CN112638421A - 用于改善肠道健康的制剂 - Google Patents

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索菲·费尔鲍姆
坦-凡·法姆
凯文·布鲁德恩斯
罗伯特·斯坦尼特
彼得罗·塞利
吉尔伯托·利塔
埃斯特法尼亚·佩雷斯卡尔沃
威尔伯特·西贝斯玛
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Abstract

通过将活性剂递送到包括人的动物的结肠来对肠健康产生多种益处。活性成分包括核黄素、维生素A、维生素C、维生素D、维生素E、维生素K、叶酸、β‑胡萝卜素、维生素B1、烟酸、维生素B5、维生素B6、生物素、维生素B12、ω‑3脂肪酸及其组合。益处包括增加肠中的至少一种短链脂肪酸及其盐的浓度，增加肠中的微生物组的多样性，增加肠中的有益细菌，增加肠中的丁酸酯合成途径，改善肠屏障功能，减少肠道的氧化还原电位，减少肠中产生的气体量；和刺激肠免疫反应。

Description

用于改善肠道健康的制剂
技术领域
本发明涉及用于改善动物和人类肠道健康的制剂。特别地，本发明的制剂可以用于增加下肠道中的短链脂肪酸(SCFA)的浓度，和/或用于增加下肠道中的丁酸酯合成途径。本发明的制剂还可用于增加或调节下肠道中的有益细菌(如双歧杆菌、阿克曼氏菌和栖粪杆菌)的微生物组多样性和/或丰度。本发明进一步涉及用于改善肠道屏障功能和刺激肠道免疫反应的方法和组合物。
背景技术
人类和动物的微生物群是生活在人类/动物身体上以及在人类/动物体内的微生物的集合，具有居于肠道的最大并且种类最多的微生物群集。肠道微生物群与宿主共同进化，为微生物提供稳定的环境，而微生物则为宿主提供广泛的功能，例如消化复杂的饮食的大量营养素，生产营养素和维生素，抵抗病原体以及维持免疫系统。现有数据表明，肠道微生物群组成异常与多种疾病有关，包括免疫力下降、过敏、代谢紊乱(例如2型糖尿病mellitus)和炎性肠病(IBD)。其中微生物群影响人类健康和疾病的机制之一是其产生与疾病发展相关的有害代谢物或预防疾病的有益代谢物的能力。膳食纤维，以及蛋白质和肽被盲肠和结肠中的微生物群代谢，蛋白质和肽无法通过上消化道中的宿主酶消化。来自肠道中的微生物发酵活动的主要产物是SCFA，尤其是乙酸酯、丙酸酯和丁酸酯。越来越多的证据表明人或动物肠道中的SCFA对宿主代谢性能例如葡萄糖代谢、免疫系统、胃肠道的完整性和屏障以及肠道整体健康(包括胃肠蠕动)具有有益作用。
WO 2007/058523 A1描述了n-3二十二碳五烯酸用于制备改善肠屏障完整性、改善屏障功能、刺激肠道成熟和/或降低肠屏障渗透性的药物组合物的用途。
WO 2016/053085 A1描述了包含尿苷源和产生丁酸酯的纤维的组合物，用于预防或治疗便秘、渡越时间功能障碍或结肠长度异常。
US 2010/247489 A1公开了包含特定矿物质例如钨的延迟释放组合物用于减少结肠中气体形成的用途。该组合物可以进一步包含维生素或产乙酸或产丁酸细菌的菌株。
Tan等人(2016)Cell Reports，第15卷，第12期，2809-2824研究了膳食纤维在小鼠中对花生过敏的有益作用。Tan等人报告，这种作用涉及肠道微生物群的重塑以及短链脂肪酸水平的提高和受体GPR43和GPR109a的活性。
WO 2010/117274 A1描述了用于增强C5和/或C6短链脂肪酸的生产的碳水化合物。
WO 2017/182347 A1描述了包含含维生素B3的核的微胶囊，其特征在于包衣层系统包含两层虫胶和在两层虫胶之间提供的pH调节物质。
US 9,433,583 B2描述了一种包含维生素D和任选的其他维生素的结肠靶向的单一剂型，其用于预防结肠直肠腺瘤性息肉和结肠直肠癌。
WO2014/070014描述了核黄素(维生素B2)用于刺激普氏栖粪杆菌的种群的用途。
发明内容
本申请的发明人发现，在某些微量营养物的存在下，肠道微生物群产生增加量的SCFA。另外，还观察到丁酸酯合成途径的增加。在进一步的研究中，已确定微量营养素还可以增加肠中的微生物组多样性和微生物丰度，改善肠道的屏障功能，并减少气体产生。因此，本发明涉及以下项[1]至[67]：
[1].如权利要求1中所定义的应用的活性剂；或者：
一种在改善动物中的肠健康中的应用的活性剂，所述活性剂选自核黄素、维生素A、维生素C、维生素D、维生素E、维生素K、叶酸、β-胡萝卜素、维生素B1、烟酸、维生素B5、维生素B6、生物素、维生素B12、ω-3脂肪酸及其组合，其中所述改善包括或由以下组成：
(i)增加肠中的至少一种短链脂肪酸或其盐的浓度，
(ii)增加肠中的微生物组多样性，
(iii)增加肠中的微生物丰度，
(iv)促进或增加肠中的丁酸酯合成途径，
(v)改善肠屏障功能，
(vi)减少肠道的氧化还原电位，
(vii)减少肠中产生的气体量，和/或
(viii)刺激肠免疫反应；
其中所述应用包括向动物施用包含有效剂量的活性剂的延迟释放制剂，其中活性剂的释放被延迟直到肠，优选大肠。
[2]根据项[1]所述的应用的活性剂，其中所述改善包括或由以下组成：增加所述肠中的至少一种短链脂肪酸或其盐的浓度，并且其中所述至少一种短链脂肪酸选自丁酸、乙酸、丙酸及其组合。
[3]根据项[2]所述的应用的活性剂，其中所述至少一种短链脂肪酸是丁酸。
[4]根据项[2]所述的应用的活性剂，其中所述至少一种短链脂肪酸是乙酸。
[5]根据项[2]所述的应用的活性剂，其中所述至少一种短链脂肪酸是丙酸。
[6]根据前述任一项所述的应用的活性剂，其中所述应用包括或由以下组成：治疗或预防与下肠道中低浓度的一种或多种SCFA相关的病症。
[7]根据项[6]所述的应用的活性剂，其中所述与下肠道中低浓度的一种或多种SCFA相关的病症是炎性病症。
[8]根据项[7]所述的应用的活性剂，其中所述炎性病症的特征在于慢性炎症。
[9]根据项[6]所述的应用的活性剂，其中所述与下肠道中低浓度的一种或多种SCFA相关的病症是动脉粥样化形成。
[10]根据项[6]所述的应用的活性剂，其中所述与下肠道中低浓度的一种或多种SCFA相关的病症是代谢紊乱。
[11]根据项[10]所述的应用的活性剂，其中所述代谢紊乱是2型糖尿病和/或肥胖症。
[12]根据项[1]所述的应用的活性剂，其中所述改善包括或由以下组成：增加所述肠中的微生物组多样性。
[13]根据项[12]所述的应用的活性剂，其中所述应用包括或由以下组成：治疗或预防与肠道中微生物组多样性不足有关的病症。
[14]根据项[1]所述的应用的活性剂，其中所述改善包括或由以下组成：增加人肠中至少一种选自双歧杆菌、阿克曼氏菌和栖粪杆菌的微生物的丰度。
[15]根据项[14]所述的应用的活性剂，其中所述应用包括或由以下组成：治疗或预防与人肠中双歧杆菌、阿克曼氏菌或栖粪杆菌丰度不足有关的病症，例如IBD，包括肥胖症和2型糖尿病的代谢疾病和其他炎性病症。
[16]根据项[1]所述的应用的活性剂，其中所述改善包括或由以下组成：增加至少一种微生物的丰度，所述至少一种微生物选自拟杆菌、阿利斯贝氏菌和栖粪杆菌。
[17]根据项[1]所述的应用的活性剂，其中所述改善包括或由以下组成：促进或增加肠中丁酸酯合成途径。
[18]根据项[17]所述的应用的活性剂，其中所述应用包括或由以下组成：治疗或预防与肠中丁酸酯合成不足有关的病症。
[19]在治疗或预防与动物(优选为哺乳动物)的肠屏障功能受损有关的病症的应用的活性剂，所述活性剂选自核黄素、维生素A、维生素C、维生素D、维生素E、维生素K、叶酸、β-胡萝卜素、维生素B1、烟酸、维生素B5、维生素B6、生物素、维生素B12、ω-3脂肪酸及其组合，其中所述应用包含向动物施用包含有效剂量的活性剂的延迟释放制剂，其中所述活性剂的释放被延迟直到大肠。
[20]根据项[19]所述的应用的活性剂，其中所述与动物的肠屏障功能受损有关的病症的特征在于肠道渗漏。
[21]根据项[19]或[20]所述的应用的活性剂，其中所述与肠屏障功能受损有关的病症由营养不良引起。
[22]根据项[19]或[20]所述的应用的活性剂，其中所述与动物的肠屏障功能受损有关的病症是炎性肠病。
[23]根据项[22]所述的应用的活性剂，其中所述炎性肠病是克罗恩病(Chron’sdiease)。
[24]根据项[22]所述的应用的活性剂，其中所述炎性肠病是溃疡性结肠炎。
[25]根据项[19]所述的应用的活性剂，其中所述动物是单胃动物。
[26]根据项[19]所述的应用的活性剂，其中所述动物是家禽或猪。
[27]根据项[1]至[26]中任一项所述的应用的活性剂，其中所述延迟释放制剂是缓释制剂。
[28]根据项[1]至[26]中任一项所述的应用的活性剂，其中所述活性剂的释放被延迟直到大肠。
[29]根据项[1]至[26]中任一项所述的应用的活性剂，其中所述活性剂的释放被延迟直到结肠。
[30]根据项[1]至[29]中任一项所述的应用的活性剂，其中所述活性剂由核黄素组成。
[31]根据项[1]至[29]中任一项所述的应用的活性剂，其中所述活性剂由维生素A组成。
[32]根据项[1]至[29]中任一项所述的应用的活性剂，其中所述活性剂由维生素C组成。
[33]根据项[1]至[29]中任一项所述的应用的活性剂，其中所述活性剂由维生素D组成。
[34]根据项[1]至[29]中任一项所述的应用的活性剂，其中所述活性剂由维生素E组成。
[35]根据项[1]至[29]中任一项所述的应用的活性剂，其中所述活性剂由维生素K组成。
[36]根据项[1]至[29]中任一项所述的应用的活性剂，其中所述活性剂由叶酸组成。
[37]根据项[1]至[29]中任一项所述的应用的活性剂，其中所述活性剂由β-胡萝卜素组成。
[38]根据项[1]至[29]中任一项所述的应用的活性剂，其中所述活性剂由维生素B1组成。
[39]根据项[1]至[29]中任一项所述的应用的活性剂，其中所述活性剂由烟酸组成。
[40]根据项[1]至[29]中任一项所述的应用的活性剂，其中所述活性剂由维生素B5组成。
[41]根据项[1]至[29]中任一项所述的应用的活性剂，其中所述活性剂由维生素B6组成。
[42]根据项[1]至[29]中任一项所述的应用的活性剂，其中所述活性剂由生物素组成。
[43]根据项[1]至[29]中任一项所述的应用的活性剂，其中所述活性剂由维生素B12组成。
[44]根据项[1]至[29]中任一项所述的应用的活性剂，其中所述活性剂由至少一种ω-3脂肪酸组成。
[45]根据项[44]所述的应用的活性剂，其中所述活性剂由二十二碳六烯酸(DHA)、二十碳五烯酸(EPA)或其组合组成。
[46]根据项[44]所述的应用的活性剂，其中所述活性剂由DHA组成。
[47]根据项[44]所述的应用的活性剂，其中所述活性剂由EPA组成。
[48]根据项[44]所述的应用的活性剂，其中所述活性剂由DHA和EPA的组合组成。
[49]根据项[1]至[29]中任一项所述的应用的活性剂，其中所述活性剂由核黄素、维生素A、维生素C、维生素D、维生素E、维生素K、叶酸、β-胡萝卜素、维生素B1、烟酸、维生素B5、维生素B6、生物素、维生素B12、DHA和EPA的组合组成。
[50]根据前述任一项所述的应用的活性剂，其中所述活性剂以至多2.9mg核黄素/kg体重、至多42.9μg维生素A/kg体重、至多3.6μg维生素D/kg体重、至多28.6mg维生素C/kg体重、至多14.3mg维生素E/kg体重、至多143pg维生素K/kg体重、至多14.3pg叶酸/kg体重、至多0.4mgβ-胡萝卜素、至多1.4mg维生素B1、至多21.4mg烟酸、至多14.3mg维生素B5、至多1.4mg维生素B6、至多35.7pg生物素、至多43pg维生素B12、71.4mgω-3脂肪酸/kg体重或其组合的每日剂量施用到动物，优选哺乳动物，其中优选地EPA是至多25.7mg/kg体重并且DHA是至多14.3mg/kg体重。
[51]用于将活性剂递送到肠的延迟释放制剂，所述制剂包含所述活性剂和肠溶层或肠衣，其中所述活性剂由至多200mg核黄素、至多3000pg维生素A、至多2000mg维生素C、至多250pg维生素D、至多1000mg维生素E、至多10mg维生素K、至多1mg叶酸、至多25mgβ-胡萝卜素、至多100mg维生素B1、至多1500mg烟酸、至多1000mg维生素B5、至多100mg维生素B6、至多2500pg生物素、至多3000pg维生素B12、至多5000mgω-3脂肪酸或其组合组成，其中优选地EPA是至多1800mg并且DHA是至多1000mg，并且其中所述活性剂的释放被延迟直到肠。
[52]用于将活性剂递送到肠的延迟释放制剂，所述制剂包含活性剂和肠溶层或肠衣，其中所述活性剂由1-85mg核黄素、0.2-0.4mg维生素A、400-600mg维生素C、5-80pg维生素D、80-120pg维生素E、80-140pg维生素K、0.3-0.5mg叶酸、80-120mgω-3脂肪酸或其组合组成，并且其中所述活性剂的释放被延迟直到肠道。
[53]项[51]或[52]所述的延迟释放制剂，其中所述活性剂由70-80mg核黄素、0.25-0.35mg维生素A、450-550mg维生素C、15-25μg维生素D、90-110mg维生素E、100-120pg维生素K、0.35-0.45mg叶酸、90-110mgω-3脂肪酸或其组合组成。
[54]项[51]至[53]中任一项所述的组合物，其中所述活性剂的释放被延迟直到结肠。
[55]用于改善动物(不患有任何肠病症或病理状况的，优选哺乳动物、单胃动物或家禽)的肠的状况或健康的活性剂的非治疗性用途，所述活性剂选自核黄素、维生素A、维生素C、维生素D、维生素E、维生素K、叶酸、β-胡萝卜素、维生素B1、烟酸、维生素B5、维生素B6、生物素、维生素B12、ω-3脂肪酸及其组合。
[56]项[55]的非治疗性用途，其中所述哺乳动物是健康人。
[57]项[55]的非治疗性用途，其中所述的哺乳动物是健康的成年人。
[58]项[55]至[57]中任一项所述的非治疗性用途，其中所述改善包括或由以下组成：增加所述肠中的至少一种短链脂肪酸或其盐的浓度。
[59]项[55]至[57]中任一项所述的非治疗性用途，其中所述改善包括或由以下组成：增加所述肠中的微生物组多样性。
[60]项[55]至[57]中任一项所述的非治疗性用途，其中所述改善包括或由以下组成：增加所述肠中的双歧杆菌、阿克曼氏菌和/或栖粪杆菌的丰度。
[61]项[55]至[57]中任一项所述的非治疗性用途，其中所述改善包括或由以下组成：促进或增加肠中丁酸酯合成途径。
[62]项[55]至[57]中任一项所述的非治疗性用途，其中所述改善包括或由以下组成：改善肠屏障功能，其中所述活性剂不包含ω-3脂肪酸。
[63]项[55]至[62]中任一项所述的非治疗性用途，其中所述活性剂不包含维生素D3。
[64]项[55]至[63]中任一项所述的非治疗性用途，其中所述活性剂不包含ω-3脂肪酸。
[65]用于在健康的哺乳动物中维持或改善肠道功能的活性剂的非治疗性用途，所述活性剂选自核黄素、维生素A、维生素D、维生素C、维生素E、维生素K、叶酸、β-胡萝卜素、维生素B1、烟酸、维生素B5、维生素B6、生物素、维生素B12、ω-3脂肪酸及其组合。
[66]一种用于改善动物中的肠健康的方法，其中所述改善包括或由以下组成：
(i)增加所述肠中的至少一种短链脂肪酸或其盐的浓度，
(ii)增加所述肠中的微生物组多样性，
(iii)增加所述肠中的微生物丰度，
(iv)促进或增加所述肠中的丁酸酯合成途径，
(v)改善肠屏障功能，
(vi)降低肠道的氧化还原电位，和/或
(vii)减少肠中产生的气体量；
包含向动物施用包含有效剂量的活性剂的延迟释放制剂，其中所述活性剂的释放被延迟直到肠，或包含超生理剂量活性剂的饲料，并且以有效量存在于肠中；
并且其中所述活性剂选自核黄素、维生素A、维生素C、维生素D、维生素E、维生素K、叶酸、β-胡萝卜素、维生素B1、烟酸、维生素B5、维生素B6、生物素、维生素B12、ω-3脂肪酸及其组合。
[67]包含超生理剂量的活性剂的家禽或非人类饲料，所述活性剂选自核黄素、维生素A、维生素C、维生素D、维生素E、维生素K、叶酸、β-胡萝卜素、维生素B1、烟酸、维生素B5、维生素B6、生物素、维生素B12、ω-3脂肪酸及其组合，其中在肠中存在足够量的活性剂。
本发明还涉及以下实施方案：
(1)在增加哺乳动物的肠中的至少一种短链脂肪酸(SCFA)或其盐的浓度中的应用的活性剂，所述活性剂选自核黄素、维生素A、维生素C、维生素D、维生素E、维生素K、叶酸、β-胡萝卜素、维生素B1、烟酸、维生素B5、维生素B6、生物素、维生素B12、ω-3脂肪酸及其组合，其中所述应用包括向哺乳动物施用包含有效剂量的活性剂的延迟释放制剂，其中所述活性剂的释放被延迟直到肠道。
(2)根据实施方案(1)的应用的活性剂，其中所述至少一种短链脂肪酸选自丁酸、乙酸、丙酸及其组合。
(3)根据实施方案(2)的应用的活性剂，其中所述至少一种短链脂肪酸是丁酸。
(4)根据实施方案(2)的应用的活性剂，其中所述至少一种短链脂肪酸是乙酸。
(5)根据实施方案(2)的应用的活性剂，其中所述至少一种短链脂肪酸是丙酸。
(6)根据前述实施方案中任一项所述的应用的活性剂，其中所述应用包括或由以下组成：治疗或预防与下肠道中低浓度的一种或多种SCFA相关的病症。
(7)根据实施方案(6)的应用的活性剂，其中所述与下肠道中低浓度的一种或多种SCFA相关的病症是炎性病症。
(8)根据实施方案(7)的应用的活性剂，其中所述炎性病症的特征在于慢性炎症。
(9)根据实施方案(6)的应用的活性剂，其中所述与下肠道中低浓度的一种或多种SCFA相关的病症是动脉粥样化形成。
(10)根据实施方案(6)的应用的活性剂，其中所述与下肠道中低浓度的一种或多种SCFA相关的病症是代谢紊乱。
(11)在治疗或预防与哺乳动物的肠屏障功能受损相关的病症中的应用的活性剂，所述活性剂选自核黄素、维生素A、维生素C、维生素D、维生素E、维生素K、叶酸、ω-3脂肪酸及其组合，其中所述应用包括向哺乳动物施用包含有效剂量的活性剂的延迟释放制剂，其中所述活性剂的释放被延迟直到肠道。
(12)根据实施方案(12)的应用的活性剂，其中所述与哺乳动物的肠屏障功能受损有关的病症的特征在于肠道渗漏。
(13)根据实施方案(12)或(13)的应用的活性剂，其中所述与肠屏障功能受损有关的病症由营养不良引起。
