KR101396187B1 - 면역력 증강을 위한 복합미생물을 이용한 복숭아, 커피 및 홍삼 발효 혼합물 및 그 제조방법 - Google Patents
면역력 증강을 위한 복합미생물을 이용한 복숭아, 커피 및 홍삼 발효 혼합물 및 그 제조방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 복합미생물을 이용한 복숭아, 커피, 홍삼 발효 혼합물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 각각의 단일미생물을 배양하고, 미생물과 커피를 발효한 커피발효액, 복합미생물 배양액과 인삼을 발효한 홍삼발효액을 희석하여 소화 흡수력이 향상되고, 장내미생물의 증식효과와 면역력 증강에도 도움이 되는 복합미생물을 이용한 복숭아, 커피, 홍삼 발효 혼합물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
복합미생물 배양액을 이용하여 기능성 음료를 제조함으로써 복숭아와 커피, 홍삼의 향미와 맛을 다양화시켜 소비자의 다양한 기호를 충족시킬 수 있고, 혼합 재료들을 발효함으로써 소화 흡수력이 향상되고 나아가 장내미생물의 증식효과와 면역력 증강에도 도움이 된다.
복합미생물 배양액을 이용하여 기능성 음료를 제조함으로써 복숭아와 커피, 홍삼의 향미와 맛을 다양화시켜 소비자의 다양한 기호를 충족시킬 수 있고, 혼합 재료들을 발효함으로써 소화 흡수력이 향상되고 나아가 장내미생물의 증식효과와 면역력 증강에도 도움이 된다.
Description
본 발명은 면역력 개선을 위한 복합미생물을 이용한 복숭아, 커피 및 홍삼 발효 혼합물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 배양된 복합미생물을 이용하여 커피를 발효한 복숭아 발효액, 커피발효액 및 홍삼발효액을 혼합하여 소화 흡수력이 향상되고, 장내미생물의 증식효과와 면역력 증강에도 도움이 되는 발효 혼합물 및 그 제조방법에 관한 것이다.
복숭아는 비타민 A와 C, 펙틴질이 풍부한 알칼리성 식품이다. 복숭아는 식이섬유를 다량 함유하고 있어 장을 윤활하게 하여 배변을 촉진함으로써 노인성 변비나 관상동맥경화에 효과적이고, 다량의 단백질과 아미노산을 함유하고 있어 건강식품으로도 좋다. 또한 복숭아는 속이 답답할 때 먹으면 좋고 새로운 혈액을 원활하게 순환시켜 어혈이나 체열을 제거시켜준다. 그래서 장기간 복용하면 안색이 좋아지고 건강해진다. 또한 식욕증진, 피로회복, 혈액순환, 면역기능 강화에 도움이 되며, 대장암 예방효과가 있다고 한다.
복숭아씨는 어혈치료, 타박상치료, 변비치료에 좋다고 알려져 있다. 특히 복숭아 속씨는 기침, 해소천식에 효과가 좋으며, 생리통, 축혈증, 산후복통, 변비, 타박상, 종기 등에도 좋은 것으로 알려져 있다.
커피는 오늘날 전 세계무역품 중 석유에 이어 두 번째로 많은 물량의 규모로 세계 인구의 약 70~80%가 커피를 마시고 있다. 우리나라의 커피 시장은 2011년에 약 2조 8000억 원으로 이중 40%는 인스턴트커피로 간편성과 보편성 때문에 한국의 커피시장을 주도하며 양적, 질적으로 꾸준한 성장을 이루고 있다.
커피 원두는 수분, 회분, 지방, 섬유질, 당분, 타닌, 카페인 등의 성분을 함유하고 있다. 이러한 커피는 자극제로, 신경계통에 작용해 정신의 활동력과 지각을 활발하게 만들어 사고를 한층 명료하게 하고, 이뇨작용을 도와 위장활동을 촉진시키는 효과가 있다. 또한 커피 속의 마그네슘 성분은 당뇨병의 억제에 도움이 되며 잠을 쫓는 각성효과 외에 학습능력 향상, 다이어트, 운동능력 제고, 숙취방지 및 해소, 암 냄새 제거, 동백경화 억제 등에 효과가 있는 것으로 보고되고 있다.
