니다.
특히, 하기 실시예에서는 셀룰로오스 생성균주로 글루콘아세토박터 한세니 (Gluconacetobacter hansenii) PJK를 사용하였나, 다른 셀룰로오스 생성균주를 사용하여도 동일한 결과를 얻을 수 있다는 것을 당업자에게 자명할 것이다.
실시예 1: 글루콘아세토박터 한세니 ( Gluconacetobacter hansenii ) PJK의 분리 및 동정
하기 표 과 같은 조성의 pH 5인 배지용액을 준비하였다. 배지용액을 121℃에서 15분간 멸균한 후 250mL 삼각 플라스크에 50mL를 분주하고 부패된 사과의 일부를 투입하여 30℃에서 정치배양 시킨 후 셀룰로오스 펠리클 (pellicle)이 나타난 배양액을 생리식염수에 희석하여 하기 표 1과 같은 조성의 고형배지에 도말하여 30℃에서 배양하였다. 고형배지에 형성된 콜로니 (colony)를 상기 방법으로 5회 반복함으로써 미생물 셀룰로오스를 생산할 수 있는 단일균을 분리하였다.
성분 양 ( /L)
포도당 (SIGMA사, 미국)효모추출물 (DIFCO사, 미국)펩톤 (DIFCO사, 미국)인산화나트륨 (약리화학, 일본)시트르산 (약리화학, 일본)아세트산 (동양화학, 한국)에탄올 (동양화학, 한국)시클로헥시미드 (SIGMA사, 미국) 20 g 5 g 5 g 2.7 g 1.15 g 2 mL 5 mL 0.1 g
분리된 단일 균주의 16S rDNA의 전체 염기서열(1376bp)을 결정하여(Juke, T. H. and Cantor, C. R., Evolution of protein molecules. In mammalian protein metabolism, Edited by H. N. Munro. p21. Academic Press, New York., 1969) 퍼센트(%) 유사도와 계통수를 분석한 결과(Saito, N. and Nei, M., Mol. Biol. Evol. 4:406-425(1987)), 표 2와 도 1에서 볼 수 있듯이 Gluconacetobacter hansenii의 표준균주와 99.27%의 높은 16S rDNA 유사도와 1000의 높은 부트스트랩 값 (bootstrap value)를 나타내어 상기 미생물은 글루콘아세토박터 한세니 (Gluconacetobacter hansenii)로 동정되었으며, 글루콘아세토박터 한세니 (Gluconacetobacter hansenii) PJK로 명명하였다.
표준균주 % 유사도
글루콘아세토박터 한세니 (Gluconacetobacter hansenii NCIMB 8746 (T)) 99.27
글루콘아세토박터 한세니 (Gluconacetobacter europaeus DSM 6160 (T)) 98.40
글루콘아세토박터 자일리너스 (Gluconacetobacter xylinussubsp. sucrofermentans BPR2001) 98.33
글루콘아세토박터 자일리너스 (Gluconacetobacter xylinussubsp. xylinus NCIMB 11664 (T)) 98.25
아세토박터 인터미디어스 (Acetobacter intermedius DSM 11804 (T)) 98.03
아세토박터 오보에디엔스 (Acetobacter oboediens DSM 11826 (T) 98.03
글루콘아세토박터 리쿼파시엔스 (Gluconacetobacter liquefaciens IFO 12388 (T)) 96.72
글루콘아세토박터 디아조트로피쿠스 (Gluconacetobacter diazotrophicusATCC 49037 (T)) 96.58
아세토박터 아세티 (Acetobacter aceti JCM 7641 (T)) 94.61
아세토박터 포모럼 (Acetobacter pomorum DSM 11825 (T)) 93.95
아세토박터 파스테우리아너스 (Acetobacter pasteurianus LMG 1262 (T)) 93.80
상기 미생물은 그람(gram) 음성의 간균이고, 에탄올, 젖산, 아세트산 산화능이 있었으며(Park, J.K. et al., Biotechnol. Bioprocess Eng. 8:83-88, 2003), 고형배지에서 형성된 콜로니(colony)의 형태는 둥글고 표면이 거친 특성을 나타내었다.
