CN114276951A - 一株可产具有广谱抑菌活性抗菌肽的植物乳杆菌 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株可产具有广谱抑菌活性抗菌肽的植物乳杆菌，属于微生物和生物技术领域。本发明从东北酸菜中分离出植物乳杆菌LBBE‑L1，已于2021年9月18日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：61935。该菌株具有明显抑制致病菌如大肠埃希氏杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、巨大芽孢杆菌、沙雷氏菌、恶臭假单胞菌、阴沟肠杆菌、屎肠球菌、弗氏柠檬酸杆菌活性的作用。

Description

一株可产具有广谱抑菌活性抗菌肽的植物乳杆菌

技术领域

本发明涉及一株可产具有广谱抑菌活性抗菌肽的植物乳杆菌，属于微生物和生物技术领域。

背景技术

在当今社会，随着人们生活水平的不断提高，对食品质量、种类等方面提出了更高的要求，食品加工业迅速发展起来。在现代食品工业里困扰人们最多的一个问题就是如何才能防腐保鲜，不能妥善解决好这个问题将导致很严重的后果。造成食品腐败常见的腐败菌为包括大肠埃希氏杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、巨大芽孢杆菌等细菌与霉菌。食品腐败变质不仅会产生经济损失，而且腐败食品中常含有细菌分泌的毒素和食品腐败产物，会干扰人体的新陈代谢，影响人体组织的正常功能，导致食品中毒甚至会对人们的生命造成威胁。

目前，市场上广泛应用的工业防腐剂多为：苯甲酸、苯甲酸钠、山梨酸、山梨酸钾、丙酸钙等，但有些防腐剂的使用不仅达不到仿佛效果还会影响食品风味和品质并导致变色。如何正确控制防腐剂的种类与用量，从而在保持食品风味的同时增加食品保质期一直是食品方面的研究热点。

而植物乳杆菌作为一种在酸奶、酸菜、酱油等食品中广泛存在的微生物，对于这些食品具有增香、减少杂菌污染等诸多方面的作用。据已有文献报道，植物乳杆菌通过产乳酸、乙酸、抗菌肽等抑菌物质或菌体共聚效应，从而使pH值降低、强氧化作用、干扰精氨酸利用、抑制DNA合成或吸附在敏感细胞表面导致细胞裂解死亡。

因此，植物乳杆菌可以作为一种安全、绿色的生物防腐剂，在食品发酵生产过程中添加进入，达到减少食品腐败、延长食品保质期、增加食品风味的目的，从而减少化学防腐剂的应用，具有极高的市场潜力与应用前景，而如何得到一种能够替代防腐剂，对多种腐败菌均有较好的抑制作用的植物乳杆菌，成为研究的热点。

发明内容

本发明的目的在于发现一株可以产具有广谱抑菌活性抗菌肽的植物乳杆菌。该菌株的无菌超滤滤出液对大肠埃希氏杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、巨大芽孢杆菌、沙雷氏菌、恶臭假单胞菌、阴沟肠杆菌、屎肠球菌、弗氏柠檬酸杆菌具有显著的抑菌效果，同时热稳定性较强，可以有效延长食品保质期。

为实现上述发明目的，本发明提供了下述技术方案：

本发明提供了一株可以产具有广谱抑菌活性抗菌肽的植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)LBBE-L1，所述植物乳杆菌(Lactiplantibacillusplantarum)保藏于广东省菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO：61935，保藏日期为2021年9月18日。

本发明的植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)LBBE-L1来源于江苏省无锡市欧尚超市中购买的东北酸菜，使用细菌通用引物27F和1492R对筛选出的抑菌菌进行菌落PCR，将得到的PCR产物送上海Songon公司测序之后，使用BLAST在NCBI上进行16S rRNA序列比对，同源度为99.93％，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，将该菌种经鉴定为植物乳杆菌Lactiplantibacillus plantarum，命名为Lactiplantibacillus plantarum LBBE-L1。

所述植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)LBBE-L1在MRS固体培养基中生长，其菌落特征为：菌落直径为1～2mm，乳白色、表面光滑湿润、液滴状、圆形、隆起、边缘整齐。

本发明还提供了一种含有上述植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)LBBE-L1或植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)LBBE-L1发酵液的微生物菌剂。

在本发明的一种实施方式中，所述微生物菌剂中，植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)LBBE-L1的浓度至少为：1×10⁸CFU/mL。

在本发明的一种实施方式中，所述微生物菌剂中，植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)LBBE-L1发酵液的添加量为：100μL。

本发明还提供了一种产品，所述产品中含有上述植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)LBBE-L1或植物乳杆菌(Lactiplantibacillusplantarum)LBBE-L1发酵液。