(14)根据实施方案(12)或(13)的应用的活性剂，其中所述与哺乳动物的肠屏障功能受损有关的病症是炎性肠病。
(15)根据实施方案(15)的应用的活性剂，其中所述炎性肠病是克罗恩病。
(16)根据实施方案(15)的应用的活性剂，其中所述炎性肠病是溃疡性结肠炎。
(17)根据实施方案(1)至(17)中任一项的应用的活性剂，其中所述延迟释放制剂是缓释制剂。
(18)根据实施方案(1)至(17)中任一项的应用的活性剂，其中所述活性剂的释放被延迟直到大肠。
(19)根据实施方案(1)至(17)中任一项的应用的活性剂，其中所述活性剂的释放被延迟直到结肠。
(20)根据前述实施方案中任一项的应用的活性剂，其中所述活性剂由核黄素组成。
(21)根据前述实施方案中任一项的应用的活性剂，其中所述活性剂由维生素A组成。
(22)根据前述实施方案中任一项的应用的活性剂，其中所述活性剂由维生素C组成。
(23)根据前述实施方案中任一项的应用的活性剂，其中所述活性剂由维生素D组成。
(24)根据前述实施方案中任一项的应用的活性剂，其中所述活性剂由维生素E组成。
(25)根据前述实施方案中任一项的应用的活性剂，其中所述活性剂由维生素K组成。
(26)根据前述实施方案中任一项的应用的活性剂，其中所述活性剂由叶酸组成。
(27)根据前述实施方案中任一项的应用的活性剂，其中所述活性剂由至少一种ω-3脂肪酸组成。
(28)根据前述实施方案中任一项的应用的活性剂，其中所述活性剂由二十二碳六烯酸(DHA)、二十碳五烯酸(EPA)或其组合组成。
(29)根据前述实施方案中任一项的应用的活性剂，其中所述活性剂由DHA组成。
(30)根据前述实施方案中任一项的应用的活性剂，其中所述活性剂由EPA组成。
(31)根据前述实施方案中任一项的应用的活性剂，其中所述活性剂由DHA和EPA的组合组成。
(32)根据前述实施方案中任一项的应用的活性剂，其中所述活性剂由核黄素、维生素A、维生素C、维生素D、维生素E、维生素K、叶酸、β-胡萝卜素、维生素B1、烟酸、维生素B5、维生素B6、生物素、维生素B12、DHA和EPA的组合组成。
(33)根据前述实施方案中任一项的应用的活性剂，其中所述活性剂以0.01-1.2mg核黄素/kg体重、2.9-5.7μg维生素A/kg体重、0.1-1.1μg维生素D/kg体重、0.2-1.7mg维生素E/kg体重、1.1-2.0pg维生素K/kg体重、4.3-7.1pg叶酸/kg体重、1.1-1.7mgω-3脂肪酸/kg体重或其组合的每日剂量施用到哺乳动物。
(34)根据前述实施方案中任一项的应用的活性剂，其中所述活性剂以1.0-1.1mg核黄素/kg体重、3.6-5.0pg维生素A/kg体重、0.2-0.4pg维生素D/kg体重、1.3-1.6mg维生素E/kg体重、1.4-1.7pg维生素K/kg体重、5.0-6.4pg叶酸/kg体重1.3-1.6mgω-3脂肪酸/kg体重或其组合的每日剂量施用到哺乳动物。
(35)用于将活性剂递送到肠的延迟释放制剂，所述制剂包含活性剂和肠溶衣，其中所述活性剂由1-85mg核黄素、0.2-0.4mg维生素A、400-600mg维生素C、5-80pg维生素D、80-120mg维生素E、80-140pg维生素K、0.3-0.5mg叶酸、80-120mgω-3脂肪酸或其组合组成，并且其中所述活性剂的释放被延迟直到肠。
(36)实施方案(36)所述的延迟释放制剂，其中所述活性剂由70-80mg核黄素、0.25-0.35mg维生素A、450-550mg维生素C、15-25μg维生素D、90-110mg维生素E、100-120pg维生素K、0.35-0.45mg叶酸、90-110mgω-3脂肪酸或其组合组成。
(37)实施方案(36)或(37)所述的延迟释放制剂，其中所述延迟释放制剂是缓释制剂。
(38)实施方案(36)或(37)所述的延迟释放制剂，其中所述活性剂的释放被延迟直到大肠优选在结肠中。
(39)实施方案(36)或(37)所述的延迟释放制剂，其中所述活性剂的释放被延迟直到结肠。
(40)实施方案(36)至(40)中任一项所述的延迟释放制剂，所述制剂包含核黄素作为唯一的活性剂。
(41)实施方案(36)至(40)中任一项所述的延迟释放制剂，所述制剂包含维生素A作为唯一的活性剂。
(42)实施方案(36)至(40)中任一项所述的延迟释放制剂，所述制剂包含维生素C作为唯一的活性剂。
(43)实施方案(36)至(40)中任一项所述的延迟释放制剂，所述制剂包含维生素D作为唯一的活性剂。
(44)实施方案(36)至(40)中任一项所述的延迟释放制剂，所述制剂包含维生素E作为唯一的活性剂。
(45)实施方案(36)至(40)中任一项所述的延迟释放制剂，所述制剂包含维生素K作为唯一的活性剂。
(46)实施方案(36)至(40)中任一项所述的延迟释放制剂，所述制剂包含叶酸作为唯一的活性剂。
(47)实施方案(36)至(40)中任一项所述的延迟释放制剂，所述制剂包含β-胡萝卜素作为唯一的活性剂。
(48)实施方案(36)至(40)中任一项所述的延迟释放制剂，所述制剂包含维生素B1作为唯一的活性剂。
(49)实施方案(36)至(40)中任一项所述的延迟释放制剂，所述制剂包含烟酸作为唯一的活性剂。
(50)实施方案(36)至(40)中任一项所述的延迟释放制剂，所述制剂包含维生素B5作为唯一的活性剂。
(51)实施方案(36)至(40)中任一项所述的延迟释放制剂，所述制剂包含维生素B6作为唯一的活性剂。
(52)实施方案(36)至(40)中任一项所述的延迟释放制剂，所述制剂包含生物素作为唯一的活性剂。
(53)实施方案(36)至(40)中任一项所述的延迟释放制剂，所述制剂包含维生素B12作为唯一的活性剂。
(54)实施方案(36)至(40)中任一项所述的延迟释放制剂，所述制剂包含一种或多种ω-3脂肪酸作为唯一的活性剂。
(55)用于增加没有患有任何病症或病理状况的哺乳动物的肠中的至少一种短链脂肪酸或其盐的浓度的活性剂的非治疗性用途，所述活性剂选自核黄素、维生素A、维生素D、维生素C、维生素E、维生素K、叶酸、β-胡萝卜素、维生素B1、烟酸、维生素B5、维生素B6、生物素、维生素B12、ω-3脂肪酸及其组合。
(56)实施方案(49)的非治疗性用途，其中所述哺乳动物是健康人。
(57)用于在健康的哺乳动物中维持或改善肠道功能的活性剂的非治疗性用途，所述活性剂选自核黄素、维生素A、维生素C、维生素D、维生素E、维生素K、叶酸、β-胡萝卜素、维生素B1、烟酸、维生素B5、维生素B6、生物素、维生素B12、ω-3脂肪酸及其组合。
(58)实施方案(51)的非治疗性用途，其中所述哺乳动物是人。
附图说明
图1施用作为水溶液(上图)或溶解在乙醇中(下图)的不同测试产品后，在发酵48小时后，产生的乙酸酯。还包括每种储液的阴性对照。RTG＝核黄素表级(Table Grade)，R5P＝核黄素-5-磷酸，AA＝抗坏血酸，RTG+AA＝核黄素表级+抗坏血酸，FA＝叶酸，VK1＝维生素K1，0080EE＝DHA，4535EE＝DHA+EPA，8000EE＝EPA。每种化合物均以3种剂量(0.2x，1x和5x)进行测试(表1)。
图2施用作为水溶液(上图)或溶解在乙醇中(下图)的不同测试产物后，在发酵48小时后，产生的丙酸酯。还包括每种储液的阴性对照。RTG＝核黄素表级，R5P＝核黄素-5-磷酸，AA＝抗坏血酸，RTG+AA＝核黄素表级+抗坏血酸，FA＝叶酸，VK1＝维生素K1，0080EE＝DHA，4535EE＝DHA+EPA，8000EE＝EPA。每种化合物均以3种剂量(0.2x，1x和5x)进行测试(表1)。
图3施用作为水溶液(上图)或溶解在乙醇中(下图)的不同测试产物后，在发酵48小时后，产生的丁酸酯。还包括每种储液的阴性对照。RTG＝核黄素表级，R5P＝核黄素-5-磷酸，AA＝抗坏血酸，RTG+AA＝核黄素表级+抗坏血酸，FA＝叶酸，VK1＝维生素K1，0080EE＝DHA，4535EE＝DHA+EPA，8000EE＝EPA。每种化合物均以3种剂量(0.2x，1x和5x)进行测试(表1)。
图4施用作为水溶液(上图)或溶解在乙醇(下图)中的不同测试产品后，在发酵48小时后，总SCFA产生。还包括每种储液的阴性对照。RTG＝核黄素表级，R5P＝核黄素-5-磷酸，AA＝抗坏血酸，RTG+AA＝核黄素表级+抗坏血酸，FA＝叶酸，VK1＝维生素K1，0080EE＝DHA，4535EE＝DHA+EPA，8000EE＝EPA。每种化合物均以3种剂量(0.2x，1x和5x)进行测试(表1)。
图5在transwell板中共培养的Caco-2和杯状细胞的示意图。跨上皮电阻(TEER)的测量提供有关极化细胞之间形成的紧密连接完整性的信息。“肠道渗漏”的特征是肠渗透性增加并且可以通过对细胞施压在体外获得。与对照细胞相比，添加顶端或基底外侧压力源(stressor)会导致TEER的时间依赖性显著降低，而萤光素黄细胞旁通量率则升高。
图6在健康的肠道细胞模型中，维生素和ω-3-脂肪酸对肠道完整性的影响。值描述为用48h发酵样品处理的细胞的跨上皮电阻(TEER)与用0h发酵样品处理的细胞的TEER之间的差异。每种化合物均以3种剂量(0.2x，1x和5x)进行测试(表1)。
图7在渗漏肠道细胞模型的基底外侧诱导中，维生素和ω-3-脂肪酸对肠道完整性的影响。值表示为用48h发酵样品处理的细胞的跨上皮电阻(TEER)/荧光黄与用0h发酵样品处理的细胞的TEER/荧光黄之间的差异。每种化合物均以3种剂量(0.2x，1x和5x)进行测试(表1)。
图8在渗漏肠道细胞模型的顶端诱导中，维生素和ω-3-脂肪酸对肠道完整性的影响。值表示为用48h发酵样品处理的细胞的跨上皮电阻(TEER)/荧光黄与用0h发酵样品处理的细胞的TEER/荧光黄之间的差异。每种化合物均以3种剂量(0.2x，1x和5x)进行测试(表1)。
图9在施用作为水溶液(上图)或溶解在乙醇中(下图)的不同测试产物后，在发酵24小时后，Shannon多样性指数。还包括每种储液的阴性对照。每种化合物均以3种剂量(0.2x，1x和5x)进行测试(表1)。
图10施用作为水溶液(上图)或溶解在乙醇中(下图)的不同测试产品后，在发酵24小时后，双歧杆菌的相对丰度(％)。还包括每种储液的阴性对照。每种化合物均以3种剂量(0.2x，1x和5x)进行测试(表1)。
图11施用作为水溶液(上图)或溶解在乙醇中(下图)的不同测试产品后，在发酵24小时后，参与乙酰辅酶A发酵至丁酸酯途径的基因的相对丰度(％)。还包括每种储液的阴性对照。每种化合物均以3种剂量(0.2x，1x和5x)进行测试(表1)。
图12维生素和ω-3脂肪酸对HT29细胞产生GROa-CXCL1的影响。数据以pg/ml表示。
图13维生素和ω-3脂肪酸对HT29细胞产生IL-8的影响。数据以pg/ml表示。
图14维生素和ω-3脂肪酸对HT29细胞产生MIP3A-CCL20的影响。数据以pg/ml表示。
图15在施用作为水溶液(上图)或溶解在乙醇中(下图)的不同测试产品后，在不同时间间隔(0-6h，6-24h和24-48h)内的气压(kPa)。还包括每种储液的阴性对照。每种化合物均以3种剂量(0.2x，1x和5x)进行测试(表1)。
图16在施用用于供体C(上图)或供体D(下图)的不同测试产品后，在不同时间间隔(0-6h，6-24h和24-48h)内的总SCFA产生。还包括阴性对照(空白)。每种化合物均以3种剂量(0.2x，1x和5x)进行测试(表2)。
图17使用供体C和供体D的粪便接种物(fecal inoculum)在孵育24h后，在对照培养中和具有测试产品的培养中双歧杆菌的丰度(log(细胞/ml))。
图18作为对照的水和补充的维生素之间的Bray-Curtis距离(β多样性)。虚线显示在24h时两个对照之间的Bray-Curtis距离，其用作参考点。
图19作为对照的水和补充维生素中Shannon多样性指数(α多样性)。虚线显示在24h的水对照中的α多样性值。比该参考对照大的多样性指数值显示为多样性增加。
图20A和B主坐标分析(PCoA)，基于A组(绿色阴影)、B(金色阴影)和C(粉红阴影)的肉鸡中的盲肠微生物群分布的加权(A)和未加权(B)的Unifrac距离。根据提供的颜色图例，样品被描述为以不同颜色阴影填充的点，从浅色(较早的样品)到深色(较后的样品)。在每个图中报告第一和第二坐标轴；报告由每个轴解释说明的在数据集中的变化百分比。
图21A-F主坐标分析(PCoA)，基于时间点T1(A，D)、T2(B，E)和T3(C，F)获得的肉鸡的盲肠微生物群分布的加权(A-C)和未加权(D-E)的Unifrac距离。样品被描绘为如图1所示的不同颜色阴影填充的点，A组为绿色，B组为金色，B组为粉红色。在每个图中报告第一和第二坐标轴；报告由每个轴解释说明的在数据集中的变化百分比。
图22如在时间点T1(A，D)、T2(B，E)和T3(C，F)获得的肉鸡的盲肠微生物群中，以Faith PD指数(A-C)和观察到的OTU数量(D-F)测量的α多样性。描绘了所有样品中多样性指数的箱状和须状分布。绿色、金色和粉红色阴影分别用于区分A、B和C组中的鸡。*，具有统计学显著性差异(P<0.0001)。
图23肉鸡盲肠生态系统的菌丝水平微生物群。A、B和C组中的每个可用时间点(T1，T2，T3)的肉鸡盲肠微生物组的平均系统发育分布作为饼图在门级下提供；至少在所有可用样品中的1％中，将细菌类群过滤，图形表示为>0.1％。
图24肉鸡盲肠生态系统的科水平微生物群分布。以科水平作为饼图提供每个可用时间点(T1，T2，T3)的A、B和C组的肉鸡的盲肠微生物组的平均系统发育分布；至少在所有可用样品中的1％中，将细菌类群过滤，图形表示为>0.5％。
图25肉鸡的盲肠微生物群中细菌科的相对丰度分布。描绘了对这些科来说在三个时间点(从左到右)的所有样品中相对丰度(％)的箱状和须状分布，表明在至少1时间点三组(A，B，C)之间的显著差异。绿色、金色和粉红色阴影分别用于区分A、B和C组中的鸡。当达到统计学显著性(P<0.05)时，报告Bejamini-Hocherg校正的P值。
图26肉鸡的盲肠微生物群中细菌属的相对丰度分布。描绘了对那些属来说在三个时间点(从左到右)在所有样品中相对丰度(°/o)的箱状和须状分布，表明在至少1个时间点中在三个组(A，B，C)之间的显著差异。绿色、金色和粉红色的阴影分别用于区分A、B和C组中的鸡。当达到统计学显著性(P<0.05)时，报告Bejamini-Hocherg校正的P值。
图27基于A组(绿色阴影)、B组(金色阴影)和C组(粉红色阴影)中的肉鸡的回肠微生物群分布的加权(A)和未加权(B)的UniFrac距离，进行的主坐标分析PCoA。根据提供的颜色图例，样品被描绘为填充不同颜色阴影的三角形，从浅色(较早的样品)到深色(较晚的样品)。在每个图中报告第一和第二坐标轴；报告由每个轴解释说明的在数据集中的变化百分比。
图28基于在时间点T1(A，D)、T2(B，E)和T3(C，F)下获取的肉鸡中的回肠微生物群分布的加权(A-C)和未加权(D-F)的Unifrac距离，进行的主坐标分析PCoA。样品被描绘为以不同颜色阴影填充的三角形，如图27所示，A组为绿色，B组为金色，B组为粉红色。在每个图中报告第一和第二坐标轴；报告由每个轴解释说明的在数据集中的变化百分比。
图29在时间点T1(A，D)、T2(B，E)和T3(C，F)获取的肉鸡中的回肠微生物群中的α多样性，以Faith PD指数(A-C)和观察到的OTU数量(D-F)测量。描绘了所有样品中的多样性指数的箱状和须状分布。绿色、金色和粉红色的阴影分别用于区分A、B和C组的鸡。统计学上显著差异(Kruskall Wallis检验)用相应的P值表示。
图30肉鸡回肠生态系统的门水平微生物群分布。A、B和C组中的每个可用时间点(T1，T2，T3)的肉鸡回肠微生物组的平均系统发育分布以饼图的形式在门水平细菌下提供；在所有可用样品中的至少1个中，将类群过滤，图形表示为>0.1％。
图31肉鸡回肠生态系统的科水平微生物群分布。A、B和C组中的每个可用时间点(T1，T2，T3)的肉鸡回肠微生物组的平均系统发育分布以饼图的形式在科水平细菌下提供；在所有可用样品中的至少1个中，将类群过滤，图形表示为>0.5％。
图32肉鸡回肠微生物群中消化链球菌科的相对丰度分布。在三个时间点(从左到右)下，描绘了所有样品中相对丰度的箱状和须状分布。分别用绿色、金色和粉红色阴影区分A、B和C组中的鸡。当达到统计学显著性时(P<0.05)，将报告Bejamini Hocherg校正的P值。
图33基于A组(绿色阴影)、B组(金色阴影)和C组(粉红色阴影)中的肉鸡中的垫草(litter)微生物群分布的加权(A)和未加权(B)的UniFrac距离的主坐标分析PCoA。样品被描绘为以不同颜色阴影填充的正方形，从浅色(较早的样品)到深色(较晚的样品)。在每个图中报告第一和第二坐标轴；报告由每个轴解释说明的在数据集中的变化百分比。
图34垫草生态系统的门水平微生物群分布。A、B和C组中的每个可用时间点(T1，T2，T3)的肉鸡的垫草微生物组的平均系统发育分布以饼图的形式在门水平细菌下提供；在所有可用样品中的至少1个中，将类群过滤，图形表示为>0.1％。
图35垫草生态系统的科水平微生物群分布。A、B和C组中的每个可用时间点(T1，T2，T3)的肉鸡的垫草微生物组的平均系统发育分布以饼图的形式在科水平细菌下提供；在所有可用样品中的至少1个中，将类群过滤，图形表示为>0.5％。
图36DSM盲肠样品C281 pH 7.13的水提取物的1H-NMR谱图。A中的垂直标度被放大，以便更好地了解下场区域(芳香区域)中的小信号。
图37所有样品的分级和归一化的1H-NMR光谱的PCA分数图，以及B)没有离群值的样品的PCA分数(图形通过使用R软件进行)。
图38A)61个样品的分级(binned)和归一化的1H NMR光谱的PLS-DA分数图，其中3个组表现出根据时间点线性可分离。B)考虑对照组[A]和治疗组[B+C]的PLS-DA分数图(图形使用Python软件进行)。
图39在5.793ppm(d)下尿嘧啶信号的积分的箱形图；根据以下时间点比较样品：A)在T0下，对应于14天；B)在T1下，对应于28天，和C)T2，对应于42天。