실시예 2: 에탄올을 포함하는 배지에서 글루콘아세토박터 한세니 ( Gluconacetobacter hansenii ) PJK의 배양
하기 표 3과 같은 조성의 pH 5인 배지용액을 준비하였다. 배지용액을 121℃에서 15분간 멸균한 후 250 mL 삼각 플라스크에 50 mL를 분주하고 미생물 셀룰로오스 생산 균주인 글루콘아세토박터 한세니 (Gluconacetobacter hansenii) PJK 균주를 접종하여 진탕 배양기에서 30℃에서 200rpm의 속도로 회전시키면서 1일간 전배양하였다. 그 후, 전배양 용액의 상등액을 250mL 삼각 플라스크에 1%(v/v) 에탄올이 포함된 새로운 배지용액 50mL에 5%(v/v) 접종하여 30℃에서 200rpm의 속도로 회전시키면서 5일간 진탕배양하였다.
성분 양 ( /L)
포도당 (SIGMA사, 미국)효모추출물 (DIFCO사, 미국)펩톤 (DIFCO사, 미국)숙신산 (WACO PURE CHEMICAL사, 미국)아세트산 (동양화학, 한국) 10 g10 g 7 g 0.2 g 1.5 mL
배양 후 배양액을 회수하여 4000rpm으로 20분간 원심분리하였다. 그 후, 상등액을 제거하고 증류수 세척 및 상기의 방법과 같이 원심분리 과정을 2회 거치고 항량이 될 때까지 영하 50℃에서 동결시켜 균체가 포함된 미생물 셀룰로오스의 건조중량을 먼저 구하였다. 그 후 균체가 포함된 셀룰로오스에 20mL의 0.3N 수산화나트륨용액을 첨가하여 5분간 끓임으로써 균체를 모두 용해시켰다. 세포가 제거된 순수 미생물 셀룰로오스는 중성이 될 때까지 충분히 세척한 후 다시 동결 건조하여 건조중량을 측정하였다. 균체가 포함된 미생물 셀룰로오스의 건조중량과 순수 미생물 셀룰로오스의 건조중량의 차이로 균체의 건조중량을 측정하였다.
측정 결과, 에탄올을 포함하는 배지에서의 균체 및 미생물 셀룰로오스의 건조중량은 각각 3.34g/L 및 2.31g/L를 나타내었다.
실시예 3: 에탄올을 포함하는 배지에 의한 덩이 형태의 미생물 셀룰로오스 생산
상기 실시예 2에서 생산되어지는 미생물 셀룰로오스의 형태를 도 2에 나타내었다. 에탄올이 포함된 배지에서 생성된 미생물 셀룰로오스는 배양 2일째부터 작은 구형의 셀룰로오스 펠렛(pellet)들이 서서히 뭉쳐져 덩이를 형성하기 시작하였으며 배양 3일째, 미생물 셀룰로오스 덩이 표면에 펠리클 (pellicle) 형태의 새로운 셀룰로오스 피막이 덩이 전체를 둘러싸고 그 후에는 피막이 점차 두꺼워져 도 2에서 보는 바와 같이 하나의 큰 덩어리를 형성하였다.
실시예 4: 에탄올을 포함하는 배지에서의 미생물 셀룰로오스를 생산하지 않는 변이주(Cel - mutant)의 발생
상기 실시예 2와 같은 방법으로 전배양 용액의 상등액을 1%(v/v) 에탄올이 포함된 배지 50mL에 5%(v/v) 접종하여 30℃, 200rpm에서 배양한 후 매일 시료를 채취하여 배양 상등액을 식염수에 105배 희석한 후 상기 표 1의 조성을 가지는 고형배지에 도말하여 30℃에서 2일간 배양하였다.
고형배지에 생성된 콜로니(colony)의 형태로부터 미생물 셀룰로오스를 생산하지 않는 변이주의 발생빈도 (Cel- mutant 콜로니 수/ 전체 콜로니 수)를 측정하고 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다. 고형배지에서 셀룰로오스 생산균주는 거친 형태(rough-type)의 콜로니를 형성하고 셀룰로오스를 생산하지 않는 변이주는 부드러운 형태(smoth-type)의 콜로니를 형성하기 때문에 (Valla, S. and Kjosbakken, J., J. General Microb. 128:1401-8, 1981) 육안으로 쉽게 변이주를 구별할 수 있다.