在本发明的一种实施方式中，所述产品中，植物乳杆菌LBBE-L1的浓度至少为：1×10⁸CFU/mL。

在本发明的一种实施方式中，所述产品中，植物乳杆菌LBBE-L1发酵液的添加量至少为：100μL。

在本发明的一种实施方式中，所述产品为食品、药品或化学品。

本发明还提供了一种采用上述植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)LBBE-L1发酵得到的发酵液。

在本发明的一种实施方法中，该发酵液的制备步骤为：将植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)LBBE-L1接种于MRS液体培养基中，于37℃、220rpm下培养18～36h。

在本发明的一种实施方法中，该发酵液的制备方法还包括：将所述发酵液离心，得到上清液。

在本发明的一种实施方法中，所述上清液再经截留分子量为3000的超滤管超滤后得到无菌超滤滤出液。

本发明提供上述植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)LBBE-L1或上述植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)LBBE-L1的发酵液在抑制大肠埃希氏杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、巨大芽孢杆菌和沙雷氏菌活性中的应用。

本发明提供上述植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)LBBE-L1或上述植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)LBBE-L1的发酵液在制备抑制大肠埃希氏杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、巨大芽孢杆菌、沙雷氏菌、恶臭假单胞菌、阴沟肠杆菌、屎肠球菌和弗氏柠檬酸杆菌活性的产品中的应用。

本发明还提供了上述植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)LBBE-L1或植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)LBBE-L1发酵液在食品或饲料领域抑菌方面的应用。

在本发明的一种实施方法中，所述致病菌包括但不限于大肠埃希氏杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、巨大芽孢杆菌、沙雷氏菌、恶臭假单胞菌、阴沟肠杆菌、屎肠球菌和弗氏柠檬酸杆菌。

本发明还提供了上述植物乳杆菌LBBE-L1或植物乳杆菌LBBE-L1发酵液在制备抑菌产品中的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述产品为食品、药品或化学品。

本发明还提供了一种抑制致病菌的方法，所述方法是将所述植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)LBBE-L1或植物乳杆菌(Lactiplantibacillusplantarum)LBBE-L1发酵液添加至含致病菌的体系中，，所述方法不以疾病的诊断和治疗为目的。

在本发明的一种实施方法中，所述致病菌包括但不限于大肠埃希氏杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、巨大芽孢杆菌、沙雷氏菌、恶臭假单胞菌、阴沟肠杆菌、屎肠球菌、弗氏柠檬酸杆菌。

本发明还提供了上述植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)LBBE-L1在制备防腐剂中的应用。

有益效果

(1)本发明从东北酸菜中分离出植物乳杆菌LBBE-L1，该菌株具有明显抑制致病菌如大肠埃希氏杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、巨大芽孢杆菌、沙雷氏菌、恶臭假单胞菌、阴沟肠杆菌、屎肠球菌、弗氏柠檬酸杆菌活性的作用。

(2)经抑菌试验结果表明，植物乳杆菌LBBE-L1的无菌超滤滤出液对9种致病菌(大肠埃希氏杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、巨大芽孢杆菌、沙雷氏菌、恶臭假单胞菌、阴沟肠杆菌、屎肠球菌、弗氏柠檬酸杆菌)的抑菌圈直径均超过15mm，与金霉素对照相比，抑菌率均超过80％。

(3)植物乳杆菌LBBE-L1无菌发酵液经121℃处理30min后对大肠埃希氏杆菌的抑菌圈直径仍有20mm，且能够耐受木瓜蛋白酶和蛋白酶K，具有较好的蛋白酶敏感性。

与现有其他菌株对比，该菌株发酵液排除菌体的影响后与部分菌株发酵液的抑菌效果相比仍较为明显，对包括但不限于9种致病菌具有拮抗作用，且能够耐受121℃30min处理和木瓜蛋白酶和蛋白酶K的处理。

此结果说明，该菌株的产生的抗菌肽对于多种指示菌具有显著拮抗作用且热稳定性较强并具有一定的蛋白酶敏感性，在食品保鲜和防腐方面具有广泛的应用前景。

生物材料保藏

一株植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)LBBE-L1，已于2021年9月18日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：61935，分类命名为Lactiplantibacillus plantarum，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所。

附图说明

图1：植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)LBBE-L1抑制指示菌活性图。

图2：植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)LBBE-L1菌落形态图。

图3：植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)LBBE-L1镜检结果图(×1000)。

图4：植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)LBBE-L1 121℃处理抑菌效果图。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明进行进一步的阐述。