图40在2.0447ppm(m)下谷氨酸酯信号的积分的箱形图；根据以下时间点比较样品：A)在T0下，对应于14天；B)在T1下，对应于28天，和C)T2，对应于42天。在所有处理中，尿嘧啶的浓度似乎都增加到42天，尤其是对于样品C。
图41在1.470ppm(d)下丙氨酸信号的积分的箱形图；根据以下时间点比较样品：A)在T0下，对应于14天；B)在T1下，对应于28天，和C)T2，对应于42天。
图42在3.920ppm(s)下肌酸信号的积分的箱形图；根据以下时间点比较样品：A)在T0下，对应于14天；B)在T1下，对应于28天，和C)T2，对应于42天。
图43在0.883ppm(t)下丁酸酯信号的积分的箱形图；根据以下时间点比较样品：A)在T0下，对应于14天；B)在T1下，对应于28天，和C)T2，对应于42天。
图44在1.0446ppm(m)下丙酸酯信号的积分的箱形图；根据以下时间点比较样品：A)在T0下，对应于14天；B)在T1下，对应于28天，和C)T2，对应于42天。
图45在1.0909ppm(s)下乙酸酯信号的积分的箱形图；根据以下时间点，比较样品：A)在T0下，对应于14天；B)在T1下，对应于28天，和C)T2，对应于42天。
图46平均代谢物信号的积分与时间的对数正态拟合。比较是以标准偏差作为误差条的分组处理。半透明区域定义拟合的95％置信区间。
图47所有样品(63个样品)的所有归一化功能特点(6361数据)的PCA分数图。
图48对于每个时间点与对照组(A组)相比，治疗组(B和C组)的归一化功能特点的PCA分数图。
图49对于每个可用时间点(T1，T2，T3)，三个不同组A、B和C的肉鸡盲肠中主要的KEGG代谢途径。
图50对于每个可用时间点(T1，T2，T3)，三个不同组A、B和C的肉鸡盲肠中环境信息处理和代谢途径(Environmental Information Processing and Metabolism pathways)的相对丰度(KEGG数据库)，其相对丰度在统计学上显著。绿色和红色箱分别与B和C组相关，而蓝色箱与A组相关。P值显示在每个图形的右上角。
图51对于每个可用时间点(T1，T2，T3)，三个不同组A、B和C的肉鸡盲肠中的相对丰度≥0.5％的次级KEGG代谢途径。
图52显示用于丁酸酯合成的四种不同途径和相应的基因(蛋白质名称)。示出了主要底物。以红色强调末端基因。L2Hgdh，2-羟基戊二酸酯脱氢酶；Gct(Get)，戊烯二酸酯CoA转移酶(α，β亚基)；HgCoAd，2-羟基-戊二酰基-CoA脱氢酶(α,β,γ亚基)；Gcd，戊烯二酰基-CoA脱羧酶(α,β亚基)；Thl，硫解酶；hbd，β-羟基丁酰基-CoA脱氢酶；Cro，烯酰水合酶(crotonase)；Bcd(Bed)，丁酰基-CoA脱氢酶(包括电子转移蛋白α,β亚基)；KamA，赖氨酸-2,3-氨基变位酶；KamD,E，
Figure BDA0002954975430000221
赖氨酸-5,6-氨基变位酶(α,β亚基)；Kdd，3,5-二氨基己酸酯脱氢酶；Kce，3-酮-5-氨基己酸酯裂解酶；Kal，3-氨基丁酰基-CoA脱氨酶；AbfH，4-羟基丁酸酯脱氢酶；AbfD，4-羟基丁酰基-CoA脱氢酶；Isom，乙烯基乙酰基-CoA3,2-异构酶(与AbfD蛋白质相同):4Hbt，丁酰基-CoA:4-羟基丁酸酯CoA转移酶；But，丁酰基-CoA:乙酸酯CoA转移酶；Ato，丁酰基-CoA:乙酰乙酸酯CoA转移酶(α,β亚基)；Ptb，磷酸酯丁酰基转移酶；Buk，丁酸酯激酶。显示各个丁酰基-CoA转移酶的共底物。(Vital等人，2014年)
定义
在整个说明书和权利要求书中使用的术语“有益细菌”包括选自以下属的至少一种细菌类群：氨基酸球菌属，阿克曼氏菌属，拟杆菌，双歧杆菌，布劳特氏菌属，梭菌属，柯林斯菌，Dorea，大肠杆菌，真杆菌属，(栖)粪杆菌属，毛螺菌属，乳酸杆菌，副拟杆菌，拉乌尔菌属，罗斯氏菌属，瘤胃球菌属，普氏菌属和Christensenella。此外，以下丹毒丝菌科、红蝽菌科、巴恩斯氏菌科可以包括有益的细菌类群。
如在整个说明书和权利要求书中所使用的，当提及“烟酸”时，它不是唯一的活性剂。如果存在，则其与至少另一种活性剂组合，并且优选不存在烟酸。
“超生理”剂量是指与“超营养”剂量相同的剂量，即高于动物的活性成分的推荐量的剂量，使得至少有效量的活性成分存在于动物肠、优选其下肠和/或结肠内，并且可用于直接滋养细菌种群。
“唯一的活性剂”是指存在于肠中、优选结肠中的仅有的活性剂。
如本文所用，术语“肠”是指由小肠和大肠组成的胃肠道部分。
如本文所用，术语“维生素A”是指选自视黄醇、视黄醛、视黄酸和维生素原A类胡萝卜素(最明显地是β-胡萝卜素)的化合物。在一个优选的实施方案中，维生素A是视黄醇。本文所用的维生素A的任何浓度或量涉及的是视黄醇当量。
术语“维生素E”是指具有α-生育酚活性的化合物。在一个优选的实施方案中，维生素E是α-生育酚及其酯，特别是乙酸生育酚。本文提到的维生素E的任何浓度或量涉及的是α-生育酚当量。
如本文所用，术语“维生素D”是指维生素D3。25-羟基维生素D3可代替维生素D3或附加到维生素D3使用，优选用于非人类物种。25-羟基维生素D3与维生素D3的相对强度为约40:1，因此应相应调节25-羟基维生素D3的剂量。
术语“核黄素”包括核黄素及其酯，特别是核黄素-5’-磷酸酯。
术语“叶酸”是指叶酸及其药学上可接受的盐。
术语“维生素C”是指抗坏血酸，其药学上可接受的盐(例如抗坏血酸钠和抗坏血酸钙)及其药学上可接受的酯(特别是抗坏血酸棕榈酸酯)。
术语“维生素K”包括维生素K1和维生素K2。
术语“β-胡萝卜素”是指β-胡萝卜素或维生素原A。
术语“维生素B1”是指硫胺素、抗神经炎素及其药用盐(例如硫胺素单硝酸盐)。
术语“烟酸”是指尼克酸，维生素B3，吡啶-3-羧酸，并且包括烟酰胺或尼克酰胺。它可以与至少一种其他活性成分组合存在，但是当它是唯一活性成分时，本发明特别地排除了它。
术语“维生素B5”是指泛酸及其药学上可接受的盐(例如泛酸钙)，并且包括其衍生物泛酰醇(pantothenol)或泛醇(panthenol)。
术语“维生素B6”是指吡哆醛磷酸盐并且包括吡哆醛5’磷酸盐。
术语“生物素”是指维生素B7、维生素H、辅酶R、生物表皮。
术语“维生素B12”是指钴胺素并且包括所有形式的维生素B12(例如，氰钴胺素和甲基钴胺素)。
“ω-3脂肪酸”是在n-3位具有双键的多不饱和脂肪酸。在一个优选的实施方案中，ω-3脂肪酸是二十碳五烯酸(EPA)或二十二碳六烯酸(DHA)或两者的组合。
具体实施方式
一方面，本发明涉及在改善动物中的肠健康中的应用的活性剂，所述活性剂选自核黄素、维生素A、β-胡萝卜素、维生素C、维生素D、维生素E、维生素K、叶酸、β-胡萝卜素、维生素B1烟酸(如果存在)、维生素B5、维生素B6、生物素、维生素B12、ω-3脂肪酸及其组合，其中所述改善包括或由以下组成：
(i)增加所述肠中的至少一种短链脂肪酸或其盐的浓度，
(ii)增加所述肠中的微生物组多样性，
(iii)增加所述肠中的有益细菌的微生物丰度，
(iv)促进或增加所述肠中的丁酸酯合成途径，
(v)改善肠屏障功能；
(vi)减少肠道的氧化还原电位；
(vii)减少肠中产生的气体量，以及
(vii)刺激肠免疫反应；
其中所述应用包括向动物施用
a)包含有效剂量的活性剂的制剂，其中所述活性剂被递送到大肠；或
b)超生理剂量的活性成分，以使在动物的肠中存在至少有效量的活性成分；
前提是，如果烟酸是活性剂，它不是唯一的活性剂；并且如果存在核黄素，它具有除了增加普氏栖粪杆菌的量外的改善作用。
通常，所述应用包括将包含有效剂量的活性剂的延迟释放制剂施用到可以是哺乳动物的动物，其中所述活性剂的释放被延迟直到大肠或直到结肠，或通过非口服途径施用，其中将试剂直接递送到结肠。延迟释放制剂及其制备在下文中更详细地解释。
当动物是非人类动物，例如单胃动物或家禽时，可以通过延迟释放制剂施用，从而将活性剂的释放延迟直到大肠，或通过使用饲料中的超生理剂量施用，使肠中存在有效量的活性剂。当动物是人时，可以按照说明书中详述的多种方式进行施用，包括施用延迟释放制剂，通过非口服途径施用和/或通过超生理剂量施用。
在一些实施方案中，烟酸不被认为是本发明的活性剂之一。
增加短链脂肪酸/促进丁酸酯的合成
如本文所用，术语“短链脂肪酸”(SCFA)是指具有两个至六个碳原子的脂肪酸。SCFA包括甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、2-甲基丙酸、3-甲基丁酸和己酸。最重要的SCFA是乙酸、丙酸和丁酸。
动物结肠中一种或多种SCFA浓度的“增加”是相对于未施用活性剂的动物的SCFA浓度的。没有施用活性剂的动物在本文中称为“对照动物”。优选地，动物结肠中一种或多种SCFA的浓度的“增加”是相对于未施用活性剂的同一动物的SCFA浓度。也就是，在这种情况下的对照动物通常是在开始施用活性剂之前的同一动物。优选地，对照动物至少28天没有接受营养补充剂形式的本文所述的活性剂。在一些实施方案中，动物是哺乳动物；在一些实施方案中，动物是单胃动物，例如猪。在一些实施方案中，动物是家禽。
在一实施方案中，乙酸的浓度在施用活性剂时增加。在另一个实施方案中，丙酸的浓度在施用活性剂时增加。在另一个实施方案中，丁酸的浓度在施用活性剂时增加。在又一个实施方案中，乙酸、丙酸和丁酸的浓度在施用活性剂时增加。
在一个实施方案中，一种或多种SCFA的浓度在单次施用活性剂后增加。在另一个实施方案中，一种或多种SCFA的浓度在两次施用活性剂(连续两天施加)后增加。在另一个实施方案中，一种或多种SCFA的浓度在七次施用活性剂(连续七天施加)后增加。在另一个实施方案中，一种或多种SCFA的浓度在14次施用活性剂(连续14天施加)后增加。优选地，一种或多种SCFA(例如，乙酸、丙酸和/或丁酸)的浓度在21次施用活性剂(连续21天施加)后增加。最优选地，一种或多种SCFA(例如，乙酸、丙酸和/或丁酸)的浓度在28次施用活性剂(连续28天施加)后增加。
相对于对照的结肠中的SCFA浓度，结肠中的SCFA的浓度可以增加至少5％，优选至少10％，或至少15％，或至少20％。在对照中没有施用活性剂。
结肠中的SCFA的浓度可以通过从施用活性剂的哺乳动物获得粪便样品并测量一种或多种SCFA的浓度来确定。
用于测量通常已知的SCFA浓度的方法是本领域技术人员已知的，例如通过气相色谱法。例如，De Weirdt等人(2010)(DOI:10.1111/j.1574-6941.2010.00974.x)描述了合适的方法。
或者，可以使用反应器和粪便悬浮液作为体外模型来确定在施用活性剂后一种或多种SCFA的增加，如本申请的实施例中所述。
进一步发现，施用活性剂导致参与乙酰辅酶A发酵至丁酸酯途径的基因的相对丰度增加。因此，本发明涉及活性剂用于激活或增加丁酸酯合成途径的的用途。可以如实施例中所述确定参与乙酰辅酶A发酵的丁酸酯途径相关的基因的相对丰度。
本文所述的活性剂是有效增加哺乳动物的结肠中的至少一种SCFA的浓度和/或改善肠屏障功能的微量营养素。发现维生素A、维生素C、核黄素、维生素D、维生素E、维生素K、叶酸和ω-3脂肪酸在某些情况下施用时能够增加哺乳动物的结肠中至少一种SCFA的浓度。
优选用于增加丁酸酯途径的活性剂是维生素A、维生素C、核黄素、维生素E、叶酸、β-胡萝卜素、ω3脂肪酸及其组合。通过这种作用可以治疗、改善或预防的病症包括代谢紊乱、2型糖尿病、肥胖症、慢性炎症和动脉生成(arterogenesis)。
因此，本发明的另一个实施方案是一种在患有病症的包括人的动物中增加至少一种短链脂肪酸和/或增加丁酸酯合成途径活性的方法，所述病症选自代谢紊乱、2型糖尿病、肥胖症、慢性炎症和动脉生成，所述方法包括施用至少一种选自维生素A、维生素C、核黄素、维生素E、叶酸、β-胡萝卜素、ω3脂肪酸及其组合的活性剂。
本发明的另一个实施方案是在改善动物(包括人)中的肠健康中的应用的活性剂，其中所述改善包括增加所述肠中的至少一种短链脂肪酸或其盐的浓度；或促进或增加所述肠中的丁酸酯合成途径；其中所述短链脂肪酸选自乙酸、丙酸和丁酸或其盐。
本发明的另一个实施方案是在增加所述肠中的至少一种短链脂肪酸或其盐的浓度中的应用的活性剂，所述活性剂选自维生素A、β-胡萝卜素、维生素C、核黄素、维生素D、维生素E、维生素K、叶酸、ω3脂肪酸及其组合。
本发明的另一个实施方案是用于改善包括人的动物中的肠健康的活性剂，其中所述改善包括增加所述肠中的至少一种短链脂肪酸或其盐的浓度；或促进或增加所述肠中的丁酸酯合成途径，其中所述动物(包括人)患有选自以下的病症：代谢紊乱，2型糖尿病，肥胖症，慢性炎症和动脉粥样化形成。
微生物组多样性和增强有益细菌
进一步观察到，活性剂的施用增加肠中的微生物组多样性。因此，本发明涉及活性剂用于增加肠道微生物组多样性、优选结肠微生物组多样性的用途。微生物组的多样性可以如在用于人、猪和家禽的实例中所述地进行测定。
特别地，发明人发现活性剂的补充增加人中的有益细菌的相对丰度，所述有益细菌优选为乳酸杆菌、双歧杆菌、阿克曼氏菌和栖粪杆菌。因此，本发明涉及活性剂用于增加在肠中、优选在结肠中有益细菌的相对丰度的用途，并且有益细菌优选地包括乳酸杆菌、双歧杆菌和/或栖粪杆菌中的至少一种。
例如在家禽中，拟杆菌和栖粪杆菌增加。因此，另一个实施方案是增加动物中有益细菌的方法，所述方法包括向动物施用超生理剂量的活性剂。
有益细菌的丰度的增加可以治疗、预防或减轻肠易激综合症、代谢疾病、肥胖症和炎性病症的症状。
优选的试剂是维生素B1、核黄素、维生素B5、维生素B12、β-胡萝卜素、生物素、维生素C、维生素E、维生素D、叶酸、维生素K、ω3脂肪酸及其组合，但是如果核黄素是活性剂，那么其出于除增加普氏栖粪杆菌的丰度外的目的存在。
因此，本发明的另一个实施方案是一种在有需要的包括人的动物中治疗、预防或减轻肠易激综合症、代谢疾病、肥胖症或炎性病症的症状的方法，所述方法包括：向动物的结肠施用有益细菌增强量的活性剂；所述活性剂选自：维生素B1，核黄素，维生素B5，维生素B12，β-胡萝卜素，生物素，维生素C，维生素E，维生素D，叶酸，维生素K，ω3脂肪酸及其组合；前提是如果核黄素是活性剂，那么其出于除增加普氏栖粪杆菌的丰度外的目的存在。
本发明的另一个实施方案是用于改善肠道健康的活性剂，其中所述改善包括增加所述肠中的微生物组多样性和/或增加结肠中增加的有益细菌的丰度。增加的有益细菌选自氨基酸球菌属(Acidaminococcus)、阿克曼氏菌种(Akkermansia sp.)卵形拟杆菌(Bacteroides ovatus)、双歧杆菌属(Bifidobacterium spp.)、产布鲁氏菌(Blautiaproducta)、产气荚膜梭菌(Clostridium cocleatum)、产气柯林斯菌(Collinsellaaerofaciens)、Dorea longicatena、大肠杆菌、真杆菌属(Eubacterium spp.)、普氏栖粪杆菌(Faecalibacterium prausnitzii)、裂果胶毛螺菌(Lachnospira pectinoshiza)、乳酸杆菌属(Lactobacillus spp.)、狄氏副拟杆菌(Parabacteroides distasonis)、拉乌尔菌属(Raoultella spp.)、罗氏菌属(Roseburia spp.)、瘤胃球菌属(Ruminococcus spp.)、链球菌属(Streptococcus spp.)及其组合，但前提是如果存在核黄素，则它具有除了增加普氏栖粪杆菌的数量外的改善作用。优选地，增加的细菌选自双歧杆菌、阿克曼氏菌、栖粪杆菌和拟杆菌(Bacteriodes)。
活性剂可以用于患有包括选自以下的病症的动物(包括人)中，所述病症包括：肠易激疾病、代谢疾病、肥胖症和炎性病症。优选地，所述活性剂选自：维生素B1、维生素B2、维生素B5、维生素B6、维生素B12、β-胡萝卜素、生物素、维生素C、维生素E、维生素D、叶酸、维生素K、ω3脂肪酸及其组合。
刺激免疫反应
进一步观察到，在施用活性剂后，用来自24h肠分批发酵的流出物处理细胞后，通过结肠上皮细胞系HT29产生的某些标志物和细胞因子增加。生物标志物和细胞因子包括GROa-CXCL1、IL-8和MIP3A-CCL20。
GROa-CXCL1是一种在炎症中起重要作用并充当嗜中性粒细胞的化学引诱物(chemoattractant)的趋化因子。它通过在组织部位募集并激活嗜中性粒细胞以杀死微生物来激活宿主的免疫反应。还已知CXCL1会激活蛋白酶和活性氧物类(ROS)的释放用于微生物防御。
白介素8(IL-8)是一种已知具有中性粒细胞迁移能力的化学引诱物细胞因子，中性粒细胞迁移能力有助于增强趋化性。它在靶细胞中诱导趋化性，导致嗜中性粒细胞和其他粒细胞向感染部位迁移。
MIP3A-CCL20也是一种可以选择性地吸引效应子和记忆T淋巴细胞、未成熟的DC和表达受体CCR6的天然B细胞的趋化因子。CCL20在免疫屏障(例如胃肠道和皮肤)中组成性表达。
所有这些生物标志物都反映免疫反应的激活。
刺激免疫反应可以有益于包括慢性炎症以及急性炎症的病症。
优选的试剂是核黄素、维生素E、维生素A、维生素K及其组合。
因此，本发明的另一个实施方案是通过向有需要的动物的结肠使用和/或施用有效量的活性剂来刺激肠免疫反应、改善免疫弱化症状、产生全身性抗炎反应的试剂的用途，其中所述试剂选自核黄素、维生素E、维生素A、维生素K及其组合。另一个实施方案是一种治疗、预防或减轻慢性或急性炎症症状的方法，所述方法包括向动物的结肠施用免疫刺激有效量的试剂，其中所述试剂选自核黄素、维生素E、维生素A、维生素K及其组合。
本发明的另一个实施方案是应用于改善肠道健康的活性剂，其中所述改善是刺激肠免疫反应。优选地，该应用是增加选自以下的免疫反应分子：GROa-CXCL1、MIP3A-CCL20、白介素8及其组合。优选地，活性剂选自：维生素B2、维生素E、维生素D、维生素A和维生素K及其混合物。
另一个实施方案是一种改善患有急性或慢性炎症的动物(包括人)中的肠免疫反应的方法，所述方法包括向肠施用选自核黄素、维生素E、维生素A、维生素K及其组合的活性剂。
氧化还原电位