배양시간 (day) 총 생균수 (CFU/mL) 변이주 발생빈도(Cel- mutant/total cell)
1 7.7×106 0.18
2 7.8×106 0.13
3 2.57×107 0.004
4 6.2×106 0.0
5 4.32×107 0.002
상기 표 4에서 보는 바와 같이, 1%(v/v) 에탄올이 포함된 배지에서 배양된 미생물은 배양 3일 이후 미생물 셀룰로오스를 생산하지 않는 변이주가 거의 발생하지 않는다는 것을 알 수 있었다.
실시예 5: 에탄올을 포함하는 배지에서의 연속 회분배양을 이용한 미생물 셀룰로오스 생산
상기 실시예 2와 동일한 방법으로 전배양한 후 배양 상등액을 1%(v/v) 에탄올이 포함된 배지 50mL에 5%(v/v) 접종하여 30℃, 200rpm에서 도 3에 도시한 공정으로 연속 회분배양을 실시하였다. 5일간 배양한 후 생성된 미생물 셀룰로오스의 생산량을 표 5에 나타냈다.
배양시간(day) 미생물 셀룰로오스의 건조중량(g/L)
회분배양의 횟수
1 회 2 회 3 회 4 회 5 회
1 2.14 0.94 0.74 0.66 0.58
3 2.13 1.34 1.49 2.07 1.72
5 2.27 1.66 1.74 0.36 0.40
상기 표 5에서 보는 바와 같이, 1%(v/v) 에탄올이 포함된 배지에서 3일 배양된 미생물을 연속 회분배양을 실시한 경우, 5회분까지 미생물 셀룰로오스 생산능을 유지하는 것을 알 수 있었다.
실시예 6: 맥주 발효 폐효모액의 조성분석
맥주 발효 폐효모액을 4000rpm으로 원심분리한 후 상등액을 채취하여 121℃에서 15분간 멸균한 다음, GC(gas chromatography)로 분석한 결과, 맥주 발효 폐효모액에는 에탄올과 아세트산이 각각 8.3%(v/v) 및 6.9%(v/v)의 농도로 포함되어 있었고, 포도당은 0.28g/L의 농도로 포함되어 있었으며, 고형물의 건조중량은 122g/L이었다.
실시예 7: 맥주 발효 폐효모액을 배지로 이용한 글루콘아세토박터 한세니 ( Gluconacetobacter hansenii ) PJK의 배양
맥주 발효 폐효모액을 4000rpm으로 원심분리한 후 상등액을 채취하여 250mL 삼각 플라스크에 50mL를 넣고 121℃에서 15분간 멸균하였다.
상기 실시예 2의 방법으로 전배양을 한 후 배양 상등액 5%(v/v)를 맥주 발효 폐효모액의 상등액에 접종하고 200rpm, 30℃에서 진탕배양하였다. 배양 후 매일 시료를 채취하여 실시예 2와 동일한 방법으로 미생물 셀룰로오스의 생산량을 측정하였고 (도 4), 실시예 4와 동일한 방법으로 셀룰로오스를 생산하지 않는 변이주(Cel- mutant)의 발생빈도를 측정하였다 (표 6).
배양시간 (day) 총생균수 (CFU/mL) 변이주 발생빈도(Cel- mutant/total cell)
1 5.3×106 0.019
2 1.2×107 0.008
3 4.1×106 0
4 3.8×106 0.079
5 5.8×106 0
6 2.4×106 0
7 1.1×106 0
8 6.1×106 0
10 7.5×106 0
11 6.3×106 0
13 5.0×106 0
14 1.4×107 0
16 1.2×107 0
도 4에서 보는 바와 같이, 배양 16일째 미생물 셀룰로오스 생산량이 1.37g/L로 에탄올을 포함하지 않는 셀룰로오스 생산배지로부터 생산된 셀룰로오스의 생산량 (비교예 1)과 거의 유사함을 알 수 있었다. 도 4에서 ●는 셀룰로오스 건조중량, ▲는 pH, ■는 포도당 농도를 나타낸다.
또한 상기 표 6에서 보는 바와 같이, 셀룰로오스를 생산하지 않는 변이주(Cel- mutant)가 거의 발생하지 않음을 알 수 있었다.