下述实施例中所涉及的大肠埃希氏杆菌指示剂、金黄色葡萄球菌指示剂、沙门氏菌指示剂、巨大芽孢杆菌指示剂购自武汉工控工业技术研究院有限公司。

下述实施例中所涉及的沙雷氏菌指示剂、恶臭假单胞菌指示剂、阴沟肠杆菌指示剂、屎肠球菌指示剂、弗氏柠檬酸杆菌指示剂筛选于无锡新嘉铵化肥厂泥土，具体的筛选方法为：

取1g土样中加入100mL牛肉膏蛋白胨液体培养基中于37℃、220rpm震荡富集培养12～18h，采用生理盐水将富集培养液进行梯度稀释，稀释后取100μL的10^-4、10^-5和10^-6稀释液涂布于的牛肉膏蛋白胨固体培养基上，每个梯度做三个平行。将涂布后的平板放于培养箱中37℃培养12～18h，挑取单菌落连续在上述相同的培养基上划线纯化2次后使用通用细菌引物27F和1492R扩增菌株16S rRNA基因。

其中通用细菌引物27F序列为5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’，通用细菌引物1492R序列为5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’。使用20μL反应混合物进行PCR，选择Taq DNAPolymerase(Takara公司)酶进行，PCR条件为预变性94℃，5min；扩增阶段35个循环，按照94℃，30s；55℃，30s；72℃，1min，40s进行，得到PCR产物。将所得到的PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分析并送上海Songon公司进行测序。使用BLAST在NCBI数据库中将序列与先前发布的细菌16S rRNA序列比对。

沙雷氏菌的16S rRNA如SEQ ID NO.2所示，恶臭假单胞菌的16S rRNA如SEQ IDNO.3所示，阴沟肠杆菌的16S rRNA如SEQ ID NO.4所示，屎肠球菌的16S rRNA如SEQ IDNO.5所示，弗氏柠檬酸杆菌的16S rRNA如SEQ ID NO.6所示，使用BLAST在NCBI数据库中将序列与上述细菌16S rRNA序列比对，其命名无误。

下列实施例中金霉素、胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K及木瓜蛋白酶购自上海甘薇生物科技有限公司。

下述实施例中所涉及的检测方法如下：

验证菌株抑菌活性方法：

(1)植物乳杆菌发酵液的制备：

植物乳杆菌以1‰(v/v)的接种量接种于MRS液体培养基中，在37℃、220rpm培养18～36h，发酵液于10000rpm、20min离心收集发酵上清液，并使用截留分子量为3000的超滤管超滤发酵上清液，收集超滤滤出液。

指示菌培养液的制备：

指示菌大肠埃希氏杆菌以1‰(v/v)接种量接种于LB液体培养基中，37℃、220rpm培养8～12h。

指示菌金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、巨大芽孢杆菌、恶臭假单胞菌、阴沟肠杆菌、屎肠球菌及弗氏柠檬酸杆菌以1‰(v/v)接种量接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，37℃、220rpm培养8～12h。

指示菌沙雷氏菌以1‰(v/v)接种量接种于PDA液体培养基中，30℃、220rpm培养18～36h。

(2)分别在培养皿倒一层5mL的固体培养基于底部，待凝固后，在平板上依次摆放4个灭菌过的牛津杯；

其中，指示菌大肠埃希氏杆菌的固体培养基为：LB固体培养基；指示菌金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、巨大芽孢杆菌、恶臭假单胞菌、阴沟肠杆菌、屎肠球菌及弗氏柠檬酸杆菌的固体培养基为：牛肉膏蛋白胨固体培养基；指示菌沙雷氏菌的固体培养基为：PDA琼脂培养基。

(3)待下层固体培养基温度降至55～60℃后，分别按照1‰(v/v)的接种量接种步骤(1)中指示菌培养液，分别倒10mL固体培养基作为上层，待凝固后，取出牛津杯，标记孔位。

(4)取100μL步骤(1)中超滤滤出液加入孔位中。在4℃冰箱中放置2h扩散后，平板正放于37℃恒温培养箱培养8～12h。通过测量抑菌圈直径验证植物乳杆菌LBBE-L1在抑菌中的应用。

下述实施例中所涉及的培养基如下：

MRS液体培养基：蛋白胨(英国Oxoid公司)10g/L、牛肉浸粉5g/L、酵母粉(Oxoid)4g/L、葡萄糖20g/L、磷酸氢二钾2g/L、柠檬酸三铵2g/L、醋酸钠5g/L、硫酸镁0.2g/L、硫酸锰0.05g/L、吐温80 1g/L。