虽然通常抗氧化剂化合物(例如维生素C和E)不会到达结肠，将抗氧化剂维生素和化合物至大肠的结肠靶向递送可降低肠道中的氧化还原电位。这种较低的氧化还原电位可以抵消与正常肠道微生物群落的组成和活性的紊乱有关的症状，尤其是在其中肠道微生物组环境面临更多氧和/或氧自由基的存在的情况下，这会阻碍严格厌氧有益微生物的生长，促进耐氧致病菌的生长，和/或引起宿主细胞的炎症和细胞损伤。
因此，本发明的另一个实施方案是活性剂、优选维生素C和/或E的用途，用于降低肠道中的氧化还原电位，从而减少耐氧致病菌的生长、减少肠道炎症和由此引起的细胞损伤，以及促进有益的严格厌氧(anerobic)细菌的生长。
此外，本发明的另一个实施方案是活性剂、优选维生素C和/或E的用途，用于降低血浆游离硫醇，血浆游离硫醇是各种炎性病症(如炎性肠病)中全身氧化还原状态的量度。
因此，本发明的另一个实施方案是降低肠的氧化还原电位的方法，所述方法导致选自以下的益处：
促进严格厌氧的有益细菌在结肠中的生长；
减少肠道中的耐氧致病菌；
减少肠道中的炎症；和
减少由肠道中的炎症引起的肠道细胞损伤；
包括向有需要的动物(包括人)施用选自核黄素、维生素C、维生素E及其混合物的试剂。
产气
结肠孵育在封闭的孵育系统中进行。这使我们能够评估顶部空间中气体的积聚，可以用压力计进行测量。产气是微生物活性的量度，并且因此也是潜在益生元底物的发酵速度的量度。在消耗益生元后，它可以用作腹胀和消化健康的指征。
如实施例所示，可以使用活性剂、优选维生素B2和/或维生素C来减少肠中产生的气体量。
因此，本发明的另一个实施方案是一种治疗、预防或减少肠道中产生的气体量的方法，所述方法包括将选自维生素B2、维生素C及其组合的活性剂递送到大肠。
增强肠屏障
Caco-2和HT29-MTX-E12细胞的共培养用于评估发酵前后上清液的保护作用。跨上皮电阻(TEER)读数与汇合(confluent)单层的紧密度相关(Srinivasan等人2015)，并且可用作肠屏障强度的指标。在与包括肠易激疾病、克罗恩病、溃疡性结肠炎、肠道渗漏和营养不良的许多病症相关的病症中，观察到肠屏障强度降低。
用于改善肠道屏障的优选试剂是核黄素、维生素C、维生素E、ω-3脂肪酸、维生素D、维生素A、叶酸、维生素K及其混合物。因此，本发明的另一个实施方案是一种治疗、预防或减轻选自肠易激疾病、克罗恩病、溃疡性结肠炎、肠道渗漏和营养不良的病症的症状的方法，所述方法包括向有需要的包括人的动物施用选自核黄素、维生素C、维生素E、ω-3脂肪酸、维生素D、维生素A、叶酸、维生素K及其混合物的试剂。
本发明的另一个实施方案是根据改善肠道健康的活性剂的用途，其中所述改善包括改善肠屏障功能。可以在患有病症的包括人的动物中使用，所述病症选自：肠易激疾病、克罗恩病、溃疡性结肠炎、肠道渗漏和营养不良。优选地，所述活性剂选自：维生素B2、维生素C、维生素E、ω-3脂肪酸、维生素D、维生素A、叶酸、维生素K1及其混合物。
剂量和浓度
本文所用的剂量旨在除哺乳动物为了一般营养目的而摄入的活性成分之外(inaddition to)的情形。反而，它们在肠道微生物的属、种和菌株水平下整体作用于肠道微生物组环境。活性剂不是旨在被哺乳动物直接代谢，而是它们旨在被结肠的细菌种群利用。因此，以下报告的数量除了通常的饮食外还将被动物消耗，但是它们由于它们的延迟释放而不能直接用于动物。
Figure BDA0002954975430000321
*所有维生素的上限均基于负责任的营养委员会的推荐(https://www.crnusa.org/resources/vitamin-mineral-safety)。对于DHA和EPA，浓度上限基于EFSA中的UL水平。
优选地，核黄素以使其在结肠中的局部浓度为至少0.01mg/ml，优选至少0.1mg/ml，更优选至少0.5mg/ml，最优选至少1.25mg/ml，例如约1.4mg/ml的量施用。结肠中的优选局部浓度为约0.01mg/ml至约5mg/ml，或约0.1mg/ml至约4mg/ml，或约0.5mg/ml至约3mg/ml，或约1.25mg/ml至约2mg/ml。
在适合家禽的一个实施方案中，超生理量可以是推荐剂量的至少约10倍或甚至20倍，例如，如果推荐每日剂量是5mg，饲料中的施用量是50mg或100mg，以使核黄素在结肠中存在。
优选地，维生素E以其在结肠中的局部浓度为至少0.01mg/ml，优选至少0.05mg/ml，最优选至少0.1mg/ml的量施用。结肠中优选的局部浓度为约0.01mg/ml至约5mg/ml，更优选为约0.03mg/ml至约4mg/ml，最优选为约0.05mg/ml至约3mg/ml。
优选地，抗坏血酸以使其在结肠中的局部浓度为至少0.05mg/ml，优选至少0.1mg/ml，最优选至少0.5mg/ml的量施用。结肠中的优选局部浓度为约0.05mg/ml至约50mg/ml，更优选约0.1mg/ml至约20mg/ml，最优选约1mg/ml至约10mg/ml。
优选地，维生素D以其在结肠中的局部浓度为至少0.01pg/ml，优选至少0.03pg/ml，最优选至少0.04μg/ml或至少0.1pg/ml的量施用。结肠中的优选局部浓度为约0.01pg/ml至约20pg/ml，更优选为约0.03pg/ml至约10pg/ml，最优选为约0.04pg/ml至约2pg/ml。或者，约0.1pg/ml至约2pg/ml。
优选地，维生素A以使其在结肠中的局部浓度为至少0.05pg/ml，优选至少0.1pg/ml，最优选至少0.2pg/ml的量施用。结肠中的优选局部浓度为约0.05pg/ml至约20pg/ml，更优选为约0.1pg/ml至约10pg/ml，更优选为约0.2pg/ml至约5pg/ml。
优选地，维生素K以使其在结肠中的局部浓度为至少0.01mg/ml，优选至少0.03mg/ml，最优选至少0.04mg/ml的量施用。结肠中优选的局部浓度为约0.01mg/ml至约5mg/ml，更优选为约0.03mg/ml至约1mg/ml，最优选为约0.05mg/ml至约0.5mg/ml。
优选地，叶酸以使其在结肠中的局部浓度为至少0.1pg/ml，优选至少0.5pg/ml，最优选至少1pg/ml的量施用。结肠中的优选局部浓度为约0.1pg/ml至约20pg/ml，更优选为约0.5pg/ml至约15pg/ml，最优选为约1pg/ml至约10pg/ml。
优选地，β-胡萝卜素以使其在结肠中的局部浓度为至少5pg/ml，优选地至少40pg/ml，最优选地至少100pg/ml的量施用。结肠中优选的局部浓度为约5pg/ml至约20mg/ml，更优选为约40pg/ml至约10mg/ml，最优选为约100pg/ml至约5mg/ml。
优选地，维生素B1以使其在结肠中的局部浓度为至少1pg/ml，优选至少10pg/ml，最优选至少20pg/ml的量施用。结肠中优选的局部浓度为约1pg/ml至约10mg/ml，更优选为约10pg/ml至约5mg/ml，最优选为约20pg/ml至约1mg/ml。
优选地，烟酸以使其在结肠中的局部浓度为至少0.5pg/ml，优选至少1pg/ml，最优选至少2pg/ml或至少3pg/ml的量施用。结肠中的优选局部浓度为约0.5pg/ml至约1mg/ml，更优选为约1pg/ml至约500pg/ml，最优选为约2pg/ml至约100pg/ml。如果施用烟酸，那么它不是唯一的活性剂。
优选地，维生素B5以使其在结肠中的局部浓度为至少0.05mg/ml，优选至少0.1mg/ml，最优选至少0.4mg/ml的量施用。结肠中的优选局部浓度为约0.05mg/ml至约100mg/ml，更优选约0.1mg/ml至约50mg/ml，最优选约0.4mg/ml至约20mg/ml。
优选地，维生素B6以使其在结肠中的局部浓度为至少1pg/ml，优选至少5pg/ml，最优选至少10pg/ml的量施用。结肠中优选的局部浓度为约1pg/ml至约3mg/ml，更优选为约5pg/ml至约1mg/ml，最优选为约10pg/ml至约500pg/ml。
优选地，生物素以使其在结肠中的局部浓度为至少1pg/ml，优选至少2pg/ml，最优选至少4pg/ml的量施用。结肠中优选的局部浓度为约1pg/ml至约1mg/ml，更优选为约2pg/ml至约500pg/ml，最优选为约4pg/ml至约200pg/ml。
优选地，维生素B12以使其在结肠中的局部浓度为至少0.01pg/ml，优选至少0.03pg/ml，最优选至少0.05pg/ml的量施用。结肠中优选的局部浓度为约0.01pg/ml至约10pg/ml，更优选为约0.03pg/ml至约5pg/ml，最优选为约0.05pg/ml至约2pg/ml。
优选地，ω-3脂肪酸以使其在结肠中的局部浓度为至少0.02mg/ml，优选至少0.05mg/ml，最优选至少0.1mg/ml的量施用。结肠中优选的局部浓度范围为约0.02mg/ml至约2mg/ml，更优选为约0.05mg/ml至约1.5mg/ml，最优选为约0.1mg/ml至约1mg/ml。在另一个实施方案中，ω-3脂肪酸以使其在结肠中的局部浓度为至少0.02mg/ml，优选至少0.05mg/ml，最优选至少0.1mg/ml的量施用。结肠中优选的局部浓度为约0.02mg/ml至约100mg/ml，更优选为约0.05mg/ml至约75mg/ml，最优选为约0.1mg/ml至约60mg/ml。在另一个实施方案中，活性剂以至多2.9mg核黄素/kg体重、至多42.9pg维生素A/kg体重、至多3.6pg维生素D/kg体重、至多28.6mg维生素C/kg体重、至多14.3mg维生素E/kg体重、至多143pg维生素K/kg体重、至多14.3pg叶酸/kg体重、至多0.4mgβ-胡萝卜素、至多1.4mg维生素B1、至多21.4mg烟酸、至多14.3mg维生素B5、至多1.4mg维生素B6、至多35.7pg生物素、至多43pg维生素B12、71.4mgω-3脂肪酸/kg体重或其组合的每日剂量施用到哺乳动物，其中优选地EPA是至多25.7mg/kg体重并且DHA是至多14.3mg/kg体重。
另一个实施方案是用于将活性剂递送到肠的延迟释放制剂，所述制剂包含活性剂和肠溶层或肠衣，其中所述活性剂由至多200mg核黄素，至多3000pg维生素A，至多2000mg维生素C，至多250pg维生素D，至多1000mg维生素E，至多10mg维生素K，至多1mg叶酸，至多25mgβ-胡萝卜素，至多100mg维生素B1，至多1500mg烟酸，至多1000mg维生素B5，至多100mg维生素B6，至多2500μg生物素，至多3000μg维生素B12，至多5000mgω-3脂肪酸或其组合组成，其中优选地EPA是至多1800mg并且DHA是至多1000mg，并且其中所述活性剂的释放被延迟直到肠。
另一个实施方案是用于将活性剂递送到肠的延迟释放制剂，所述制剂包含活性剂和肠溶层或肠衣，其中所述活性剂由1-85mg核黄素、0.2-0.4mg维生素A、400-600mg维生素C、5-80pg维生素D、80-120mg维生素E、80-140pg维生素K、0.3-0.5mg叶酸、80-120mgω-3脂肪酸或其组合组成，并且其中所述活性剂的释放被延迟直到肠。
另一个实施方案是物品的延迟释放制剂，其中所述活性剂由70-80mg核黄素、0.25-0.35mg维生素A、450-550mg维生素C、15-25pg维生素D、90-110mg维生素E、100-120pg维生素K、0.35-0.45mg叶酸、90-110mgω-3脂肪酸或其组合组成。
在一个实施方案中，核黄素作为唯一的活性剂施用。
在另一个实施方案中，维生素A作为唯一的活性剂施用。
在另一个实施方案中，维生素C作为唯一的活性剂施用。
在另一个实施方案中，维生素D作为唯一的活性剂施用。
在另一个实施方案中，维生素E作为唯一的活性剂施用。
在另一个实施方案中，维生素K作为唯一的活性剂施用。
在另一个实施方案中，一种或多种ω-3-脂肪酸作为唯一的活性剂施用。
在一个实施方案中，叶酸作为唯一的活性剂施用。
在另一个实施方案中，β-胡萝卜素作为唯一的活性剂施用。
在另一个实施方案中，维生素B1作为唯一的活性剂施用。
在另一个实施方案中，维生素B5作为唯一的活性剂施用。
在另一个实施方案中，维生素B6作为唯一的活性剂施用。
在另一个实施方案中，生物素作为唯一的活性剂施用。
在另一个实施方案中，维生素B12作为唯一的活性剂施用。
在另一个实施方案中，DHA作为唯一的活性剂施用。
在另一个实施方案中，EPA作为唯一的活性剂施用。
在另一个实施方案中，EPA和DHA作为唯一的活性剂施用。
在另一个实施方案中，活性剂由核黄素、维生素A、维生素D、维生素E、维生素K、叶酸、EPA和DHA的组合组成。在又一个实施方案中，活性剂由核黄素、维生素A、维生素C、维生素D、维生素E、维生素K、叶酸、EPA和DHA的组合组成。在又一个实施方案中，活性剂由核黄素、维生素A、维生素C、维生素D、维生素E、维生素K、叶酸、β-胡萝卜素、维生素B1、烟酸、维生素B5、维生素B6、生物素、维生素B12、EPA和DHA的组合组成。
在一个实施方案中，本发明的延迟释放制剂每天施用一次。在其他实施方案中，所述制剂每天两次或每两天施用一次。
在一实施方案中，将活性剂施用到哺乳动物。哺乳动物可以是马、牛、猪、狗或猫。更优选地，哺乳动物是人类，例如成年人。在一个实施方案中，该成年人的体重指数(BMI)为至少20或至少25或甚至至少30。例如，BMI的范围可以为25至35，或26至34，或27至33，或28至32。
待治疗或预防的病症
根据本发明的第一方面，施用活性剂以增加一种或多种SCFA的浓度。因此，可以治疗或预防与结肠中SCFA水平受损有关的任何病症。如果SCFA的水平相对于健康个体的水平显著降低至少10％或至少20％或至少30％，则会损害其水平。粪便浓度可以作为结肠中浓度的量度。
根据本发明待治疗或预防的病症包括炎性病症、以炎症特别是慢性炎症为特征的病症以及动脉粥样化形成。另外，可以治疗或预防或改善诸如2型糖尿病的代谢紊乱或肥胖症。此外，可以治疗免疫功能低下或过敏。
根据本发明的另一方面，为了改善或增强肠中的屏障功能，施用活性剂。在一个实施方案中，改善或增强小肠中的屏障功能。在另一个实施方案中，改善或增强大肠中的屏障功能。在另一个实施方案中，改善或增强结肠中的屏障功能。因此，可以治疗、改善或预防与肠渗透性增加相关的任何状况或病症。待治疗的病症包括但不限于以肠渗透性增加、肠病(例如环境性肠病，营养不良引起的肠病)、炎性肠病(例如克罗恩病或溃疡性结肠炎)和肠易激综合症为特征的病症。
可以通过测量模型系统中的初始跨上皮电阻(TEER)来确定肠屏障功能的完整性(参见实施例)。或者，可以通过测量荧光黄从顶端到基底外侧隔室的运输来确定肠屏障功能的完整性(参见实施例)。在人类中，可以通过确定细菌脂多糖或对脂多糖核部分的抗体的循环浓度间接测量肠渗透性，或直接通过双重糖吸收测试来间接测量肠渗透性(Dorshow等人，Scientific Reports第7卷，文章编号：10888(2017)。例如，可以确定双糖摄入后尿液中乳糖:甘露醇的比率。或者，可以确定血液α-1抗胰蛋白酶、髓过氧化物酶和/或REG1B蛋白。
本发明的另一方面是减少大肠发酵期间的产气，这将改善肠道的健康状况，减少腹胀并潜在地对纤维和益生元处理更高的适应性。
制剂
如本文所用的“延迟释放”是指在施用后在晚于立即释放的时间释放活性剂。优选地，“延迟释放”是指在口服施用时活性剂以相对于立即释放制剂的延迟的方式向大肠的递送。
“肠溶层”是围绕核的层，其中核包含活性剂并且该层赋予对胃液的抗性。“肠衣”是包围或包封活性剂的壳或基质，其中所述壳赋予对胃液的抗性。或者，可以使用基于基质的递送系统。基于基质的系统没有离散的包衣材料层，但是活性剂或多或少差不多均匀地分布在基质内。此外，存在将活性剂包埋在例如纤维基质中(酶促引发)和顶部的肠溶衣中的结肠释放系统。
在一个用于人的优选实施方案中，本发明的制剂是用于口服施用的固体剂型。所述制剂可以是胶囊剂、丸剂、珠、球、小球、片剂、小片剂或颗粒剂，可选地涂有延迟释放的包衣或壳，包衣或壳防止活性剂在小肠之、优选在结肠之前释放。
在口服施用时，用于延迟释放活性剂、特别是用于在回肠或大肠中靶向释放的包衣、壳或基质材料是本领域已知的。它们可以细分为在高于特定pH值下崩解的包衣材料、在胃肠道中特定停留时间后崩解的包衣材料和因肠的特定区域的微生物群特有的酶促引发而崩解的包衣材料。通常将不同类别的包衣或壳材料组合使用。例如，在Bansal等人(Polim.Med.2014,44,2,109-118)中综述用于靶向大肠的这三种不同类别的包衣或壳材料。在本发明的一个实施方案中，延迟释放包衣包含至少一种组分，所述组分选自pH依赖性崩解的包衣材料、时间依赖性崩解的包衣材料、肠环境中(例如在回肠和大肠的肠道环境中)由于酶促引发而崩解的包衣材料及其组合。
依赖于pH崩解的包衣材料包括邻苯二甲酸聚乙酸乙烯酯，偏苯三酸乙酸纤维素，羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯HP-50，HP-55或HP-558，邻苯二甲酸乙酸纤维素，虫胶，羟丙基甲基纤维素乙酸琥珀酸酯(HPMCAS)，聚(甲基丙烯酸，丙烯酸乙酯)1:1(
Figure BDA0002954975430000391
L100-55，
Figure BDA0002954975430000392
L30D-55)，聚(甲基丙烯酸，甲基丙烯酸甲酯)1:1(
Figure BDA0002954975430000393
L-100，
Figure BDA0002954975430000394
L12.5)，聚(甲基丙烯酸，甲基丙烯酸甲酯)1:2(
Figure BDA0002954975430000395
S-100，
Figure BDA0002954975430000396
S12,5，和
Figure BDA0002954975430000397
FS30D)。
随时间而崩解的包衣材料包括
Figure BDA0002954975430000399
RL、
Figure BDA0002954975430000398
RS和乙基纤维素。
在大肠环境中由于酶促引发而崩解的包衣材料包括硫酸软骨素、果胶、瓜尔豆胶、壳聚糖、菊粉、乳糖、棉子糖、水苏糖、藻酸盐、右旋糖酐、黄原胶、刺槐豆胶、阿拉伯半乳聚糖、环糊精、普鲁兰多糖、角叉菜胶、硬葡聚糖、几丁质、姜黄素、莱万、支链淀粉、淀粉、直链淀粉、抗性淀粉和被偶氮键分裂细菌降解的偶氮化合物。