인삼은 오가피나무과 인삼 속에 속하는 다년생 초본류로서 한방에서는 그 뿌리를 주로 이용하고 있는 대표적인 약용작물 중에 하나이다. 그 중에서도 고려인삼, 즉 국내에서 재배되는 인삼의 경우 중국, 일본, 미국 등에서 생산되는 인삼에 비해 그 약효가 훨씬 뛰어난 것으로 잘 알려져 있다.
홍삼은 수삼(땅에서 캐어내 말리지 않은 상태의 인삼)을 증숙한 후 건조하여 제조한 것으로, 열을 가하기 때문에 입체적인 화학변화를 받아 수삼 표피의 색이 붉게 되기 때문에 홍삼이라 불린다. 이러한 증숙 과정을 거친 홍삼은 수삼에서는 발견되지 않은 특유성분인 3-hydroxy-2-methyl-4-pyrone(Maltol)이 생성된다. 홍삼 사포닌 중 ginsenoside Rb1 은 진정작용, 용혈방어작용, 중추신경억제, 해열진통, 간 기능 보호 기능이 있으며, 지각신경절에서 신경성장 인자의 신경돌기 성장을 촉진한다고 한다. 또한 ginsenoside Rg1 에는 피로회복 촉진작용, 학습기능개선, 항피로 작용을 하고 있으며, ginsenoside Rb2, Re, Rg1은 항당뇨, 항동백경화, 간세포 증식, 골수세포 합성 촉진작용, 단백생합성, 지질생합성을 촉진시킨다고 보고되어 있다.
홍삼 제조 시 수삼으로부터 인삼의 유기산을 촉매로 하여 홍삼의 생리활성물질이 생성되고 이들이 약리 및 효능 작용을 가지게 된다.
생리활성물질로 인한 홍삼의 효능은 항우울, 항불안 및 스트레스를 방어해주는 항정신작용이 있으며, 홍삼의 사포닌이 뇌허혈에 수반하는 신경세포의 손상과 학습행동 장애의 예방적 효과, 면역증강 효과, 혈당강하 작용, 독성물질 해독작용, 콜레스테롤 대사 개선작용 등에 효과가 있으며 골다공증에 대한 예방효과, 항스트레스 및 항피로작용 등이 있는 것으로 보고되고 있다.
홍삼발효액은 복합미생물 배양액을 이용한 발효를 통해 특정성분을 강화시키고 유효성분을 저분화하여 소화흡수성을 증강시킨 가공인삼으로 최근 들어 음료로 주목받고 있다.
인삼을 이용한 기능성 음료에 대한 종래기술로서 특허문헌 1에 인삼박, 인삼 페이스트, 인삼 효소처리 등의 과정을 거쳐 인삼 식이섬유와 인삼 올리고당을 발효유 또는 음료에 첨가한 다음, 살균하고 균질화하여 기능성 음료를 제조하는 방법이 제시되어 있다.
발효 혼합물에 대한 종래기술로서 특허문헌 2에 천연 식물성 소재나 한약재를 누룩 및 유산균을 이용하여 발효시킴으로써 별도의 탄소원 첨가 없이도 유산균 발효 효율을 높일 수 있어 항노화, 항암, 항염, 면역 개선 등의 효능을 갖는 약학 조성물, 화장품 조성물 및 식품 조성물 조성물에 관한 것이다. 또한 특허문헌 3에는 생약류와 곡류/도류/조류를 포함하는 생약혼합물을 발효하는 제조방법에 관한 것으로, 생약의 섬유질과 생리활성물질의 유효성분을 식품으로 효과적으로 이용할 수 있도록 하는 것이다.
본 발명은 복합미생물을 이용한 복숭아, 커피, 홍삼 발효 혼합물을 제공하는 것으로서, 유산균, 효모균, 납두균, 고초균, 아세트산균, 광합성세균 등의 미생물 배양액과 복숭아, 커피, 홍삼을 각각 발효하여 혼합하는 복숭아, 커피, 홍삼 발효 혼합물 및 그 제조방법을 제공하고자 한다.