MRS固体培养基：在MRS液体培养基的基础上，添加15g/L琼脂。

LB液体培养基：蛋白胨(英国Oxoid公司)10g/L、酵母粉(Oxoid)5g/L、氯化钠10g/L。

LB固体培养基：蛋白胨(英国Oxoid公司)10g/L、酵母粉(Oxoid)5g/L、氯化钠10g/L，琼脂15g/L。

PDA液体培养基：马铃薯浸出粉6g/L、葡萄糖20g/L。

PDA琼脂培养基：在PDA液体培养基的基础上，添加15g/L琼脂。

牛肉膏蛋白胨液体培养基：牛肉膏3g/L、蛋白胨(英国Oxoid公司)10g/L、氯化钠5g/L。

牛肉膏蛋白胨固体培养基：牛肉膏3g/L、蛋白胨(英国Oxoid公司)10g/L、氯化钠5g/L，琼脂15g/L。

实施例1：植物乳杆菌Lactiplantibacillus plantarum LBBE-L1菌株分离、筛选、鉴定

1、菌株的分离

取东北酸菜样品液体100μL加入MRS液体培养基中于37℃、220rpm震荡富集培养18～36h，采用生理盐水将富集培养液进行梯度稀释，稀释后取100μL的10^-4、10^-5和10^-6稀释液涂布于的MRS固体培养基上，每个梯度做三个平行。将涂布后的平板放于培养箱中37℃培养18～36h，挑取单菌落连续在上述相同的培养基上划线纯化2次后用于后期筛选对大肠埃希氏杆菌具有抑菌效果的菌株。

2、菌株的筛选

具体步骤如下：

(1)挑选菌株单菌落，接种于MRS液体培养基中37℃、220rpm培养18～36h。指示菌大肠埃希氏杆菌以1‰(v/v)接种量接种于LB液体培养基中，37℃、220rpm培养8～12h。

(2)用96深孔板进行培养,每孔加入800μL灭菌后的MRS液体培养基和20μL步骤(1)中所述单菌落培养液，于37℃、220rpm培养18～36h。在培养过程中为防止各孔间的交叉污染，使用96孔板专用封膜，将其盖好，置于孔板震荡摇床中培养。

(3)培养后的孔板置于孔板离心机中4000rpm离心15min，得到的发酵上清液待共培养使用。

(4)取一96平底浅孔板，共培养菌液孔每孔加入178μL灭菌后的LB液体培养基、20μL步骤(3)中所得发酵上清液和2μL步骤(1)中得到的指示菌大肠埃希氏杆菌培养液；空白孔为每孔加入178μL灭菌后的LB液体培养基、20μL MRS液体培养基和2μL步骤(1)中得到的指示菌大肠埃希氏杆菌培养液；对照孔为空白孔为每孔加入180μL灭菌后的LB液体培养基、20μL步骤(3)中所得发酵上清液。设置4个平行，于37℃恒温培养箱中静置培养8～10h。利用酶标仪在600nm波长处测定吸光度。

(5)通过计算抑菌率筛选抑菌效果好的菌株。

抑菌率(％)＝(对照孔OD值+空白孔OD值-共培养菌液孔OD值)×100％

空白孔OD值+对照孔OD值

抑菌率结果如表1，菌株对大肠埃希氏杆菌的抑菌率达到了88.56％。

表1植物乳杆菌LBBE-L1抑菌率计算

3、菌株的鉴定

具体步骤如下：

(1)对步骤2中得到的菌株使用通用细菌引物27F和1492R扩增菌株16S rRNA基因。其中通用细菌引物27F序列为5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’，通用细菌引物1492R序列为5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’。

(2)使用20μL反应混合物进行PCR，选择Taq DNA Polymerase(Takara公司)酶进行，PCR条件为预变性94℃，5min；扩增阶段35个循环，按照94℃，30s；55℃，30s；72℃，1min，40s进行，得到PCR产物。

(3)将步骤(2)得到的PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分析并送上海Songon公司进行测序。

(4)使用BLAST在NCBI数据库中将序列与先前发布的细菌16S rRNA序列比对，同源度为99.93％，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述菌株在MRS固体培养基中，其菌落特征为：菌落直径为1～2mm，乳白色、表面光滑湿润、液滴状、圆形、隆起、边缘整齐，如图2、图3所示。

(5)经鉴定，菌株为植物乳杆菌，属于乳杆菌属，并被保藏于广东省菌种保藏中心，保藏号为GDMCC No：61935，将其命名为植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)LBBE-L1。