在一个实施方案中，制剂包含填充有包含活性剂的组合物的肠溶胶囊。肠溶胶囊对胃的酸性环境具有抵抗力。例如，软凝胶制剂可以在溶液中递送活性剂，但仍提供固体剂型的优点。软凝胶胶囊特别适合于不易溶于水的疏水性活性剂。维生素K和ω-3脂肪酸优选配制成软胶囊。
在另一个实施方案中，该制剂是片剂，所述片剂包含(i)包含活性剂的核，和(ii)延迟释放的包衣，例如肠溶衣。这可以是硬胶囊。
药物的释放可能被延迟直到小肠。在另一个实施方案中，药物的释放被延迟直到远端小肠。在另一个实施方案中，药物的释放被延迟直到结肠。
例如，一种制剂可包含活性剂和肠溶层或肠衣，其中所述活性剂选自：至多200mg核黄素、至多3000μg维生素A、至多2000mg维生素C、至多250pg维生素D、至多1000mg维生素E、至多10mg维生素K、至多1mg叶酸、至多25mgβ-胡萝卜素、至多100mg维生素B1、至多1500mg烟酸、至多1000mg维生素B5、至多100mg维生素B6、至多2500pg生物素、至多3000pg维生素B12、至多5000mgω-3脂肪酸或其组合，其中优选地EPA是至多1800mg并且DHA是至多1000mg，其中所述活性剂的释放被延迟直到肠。
本发明的另一方面是用于在未患有肠的任何病症或病理状况的哺乳动物中增加至少一种短链脂肪酸或其盐的浓度的活性剂的非治疗性用途，所述活性剂选自核黄素、维生素A、维生素C、维生素D、维生素E、维生素K、叶酸、β-胡萝卜素、维生素B1、烟酸、维生素B5、维生素B6、生物素、维生素B12、ω-3脂肪酸及其组合，前提是如果烟酸是活性剂，则它不是唯一的活性剂。哺乳动物优选是健康的人。
本发明的又一个方面是用于维持或改善健康哺乳动物(优选健康人)的肠道功能的活性剂的非治疗性用途，所述活性剂选自核黄素、维生素A、维生素C、维生素D、维生素E、维生素K、叶酸、β-胡萝卜素、维生素B1、烟酸、维生素B5、维生素B6、生物素、维生素B12、ω-3脂肪酸及其组合，但前提是如果烟酸是活性剂，则烟酸不是唯一的活性剂。
本发明的一个考虑是所使用的活性剂并不意图为哺乳动物接收者提供营养；相反，它们旨在直接使大肠微生物种群受益，从而间接使哺乳动物受益。因此，剂量表示除作为哺乳动物饮食的部分的维生素、脂肪酸和其他营养素的正常日常消费外的剂量。因此，通过绕过胃并且优选小肠中的吸收，可以滋养微生物种群，在保持肠道屏障完整的情况下保持最佳性能。因此，本发明的制剂有助于维持健康的肠道。
我们还观察到对整体消化的有益作用。如实施例中所示，与未补充维生素B2的猪相比，补充有维生素B2的猪显示对胃蛋白酶-HCl中孵育的底物(饲料或猪的胃内容物)更高的DM消化率。这是令人惊讶的并且显然对胃肠功能具有积极作用。另外，我们观察到使用来自猪的盲肠内容物时对大肠发酵的有益效果，即减少甲烷的产生。尽管不希望受到理论的束缚，但我们认为这可以通过以下事实来解释：维生素B2可以降低产甲烷细菌或古细菌种群的活性，从而对环境产生积极影响。
实施例
实施例1
材料和方法
供体和样品制备
在肠道批次发酵培养开始时的第一组体外实验中，将所有测试成分从储液加到改良的营养培养基中，该培养基包含(g/l)：2.5K2HPO4、10.9KH2PO4、2NaHCO3、2酵母提取物、2蛋白胨、1粘蛋白、0.5半胱氨酸、2Tween 80、2葡萄糖、2淀粉、2纤维二糖、0.1NaCl、0.01mgSO4.7H2O、0.01CaCl2.6H2O、0.05血红素、0.5胆汁盐。
从水中制备的储液加入以下化合物：
·核黄素表级(缩写RTG)，
·核黄素-5-磷酸酯(R5P)，
·抗坏血酸颗粒粉末(AA)，
·干燥维生素E 50 CWS-S(E 50 CWS-S)，
·干燥维生素D3 100 CWS(D3 100 CWS)，
·干燥维生素A乙酸酯325CWS/A，
·核黄素表级+抗坏血酸，
·叶酸，
其他化合物在乙醇中制备：
·维生素K1(VK1)，
·MEG-3 0080EE油(MEG-3 0080EE)，
·MEG-3 4535EE油(MEG-3 4535EE)，
·MEG-3 8000EE油(MEG-3 8000EE)。
每种化合物均以三种不同浓度测试；在表1中给出概述。由于已知乙醇具有抗菌作用，每种储液类型均包含两个空白。作为微生物群落的来源，将来自选定供体的新鲜制备的粪便悬浮液加到反应器中。每个反应器的体积为70mL。除空白外，所有测试均进行一次重复，如表1所示，进行40次独立孵育。预筛选实验和最终实验的孵育条件是在37℃下在摇动(90rpm)和厌氧条件下48小时。从发酵前(0h发酵)和发酵后(24h发酵)的每个发酵瓶收集的流出物样品提取DNA，并通过Shotgun测序进行微生物组组成分析。从发酵前(0h发酵)和发酵后(48h发酵)的每个发酵瓶中收集流出物样品，通过0.22μm过滤器过滤来灭菌并用于短链脂肪酸(SCFA)、免疫学生物标志物的定量和细胞培养的体外分析系统。
表1：最终实验的实验设置
Figure BDA0002954975430000421
Figure BDA0002954975430000431
Figure BDA0002954975430000441
1：视黄醇当量
2：α-生育酚当量
在第二组体外实验中，在短期结肠孵育开始时，将测试成分加到含有结肠中存在的基础营养素的营养培养基(例如，宿主衍生的聚糖，例如粘蛋白)中。每个产品测试三个剂量。用于该特定项目的营养培养基再次补充有NaCl、MgSO4、CaCl2、血红素和胆汁盐，以及碳源葡萄糖、淀粉和纤维二糖。每个供体都包括空白样，该空白样包含与产品孵育所使用的营养培养基相同的营养培养基，但不添加产品。这样做可以评估细菌群落的背景活性，这是由于营养培养基中化合物的发酵而产生的。作为结肠微生物群的来源，加入两个健康成年人的粪便接种物。在37℃下在摇动(90rpm)和厌氧条件下孵育48h，并避光。测试以下化合物：
·盐酸硫胺素
·β-胡萝卜素10％CWS/S
·尼克酰胺PC
·D-泛酸钙
·盐酸吡哆醇
·D-生物素
·维生素B12结晶。
每种化合物均以三种不同浓度测试；下表2中给出概述：
表2第二实验结果
Figure BDA0002954975430000451
Figure BDA0002954975430000461
短链脂肪酸
短链脂肪酸(SCFA)是对微生物碳水化合物代谢(乙酸酯，丙酸酯和丁酸酯)或蛋白质代谢(支化SCFA)的评估，并且可以与正常GI微生物群的典型发酵模式比较。在孵育0、6、24和48h后，针对上述两组体外实验分析用于SCFA分析的样品。
在加入2-甲基己酸作为内标后用乙醚从样品提取SCFA。提取物使用GC-2014气相色谱仪(Shimadzu,‘s-Hertogenbosch,荷兰)分析，该色谱仪配备有无毛细管脂肪酸EC-1000Econo-Cap色谱柱(尺寸：25mm x 0.53mm，膜厚1.2mM；Alltech,Laarne,Belgium)、火焰电离检测器和分流进样器。进样量为1ml并且温度曲线设置为110至160℃，温度升高6℃min-1。载气为氮气并且注射器和检测器的温度分别为100和220℃。通过分别将乙酸酯、丙酸酯、丁酸酯、戊酸酯和己酸酯的摩尔浓度相加，以及将异丁酸酯、异戊酸酯和异己酸酯的摩尔浓度相加来计算非支化和支化SCFA的产生。SCFA的总产量定义为非支化和支化SCFA的总和。
细胞培养
Caco-2和HT29-MTX-E12细胞的共培养用于评估上述两组体外实验在发酵前(0h)和在发酵后(48h)的上清液的保护作用。
将CaCo-2 ECACC 86010202和HT29-MTX-E12 ECACC12040401细胞(均来自欧洲细胞培养中心，英国索尔兹伯里)均在5％CO2的气氛中在37℃下在DMEM培养基中培养，所述DMEM培养基补充有4.5g/L D-葡萄糖、4mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、1％MEM非必需氨基酸、50pg/mL庆大霉素(Life Technologies Europe B.V.,Zug,瑞士)和10％热灭活的FBS(Sigma-Aldrich,Buchs,瑞士)。使用0.25％的胰蛋白酶/EDTA(Life Technologies EuropeB.V.,Zug,瑞士)对次汇合的细胞进行胰蛋白酶处理，每周两次以1:5–1:10的比率传代。在第55和85代之间的细胞用于该研究。
在Corning HTS Transwell-24系统PET膜中以7:3的比率(Caco-2:HT29-MTX-E12)以20000个细胞/孔的密度接种细胞，孔径为0.4μM，细胞生长面积为0.33cm2/孔(CorningBV，阿姆斯特丹，荷兰)和如上所述进行培养。培养基每隔第二到第三天更换一次。
健康肠道模型中的屏障完整性的测量
对于两组体外实验，在将细胞培养13天后，使用配备STX100电极的EVOM2伏特计(EVOM，世界精密仪器，柏林)获得初始跨上皮电阻(TEER)读数。TEER值与汇合单层的紧密度相关(Srinivasan等人，2015)。
从总TEER(细胞单层加插入物)中减去背景TEER(插入物)以产生单层电阻，并且然后通过乘以插入物的面积归一化为表面积(Srinivasan等人2015)。通过测量TEER在基础水平上确定单层的完整性。300Ωcm2的TEER被认为是紧密的单层(参见结果部分)。之后，用无菌过滤的发酵上清液或发酵培养基作为对照(在生长培养基中以1:20稀释)处理细胞。在孵育24h后，再次测量每个细胞单层上的电阻，并计算每个插入物的TEER与初始TEER相比的百分比变化以代表健康的肠道模型。所有TEER测量都是通过将包含插入物的板放在37℃的加热板上进行的，并在相同的时间内进行。
泄漏肠道模型中的屏障完整性测量
对于这两组体外实验，通过TEER值和通过测量荧光黄从顶端到基底外侧隔室的转运(渗漏肠道模型)来评估压力源试验后细胞单层的完整性。预热的HBSS转运缓冲液，由具有Ca2+和mg2+的Hank的pH 7.4的平衡盐溶液组成，含有5.5mM D-(+)-葡萄糖、碳酸氢钠，并补充有4mM L-谷氨酰胺、20mM HEPES(Life Technologies Europe B.V.,Zug，瑞士)用于所有渗透率实验。插入物使用储槽托盘用HBSS冲洗两次，然后将100pi HBSS加到插入物的顶端，并且然后移至装有新鲜HBSS的新孔中并在培养箱中在37℃下平衡60min，然后TEER测量以获得基线电阻读数。
将荧光黄CH二锂盐(Sigma-Aldrich，Buchs，瑞士)在100pg/ml的终浓度下溶解在HBSS中。在HBSS中将基底外侧压力源EtOH(Merck，KgaA，Darmstadt，德国)稀释至5％。将顶端压力源鼠李糖脂R90(AGAE Technologies,Corvallis,USA)在350pg/ml的终浓度下溶解在含荧光黄的HBSS中。每次都新鲜配制所有溶液。
首先从基底外侧腔抽吸HBSS转运缓冲液，然后从顶端腔抽吸HBSS并用荧光黄溶液代替。对于顶端压力测试，将含有350pg/ml鼠李糖脂的荧光黄溶液或不含用于对照孔的压力源的荧光黄溶液装入顶端腔，随后将空白HBSS加入基底外侧腔。对于基底外侧压力测试，将荧光黄溶液加到所有孔的顶侧，并将HBSS中的5％EtOH或对照孔中的空白HBSS放入基底外侧隔室中。
在37℃下孵育3h后，通过测量TEER值评估细胞单层的渗透性。TEER数据表示为初始值的百分比。
在TEER测量后，从基底外侧位点一式两份取出100pi等份样品以定量所转运的荧光黄的量。在96孔荧光板读数器(Spectramax M5 Series Multi-Mode MicroplateReader,Molecular Devices,Sunnyvale,CA,USA)中测量荧光水平(在420nm下激发和在530nm下发射)。
通过Shotgun测序进行微生物组组成分析
对于第一组体外实验，使用QiAmp DNA粪便微型试剂盒(Qiagen，Crawley，英国)，根据制造商的说明，从整个研究中收集的所有样品提取总DNA，除了增加打珠步骤和如先前所述将裂解温度提高到95℃外(McCormack等人，2018)。
在DNA分离后，使用Qubit高灵敏度DNA测定(Thermo Fisher)对DNA进行定量。然后根据制造商的说明使用Illumina Nextera XT试剂盒(Illumina)制备完整的元基因组库，所述制造商的说明具有以下修改：首先，将标记时间延长至7min，并且其次，在并入产物的指标和安倍纯化后，通过在Agilent高灵敏度芯片(Agilent)上运行分别单独对样品进行大小分析并根据Teagasc测序平台SOP使用Qubit高灵敏度DNA测定(Thermo Fisher)进行定量。然后将样品等摩尔合并并在具有NextSeq 500/550v2高输出试剂盒的IlluminaNextSeq 500上测序(300个循环)。所有测序均根据标准Illumina测序方案在Teagasc测序设施中进行。
对交付的原始FASTQ序列文件进行以下质量检查：质量差和重复读数被删除，以及使用SAM和Picard工具的组合进行修整。使用Kraken软件将分类法分配给读数并使用Superfocus进行功能分析。
对于第二组体外实验，根据Vandeputte等人(2017)结合两种技术以详细描绘由不同处理引起的群落转移：1)16S靶向的Illumina测序，基于PCR的方法，通过该方法可将微生物序列扩增到饱和，从而在不同的系统发生水平下提供不同类群的比例丰度(微生物门、科和OTU水平)。2)通过流式细胞术准确定量样品中的总细菌细胞。通过流式细胞术将16S靶向的Illumina的高分辨率系统发育信息与细胞计数的准确定量结合，导致反应器内的不同生物分类实体的定量计数。
HT29细胞培养和免疫生物标志物的定量
对于两组体外实验，HT29细胞均获自美国典型培养物保藏中心(Manassas，VA)。在补充有10％胎牛血清(FBS)、50单位/ml青霉素、50μg/ml链霉素、L-谷氨酰胺和非必需氨基酸的DMEM中培养细胞(Life Technologies Europe B.V.，Zug，Switzerland)。将细胞以每孔8x105个细胞接种到12孔板中并在预培养2天后使用。在处理前，将它们在含有0.25％FBS的DMEM中饥饿18h。用100ng/mL的TNF-α或发酵上清液处理细胞24h，所述发酵上清液被无菌过滤并在含有0.25％FBS的DMEM中以1:20稀释。所有处理均重复三次。因此，使用Luminex技术(LiquiChip Workstation IS 200，Qiagen，Hilden，德国)与Bio-Plex Pro人细胞因子面板试剂盒(Bio-Rad，Hercules，CA)或与Luminex筛选测定试剂盒(R&D Systems,Inc.,Minneapolis,MN)，按照制造商的说明，可以定量HT29上清液中的细胞因子、趋化因子和白介素。用Luminex IS 2.3软件获取数据，并用LiquiChip Analyzer软件(Qiagen,Hilden,德国)评估。
气体产生(产气)
对于两组体外实验，如上所述在封闭的孵育系统中进行结肠孵育。这样可以评估顶部空间中气体的积聚，这可以使用压力计进行测量。气体产生是微生物活性的量度，并且因此也是潜在益生元底物发酵速度的量度。
结果
第一组实验如图1-15所示。
关于在施用维生素和ω-3脂肪酸后在发酵48h后乙酸酯产生，进行以下观察：与相应的对照相比
-补充1x和5x剂量的维生素E提高乙酸酯产生
-补充1x剂量的维生素A提高乙酸酯产生
-补充1x剂量的维生素B2+C提高乙酸酯产生
-补充0.2x、1x和5x剂量的叶酸提高乙酸酯产生
-补充0.2x、1x和5x剂量的维生素K1提高乙酸酯产生
-补充0.2x、1x和5x剂量的DHA提高乙酸酯产生
-补充0.2x和1x剂量的DHA+EPA提高乙酸酯产生
-补充0.2x和1x剂量的EPA提高乙酸酯产生。
关于在施用维生素和ω-3脂肪酸后在发酵48h后丙酸酯产生，进行以下观察：与相应的对照相比
-补充1x剂量的维生素E提高丙酸酯产生
-补充1x和5x剂量的维生素D提高丙酸酯产生
-补充0.2x、1x和5x剂量的维生素A提高丙酸酯产生
-补充0.2x剂量的维生素B2+C提高丙酸酯产生
-补充0.2x、1x和5x剂量的叶酸提高丙酸酯产生
-补充0.2x、1x和5x剂量的维生素K1提高丙酸酯产生
-补充0.2x、1x和5x剂量的DHA提高丙酸酯产生
-补充0.2x、1x和5x剂量的DHA+EPA提高丙酸酯产生
-补充0.2x、1x和5x剂量的EPA提高丙酸酯产生。
关于在施用维生素和ω-3脂肪酸后在发酵48h后丁酸酯产生，进行以下观察：与相应的对照相比
-补充5x剂量的维生素B2提高丁酸酯产生
-补充5x剂量的维生素B2-5-磷酸酯提高丁酸酯产生
-补充0.2x和1x剂量的维生素D提高丁酸酯产生
-补充0.2x、1x和5x剂量的维生素A提高丁酸酯产生
-补充0.2x、1x和5x剂量的叶酸提高丁酸酯产生
-补充0.2x、1x和5x剂量的维生素K1提高丁酸酯产生
-补充0.2x、1x和5x剂量的DHA提高丁酸酯产生
-补充0.2x和1x剂量的DHA+EPA提高丁酸酯产生
-补充0.2x、1x和5x剂量的EPA提高丁酸酯产生。
关于在施用维生素和ω-3脂肪酸后在发酵48h后总SCFA产生，进行以下观察：与相应的对照相比
-补充1x剂量的维生素E提高总SCFA产生
-补充1x和5x剂量的维生素D提高总SCFA产生
-补充0.2x和5x剂量的维生素A提高总SCFA产生
-补充0.2x、1x和5x剂量的叶酸提高总SCFA产生
-补充0.2x、1x和5x剂量的维生素K1提高总SCFA产生
-补充0.2x、1x和5x剂量的DHA提高总SCFA产生
-补充0.2x和1x剂量的DHA+EPA提高总SCFA产生
-补充0.2x和1x剂量的EPA提高总SCFA产生。
关于在健康肠道细胞模型(图6)中用48h发酵样品处理的细胞在减去用0h发酵样品处理的细胞的TEER后的TEER测量，进行以下观察：与相应的对照相比，
-从0.2x剂量的维生素B2-5-磷酸酯的发酵用样品处理细胞提高TEER
-从1x剂量的维生素C的发酵用样品处理细胞提高TEER
-从1x和5x剂量的维生素E的发酵用样品处理细胞提高TEER
-从0.2x、1x和5x剂量的DHA+EPA的发酵用样品处理细胞提高TEER