본 발명의 다른 목적은 복합미생물 배양액을 이용하여 복숭아와 커피, 홍삼의 향미와 맛을 다양화시켜 소비자의 다양한 기호를 충족시키도록 기능성 음료를 제공함에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 복합미생물 배양액, 복숭아, 커피, 홍삼을 발효함으로써 소화 흡수력이 향상되고 장내미생물의 증식효과와 면역력 증강에도 도움이 되는 기능성 음료를 제공함에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 약품, 식품, 건강식품, 화장품, 기능성음료, 음료의 원료를 제공함에 있다.
상기 해결하고자 하는 과제를 위한 본 발명에 따른 복합미생물을 이용한 복숭아, 커피, 홍삼 발효 혼합물 제조방법은,
유산균, 효모균, 납두균, 아세트산균, 광합성 세균을 각각 따로 배양하는 제1 단계;
복숭아 추출액에 상기 제1 단계에서 배양된 유산균 0.1~50 중량%, 효모균 0.1~50 중량%, 납두균 0.1~50 중량% 및 광합성세균+효모균을 0.01~20 중량%로 혼합한 복합미생물 0.1~ 5 중량% 및 설탕 0.1~ 10 중량%를 넣고 발효하는 제2 단계;
커피 추출액에 상기 제1 단계에서 배양된 유산균 5~30 중량%, 효모균 5~30 중량%, 광합성세균 5~30 중량%, 납두균 1~20 중량%, 아세트산균 1~20 중량%로 혼합한 복합미생물 0.1~ 5 중량% 및 설탕 0.1~ 10 중량%를 넣고 발효하는 제3 단계;
홍삼발효액을 제조하는 제4 단계; 및
상기 제2 단계에서 제조된 복숭아발효액, 상기 제3 단계에서 제조된 커피발효액 및 상기 제4 단계에서 제조된 홍삼발효액을 혼합하는 제5 단계를 포함한다.
본 발명의 바람직한 실시예로서, 상기 제4 단계의 홍삼발효액의 제조는,
인삼을 한약발효기에 넣고 상기 제1 단계에서 배양된 유산균 5~30 중량%, 효모균 5~30 중량%, 광합성세균 5~30 중량%, 납두균 1~20 중량% 및 아세트산균 1~20 중량%로 혼합한 복합미생물 0.1~10중량%을 넣고 35℃에서 24시간 발효하는 제4-1 단계;
발효 후 온도를 높이어 90℃에서 30~40분 동안 증삼하는 제4-2 단계;
증삼 후 -25℃에서 15분간 냉건조하는 제4-3 단계;
냉건조 후 30℃에서 4시간 온건조하는 제4-4 단계;
상기 온건조 한 인삼에 상기 제1 단계에서 배양된 유산균 5~40 중량%, 효모균 5~40 중량%, 광합성세균 1~30 중량%로 혼합한 복합미생물 0.1~10중량%을 넣고 32℃에서 24시간 발효하는 제4-5 단계;
상기 제4-5단계 후 후 온도를 높이어 90℃에서 20~30분 동안 증삼하는 제4-6 단계;
증삼 후 -25℃에서 6시간 냉건조 하는 제4-7 단계;
냉건조 후 30℃에서 4시간 온건조 하는 제4-8 단계를 통해 홍삼발효액을 제조하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 바람직한 실시예로서, 상기 광합성세균+효모균은 광합성세균과 효모균을 1:1로 혼합하는 제1-1 단계;
25~35℃에서 7일 동안 배양하는 제1-2 단계;
배지 공급 없이 30일 동안 휴면상태로 만드는 제1-3 단계를 포함한다.
본 발명의 바람직한 실시예로서, 상기 복숭아 추출액은 복숭아, 정제수 또는 미네랄워터를 1:1~4로 혼합하고, 밀폐가온식 추출용기에서 10시간 동안 가온 가압하여 추출하고, 여과하여 살균 처리하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 바람직한 실시예로서, 상기 커피발효액은 커피의 생두를 121℃에서 30분 동안 가열하여 멸균 처리한 커피 추출액을 제조하는 제3-1 단계 및
상기 제1 단계에서 배양된 유산균 5~30 중량%, 효모균 5~30 중량%, 광합성세균 5~30 중량%, 납두균 1~20 중량%, 아세트산균 1~20 중량%로 혼합한 복합미생물 0.1~ 5 중량% 및 설탕 0.1~ 10 중량%를 넣고 35℃에서 24시간 동안 발효시키는 제3-2 단계를 포함한다.