비교예 1: 에탄올을 포함하지 않는 배지에서의 글루콘아세토박터 한세니 ( Gluconacetobacter hansenii ) PJK의 배양
실시예 2와 같은 방법으로 글루콘아세토박터 한세니 (Gluconacetobacter hansenii) PJK 균주를 전배양한 후, 배양 상등액을 250mL 삼각 플라스크에 상기 표 2와 같은 조성의 새로운 배지용액 50mL에 5%(v/v) 접종하여 30℃에서 200rpm 속도로 회전시키면서 5일간 진탕배양하였다.
배양 후 배양액을 회수하여 상기 실시예 2와 같은 방법으로 균체 및 미생물 셀룰로오스의 건조중량을 측정하였다. 측정 결과, 에탄올을 포함하지 않는 배지에서의 균체 및 미생물 셀룰로오스의 건조중량은 각각 2.33g/L 및 1.30g/L로 에탄올을 포함하는 배지의 경우에 비하여 각각 1.4배 및 1.8배 감소하였다. 상기의 결과에서 미생물 셀룰로오스의 생산량은 에탄올이 포함된 배지에서 더 높아짐을 알 수 있었다.
비교예 2: 에탄올을 포함하지 않는 배지에서의 미생물 셀룰로오스를 생산하지 않는 변이주(Cel - mutant)의 발생
상기 실시예 4와 같은 방법으로 전배양 용액의 상등액을 에탄올이 포함되지 않은 배지 50mL에 5%(v/v) 접종하여 30℃에서 200rpm의 회전속도로 배양한 후 매일 시료를 채취하여 배양 상등액을 식염수에 105배 희석한 후 상기 표 3의 조성을 가지는 고형배지에 도말하여 30℃에서 2일간 배양하였으며 그 결과를 하기 표 7에 나타내었다.
배양시간 (day) 총생균수 (CFU/mL) 변이주 발생빈도(Cel- mutant/total cell)
1 2.3×106 0.26
2 1.22×108 0.19
3 950 0.042
4 0 -
5 0 -
표 7과 표 4로부터, 배지에 1%(v/v)의 에탄올을 첨가할 경우, 배양 중 셀룰로오스를 생산하지 않는 변이주(Cel- mutant)의 발생빈도를 낮추는 것이 가능하다는 것을 알 수 있었다.
비교예 3: 에탄올을 포함하지 않는 배지에서의 연속 회분배양을 이용한 미생물 셀룰로오스 생산
실시예 5와 동일한 방법으로 에탄올을 포함하지 않는 배지에서 연속 회분배양을 실시한 후 결과를 표 8에 나타내었다.
배양시간 미생물 셀룰로오스의 건조중량(g/L)
회분배양의 횟수
1 회 2 회 3 회 4 회 5 회
1 일 1.26 0.55 0.18
2 일 1.26 0.66 0.49
3 일 1.32 1.40 1.32 0.63 0.28
5 일 1.46 0
상기 표 8에 보는 바와 같이, 에탄올이 포함되지 않은 배지에서 3일 배양된 미생물을 연속 회분배양을 실시한 경우, 3회분이후 미생물 셀룰로오스 생산능이 급격히 감소하는 것을 알 수 있었다.
이상 설명한 바와 같이, 본 발명은 생산수율이 향상되고 분리공정이 용이한 미생물 셀룰로오스의 제조방법을 제공하는 효과가 있다. 또한, 맥주 발효 폐효모액을 배지로 이용하여 미생물 셀룰로오스를 생산할 경우, 발효 산업체로부터 산업 폐기물의 처리비용을 줄일 수 있으며 셀룰로오스 생산에 소요되는 원가를 절감할 수 있어 미생물 셀룰로오스의 상업적 생산이 가능하다.
도 1은 분리된 균주의 계통수를 나타낸 그림이다.
도 2는 에탄올을 포함하는 배지에서 생산된 미생물 셀룰로오스의 형태를 나타낸 그림이다.
도 3은 본 발명에 따른 연속 회분배양 공정의 개략도이다.
도 4는 맥주 발효 폐효모액 배지에서 배양시간에 따른 미생물 셀룰로오스의 생산을 나타낸 그래프이다.