-从0.2x、1x和5x剂量的EPA的发酵用样品处理细胞提高TEER。
关于在渗漏肠道细胞模型(图7)的基底外侧诱导中用48h发酵样品处理的细胞在减去用0h发酵样品处理的细胞的TEER后的TEER测量，进行以下观察：与相应的对照相比，
-从0.2x的维生素B2剂量的发酵用样品处理细胞提高TEER
-从0.2x剂量的维生素B2+维生素C的发酵用样品处理细胞提高TEER
-从0.2x剂量的维生素E的发酵用样品处理细胞提高TEER
-从0.2x和1x剂量的DHA+EPA的发酵用样品处理细胞提高TEER
-从0.2x和1x剂量的EPA的发酵用样品处理细胞提高TEER。
关于在渗漏肠道细胞模型(图7)的基底外侧诱导中用48h发酵样品处理的细胞在用48h发酵样品处理的细胞的TEER后的荧光黄测量，进行以下观察：与相应的对照相比，
-从0.2x的维生素B2剂量的发酵用样品处理细胞降低荧光黄
-从0.2x剂量的维生素B2+维生素C的发酵用样品处理细胞降低荧光黄
-从0.2x剂量的维生素E的发酵用样品处理细胞降低荧光黄
-从0.2x剂量的DHA+EPA的发酵用样品处理细胞降低荧光黄。
关于在渗漏肠道细胞模型(图8)的顶端诱导中用48h发酵样品处理的细胞在减去用0h发酵样品处理的细胞的TEER后的TEER测量，进行以下观察：与相应的对照相比，
-从0.2x的维生素B2剂量的发酵用样品处理细胞提高TEER
-从0.2x剂量的维生素B2-5-磷酸酯的发酵用样品处理细胞提高TEER
-从0.2x和1x剂量的维生素C的发酵用样品处理细胞提高TEER
-从0.2x剂量的维生素B2+维生素C的发酵用样品处理细胞提高TEER
-从0.2x、1x和5x剂量的维生素E的发酵用样品处理细胞提高TEER
-从5x剂量的维生素D的发酵用样品处理细胞提高TEER
-从0.2x、1x和5x剂量的维生素A的发酵用样品处理细胞提高TEER
-从0.2x和1x剂量的叶酸的发酵用样品处理细胞提高TEER
-从0.2x剂量的DHA+EPA的发酵用样品处理细胞提高TEER
-从0.2x、1x和5x剂量的EPA的发酵用样品处理细胞提高TEER。
关于在渗漏肠道细胞模型(图8)的顶端诱导中用48h发酵样品处理的细胞在用48h发酵样品处理的细胞的TEER后的荧光黄测量，进行以下观察：与相应的对照相比，
-从0.2x的维生素B2剂量的发酵用样品处理细胞降低荧光黄
-从0.2x剂量的维生素B2-5-磷酸酯的发酵用样品处理细胞降低荧光黄
-从0.2x和1x剂量的维生素C的发酵用样品处理细胞降低荧光黄
-从0.2x剂量的维生素B2+维生素C的发酵用样品处理细胞降低荧光黄
-从1x和5x剂量的维生素E的发酵用样品处理细胞降低荧光黄
-从1x和5x剂量的维生素A的发酵用样品处理细胞降低荧光黄
-从0.2x剂量的维生素K1的发酵用样品处理细胞降低荧光黄
-从0.2x剂量的DHA+EPA的发酵用样品处理细胞降低荧光黄。
关于在施用维生素和ω-3脂肪酸后在发酵24h后微生物组α多样性，进行以下观察：与相应的对照相比，
-补充1x和5x剂量的维生素B2提高微生物组多样性
-补充0.2x和1x剂量的维生素B2-5-磷酸酯提高微生物组多样性
-补充5x剂量的维生素C提高微生物组多样性
-补充0.2x、1x和5x剂量的维生素E提高微生物组多样性
-补充0.2x和5x剂量的维生素D提高微生物组多样性
-补充1x和5x剂量的维生素A提高微生物组多样性
-补充1x和5x剂量的维生素B2+维生素C提高微生物组多样性
-补充0.2x和1x剂量的叶酸提高微生物组多样性
-补充0.2x、1x和5x剂量的维生素K1提高微生物组多样性
-补充0.2x、1x和5x剂量的DHA提高微生物组多样性
-补充1x和5x剂量的DHA+EPA提高微生物组多样性
-补充0.2x、1x和5x剂量的EPA提高微生物组多样性。
关于在施用维生素和ω-3脂肪酸后在发酵24h后双歧杆菌相对丰度，进行以下观察：与相应的对照相比，
-补充1x和5x剂量的维生素B2提高双歧杆菌相对丰度
-补充0.2x和1x剂量的维生素B2-5-磷酸酯提高双歧杆菌相对丰度
-补充1x剂量的维生素C提高双歧杆菌相对丰度
-补充0.2x、1x和5x剂量的维生素E提高双歧杆菌相对丰度
-补充0.2x和5x剂量的维生素D提高双歧杆菌相对丰度
-补充1x剂量的维生素A提高双歧杆菌相对丰度
-补充1x和5x剂量的维生素B2+维生素C提高双歧杆菌相对丰度
-补充0.2x和1x剂量的叶酸提高双歧杆菌相对丰度
-补充0.2x剂量的维生素K1提高双歧杆菌相对丰度
-补充0.2x和5x剂量的DHA提高双歧杆菌相对丰度
-补充5x剂量的DHA+EPA提高双歧杆菌相对丰度
-补充0.2x、1x和5x剂量的EPA提高双歧杆菌相对丰度。
对于其他有利细菌进行类似观察。
关于在施用维生素和ω-3脂肪酸后在发酵24h后参与乙酰辅酶A发酵至丁酸酯途径的基因的相对丰度，进行以下观察：与相应的对照相比，
-补充1x和5x剂量的维生素B2提高参与乙酰辅酶A发酵至丁酸酯途径的基因的相对丰度
-补充0.2x和1x剂量的维生素B2-5-磷酸酯提高参与乙酰辅酶A发酵至丁酸酯途径的基因的相对丰度
-补充5x剂量的维生素C提高参与乙酰辅酶A发酵至丁酸酯途径的基因的相对丰度
-补充0.2x剂量的维生素E提高参与乙酰辅酶A发酵至丁酸酯途径的基因的相对丰度
-补充0.2x剂量的维生素D提高参与乙酰辅酶A发酵至丁酸酯途径的基因的相对丰度
-补充1x和5x剂量的维生素A提高参与乙酰辅酶A发酵至丁酸酯途径的基因的相对丰度
-补充5x剂量的维生素B2+维生素C提高参与乙酰辅酶A发酵至丁酸酯途径的基因的相对丰度
-补充0.2x剂量的叶酸提高参与乙酰辅酶A发酵至丁酸酯途径的基因的相对丰度
-补充0.2x、1x和5x剂量的维生素K1提高参与乙酰辅酶A发酵至丁酸酯途径的基因的相对丰度
-补充0.2x、1x和5x剂量的DHA提高参与乙酰辅酶A发酵至丁酸酯途径的基因的相对丰度
-补充0.2x、1x和5x剂量的DHA+EPA提高参与乙酰辅酶A发酵至丁酸酯途径的基因的相对丰度
-补充0.2x、1x和5x剂量的EPA提高参与乙酰辅酶A发酵至丁酸酯途径的基因的相对丰度。
关于在施用维生素和ω-3脂肪酸后在用来自24h发酵的流出物处理后通过HT29细胞产生GROa-CXCL1，进行以下观察：与相应的对照相比，
-补充1x和5x剂量的维生素B2提高GROa-CXCL1产生
-补充5x剂量的维生素E提高GROa-CXCL1产生
-补充1x剂量的维生素B2+维生素C提高GROa-CXCL1产生
-补充0.2x、1x和5x剂量的DHA提高GROa-CXCL1产生
-补充0.2x、1x和5x剂量的DHA+EPA提高GROa-CXCL1产生
-补充1x和5x剂量的EPA提高GROa-CXCL1产生。
关于在施用维生素和ω-3脂肪酸后在用来自24h发酵的流出物处理后通过HT29细胞产生IL-8，进行以下观察：与相应的对照相比，
-补充1x和5x剂量的维生素B2提高IL-8产生
-补充5x剂量的维生素B2-5-磷酸酯提高IL-8产生
-补充0.2x、1x和5x剂量的维生素E提高IL-8产生
-补充0.2x和5x剂量的维生素A提高IL-8产生
-补充1x剂量的维生素B2+维生素C IL-8产生
-补充0.2x和5x剂量的叶酸提高IL-8产生
-补充0.2x剂量的维生素K1提高IL-8产生
-补充0.2x、1x和5x剂量的DHA提高IL-8产生
-补充0.2x、1x和5x剂量的DHA+EPA提高IL-8产生
-补充0.2x、1x和5x剂量的EPA提高IL-8产生。
关于在施用维生素和ω-3脂肪酸后在用来自24h发酵的流出物处理后通过HT29细胞产生MIP3A-CCL20，进行以下观察：与相应的对照相比，
-补充0.2x、1x和5x剂量的维生素E提高MIP3A-CCL20产生
-补充0.2x、1x和5x剂量的维生素D提高MIP3A-CCL20产生
-补充0.2x、1x和5x剂量的维生素A提高MIP3A-CCL20产生
-补充0.2x、1x和5x剂量的维生素K1提高MIP3A-CCL20产生
-补充0.2x、1x和5x剂量的DHA提高MIP3A-CCL20产生
-补充0.2x、1x和5x剂量的DHA+EPA提高MIP3A-CCL20产生
-补充0.2x、1x和5x剂量的EPA提高MIP3A-CCL20产生。
关于在施用维生素和ω-3脂肪酸后在发酵48h后气体产生，进行以下观察：与相应的对照相比，
补充1x和5x剂量的维生素C减少气体产生
补充1x和5x剂量的维生素E减少气体产生
补充1x和5x剂量的维生素C和B2减少气体产生。
第二组体外实验如图16-19所示：
关于在施用维生素和β-胡萝卜素后在发酵48h后乙酸酯产生，进行以下观察：
-与相应的对照相比，补充1x和5x剂量的β-胡萝卜素提高两种供体中的乙酸酯产生。
关于在施用维生素后在发酵48h后丙酸酯产生，进行以下观察：与相应的对照相比
-补充1x和5x剂量的β-胡萝卜素提高两种供体之一(供体C)中丙酸酯产生
-补充0.2x的维生素B5提高两种供体之一(供体C)中丙酸酯产生。
关于在施用维生素后在发酵48h后丁酸酯产生，进行以下观察：与相应的对照相比
-补充1x剂量的β-胡萝卜素提高两种供体中丁酸酯产生
-补充0.2x剂量的β-胡萝卜素提高两种供体之一(供体C)中丁酸酯产生。
关于在施用维生素和β-胡萝卜素后在发酵48h后总SCFA产生，进行以下观察：
-与相应的对照相比，补充1x和5x剂量的β-胡萝卜素提高两种供体的总SCFA产生。
-与相应的对照相比，补充5x剂量的维生素B5降低两种供体的支化SCFA产生。
关于在施用维生素后在发酵24h后双歧杆菌相对丰度，进行以下观察：与相应的对照相比
-补充1x和5x剂量的β-胡萝卜素提高两种供体的双歧杆菌相对丰度
-补充5x剂量的维生素B5提高两种供体的双歧杆菌相对丰度
-补充0.2x、1x和5x剂量的生物素提高两种供体之一(供体D)的双歧杆菌相对丰度
-补充1x和5x剂量的吡哆醇提高两种供体之一(供体D)的双歧杆菌相对丰度。
关于在施用维生素后在发酵24h后伊格尔兹氏菌科(Eggerthellaceae)相对丰度，进行以下观察：
-与相应的对照相比，补充5x剂量的β-胡萝卜素提高两种供体的伊格尔兹氏菌科相对丰度。
关于在施用维生素后在发酵24h后脱硫弧菌科相对丰度，进行以下观察：与相应的对照相比
-补充5x剂量的β-胡萝卜素降低两种供体的脱硫弧菌科相对丰度
-补充5x剂量的维生素B5降低两种供体之一(供体C)的脱硫弧菌科相对丰度。
关于在施用维生素后在发酵24h后阿克曼氏菌相对丰度，进行以下观察：与相应的对照相比
-补充5x剂量的β-胡萝卜素提高两种供体的阿克曼氏菌相对丰度
-补充1x剂量的硫胺素提高两种供体之一(供体C)的阿克曼氏菌相对丰度
-补充0.2x剂量的尼克酰胺提高两种供体之一(供体C)的阿克曼氏菌相对丰度
-补充0.2x的维生素B5剂量提高两种供体之一(供体D)的阿克曼氏菌相对丰度
-补充0.2x、1x和5x剂量的吡哆醇提高两种供体之一(供体D)的阿克曼氏菌相对丰度
-补充0.2x剂量的生物素提高两种供体之一(供体D)的阿克曼氏菌相对丰度
-补充0.2x和1x剂量的维生素B12提高两种供体之一(供体D)的阿克曼氏菌相对丰度。
关于在施用维生素后在发酵24h后普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)相对丰度，进行以下观察：与相应的对照相比
-补充1x剂量的β-胡萝卜素提高两种供体之一(供体C)的普雷沃氏菌科相对丰度
-补充5x剂量的吡哆醇提高两种供体之一(供体C)的普雷沃氏菌科相对丰度。
关于在施用维生素后在发酵24h后梭菌科相对丰度，进行以下观察：与相应的对照相比
-补充1x剂量的β-胡萝卜素提高两种供体之一(供体C)的梭菌科相对丰度。
关于在施用维生素后在发酵24h后丹毒丝菌(Erysipelotrichaceae)相对丰度，进行以下观察：与相应的对照相比
-补充5x剂量的硫胺素提高两种供体之一(供体C)的丹毒丝菌相对丰度
-补充1x和5x剂量的尼克酰胺提高两种供体之一(供体C)的丹毒丝菌相对丰度
-补充1x剂量的吡哆醇提高两种供体之一(供体C)的丹毒丝菌相对丰度
-补充0.2x和1x剂量的生物素提高两种供体之一(供体C)的丹毒丝菌相对丰度
-补充1x和5x剂量的维生素B12提高两种供体之一(供体C)的丹毒丝菌相对丰度
-补充1x剂量的维生素B5提高两种供体之一(供体D)的丹毒丝菌相对丰度。
关于在施用维生素后在发酵24h后红蝽菌科相对丰度，进行以下观察：与相应的对照相比
-补充1x和5x剂量的β-胡萝卜素提高两种供体之一(供体D)的红蝽菌科相对丰度。
关于在施用维生素后在发酵24h后巴恩斯氏菌科(Barnesiellaceae)相对丰度，进行以下观察：与相应的对照相比
-补充5x剂量的β-胡萝卜素提高两种供体之一(供体D)的巴恩斯氏菌科相对丰度
-补充1x剂量的生物素提高两种供体之一(供体D)的巴恩斯氏菌科相对丰度。
关于在施用维生素后在发酵24h后普拉梭菌相对丰度，进行以下观察：与相应的对照相比
-补充1x和5x剂量的β-胡萝卜素提高两种供体之一(供体D)的普拉梭菌相对丰度
-补充0.2x的维生素B5、1x和5x剂量提高两种供体之一(供体D)的普拉梭菌相对丰度
-补充0.2x、1x和5x剂量的吡哆醇提高两种供体之一(供体D)的普拉梭菌相对丰度
-补充0.2x、1x和5x剂量的生物素提高两种供体之一(供体D)的普拉梭菌相对丰度
-补充0.2x、1x和5x剂量的维生素B12提高两种供体之一(供体D)的普拉梭菌相对丰度。
关于在施用维生素后在发酵24h后韦荣氏菌科相对丰度，进行以下观察：与相应的对照相比
-补充1x和5x剂量的β-胡萝卜素提高两种供体之一(供体D)的韦荣氏菌科相对丰度
-补充0.2x的维生素B5剂量提高两种供体之一(供体D)的韦荣氏菌科相对丰度
-补充5x剂量的吡哆醇提高两种供体之一(供体D)的韦荣氏菌科相对丰度。
关于微生物组多样性，进行以下观察：
补充1x和5x剂量的β-胡萝卜素提高两种供体中β-多样性。补充0.2x剂量的β-胡萝卜素提高两种供体之一(供体D)中的β-多样性。
补充5x剂量的维生素B5提高两种供体中β-多样性。补充0.2x和1x剂量的β-胡萝卜素提高两种供体之一(供体D)中的β-多样性。
补充0.2x、1x和5x剂量的维生素B6提高两种供体之一(供体D)中的β-多样性。
补充0.2x、1x和5x剂量的维生素B12提高两种供体之一(供体D)中的β-多样性。
补充1x剂量对的维生素B7提高两种供体中β-多样性。
补充5x剂量的维生素B7提高两种供体之一(供体D)中的β-多样性。
补充1x剂量的维生素B1提高两个供体之一(供体C)中的β-多样性。补充5x剂量的维生素B1提高两种供体之一(供体D)中的β-多样性。
补充0.2x和5x剂量的维生素B3提高两个供体之一(供体D)的β-多样性。
与相应的对照相比补充1x剂量的维生素B1提高两种供体之一(供体C)的β-多样性。
补充0.2x和5x剂量的维生素B5提高两种供体之一(供体D)的α-多样性。
补充5x剂量的维生素B6提高两种供体之一(供体D)的α-多样性。
补充0.2x和1x剂量的维生素B12提高两种供体之一(供体D)的α-多样性。
补充0.2x剂量的维生素B7提高两种供体中的α-多样性。补充5x剂量的维生素B7提高两种供体之一(供体D)的α-多样性。
补充0.2x和1x剂量的维生素B1提高两种供体之一(供体C)中的α-多样性。
补充1x剂量的维生素B3提高两种供体之一(供体C)中的α-多样性。
实施例2
用于人类的制剂
制备以下各自包含单一活性成分的制剂并将其装入涂覆有
Figure BDA0002954975430000621
S 100聚合物的肠溶硬明胶胶囊(Capsugel)中。
表3.人类使用的制剂
Figure BDA0002954975430000622
Figure BDA0002954975430000631
1：视黄醇当量
2：生育酚当量
该制剂适合于每天一次施用，优选连续至少28天。
实施例3
家禽模型
将具有相同遗传特征的三组各120只鸡(均是雌性)饲养在具有相同环境条件的三个独立房间中并饲喂三种不同的饮食：(A)对照饮食(5mg/kg核黄素)；(B)对照饮食+50mg/kg维生素核黄素；(C)对照饮食+100mg/kg维生素核黄素。
每组在特定天数中进行三次采样(即S1＝14天，S2＝28天，S3＝38/42天)，特定天数与在喂食程序中将更换饲料的时间对应。
42天的肉鸡(试验结束)重2.6kg并且每头日吃约205g。因此，这3种测试剂量对应于分别在5、50和100mg/kg饲料下0.38、3.82和7.65mg/kg体重的核黄素摄入量，并且每kg体重的摄入量在较低的体重下要高得多。下表4示出肉鸡的理论生长和所加入的核黄素的量。
表4.理论增长
Figure BDA0002954975430000641
在每次采样(即S1，S2和S3)期间，对总共40只鸡/组进行人道安乐死并将收集9窝样品(即3个样品/组)。
盲肠样品微生物群分析
总共741个盲肠样品被卫生部微生物生态学部门分析，包括来自第一时间点的120个样品、来自第二时间点的119个样品(C组中有1只鸡损失)和来自第三个时间点的118个(B组有1只鸡并且C组有1只鸡损失)和来自第三个时间点的118只(B组有1只鸡并且C组有1只鸡损失)。
材料和方法。
从盲肠样品提取DNA：已经选择商用试剂盒DNeasy PowerSoil试剂盒(德国，希尔登，Qiagen)并按照制造商的说明将其应用于所有可用的盲肠样品。使用Nanodrop仪器测量DNA产率。
16S rRNA基因PCR扩增和测序。使用具有Illumina外伸接头序列的341F和785R引物对16S rRNA基因的V3-V4高变区进行PCR扩增。通过使用AMPure XP Beads磁珠(BeckmanCoulter，Brea，CA)进行扩增子纯化。对于编制索引的库，使用Nextera XT DNA库制备试剂盒(Illumina，San Diego，CA)。进行进一步的磁珠纯化步骤并使用Qubit 3.0荧光计(Invitrogen)对库进行定量，然后在4nM下合并。库池用0.2N NaOH变性并稀释至6pM。根据制造商的说明(Illumina)，在Illumina MiSeq平台上使用2x 250bp配对末端方案进行测序。