본 발명의 다른 실시예로서, 복숭아발효액, 커피발효액 및 홍삼발효액을 2:1:1 부피비로 혼합한 기능성 음료를 특징으로 한다.
본 발명에 따른 발효 혼합물은 복합미생물 배양액을 이용하여 기능성 음료를 제조함으로써 복숭아와 커피, 홍삼의 향미와 맛을 다양화시켜 소비자의 다양한 기호를 충족시킬 수 있다.
또한 혼합 재료들을 발효함으로써 소화 흡수력이 향상되고 나아가 장내미생물의 증시효과와 면역력 증강에도 도움이 된다.
도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 NO(nitric oxide) 실험결과이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따른 TNF-α assay 실험결과이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따른 TNF-α assay 실험결과이다.
이하, 본 발명은 실시예에 의거하여 구체적으로 설명하겠는 바, 다음 실시예에 의하여 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 복합미생물을 이용한 복숭아발효액, 커피발효액, 홍삼발효액을 혼합한 혼합물 제조방법에 관한 것이다. 이에 사용되는 미생물은 복합미생물 배양액으로, 배양방법은 먹이원으로 설탕 또는 당밀로 하여 각각의 균들을 따로 배양한 후 이 배양액들을 혼합하여 복합미생물 배양액을 만들어 내게 된다.
단일미생물의 배양
발효를 위한 미생물은 미생물 분양기관으로부터 분양받거나, 상용의 미생물 균주를 구입하여 배양하거나, 전통식품인 김치, 고추장, 된장, 청국장, 메주, 젓갈 등에서 유산균, 효모균, 고초균, 아세트산균, 광합성세균을 추출한다. 구체적으로, 유산균으로는 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei)와 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 효모균으로는 사카로마이세스 세레비시아에(Saccharomyces cerevisiae), 납두균으로는 바실러스 서부틸리스(Bacillus subtilis), 아세트산균으로는 아세토박터 아세티(Acetobacter aceti), 광합성 세균으로 클로로비움(Chlorobium)을 추출한다.
이렇게 추출한 각 균주는 다음의 과정을 거쳐 배양해 둔다.
1. 유산균은 20~35℃에서 설탕 배지에서 3 ~ 7일 동안 배양한 후 45일간 더 이상의 배지를 공급하지 않고 휴면상태로 만든다.
2. 효모균은 30~35℃에서 당밀 배지에서 5 ~ 7일 동안 배양한 후 45일간 더 이상의 배지를 공급하지 않고 휴면상태로 만든다.
3. 납두균은 30~45℃에서 당밀 배지에서 3 ~ 5일 동안 배양한 후 45일간 더 이상의 배지를 공급하지 않고 휴면상태로 만든다.
4. 아세트산균은 20~35℃에서 당밀 배지에서 5 ~ 7일 동안 배양한 후 45일간 더 이상의 배지를 공급하지 않고 휴면상태로 만든다.
5. 광합성세균+효모균은 광합성 세균과 효모균을 1:1로 혼합하여 20~ 40℃에서 당밀 배지에서 1~10일간 배양한 후 45일간 더 이상의 배지를 공급하지 않고 휴면상태로 만든다.
6. 상기 준비된 각각의 미생물 배양액은 유산균 0.1~50 중량%, 효모균 0.1~50 중량%, 납두균 0.1~50 중량%, 광합성세균+효모균 0.01~20 중량%를 혼합하고, 더 이상의 배지의 공급 없이 20~35℃에서 3~4개월 이상 배양한다.
바람직하게는, 상기 광합성세균+효모균은 광합성 세균과 효모균을 1:1로 혼합하여 20~40℃에서 1~10일 동안 배양한 후, 30일 이상 더 이상의 배지의 공급 없이 휴면 상태로 만든다.
실시예 1에서 배양한 각각의 균주들은 콜로니(colony)를 계측하여 미생물 균수를 측정하는데 다음과 배양 과정을 거쳐 동종한다.
1. 1L의 3차 증류수에 37g의 BHI(Brain Heart Infusion Broth)배지를 넣고 저어준다. 이때 연노랑의 색을 띈다. 이와는 별도로 50㎖의 3차 증류수에 0.36g의 환원제(Na2S.7H2O)를 넣고 저어준 후 시료병에 넣는다.