<110> PARK, Joong Kon <120> Method for Producing Bacterial Cellulose Using the Waste of Beer Fermentation Broth <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1376 <212> DNA <213> Gluconacetobacter hansenii <400> 1 catgcaagtc gcacgaacct ttcggggtta gtggcggacg ggtgagtaac tcgtagggat 60 ctgtccatgg gtgggggata actttgggaa actgaagcta ataccgcatg acacctgagg 120 gtcaaaggcg cgagtcgcct gtggaggaac ctgcgttcga ttagctagtt ggtggggtaa 180 aggcctacca aggcgatgat cgatagctgg tctgagagga tgatcagcca cactgggact 240 ganacacggc ccagactcct acgggaggca gcagtgggga atattggaca atgggcgcaa 300 gcctgatcca gcaatgccgc gtgtgtgaag aaggttttcg gattgtaaag cactttcagc 360 ggggacgatg atgacggtcc ccgcagaaga agccccggct aacttcgtgc cagcagccgc 420 ggtaatacga agggggcaag cgttgctcgg aatgactggg cgtaaagggc gcgtaagcgg 480 ttgttacagt cagatgtgaa attcccgggc ttaacctggg ggctgcattt gatacgtgac 540 gactataatg tgagagaggg ttgtggaatt cccagtgtag aggtgaaatt cgtagatatt 600 gggaagaaca ccggtggcga aggcggcaac ctggctcatg actgacgctg aggcgcgaaa 660 gcgtggggag caaacaggat tagataccct ggtagtccac gctgtaaacg atgtgtgctg 720 gatgttggat ggcttggcca ttcagtgtcg tagttaacgc gataagcaca ccgcctgggg 780 agtacggccg caaggttgaa actcaaagga attgacgggg gcccgcacaa gcggtggagc 840 atgtggttta attcgaagca acgcgcagaa ccttaccagg acttgacatg cggaggctgt 900 gtccagagat gggcatttct cgcaagagac ctccagcaca ggtgctgcat ggctgtcgtc 960 agctcgtgtc gtgagatgtt gggttaagtc ccgcaacgag cgcaaccctc gcctttagtt 1020 gccagcacgt ctgggtgggc actttaaagg aactgccggt gacaagccgg aggaaggtgg 1080 ggatgacgtc aagtcctcat ggcccttatg tcctgggcta cacacgtgct acaatggcgg 1140 tgacagtggg aagccaggca gcgatgccga gcggatntcc aaaagccgtc tcagttcgga 1200 ttgcactctg caactcgagt gcatgaaggt ggaatcgcta gtaatcgcgg atcagcatgc 1260 cgcggtgaat acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt cacaccatgg gagttggttt 1320 gaccttaagc cggtgagcga accgcaagga cgcagccgac cacggtcggg tcagcg 1376

Claims (6)

  1. 아세토박터 (Acetobacter) 속, 글루콘아세토박터(Gluconacetobacter)속, 아그로박테리움 (Agrobacterium) 속, 리조비움 (Rhizobium) 속, 슈도모나스 (Pseudomonas) 속 및 사르시나 (Sarcina) 속으로 구성된 군에서 선택된 셀룰로오스 생성능을 가진 미생물을 맥주 발효 폐효모액에서 배양하는 것을 특징으로 하는 미생물 셀룰로오스의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, 미생물이 글루콘아세토박터 한세니 (Gluconacetobacter hansenii) PJK (KCTC 10505BP)인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 배양은 연속적 회분배양 방식인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제4항에 있어서, 연속적 회분배양은 다음의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    (a) 셀룰로오스 생성능을 가진 미생물을 전배양한 후 배양 상등액을 맥주 발효 폐효모액에 접종하는 단계;
    (b) 맥주 발효 폐효모액에서 상기 미생물을 배양하여 덩이 형태의 미생물 셀룰로오스를 생산하는 단계;
    (c) 상기 배양 상등액의 일부를 새로운 맥주 발효 폐효모액에 접종하는 단계;
    (d) 상기 접종된 배양액으로부터 미생물 셀룰로오스를 생산하는 단계; 및
    (e) 상기 (c) 및 (d) 단계를 반복하는 단계.
  5. 셀룰로오스 생성능을 가지는 글루콘아세토박터 한세니 (Gluconacetobacter hansenii) PJK (KCTC 10505BP).
  6. 제 6항의 글루콘아세토박터 한세니 (Gluconacetobacter hansenii) PJK (KCTC 10505BP)를 0.5 내지 15%(v/v)의 에탄올을 함유하는 배지에서 배양하는 것을 특징으로하는 미생물 셀룰로오스의 제조방법.
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