生物信息学和统计学。使用结合PANDAseq(Masella等人，2012)和QIIME2(Caporaso等人，2010；https://qiime2.org)的管道处理原始序列。在去除嵌合体序列后，通过用dada2进行开放参考策略，根据99％的分类阈值，将高质量的读数过滤并分成高分辨率的操作类群(OTU)(Callahan等人，2016)。使用vsearch分类器(Rognes等人，2016)和SILVA数据库作为参考(Quast等人，2013)对分类法进行分配。使用Faith PD指数和观察到的OTU数量测量α多样性。使用在R软件3.1.3(https://www.r-project.org/)上运行的RStudio软件版本1.0.136(通过vegan，made4，PMCMR库执行)进行统计。β多样性通过计算加权的UniFrac距离评估并通过主坐标分析(PCoAs)可视化。使用vegan包的Adonis功能通过变化的多元方差分析来检验样品组之间分离的重要性。至少在1％的样品中显示0.5％的最小相对丰度的细菌系统发育组(属，科，门)被保留用于进一步分析和图形显示。使用Kruskal-Wallis检验测试样品组之间的组成差异。使用Benjamini-Hochberg方法对P值进行多次比较校正。
结果
对从741个DNA样品获得的16S rRNA扩增子进行测序，得到4,986,865个高质量序列，范围在1,099和15,182之间，每个样品的平均值为6,490±2715个序列。基于99％类似性，将读数分为20,950个操作分类单位(OTU)。
首先，对B组鸡的所有可用样品的β多样性分析(图20)显示，相对于A组和C组，盲肠中的微生物群结构存在不同的纵向轨迹。
当使用加权的UniFrac距离来绘制整个样品集时，这种趋势特别明显(图20A)，而使用未加权的UniFrac距离获得的PCoA显示不同组之间的重叠更高(图20B)。这表明，B组中的肉鸡的微生物群差异很可能存在于最丰富的细菌物种中，而不是次要细菌物种中。
分别使用来自时间点T1、T2和T3的样品进行相同的分析(图21)。在T1时，来自A、B和C组的样品大部分重叠(图21A和121D)，而B组样品在T2和T3开始彼此聚类，尤其是在使用加权的UniFrac度量时(图21B和21C)。
相反，就生物多样性(α多样性，图18)而言，在时间点T2和T3(P<0.0001)，施用到C组中的鸡的营养方案导致物种富集度显著增加(通过“观察到的OTU”度量))(图22E和22F)。
平均微生物群分布的可视化强调三个实验组之间的组成差异在门水平上是可观的(图23)。在B组中，拟杆菌门的相对丰度(图23中的蓝色)在T2时显著增加，而在A组中，拟杆菌的相对丰度仅在T3时发生。C组的饮食似乎部分抑制这种增加。从科水平的成分分析(图24)可以看出，仅施用到B组的饮食促进拟杆菌科的逐渐增加(图24中的深蓝色)，而在A组和C组中，拟杆菌门主要由平均属于理研菌科的细菌(图24中的淡蓝色)组成。该观察在科(图25)和属水平(图25)上均得到统计学证实。B组中的拟杆菌科和拟杆菌属在所有可用时间点均显示出较高的丰度。相反，理研菌科及其阿利斯贝氏菌属在A和C组中显示较高的丰度，但仅在T3时丰度较高。
不同的是，C组中的肉鸡获得的平均科水平分布显示双歧杆菌科的丰度逐渐增加(从T1到T3)(图24中的黄色)，这在A和B组中不可见(图24)。这种差异的重要性被T2和T3的科(图25)和属水平(双歧杆菌属，图26)确认。在科水平下，也强调双歧杆菌科的增加对科氏杆菌科的危害，另一科属于放线菌门(图25)。
最有趣的是，属水平分析表明，施用到B组和C组的两种饮食方案似乎都加速栖粪杆菌相对丰度的增加，相对于A组在T1时在B和C组中的相对含量显著更高(图26)。在以下时间点，三组中的栖粪杆菌的相对丰度没有显著差异。这种纵向趋势反映栖粪杆菌属所属于的瘤胃菌科的观察结果(图25)。在时间点T2，属于瘤胃菌科的另一个属，产粪甾醇[真细菌]组，相对于对照组A，在B和C组的丰度更高(图26)。
沿生产周期(时间点T1，T2和T3)在三组肉鸡(A，B，C组)中回肠微生物群的描述。
初次观察时，对所有可用的回肠样品进行的β多样性分析(图27)显示从三个不同组的鸡(A、B和C)采集的样品在微生物群结构方面并没有遵循不同的纵向轨迹，这与在盲肠微生物群的情况下观察到的结果不同。事实上，在用于样品距离计算的加权和未加权的UniFrac度量的情况下，三组样品均重叠(图27A和B)。
对从741个DNA样品获得的16S rRNA扩增子进行测序，得到4,986,865个高质量序列，范围在1,099和15,182之间，每个样品的平均值为6,490±2715个序列。基于99％的类似性，将读数分为20,950个操作分类单位(OTU)。
这通过在不同的PCoA上绘制在不同时间点收集的样品来确认(图28)。
就生物多样性(α多样性，图29)而言，施用到B组和C组的鸡的营养方案在第一时间点(T1，P＜0.001，图29A)导致相对于A组，回肠生态系统的多样性显著下降(以Faith的PD指数计算)。相反，相同的饮食(B和C组)在时间点T2和T3(仅对于时间点T2有意义，P<0.0001)导致物种富集度的增加(通过“观察到的OTU”度量计算)(29E和29F)。
平均微生物群分布的可视化强调在门水平下，回肠微生物群反映对于盲肠的报道，绝大部分细菌属于厚壁菌门(图30中的绿色)。然而，在较低的系统发育水平(科)下，回肠微生物群的特殊性是明显的，其中乳酸杆菌科(属于厚壁菌门的科)在所有可用时间点上都占主导地位(图31的淡紫色)。
纵向分析强调肠杆菌科(图31中的红色)从T1到T3的逐渐减少，与营养方案(A、B和C组)无关。此外，有可能注意到梭菌科从T1到T3逐渐减少(图31中的深绿色)，有利于消化链球菌(图31中的浅绿色)。如Kruskall-Wallis检验所证实的，这在从A组和C组鸡中采集的T3样品中尤为明显(P<0.0001，图32)。消化链球菌是肉鸡肠道中功能未知的细菌分类群。关注于鸡盲肠微生物组的研究强调该类群的丰度随饮食、补品和抗生素治疗的变化而变化(Munyaka等人，2016；Costa等人，2017；Zeits等人，2019)，而回肠微生物组的研究仍然太少，很难推测消化链球菌变化可能的功能作用。
沿生产周期(时间点T1，T2和T3)的三组肉鸡(A，B，C组)的垫草微生物群的描述。
最初观察时，对所有可用垫草样品进行的β多样性分析(图33)显示，在微生物群结构方面，当使用未加权的Unifrac度量计算样品之间的距离时(Adonis测试)，将从C组中的鸡的箱体获取的样品与其他样品分开聚类，可视化平均微生物群分布强调，在门水平下，回肠微生物群反映对于盲肠的报道，绝大部分细菌属于厚壁菌门(图30中的绿色)。然而，在较低的系统发育水平(科)下，回肠微生物群的特殊性是明显的，其中乳酸杆菌科(属于厚壁菌门的科)在所有可用时间点上都占主导地位(图31的淡紫色)。
纵向分析强调肠杆菌科(图31中的红色)从T1到T3的逐渐减少，与营养方案(A、B和C组)无关。此外，有可能注意到梭菌科从T1到T3逐渐减少(图31中的深绿色)，有利于消化链球菌科(图31中的浅绿色)。如Kruskall-Wallis检验所证实的，这在从A组和C组的鸡中采集的T3样品中尤为明显(P<0.0001，图32)。消化链球菌是肉鸡肠道中一种功能未知的细菌分类群。关注于鸡盲肠微生物组的研究强调该类群的丰度随饮食、补品和抗生素治疗的变化而变化(Munyaka等人，2016；Costa等人，2017；Zeits等人，2019)，而回肠微生物组的研究仍然太少，因此很难推测消化链球菌变化可能的功能作用。
沿生产周期(时间点T1，T2和T3)的三组肉鸡(A，B，C组)的垫草微生物群的描述。
最初观察时，对所有可用垫草样品进行的β多样性分析(图33)显示，在微生物群结构方面，当使用未加权的Unifrac度量计算样品之间的距离时(Adonis测试)，从C组的鸡的箱体获取的样品与其他样品分开聚类，可视化平均微生物群分布强调，在门水平下，回肠微生物群反映对于盲肠的报道，绝大部分细菌属于厚壁菌门(图30中的绿色)。然而，在较低的系统发育水平(科)下，回肠微生物群的特殊性是明显的，其中乳酸杆菌科(属于厚壁菌门的科)在所有可用时间点上都占主导地位(图31中的淡紫色；P＝0.006，图33B)。
基于加权的UniFrac距离的分析没有证实这一点(图33A)，表明C组垫草微生物群与其他垫草微生物群之间的差异可能存在于次要的细菌类群中。同样，基于未加权的UniFrac距离的PCoA中C组垫草和其他垫草样品之间的分离(图33B)沿第二排序轴(MDS2)定位，这仅有助于解释数据集中的总变化的9.4％。
平均微生物群分布的可视化(图34和35)强调，在门和科水平下都没有单一的主要优势类群。然而，在分析的数据集中，垫草微生物组的细菌组成(在科或属水平)和物种丰度/多样性(数据未显示)没有显著差异。
代谢组学分析
样品分析
总共63个样品已提供给意大利博洛尼亚大学的农业与食品科学系的Bio-NMR团队和工业农产品研究(CIRI)的部门间中心，包括在第一时间点收集的21个盲肠样品、在第二时间点收集的21个和在第三个时间点收集的21个。
样品制备
对以下细分的63个样品进行初步分析：对照样品(A)饲喂10mg/kg维生素B2，经处理的样品(B)饲喂50mg/kg维生素B2，经处理的样品(C)饲喂100mg/kg维生素B2。通过将粪便与1ml去离子水涡旋混合5分钟，然后在14 000rpm和4℃下离心10分钟，制备用于核磁共振(NMR)分析的样品。将约540mL上清液加到100μL D2O 1.5M磷酸盐缓冲溶液中，该溶液含有0.1％TSP(3-(三甲基甲硅烷基)丙酸-d4)，NaN3 2mM，设定为pH 7.40。在分析之前，将样品再次离心10分钟并且然后将590μL转移到NMR管中。
NMR光谱采集
用在600.13MHz频率下运行的AVANCE III光谱仪(Bruker，米兰，意大利)在298K下记录质子NMR(1H-NMR)光谱。通过预饱和抑制氢氧化氘(HOD)残留信号，而通过将Carr-Purcell-Meiboom-Gill滤波器27包含在自由感应衰变序列中，去除来自缓慢翻滚分子的宽信号。该滤波器由一系列400回波(相隔800μs)组成，总时间为328ms。通过在7211.54Hz频谱上使用32K数据点求和256个瞬态来获取每个频谱(获取时间为2.27秒)。考虑到所研究的质子的纵向弛豫时间，将循环延迟设置为8秒。通过使用自动命令apkO.noe和通过应用1Hz的行宽因子用Top Spin 3.0(Bruker)处理每个频谱，该命令一次执行基线和相位校正。通过与文献比较其化学位移和多重性并通过使用Chenomx NMR suit 8.1软件对峰进行分配。
1H-NMR光谱预处理
在傅立叶变换、相位和基线校正后，参照分配给内标TSP的0.00ppm的化学位移对光谱校准；去除光谱周边区域以及水信号。此后，使用概率商算法(PQN)在两个不同区域上分别对光谱进行归一化(区域缩放)，因为这最适合此类样品。在归一化之后和在进行任何可能的统计分析之前，将光谱分级到100个数据点中，每个0.0183ppm的间隔。结果，新的光谱图由410个分级的数据组成，已将其作为矩阵保存在文本文件中并导入到R和Python空间中用于多元统计分析(MvSA)。
统计分析
MvSA已应用于分级的数据集矩阵。具体而言，已采用主成分分析(PCA)和偏最小二乘判别分析(PLS-DA)。PCA用于探索一个单一类型的组学数据并确定最大的变异来源，而多级方法旨在与生物样品之间的生物变异分开强调受试者内的处理效果(在这种情况下，属于B和C组的样品分别用50和100mg/kg维生素B2处理)。
结果
NMR谱图
图36报告在pH 7.13下命名为C281的样品的1H-NMR谱图。
通过与文献比较其化学位移和多重性并使用Chenomx NMR Suit8.1软件分配几种代谢物(多重性的缩写为：s＝单峰，dd＝双峰的双峰，d＝双峰，t＝三重峰，m＝多重峰(表示复杂模式)。1)丁酸酯(t：0.899ppm，m：1.562ppm，t：2.165ppm)；2)亮氨酸(t：0.959ppm，m：1.702ppm，m：3.734ppm)；3)缬氨酸(d：0.978ppm，d：1.030，m：2.261ppm，d：3.583ppm)；4)丙酸酯(t：1.060ppm，q：2.188ppm)；5)乙醇(t：1.189ppm，q：3.664ppm)；6)乳酸酯(d：1.335ppm，q：4.124ppm)；7)丙氨酸(d：1.485ppm，q：3.792ppm)；8)乙酸酯(s：1.925ppm)；9)谷氨酸酯(m：2.047ppm，m：2.134ppm，t：2.339ppm，m：2.371，q：3.768ppm)；10)琥珀酸酯(s：2.409ppm)；11)天门冬氨酸酯(q：2.692ppm，dd：2.815ppm，q：3.893ppm)；12)二甲胺(s：2.714ppm)；13)三甲胺(s：2.878ppm)；14)肌酸(s：3.011ppm，s：3.918ppm)；15)甲酸酯(s：8.461ppm)；16)尿嘧啶(d：5.810ppm，d：7.550ppm)；17)苯丙氨酸(m：7.434ppm，m：7.382ppm，d：7.337ppm)；18)酪氨酸(d：7.198ppm，d：6.907ppm)；19)富马酸酯(s：6.525ppm)；20)牛磺酸(t：3.429ppm，t：3.273ppm)。
多元统计分析。
首先，将不同的无管理尺寸缩减方法(PCA，因子分析，独立组件分析，内核驱动的PCA)和分类器(Random Forest，ADABoosted决策树，支持向量机)组合以寻找最佳的尺寸缩减模型，该模型允许在组之间进行分离并识别任何异常样品。在图37中显示未缩放的PCA的结果，该结果在分级和区域的数据集上进行。图37A中的PCA显示存在两个离群值(样品44和46分别为T3-A-C250和T3-A-C261)。排除这些离群值后，新PCA的结果在图37B中显示。前两个主要成分占总方差的84％，但未显示任何可见趋势或分离，也未显示更多的离群值。
由于没有强调与无管理方法的区别，有必要应用有管理的方法(图38)。经过离群值过滤后，具有437个光谱特点的61个受试者各自用于最终PLS-DA(Szymahska，E.等人，2012)。在标准缩放数据上训练5分量PLS-DA模型，其中第一3-PLS方向的组合在区分时间组间隔(尤其是第一方向)方面最具信息性(图38A)。因此，通过将第一3-PLS方向馈入线性内核支持向量分类器中获得最佳预测精度，平均预测精度为约89％。还对ADABoosting树分类器进行评估用于比较，得出平均性能稍差的结果(Valdes，G.等人，2016)。这个结果与2d-PLS-DA空间投影是一致的，其中3组似乎考虑时间作为变量是线性可分的；而考虑到对照样品与处理样品，没有出现明显的分离(图38B)。所使用管道的所有步骤均在内部交叉验证，尤其要注意分类和预测步骤，已对其进行分层的10倍交叉验证以避免过拟合。PLS-DA平均权重与频谱中信息量最大的信号相关，其中在平滑和基线校正后提取频谱以增强信噪比并过滤非信息性频谱信号。
分离中涉及的主要代谢物是：尿嘧啶(图39)，谷氨酸酯(图40)，丙氨酸(图41)，肌酸(图42)，丁酸酯(图43)，丙酸酯(图44)和乙酸酯(图45)。在这些图中，已比较样品在不同时间(T0-T1-T2，分别对应于14天、28天和38/42天)的每种代谢物的积分面积。
在所有处理中，尿嘧啶(图39)的积分面积似乎都将其浓度增加到42天(T2)，尤其是对于浓度始终高于其他浓度的样品C。谷氨酸酯(图40)显示在28天(T1)后其浓度增加的趋势，尤其是在样品A和B中，在T3保持恒定。同样，丙氨酸的积分(图41)总之对于样品C在T1处增加。相反，肌酸仅对于样品A和B在T2处的增加的趋势，但是然后在T3处其浓度降低(图42)。
图43和44与光谱中识别的有机酸有关。与前面的一样，根据时间点在三组之间比较间隔峰的积分。图43和44显示丁酸酯和丙酸酯的结果。
丁酸酯(图43)似乎不受治疗和时间的影响。实际上，所有样品中的T0、T1和T2处的平均积分面积是大致相同的量。对于乙酸酯，趋势结果相同(图45)。对于丙酸酯出现趋势增加(图44)。
重要的是要强调结果受到数据短缺的影响且因此无法从它们产生明显的趋势。因此，已进行进一步分析并拟合4种主要代谢物的趋势：图46显示各组中指定的有机酸的积分面积如何随时间变化。
元基因组分析
样品分析
总共向博洛尼亚大学(UNIBO)的农业和食品科学部的食品安全实验室提供63个样品，包括从第一时间点收集的21个盲肠样品、从第二时间点收集的21个盲肠样品和从第三个时间点收集的21个样品。
元基因组分析的方法论
DNA提取用于宏基因组学测序
使用珠敲打程序从盲肠内容物的每个样品提取DNA。简而言之，将0.25g盲肠内容物悬浮于1ml具有MagNA Lyser Green Beads(Roche，米兰，意大利)的裂解缓冲液(500mMNaCl，50mM Tris-Cl，pH 8.0，50mM EDTA，4％SDS)中并在MagNA Lyser(Roche)上在6500rpm下均质化25秒。然后将样品在70℃下加热15min，然后离心以从细菌细胞碎片中分离DNA。用第二个300pi等份的裂解缓冲液重复此过程。然后使样品进行10M v/v乙酸铵沉淀(Sigma，米兰，意大利)，然后进行异丙醇(Sigma)沉淀和70％乙醇(Carlo Erba，米兰，意大利)洗涤并重新悬浮于100ul 1X Tris-EDTA(Sigma)。然后将样品用不含DNase的RNase(Roche)处理并在4℃下孵育过夜，然后根据具有一些修改的制造商的指示通过
Figure BDA0002954975430000741
DNA StoolMini Kit(Qiagen，米兰，意大利)处理。在
Figure BDA0002954975430000742
(Eppendorf，米兰，意大利)上测量样品以评估DNA的数量和质量。符合DNA质量分数的所有样品(即A260/280nm比率在1.8和2.0之间)将使用Nextera XT DNA库制备试剂盒(Illumina，San Diego，CA)进行库制备。然后，所有平均大小在300至500bp之间且最低浓度为4pM的库将使用NextSeq500(Illumina)在150bp下在配对末端模式中测序。