2. 배지가 녹으면 파란색의 레사주린 용액(Resazurin solution)을 넣는다. 그러면 배지와 섞여 붉은 색을 띄게 된다.
3. 모두 섞으면 5개의 120㎖ 시료병에 배지를 49㎖ 씩 분주 한다. 이때 나중에 넣어줄 환원제(Na2S, 7H2O)와 셀 양을 고려하여 넣는다.
4. 질소 가스를 시료병 속 배지에 담가 배지 속의 산소를 넣는다. 이때 1분씩 가스를 주입한다. 산소를 빼낸 후 고무 캡으로 덮고 알루미늄 캡을 씌운다. 준비된 환원제가 들어 있는 시료병도 고무 캡으로 덮고 알루미늄 캡을 씌운다.
5. 100ㅀＣ에서 15분간 오토클레이브 한다.
6. 오토클레이브 후에는 지시약이 녹아 들어가 배지의 색이 붉은 색으로 변하게 된다. 이후부터는 클린벤치(Clean bench)에서 나머지 조작을 수행한다.
7. 10㎖ 주사기를 이용 5㎖의 환원제를 배지에 넣어주고 약 2번 흔들어 섞는다. 시간이 지나면 산화되면서 원래의 배지 색으로 돌아간다.
8. 색이 원래의 배지 색으로 돌아가면 1㎖ 주사기를 이용하여 보관된 균주를 시료병에 주입한다.
9. 질소 가스를 불어 넣어 시료병 안의 공기를 대처한다.
10. 45℃ 인큐베이터에서 1일 배양하고. 2일부터는 33℃에서 3일을 배양한다.
11. 더 이상의 배지를 공급하지 않고 25℃에서 1개월을 배양한다.
복숭아추출물 제조
복숭아의 전체 중량에 대하여 1 ?? 4배의 정제수 혹은 미네랄워터를 첨가하고 밀폐 가온 가압식 추출용기에서 10시간 동안 가온 가압하여 추출하고 여과한 다음 살균 처리하여 복숭아추출물을 얻는다.
복숭아발효액 제조
실시예 1에서 배양해 둔 유산균 5~30 중량%, 효모균 5~30 중량%, 납두균 5~30 중량%, 아세트산균 1~20 중량%, 광합성+효모균 1~20 중량%를 혼합한 복합미생물 배양액 0.1~5 중량%(복숭아추출물 중량대비)를 설탕 0.1~10 중량%(복숭아추출물 중량대비)와 혼합한다. 혼합물을 30~85℃에서 24시간 가열한 후 식혀 32℃로 발효시킨다. 그 후 실시예 2에서 준비한 복숭아추출물에 첨가하여 32℃에서 3일 동안 발효시켜 복숭아발효액을 제조한다.
커피발효액 제조
커피의 생두를 121℃에서 30분 가열하여 멸균하여 식힌다. 여기에 유산균 5~30 중량%, 효모균 5~30 중량%, 광합성세균 5~30 중량%, 납두균 1~20 중량%, 아세트산균 1~20 중량%를 혼합한 복합미생물 배양액 중 0.1~5 중량%(커피 중량대비를 설탕 0.1~10 중량%(커피 중량대비)와 혼합하여 35℃에서 24시간 발효한다.
홍삼발효액 제조
1. 원료 인삼을 한약발효기에 넣고, 유산균 5~30 중량%, 효모균 5~30 중량%, 광합성세균 5~30 중량%, 납두균 1~20 중량%, 아세트산균 1~20 중량%를 혼합한 복합미생물을 넣어 35℃에서 24시간 발효한다.
2. 발효 후 온도를 높이고 90℃에서 30~40 분정도 증삼한다.
3. 발효 증삼한 것은 다시 -25℃에서 15분간 냉건조한다.
4. 3의 냉건조한 인삼을 30℃에서 4시간 온건조한다.
5. 4의 온건조한 인삼에 유산균 5~40중량%, 효모균 5~40 중량%, 광합성세균 1~30 중량%로 혼합한 복합미생물을 넣고 32℃에서 24시간 발효한다.