实施例2：植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)LBBE-L1菌株在抑菌中的应用

具体步骤如下：

(1)植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)LBBE-L1发酵液的制备

挑选实施例1得到菌株单菌落，接种于MRS液体培养基中，在37℃、220rpm条件下，培养18～36h，制备得到种子液；

将制备得到的种子液以1‰(v/v)的接种量，接种于MRS液体培养基中，在37℃、220rpm培养18～36h，制备得到发酵液；

将制备得到的发酵液于10000rpm、20min离心收集发酵上清液，并使用截留分子量为3000的超滤管超滤发酵上清液，收集超滤滤出液；制备得到不含有菌体的植物乳杆菌LBBE-L1发酵液。

(2)指示菌培养液的制备

将指示菌大肠埃希氏杆菌以1‰(v/v)的接种量接种于LB液体培养基中，37℃、220rpm培养8～12h，菌浓为：1×10⁸CFU/mL。

分别将指示菌金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、巨大芽孢杆菌、恶臭假单胞菌、阴沟肠杆菌、屎肠球菌及弗氏柠檬酸杆菌以1‰(v/v)的接种量接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，37℃、220rpm培养8～12h；指示菌金黄色葡萄球菌的菌浓为：1×10⁸CFU/mL，沙门氏菌的菌浓为：1×10⁸CFU/mL，巨大芽孢杆菌的菌浓为：1×10⁸CFU/mL。

将指示菌沙雷氏菌以1‰(v/v)的接种量接种于PDA液体培养基中，30℃、220rpm培养18～36h，菌浓为：1×10⁸CFU/mL。

(3)植物乳杆菌LBBE-L1的抑菌实验

1)分别在培养皿倒一层5mL的固体培养基于底部，待凝固后，在平板上依次摆放4个灭菌过的牛津杯；

其中，指示菌大肠埃希氏杆菌的固体培养基为：LB固体培养基；指示菌金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、巨大芽孢杆菌、恶臭假单胞菌、阴沟肠杆菌、屎肠球菌及弗氏柠檬酸杆菌的固体培养基为：牛肉膏蛋白胨固体培养基；指示菌沙雷氏菌的固体培养基为：PDA琼脂培养基。

2)待下层固体培养基温度降至55～60℃后，分别按照1‰(v/v)的接种量接种步骤(2)得到的指示菌培养液至各自培养基中，分别倒10mL各个指示菌的固体培养基作为上层，待凝固后，取出牛津杯，标记孔位。

3)取100μL上述步骤(1)制备得到的植物乳杆菌(Lactiplantibacillusplantarum)LBBE-L1发酵液分别加入到步骤2)的指示菌的孔位中。

对照：按照步骤1)～2)的方法制备得到含有不同指示菌剂的孔位，分别向含有指示菌的孔位中添加75ppm的金霉素。

将上述添加了植物乳杆菌或金霉素的不同指示菌剂的孔板在4℃冰箱中放置2h扩散后，分别进行培养：将指示菌为大肠埃希氏杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、巨大芽孢杆菌、恶臭假单胞菌、阴沟肠杆菌、屎肠球菌及弗氏柠檬酸杆菌的平板正放于37℃恒温培养箱培养8～12h；

将指示菌为沙雷氏菌的平板正放置于30℃恒温培养箱培养18～36h。

通过测量抑菌圈直径验证植物乳杆菌LBBE-L1在抑菌活性中的应用，结果如表2及图1所示.

表2：植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)LBBE-L1的抑菌效果

结果显示，采用本发明提供的菌株的发酵液对大肠埃希氏杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、巨大芽孢杆菌及沙雷氏菌的抑菌圈直径均大于15mm，属于对指示菌高敏感，说明本发明中的菌株所产的抗菌肽具有高效广谱的抑菌活性。

实施例3：植物乳杆菌Lactiplantibacillus plantarum LBBE-L1菌株无菌发酵液的蛋白酶敏感性与温度敏感性实验

具体步骤如下：

(1)植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)LBBE-L1无菌发酵液的制备

挑选实施例1得到菌株单菌落，接种于MRS液体培养基中，在37℃、220rpm条件下，培养18～36h，制备得到种子液；

将制备得到的种子液以1‰(v/v)的接种量接种于MRS液体培养基中，在37℃、220rpm培养18～36h，制备得到发酵液；

将制备得到的发酵液于10000rpm、20min离心收集发酵上清液，并使用0.22μm的滤膜过滤除菌，制备得到无菌发酵液。

热处理步骤：

将制备得到的无菌发酵液分别于37℃、60℃、70℃、100℃和121℃处理30min后待验证抑菌效果，制备得到不同温度处理后的无菌发酵液。

酶处理步骤：

将制备得到的无菌发酵液分别加入胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K和木瓜蛋白酶，各蛋白酶按照终浓度为1.0mg/mL的标准添加，用2mol/L HCl和2mol/L NaOH分别调节至各酶液最适pH值(依次7.4、2.0、7.4和6.0)，37℃恒温水浴反应4h。处理完成后将pH值调节至无菌发酵液原始值(pH 4.0)再用0.22μm的滤膜过滤除菌，分别制备得到不同蛋白酶处理后的无菌发酵液。