6. 발효 후 온도를 높이고 90℃에서 20~30분 정도 증삼한다.
7. 6의 단계 후에 -25℃에서 6시간 냉건조한다.
8. 7의 냉건조한 인삼을 30℃에서 4시간 온건조시킨다.
9. 위의 방법을 1회 이상 반복하여 홍삼발효액을 만든다.
[실험예 1]
복숭아, 커피 및 홍삼 발효액 혼합 기능성 음료 관능검사
실시예 3~5의 방법으로 준비한 복숭아발효액, 커피발효액, 홍삼발효액의 혼합비율을 3가지로 하여 기능성 음료 시료(a),(b),(c)를 제조하였다.
(a)는 복숭아발효액, 커피발효액, 홍삼발효액의 혼합비율을 1:1:1 부피비로 혼합한 것이고, (b)는 복숭아발효액, 커피발효액, 홍삼발효액의 혼합비율을 1:2:1 부피비로 혼합하여 제조한 것이고, (c)는 복숭아발효액, 커피발효액, 홍삼발효액의 혼합비율을 2:1:1 부피비로 혼합하여 제조한 것이다.
시료 (a),(b),(c)를 복숭아, 커피, 홍삼 기능성 음료에 대하여 20명이 시음하여 풍미, 향 및 기호도를 조사한 것으로 5점의 척도법으로 평가하여 그 결과를 표 1로 나타내었다.
| 시료 | (a) | (b) | (c) | |
| 관능검사 항목 | 맛 강도 | 3.7 | 3.8 | 4.3 |
| 향 강도 | 4.0 | 4.2 | 4.0 | |
| 기호도 | 3.9 | 3.8 | 4.2 | |
* 1점:매우 불량, 2점:불량, 3점:보통, 4점:양호, 5점:매우 양호
본 실험에서는 (c)의 경우 맛이 가장 뛰어남을 알 수 있다. (b)는 향이 가장 뛰어 남을 알 수 있는데, 이는 홍삼 향이 강하다는 것을 알 수 있다. (c)는 맛과 기호도에서 가장 좋음을 알 수 있었다.
본 실험에서 알 수 있듯이 (a)와 (b)는 맛과 기호도에서 차이를 보이지는 않았지만 향에서 차이를 느낄 수 있었다. 복숭아발효액이 다량 함유한 혼합비율 즉, 복숭아발효액, 커피발효액, 홍삼발효액의 혼합비율이 2:1:1 부피비로 혼합시킨 비율이 기호도와 맛에서 뛰어난 효과가 있음을 알 수 있었다.
[실험예 2]
대식세포를 이용한 복숭아, 커피, 홍삼발효액의 면역강화 효과실험
본 발명에서는 복숭아, 커피, 홍삼 발효액을 2:1:1 부피비로 혼합한 기능성음료에 의한 대식세포(macophage)의 활성평가를 위해 NO 및 TNF-α 분석(assay)을 실시하였다. 한국세포주은행(KCLB, Seoul, Korea)에서 분양받은 Raw 264.7, MDA-MB-231 세포주를 사용하였다. 이들 세포주의 세포배양액은 DMEM, RPMI 1640(Hyclone Laboratoris Inc., Logan, UT, USA)에 10% fetal bovineserum, 1% streptomycin/penicillin(Gibco BRL, Grand Island, NY, USA)를 첨가하여 사용하였다. 이들 세포주는 37℃ 5% CO2 배양기에서 배양하였다.
<NO (Nitric Oxide) assay>
NO 분석(assay)은 CAYMAN(Denver, CO, USA)의 NO kit를 사용하였다. Raw 264.7 세포를 96 well plate에 1ㅧ104 cells/well로 분주한 후에 24시간 동안 배양시킨 다음, Raw 264.7세포주에 β-glucan을 50, 100, 200, 400 μg/mL의 농도로 처리하여 24시간 동안 배양한 후 상등액을 취하였다. 상등액 중 100 μL를 취하여 새로운 96 well plate로 옮긴 후 100 μL Griegrie reagent(1% sulfanilamide, 0.1% napthylethylenediaminedihydrochloride/2.5% H3PO4)를 넣고 10분간 실온에서 방치한 후 ELISA-reader(Bio-Rad Laboratories Inc.)를 사용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. Sodium nitrite 검량선 으로 부터 세포가 분비하는 nitric oxide를 계산하였다.
<TNF-α assay>
TNF-α 분석은 Invitrogen(Carlsbad, CA, USA)의 TNF-α kit를 사용하였다. Raw 264.7 세포를 96 well plate에 1ㅧ104 cells/well로 분주 후에 24시간 동안 배양시킨 다음 Raw 264.7 세포주에 β-glucan을 10, 20, 40, 80, 100, 200 μg/mL의 농도로 처리하여 24시간 동안 배양한 후 상등액을 취하였다. 상등액 중 10 μL를 취하여 TNF-α antibody-coated 처리된 96 well plate에 옮긴 후 standard diluents buffer와 biotinylated anti-TNF-α solution을 각각 20 μL 첨가한 후 90분간 실온에서 배양하였다. 배양 후, wash buffer를 이용하여 4번 세척한 후 steptavidin-HRP 100 μL를 첨가하고 30분간 실온에서 반응시켰다. 이를 4번 세척한 후 stabilized chromogen을 각 well에 100 μL 첨가한 후, 차광하여 30분간 실온에서 반응시켰다. 각 well에 stop solution 100μL를 첨가한 후 30분 이내로 ELISA-reader(Bio-Rad Laboratories Inc.)를 이용하여 450 nm에서 측정하였다.
[비교예 1]
복숭아, 커피, 홍삼 발효음료에 의한 대식세포의 NO 및 TNF-α 분비확인
감염된 미생물의 방어를 위해 대식세포가 이펙터 기능(effector function)을 갖기 위해서는 NO(nitric oxide)가 중요하다고 알려져 있다. 따라서 대조구(비발효 복숭아, 커피, 홍삼음료)와 발효한 복숭아, 커피, 홍삼애글 2:1:1 부피비로 혼합한 기능성음료를 비교하여 대식세포의 활성화 단계에 따라 NO 분비의 발현이 어떻게 변화하는지 확인해 보았다.
도 1을 참고하면, 다양한 조직의 대식세포(C57/BL6 peritonealmacrophage, microglia, Raw 264.7)에 복숭아, 커피, 홍삼 발효 기능성음료를 처리하자 다양한 조직의 대식세포에서도 탐식능이 증가하였으며, 10 μg/mL의 농도에서부터 현저히 그 효과가 나타났다. NO의 분비는 농도 의존적으로 증가하였으며, 20 μg/mL인 농도부터 유의적인 차이를 나타내었다.
감염된 미생물의 방어를 위해 대식세포가 분비하는 대표적인 사이토카인으로 TNF-α가 알려져 있다. 따라서 복숭아, 커피, 홍삼 발효 기능성음료에 의한 대식세포의 TNF-α의 분비에 어떠한 영향을 미치는지 확인해 보았다.
도 2를 참고하면, TNF-α의 분비는 저농도부터 농도 유의적으로 증가하다 NO 및 TNF-α의 생산이 증가한 것으로 볼 때 복숭아, 커피, 홍삼 발효음료가 macrophage인 Raw 264.7 세포를 활성화시키는 것으로 사료된다. 따라서 복숭아, 커피, 홍삼 음료는 발효하지 않은 대조구보다 면역강화 효과가 충분히 있다고 사료된다.
복합미생물을 이용한 복숭아, 커피, 홍삼 발효 혼합물은 기능성 음료에 사용되어 다양한 효과를 볼 수 있지만, 이에 한정하지 않고 약품, 식품, 건강식품, 화장품, 기능성음료, 음료의 원료 등으로 폭넓게 응용될 수 있다. 또한 혼합물의 제형은 음료에 국한된 것이 아니며 과립, 분말, 정제(tablet), 캡슐, 액상, 농축액 등의 다양한 제형으로 제조할 수 있다.