(2)指示菌的培养

指示菌大肠埃希氏杆菌以1‰(v/v)的接种量接种于LB液体培养基中，37℃、220rpm培养8～12h，菌浓为：1×10⁸CFU/mL。

(3)植物乳杆菌LBBE-L1的蛋白酶敏感性实验

1)首先在培养皿倒一层5mL的LB固体培养基于底部，待凝固后，在平板上依次摆放4个灭菌过的牛津杯。

2)待下层固体培养基温度约为55～60℃后，加入步骤(2)中制备得到的大肠埃希氏杆菌指示菌培养液，倒10mL LB固体培养基作为上层，待凝固后，取出牛津杯，标记孔位。

3)取100μL步骤(1)中制备得到的植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)LBBE-L1不同蛋白酶处理后的无菌发酵液分别加入到步骤2)的指示菌的孔位中。在4℃冰箱中放置2h扩散后，分别进行培养：

将指示菌为大肠埃希氏杆菌的平板正放于37℃恒温培养箱培养8～12h。

通过测量抑菌圈直径验证植物乳杆菌LBBE-L1无菌发酵液对胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K和木瓜蛋白酶的敏感性，结果如表3及图4所示。

表3：不同蛋白酶处理后植物乳杆菌LBBE-L1无菌发酵液的抗菌性能

结果显示，采用本发明提供的菌株的无菌发酵液经胃蛋白酶和胰蛋白酶处理后失去对大肠埃希氏杆菌的抑菌效果，说明本发明的植物乳杆菌所产抑菌物质为抗菌肽，且对蛋白酶K和木瓜蛋白酶不敏感。

(4)具体实施方式同步骤(1)～(3)，区别在于，将步骤(3)中的3)取100μL步骤(1)中制备得到的植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)LBBE-L1不同蛋白酶处理后的无菌发酵液调整为：步骤(1)中不同温度处理后的无菌发酵液，通过测量抑菌圈直径验证植物乳杆菌LBBE-L1无菌发酵液对温度的敏感性，结果如表4及图4所示。

表4：不同温度处理后植物乳杆菌LBBE-L1无菌发酵液的抗菌性能

温度(℃)	37	60	70	100	121
						抑菌圈直径(mm)	23.50	21.12	21.08	18.24	21.22

结果如图4所示，采用本发明提供的菌株的无菌发酵液经不同温度处理后对大肠埃希氏杆菌的抑菌圈直径均超过20mm，说明本发明的植物乳杆菌所产抗菌肽对温度敏感性较低，较为耐热。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一株可产具有广谱抑菌活性抗菌肽的植物乳杆菌

<130> BAA211323A

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1472

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gcgggttggg ggggtgctat acatgcagtc gaacgaactc tggtattgat tggtgcttgc 60

atcatgattt acatttgagt gagtggcgaa ctggtgagta acacgtggga aacctgccca 120

gaagcggggg ataacacctg gaaacagatg ctaataccgc ataacaactt ggaccgcatg 180

gtccgagttt gaaagatggc ttcggctatc acttttggat ggtcccgcgg cgtattagct 240

agatggtgag gtaacggctc accatggcaa tgatacgtag ccgacctgag agggtaatcg 300

gccacattgg gactgagaca cggcccaaac tcctacggga ggcagcagta gggaatcttc 360

cacaatggac gaaagtctga tggagcaacg ccgcgtgagt gaagaagggt ttcggctcgt 420

aaaactctgt tgttaaagaa gaacatatct gagagtaact gttcaggtat tgacggtatt 480

taaccagaaa gccacggcta actacgtgcc agcagccgcg gtaatacgta ggtggcaagc 540

gttgtccgga tttattgggc gtaaagcgag cgcaggcggt tttttaagtc tgatgtgaaa 600

gccttcggct caaccgaaga agtgcatcgg aaactgggaa acttgagtgc agaagaggac 660

agtggaactc catgtgtagc ggtgaaatgc gtagatatat ggaagaacac cagtggcgaa 720

ggcggctgtc tggtctgtaa ctgacgctga ggctcgaaag tatgggtagc aaacaggatt 780

agataccctg gtagtccata ccgtaaacga tgaatgctaa gtgttggagg gtttccgccc 840

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actcaaagga attgacgggg gcccgcacaa gcggtggagc atgtggttta attcgaagct 960

acgcgaagaa ccttaccagg tcttgacata ctatgcaaat ctaagagatt agacgttccc 1020

ttcggggaca tggatacagg tggtgcatgg ttgtcgtcag ctcgtgtcgt gagatgttgg 1080

gttaagtccc gcaacgagcg caacccttat tatcagttgc cagcattaag ttgggcactc 1140

tggtgagact gccggtgaca aaccggagga aggtggggat gacgtcaaat catcatgccc 1200

cttatgacct gggctacaca cgtgctacaa tggatggtac aacgagttgc gaactcgcga 1260

gagtaagcta atctcttaaa gccattctca gttcggattg taggctgcaa ctcgcctaca 1320

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<211> 1367

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

aggggagctt gctccccggg tgacgagcgg cggacgggtg agtaatgtct gggaaactgc 60

ctgatggagg gggataacta ctggaaacgg tagctaatac cgcataacgt cgcaagacca 120

aagaggggga ccttcgggcc tcttgccatc agatgtgccc agatgggatt agctagtagg 180

tggggtaatg gctcacctag gcgacgatcc ctagctggtc tgagaggatg accagccaca 240

ctggaactga gacacggtcc agactcctac gggaggcagc agtggggaat attgcacaat 300

gggcgcaagc ctgatgcagc catgccgcgt gtgtgaagaa ggccttcggg ttgtaaagca 360

ctttcagcga ggaggaaggt ggtgagctta atacgttcat caattgacgt tactcgcaga 420

agaagcaccg gctaactccg tgccagcagc cgcggtaata cggagggtgc aagcgttaat 480

cggaattact gggcgtaaag cgcacgcagg cggtttgtta agtcagatgt gaaatccccg 540

ggctcaacct gggaactgca tttgaaactg gcaagctaga gtctcgtaga ggggggtaga 600

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tgaattgacg ggggcccgca caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgat gcaacgcgaa 900

gaaccttacc tactcttgac atccagagaa ctttccagag atggattggt gccttcggga 960

actctgagac aggtgctgca tggctgtcgt cagctcgtgt tgtgaaatgt tgggttaagt 1020

cccgcaacga gcgcaaccct tatcctttgt tgccagcggt tcggccggga actcaaagga 1080

gactgccagt gataaactgg aggaaggtgg ggatgacgtc aagtcatcat ggcccttacg 1140

agtagggcta cacacgtgct acaatggcgt atacaaagag aagcgacctc gcgagagcaa 1200

gcggacctca taaagtacgt cgtagtccgg attggagtct gcaactcgac tccatgaagt 1260

cggaatcgct agtaatcgta gatcagaatg ctacggtgaa tacgttcccg ggccttgtac 1320

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<210> 3

<211> 1384

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

agactagcta cttctggtgc aacccactcc catggtgtga cgggcggtgt gtacaaggcc 60

cgggaacgta ttcaccgcga cattctgatt cgcgattact agcgattccg acttcacgca 120

gtcgagttgc agactgcgat ccggactacg atcggttttg tgagattagc tccacctcgc 180

ggcttggcaa ccctctgtac cgaccattgt agcacgtgtg tagcccaggc cgtaagggcc 240

atgatgactt gacgtcatcc ccaccttcct ccggtttgtc accggcagtc tccttagagt 300

gcccaccata acgtgctggt aactaaggac aagggttgcg ctcgttacgg gacttaaccc 360

aacatctcac gacacgagct gacgacagcc atgcagcacc tgtgtcagag ttcccgaagg 420

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ctcaaggatt ccaacggcta gttgacatcg tttacggcgt ggactaccag ggtatctaat 660

cctgtttgct ccccacgctt tcgcacctca gtgtcagtat cagtccaggt ggtcgccttc 720

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cacatccaac ttaacaaacc acctacgcgc gctttacgcc cagtaattcc gattaacgct 900

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<400> 4

catgcagtcg aacggtagca cagagagctt gctctcgggt gacgagtggc ggacgggtga 60

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gatgggatta gctagtaggt ggggtaacgg ctcacctagg cgacgatccc tagctggtct 240

gagaggatga ccagccacac tggaactgag acacggtcca gactcctacg ggaggcagca 300

gtggggaata ttgcacaatg ggcgcaagcc tgatgcagcc atgccgcgtg tatgaagaag 360

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taattcgatg caacgcgaag aaccttacct actcttgaca tccagagaac tttccagaga 960