Claims (6)
- 유산균, 효모균, 납두균, 아세트산균, 광합성 세균을 각각 따로 배양하는 제1 단계;
복숭아 추출액에 상기 제1 단계에서 배양된 유산균 0.1~50 중량%, 효모균 0.1~50 중량%, 납두균 0.1~50 중량% 및 광합성세균+효모균을 0.01~20 중량%로 혼합한 복합미생물 0.1~ 5 중량% 및 설탕 0.1~ 10 중량%를 넣고 발효하는 제2 단계;
커피 추출액에 상기 제1 단계에서 배양된 유산균 5~30 중량%, 효모균 5~30 중량%, 광합성세균 5~30 중량%, 납두균 1~20 중량%, 아세트산균 1~20 중량%로 혼합한 복합미생물 0.1~ 5 중량% 및 설탕 0.1~ 10 중량%를 넣고 발효하는 제3 단계;
홍삼발효액을 제조하는 제4 단계; 및
상기 제2 단계에서 제조된 복숭아발효액, 상기 제3 단계에서 제조된 커피발효액 및 상기 제4 단계에서 제조된 홍삼발효액을 혼합하는 제5 단계를 포함하는 복합미생물을 이용한 복숭아, 커피 및 홍삼 발효 혼합물 제조방법. - 제 1항에 있어서,
상기 제4 단계의 홍삼발효액의 제조는,
인삼을 한약발효기에 넣고 상기 제1 단계에서 배양된 유산균 5~30 중량%, 효모균 5~30 중량%, 광합성세균 5~30 중량%, 납두균 1~20 중량% 및 아세트산균 1~20 중량%로 혼합한 복합미생물 0.1~10중량%을 넣고 35℃에서 24시간 발효하는 제4-1 단계;
발효 후 온도를 높이어 90℃에서 30~40분 동안 증삼하는 제4-2 단계;
증삼 후 -25℃에서 15분간 냉건조하는 제4-3 단계;
냉건조 후 30℃에서 4시간 온건조하는 제4-4 단계;
상기 온건조 한 인삼에 상기 제1 단계에서 배양된 유산균 5~40 중량%, 효모균 5~40 중량%, 광합성세균 1~30 중량%로 혼합한 복합미생물 0.1~10중량%을 넣고 32℃에서 24시간 발효하는 제4-5 단계;
상기 제4-5단계 후 후 온도를 높이어 90℃에서 20~30분 동안 증삼하는 제4-6 단계;
증삼 후 -25℃에서 6시간 냉건조 하는 제4-7 단계; 및
냉건조 후 30℃에서 4시간 온건조 하는 제4-8 단계를 통해 홍삼발효액을 제조하는 것을 특징으로 하는 복합미생물을 이용한 복숭아, 커피 및 홍삼 발효 혼합물 제조방법. - 제 1항에 있어서,
상기 광합성세균+효모균은 광합성세균과 효모균을 1:1로 혼합하는 제1-1 단계;
25~35℃에서 7일 동안 배양하는 제1-2 단계; 및
배지 공급 없이 30일 동안 휴면상태로 만드는 제1-3 단계를 포함하는 복합미생물을 이용한 복숭아, 커피 및 홍삼 발효 혼합물 제조방법. - 제 1항에 있어서,
상기 복숭아 추출액은 복숭아, 정제수 또는 미네랄워터를 1:1~4로 혼합하고, 밀폐가온식 추출용기에서 10시간 동안 가온 가압하여 추출하고, 여과하여 살균 처리하는 것을 특징으로 하는 복합미생물을 이용한 복숭아, 커피 및 홍삼 발효 혼합물 제조방법. - 제 1항에 있어서,
상기 커피발효액은 커피의 생두를 121℃에서 30분 동안 가열하여 멸균 처리한 커피 추출액을 제조하는 제3-1 단계 및
상기 제1 단계에서 배양된 유산균 5~30 중량%, 효모균 5~30 중량%, 광합성세균 5~30 중량%, 납두균 1~20 중량%, 아세트산균 1~20 중량%로 혼합한 복합미생물 0.1~ 5 중량% 및 설탕 0.1~ 10 중량%를 넣고 35℃에서 24시간 동안 발효시키는 제3-2 단계를 포함하는 복합미생물을 이용한 복숭아, 커피 및 홍삼 발효 혼합물 제조방법. - 제1항의 제조방법으로 제조된 복숭아발효액, 커피발효액 및 홍삼발효액을 2:1:1 부피비로 혼합한 기능성 음료.
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- 2013-01-08 KR KR1020130002169A patent/KR101396187B1/ko not_active IP Right Cessation
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