tggattggtg ccttcgggaa ctctgagaca ggtgctgcat ggctgtcgtc agctcgtgtt 1020

gtgaaatgtt gggttaagtc ccgcaacgag cgcaaccctt atcctttgtt gccagcggtc 1080

cggccgggaa ctcaaaggag actgccagtg ataaactgga ggaaggtggg gatgacgtca 1140

agtcatcatg gcccttacga gtagggctac acacgtgcta caatggcgca tacaaagaga 1200

agcgaactcg cgagagcaag cggacctcat aaagtgcgtc gtagtccgga ttggagtctg 1260

caactcgact ccatgaagtc ggaatcgcta gtaatcgtag atcagaatgc tacggtgaat 1320

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<210> 5

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<213> 人工序列

<400> 5

gacaaggtta cctcaccgac ttcgcggtgt tacaaactct cgtggtgtga cgggcggtgt 60

gtacaaggcc cgggaacgta ttcaccgcgg cgtgctgatc cgcgattact agcgattccg 120

gcttcatgca ggcgagttgc agcctgcaat ccgaactgag agaagcttta agagattagc 180

ttagcctcgc gacttcgcaa ctcgttgtac ttcccattgt agcacgtgtg tagcccaggt 240

cataaggggc atgatgattt gacgtcatcc ccaccttcct ccggtttgtc accggcagtc 300

ttgctagagt gcccaactga atgatggcaa ctaacaataa gggttgcgct cgttgcggga 360

cttaacccaa catctcacga cacgagctga cgacaaccat gcaccacctg tcactttgcc 420

cccgaagggg aagctctatc tctagagtgg tcaaaggatg tcaagacctg gtaaggttct 480

tcgcgttgct tcgaattaaa ccacatgctc caccgcttgt gcgggccccc gtcaattcct 540

ttgagtttca accttgcggt cgtactcccc aggcggagtg cttaatgcgt tagctgcagc 600

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gtatctaatc ctgtttgctc cccacgcttt cgagcctcag cgtcagttac agaccagaga 720

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tccactctcc tcttctgcac tcaagtctcc cagtttccaa tgaccctccc cggttgagcc 840

gggggctttc acatcagact taagaaaccg cctgcgctcg ctttacgccc aataaatccg 900

gacaacgctt gccacctacg tattaccgcg gctgctggca cgtagttagc cgtggctttc 960

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attgccgaag attccctact gctgcctccc gtaggagttt gggccgtgtc tcagtcccaa 1140

tgtggccgat caccctctca ggtcggctat gcatcgtggc cttggtgagc cgttacctca 1200

ccaactagct aatgcaccgc gggtccatcc atcagcgaca cccgaaagcg cctttcaaat 1260

caaaaccatg cggtttcgat tgttatacgg tattagcacc tgtttccaag tgttatcccc 1320

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gtaatgtctg ggaaactgcc cgatggaggg ggataactac tggaaacggt agctaatacc 120

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cggccgggaa ctcaaaggag actgccagtg ataaactgga ggaaggtggg gatgacgtca 1140

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agcgacctcg cgagagcaag cggacctcat aaagtatgtc gtagtccgga ttggagtctg 1260

caactcgact ccatgaagtc ggaatcgcta gtaatcgtgg atcagaatgc cacggtgaat 1320

acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt cacaccatgg gagtgggttg caaaagaagt 1380

aggtagctta accttcggga gcac 1404

Claims (10)

1.一株植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)LBBE-L1，已于2021年9月18日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：61935。

2.含有权利要求1所述植物乳杆菌LBBE-L1或植物乳杆菌LBBE-L1发酵液的微生物菌剂。

3.一种产品，其特征在于，所述产品中含有权利要求1所述的植物乳杆菌LBBE-L1或植物乳杆菌LBBE-L1的发酵液。

4.根据权利要求3所述的产品，其特征在于，所述产品中，植物乳杆菌LBBE-L1的浓度至少为：1×10⁸CFU/mL。

5.根据权利要求3或4所述的产品，其特征在于，所述产品为食品、药品或化学品。

6.权利要求1所述的植物乳杆菌LBBE-L1或植物乳杆菌LBBE-L1发酵液在制备抑菌产品中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述产品为食品、药品或化学品。

8.一种抑制致病菌的方法，其特征在于，所述方法是将所述植物乳杆菌LBBE-L1或植物乳杆菌LBBE-L1发酵液添加至含致病菌的体系中，所述方法不以疾病的诊断和治疗为目的。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述致病菌包括但不限于大肠埃希氏杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、巨大芽孢杆菌、沙雷氏菌、恶臭假单胞菌、阴沟肠杆菌、屎肠球菌、弗氏柠檬酸杆菌。

10.权利要求1所述的植物乳杆菌LBBE-L1或其发酵液在制备防腐剂中的应用。

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