测序策略和平台
所有样品均以成对末端测序。平均读取长度为300bp。通过使用Illumina的NextSeq500进行测序运行。提交的基因组的特征是在20Mbp和12Gbp之间的输出。
生物信息学分析
使用MGRast(MR)(https://www.mg-rast.org)(Keegan等人，2016)生物信息学流水线对原始读数进行过滤和整理。此外，使用默认设置参数(e值截止：<1e-5，最小％同一性截止：60％，和最小对齐长度截止：15)在MG-RAST v3.6元基因组分析服务器(Meyer等人，2008)上进行功能注释。对于功能分类，分别使用SEED和KEGG(Kyoto Encyclopedia ofGenes and Genomes)标识符将基因映射到SEED和KEGG分类中。
统计分析
使用STAMP v2.0.8软件(Parks和Beiko，2010；Parks等人，2014)进行比较功能分析以进行统计分析。通过将个体功能中的基因命中数除以每个元基因组数据集的基因命中数将基因计数归一化，以消除由于测序工作差异而产生的偏差。为了识别元基因组中丰度有差异的SEED或KEGG功能，通过应用双面Welch精确检验与Benjamini-Hochberg错误发现率(FDR)多重检验校正方法和p值<0.05对相对基因丰度进行统计检验。
结果
首先，基于“功能特点数据”的主成分分析(PCA)旨在寻找最佳的尺寸缩减模型，该模型可在组之间进行分离并识别任何异常样品。在图47中，报告对63个具有6361个功能特点的受试者进行的PCA结果。前两个主要成分占总方差的81％；代表治疗组(B和C组)与对照组(A组)之间清晰可见的分离。关于时间点，无法识别分离。
三组肉鸡(A，B，C组)沿生产周期(时间点T1，T2和T3)的主要KEGG代谢途径的描述。
对于每个可用时间点(T1，T2，T3)，基于三个不同组A、B和C的肉鸡盲肠的KEGG数据库，在1级(水平1)平均功能基因分布的可视化强调，三个实验组之间的组成差异在1级下是明显的(图49)。特别是在A组中，与治疗组相比，遗传信息处理的相对丰度(图49中橙色)在每个时间点均具有统计学上的显著增加(表5)。相反，环境信息处理的相对丰度(图50A)与A组相比在A和B组中在每个时间点具有统计学上的显著增加(表5)。此外，代谢的相对丰度(图50B)在28天的年龄下与A组相比在B和C组中在统计学上增加，而与B和C组相比在A组中在统计学上增加(表5)。
表5肉鸡盲肠中的主要KEGG代谢途径的相对丰度≥0.1％，显示在每个时间点(T1，T2，T3)下治疗组(B组和C组)与对照组(A组)之间的统计学差异
Figure BDA0002954975430000761
*＝当达到统计显著性时(P<0.05)，报告Bejamini Hocherg校正P值。
三组肉鸡(A，B，C组)沿生产周期(时间点T1，T2和T3)的次级KEGG代谢途径的描述。
相对丰度≥0.5％的次级KEGG代谢途径的可视化强调对于每个时间点在三个实验组之间的组成差异是明显的(图51)(即在14天的翻译、转录；在28天的膜转运、翻译、复制和修复；在42天的膜转运、翻译、复制和修复、核苷酸代谢)。
特别是在B和C组中，与A组相比，辅因子和维生素在每个时间点天数的相对丰度在统计学上显著增加(下表6、7和8中的浅灰色)。相反，与B和C组相比，在A组中在每个时间点的翻译、转录和环境适应的相对丰度在统计学上显著增加(表5中的白色)。
考虑其他途径，与A组相比(表7和8中的橙色)，B和C组中的膜转运、复制和修复，其他次生代谢物的生物合成，萜类和聚酮化合物的代谢以及其他氨基酸的代谢的相对丰度在28天和42天的年龄下在统计学上增加。相反，在28天和42天的年龄下，与B和C组相比(表7和8中的白色)，A组中的翻译，能量代谢，信号传导，转录，传染病和环境适应的相对丰度在统计学上增加。最后，在28天的年龄下，与A组相比，B和C组的脂质代谢的相对丰度显著增加(表6和7中的浅灰色)，而A组中的折叠、分类和降解、细胞通讯和信号传导分子以及相互作用在28天的年龄下与B和C组相比，在统计学上增加(表7中的白色)。
表6肉鸡盲肠中相对丰度≥0.5％的次级KEGG代谢途径，并且显示在T1(14天的年龄)下(B组和C组)与对照组(A组)之间的统计学显著差异
Figure BDA0002954975430000771
*＝当达到统计显著性时(P<0.05)，报告Bejamini Hocherg校正P值。
表7肉鸡盲肠中相对丰度≥0.5％的次级KEGG代谢途径，并且显示在T2(28天的年龄)下治疗组(B和C组)和对照组(A组)之间统计学显著差异
Figure BDA0002954975430000772
Figure BDA0002954975430000781
*＝当达到统计显著性时(P<0.05)，报告Bejamini Hocherg校正P值。
表8肉鸡盲肠中相对丰度≥0.5％的次级KEGG代谢途径，并且显示在T3(42天的年龄)下治疗组(B和C组)与对照组(A组)之间的统计学显著差异
Figure BDA0002954975430000791
*＝当达到统计显著性时(P<0.05)，报告Bejamini Hocherg校正P值。
三组肉鸡(A，B，C组)沿生产周期(时间点T1，T2和T3)的三级KEGG代谢途径的描述。
在分析三级KEGG代谢途径时，在实验组之间在14天的年龄时未见差异(数据未报道)，而大量途径在28天和42天的年龄时显示显著差异(下表9和10)。
特别是在28和42天的年龄下，相对丰度≥0.1％的19种途径(ABC转运蛋白，DNA复制，嘧啶代谢，同源重组，磷酸戊糖途径，苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸生物合成，烟酸酯和尼克酰胺代谢，类苯丙烷生物合成，硫中继系统，甘油磷脂代谢，甲烷代谢，泛酸和CoA生物合成，硒化合物代谢，叶酸酯生物合成，磷酸肌醇代谢，溶酶体，丁酸酯代谢，生物素代谢，膦酸酯和次膦酸酯代谢)在B和C组中与A组相比(表9和10中的浅灰色)在统计学上显著增加。相反，相对丰度≥0.1％的9种途径(丙氨酸，天冬氨酸酯和谷氨酸酯代谢，嘌呤代谢，RNA聚合酶，RNA降解，两组分系统，丙酮酸酯代谢，核苷酸切除修复，缬氨酸，亮氨酸和异亮氨酸降解，赖氨酸降解)与B和C组相比(表9和10中的白色)在A组中在统计学上显著增加。
此外，27种途径(氨酰基tRNA生物合成，糖酵解/糖异生，氧化磷酸化，淀粉和蔗糖代谢，精氨酸和脯氨酸代谢，半乳糖代谢，氨基糖和核苷酸糖代谢，肽聚糖生物合成，组氨酸代谢，磷酸转移酶系统(PTS)，萜类主链生物合成，果糖和甘露糖代谢，脂肪酸生物合成，柠檬酸酯循环(TCA循环)，碱基切除修复，失配修复，酪氨酸代谢，乙醛酸酯和二羧酸酯代谢，细菌趋化性，过氧化物酶体，其他聚糖降解，谷胱甘肽代谢，维生素B6代谢，玉米素生物合成，脂多糖生物合成，色氨酸代谢，钙信号传导途径)在28天的年龄下在B和C组中与A组(表9中的浅灰色)相比在显著学上增加。
特别令人关注的是代谢途径，例如脂肪酸生物合成，磷酸转移酶系统(PTS)和丁酸酯代谢，这些在治疗组中增加并且与SCFA的产生有关。此外，针对维生素B途径如烟酸酯和尼克酰胺代谢，泛酸酯生物合成，叶酸酯生物合成，生物素代谢和维生素B6代谢报告治疗组(B和C组)中的统计学显著增加。
表9肉鸡盲肠中的三级KEGG代谢途径，并且显示在28天的年龄下治疗组(B和C组)与对照组(A组)之间的统计学显著差异
Figure BDA0002954975430000801
Figure BDA0002954975430000811
Figure BDA0002954975430000821
Figure BDA0002954975430000831
Figure BDA0002954975430000841
*＝当达到统计显著性时(P<0.05)，报告Bejamini Hocherg校正P值。
表10肉鸡盲肠中相对丰度≥0.1％的三级KEGG代谢途径，并且显示治疗组(B组和C组)和对照组(A组)在42天的年龄下的统计学显著差异
Figure BDA0002954975430000851
Figure BDA0002954975430000861
Figure BDA0002954975430000871
*＝当达到统计显著性时(P<0.05)，报告Bejamini Hocherg校正P值。
评估与SCFA和葡糖苷酶有关的基因丰度
由于短链脂肪酸(SCFA)在肠道生理中起着重要作用，我们专门分析导致丁酸酯和丙酸酯合成的代谢途径。如文献中所述，存在导致丁酸酯生产的4种潜在途径。第一个也是主要的一个是基于乙酰辅酶A乙酰转移酶(图39)。
在我们的研究中考虑与丁酸酯生产相关的基因的相对丰度，我们识别与A组相比，在治疗组(B和C组)中在28天的年龄下至少7种代谢功能并且在42天的年龄下5种代谢功能在统计学上显著增加(下表11)。该证据可能与不同微生物属例如粪杆菌属和真杆菌属(Polansky等人，2016，Rowland等人，2018)以及双歧杆菌的交叉喂养活性相关(如被Reviere等人，2016报告)。所有这些属已在我们的研究中通过微生物群分析识别并且这些结果可预测用维生素B2处理的动物中丁酸酯的潜在产量。
表11肉鸡盲肠中与丁酸酯产生相关的功能基因的相对丰度的百分比(KEGG和SEED数据库)，显示在28天和42天的年龄下治疗组(B组和C组)与对照组(A组)的统计学显著差异
Figure BDA0002954975430000881
Figure BDA0002954975430000891
*＝当达到统计显著性时(P<0.05)，报告Bejamini Hocherg校正P值。
非常有趣的是，与A组相比，治疗组(B和C组)的肉鸡盲肠中与β-半乳糖苷酶相关的功能基因的相对丰度的统计学上显著增加的证据(下表12)。如微生物群分析中报告的那样，该结果可以被治疗组中双歧杆菌的增加以及乳酸杆菌属物种解释(Shaima等人，2017)。在人类中，这种酶在结肠中大量发现，在结肠中它促进乳糖发酵，并且其活性经测量表明结肠微生物群发酵肠乳糖的能力。
表12在肉鸡盲肠中与β-半乳糖苷酶(KEGG和SEED数据库)相关的功能基因的相对丰度百分比，显示治疗组(B和C组)与对照组(A组)之间的统计学显著差异
Figure BDA0002954975430000892
Figure BDA0002954975430000901
*＝当达到统计显著性时(P<0.05)，报告Bejamini Hocherg校正P值。
结论
·施用到B组和C组的两种饮食方案引起盲肠微生物群的改变，包括在肉鸡生产周期的第一时期(T1)期间属于栖粪杆菌属的众所周知的消炎和促进健康的细菌相对于对照饮食的增加。在生产周期的第二和第三阶段(T2和T3)，栖粪杆菌的相对丰度在三组之间没有显著差异。综上所述，我们的结果看上去强调栖粪杆菌在肉鸡的生产周期期间自然增加(对照饮食，A组)，而施用到B和C组中的肉鸡的饮食方案看上去速这种增长。
·相对于对照饮食(施用到A组)，施用到C组的饮食还诱导另一个促进健康的双歧杆菌组的丰度逐渐增加，以及物种富集度的增加。相反，施用到B组的饮食有利于整个生产周期期间拟杆菌丰度的增加。
·拟杆菌增加将损害拟杆菌门的另一种成员，理研菌科(阿利斯贝氏菌)。
·施用到B和C组中的肉鸡的两种饮食对回肠微生物群组成和多样性具有轻微影响，并且在垫草样品中未检测到对微生物群的显著影响。
·如前所述，选择用于代谢研究的样品的短缺影响数据和结果的质量。因此，重要的是具有包括在所有样品的分析中的更稳健的数据集。然而，似乎很清楚，代谢物如乙酸酯、谷氨酸酯、丙酸酯和丁酸酯都受到处理的影响。
·对63个具有6361个功能特点的受试者进行的PCA显示明显的维生素B2效果，这导致治疗组(B组和C组)和对照组(A组)之间的分离。该结果未强调为分析时间的函数。
·考虑到主要的KEGG代谢途径，A组(5ppm维生素B2)的遗传信息处理和生物系统的相对丰度增加，而治疗组(50和100ppm维生素B2)的环境信息处理和代谢增加。
·观察相对丰度≥0.5％的次级KEGG代谢途径，结果强调对于每个时间点在三个实验组之间的明显组成差异。特别地，在50和100ppm的维生素B2的处理组中，辅因子和维生素的代谢的相对丰度，膜转运，复制和修复，其他次生代谢物的生物合成，萜类和聚酮化合物的代谢以及其他氨基酸的代谢增加。相反，在5ppm的维生素B2的对照组的翻译，能量代谢，信号传导，转录，传染病和环境适应性在统计学上增加。
·观察三级KEGG代谢途径，在实验组之间在14天的年龄下没有报告差异，而许多途径显示在28天和42天的年龄下的显著差异。特别有趣的是代谢途径，例如脂肪酸生物合成，磷酸转移酶系统(PTS)和丁酸酯代谢，在治疗组(维生素B2的50和100ppm)中增加，并与SCFA的产生有关。此外，对于维生素B途径如烟酸酯和尼克酰胺代谢，泛酸酯生物合成，叶酸酯生物合成，生物素代谢和维生素B6代谢报告治疗组中的统计学上显著增加。
·与对照组(5ppm维生素B2)相比，在治疗组(50和100ppm维生素B2)中与丁酸酯产生有关的在28天的年龄下至少7种代谢功能和在42天的年龄下5种代谢功能在统计学上增加。该证据可能与不同的微生物属，例如栖粪杆菌属和真杆菌属(Zam等人，2016；Rowland等人，2018)，以及双歧杆菌的交叉喂养活性(如通过Reviere等人，2016年报道)有关。所有这些属已在我们的研究中通过微生物群分析识别，并且这些结果可预测用维生素B2处理的动物中的丁酸酯的潜在产量。
实施例4
猪模型
材料和方法
给三头猪提供商业饲料4周。饲料包括：大麦、小麦和豆粕作为主要成分，并且其主要化学成分是(g/kg)：151粗蛋白，34粗脂肪，40粗纤维，55和灰分。在实验时间段开始时(平均；23.9±1.01Kg)和在结束时(平均；43.3±3.56Kg)分别对动物称重。在适应30天后，将动物宰杀。用玻璃电极pH计(CRISON 507，CRISON，巴塞罗那，西班牙)直接测量胃、小肠和后肠内容物的pH。立即将胃和小肠内容物过滤，取样并储存在-20℃下，用作消化接种物以评估离体消化率。关于盲肠内容物，立即取样一份，分配在20ml试管中，在液氮中冷冻，并在-80℃下储存以用作冷冻接种物用于体外产气研究。另一部分直接用作新鲜发酵接种物。
体外酶消化
为了确定在猪的胃和小肠中的酶消化率，进行两个实验：
A-用外源酶：
对于每种处理，一式两份孵育仅包含0.5g底物或补充三种优生素的锥形瓶(总体积100mL)，以按照Boisen和Fernandez(1997)的三步法测定其体外酶消化率。消化率通过以下确定：
[1]胃蛋白酶
[2]胃蛋白酶+胰酶
[3]胃蛋白酶+胰酶+粘液酶
B.用胃内容物和小肠内容物
遵循类似的酶消化程序，但是在这种情况下，胃蛋白酶和胰蛋白酶溶液被每只动物的胃内容物和小肠内容物替代，从而消除了Boisen和Fernandez(1997)的第三步。消化率通过以下确定：
胃内容物(9mL)
胃内容物+小肠内容物(9mL)
体外产气
通过产气技术体外研究盲肠内容物的微生物发酵模式(Theodorou等人，1994.Anim Feed Sci Technol 48:185-1-971994.Anim Feed Sci Technol 48:185-1-97)。模拟盲肠之前发生的消化过程的0.8g量的预消化饲料(根据Boisen和Fernández,1997Anim Feed Sci Technol 51:29-43的程序，在胃蛋白酶-HCl和胰酶培养中连续培养)单独用作底物或补充的维生素B2。首先，每次处理一式三份的玻璃瓶(总体积110mL)装满56ml孵育溶液。将每种处理的每3只猪的盲肠内容物与孵育溶液在CO2气氛下以2:1混合，并用沃林搅拌器均质化几分钟(盲肠内容物为总孵育溶液的0.20)。然后，向每瓶中加入24mL混合物以完成80mL总液体体积。另外，不具有底物的一式三份的瓶也作为空白包括。将瓶在CO2流下密封并在39℃下孵育12h。在整个培养时间中，通过装有TP804压力表的HD 2124.02压力计(Delta Ohm,Caselle di Selvazzano，意大利)每两小时记录一次压力。通过在相同条件下在相同瓶中记录的压力与已知空气体积之间(n＝103；R2＝0.996)预先建立的线性回归方程将读数转换为体积。每次孵育时间记录的气体体积以每单位孵育的有机物(OM)表示。每隔6h测量甲烷(CH4)浓度。在第6和12h，收集孵育样品，并用0.1N HCl以1:1酸化，或加到0.5ml 0.5M PO4H3与2mg/ml 4-甲基戊酸的去蛋白混合物中，并在-20℃下保存分别用于测定氨和挥发性脂肪酸(VFA)的浓度。注意到对于新鲜接种物和冷冻接种物二者的体外产气程序都是相同的，唯一的区别是事先将盲肠内容物的冷冻样品在38℃下保持5min以解冻。
对于产气，将每个孵育时间的结果作为分图设计来分析，将供体猪作为一个块，将内容物(新鲜与冷冻)作为主要图，并且将处理作为子图。使用相同的设计来分析从消化内容物(胃和小肠)获得的结果作为主图。由于没有实验可变性的来源，未对体外酶促结果进行统计分析。当P<0.05时，差异被认为是显著的，并且当0.05￡P<0.10时，差异被认为是显著趋势；并且当显著时，通过Tukey t检验在P<0.05下比较差异。
结果
离体和酶消化
观察到对于胃内容物，与对照相比，维生素B2的底物消化率最高(P<0.05)。在小肠内容物消化后，这种差异减至最小，并且在各处理之间未发现差异(P>0.05)。
尽管胃蛋白酶-HCl消化程度略低于胃内容物，但对于外源酶观察到的底物消化率结果与对于消化物内容物记录的结果一致。因此，当在胃蛋白酶-HCl中孵育时，对补充有维生素B2的底物记录的消化率高于其他处理的消化率。然而，当在(P+胰酶)和/或(P+P+粘菌酶)中孵育处理时，未观察到处理之间的差异。结果表明，这两种方法对评估猪的酶消化是有效的。
体外产气
平均而言，用新鲜盲肠内容物孵育的来自处理的产气模式与用冷冻盲肠内容物记录的产气模式没有差异(P>0.05)；然而，在孵育4h时，带有新鲜内容物的气体体积倾向于更高(P＝0.081)。平均而言，在孵育4、10和12h时，用维生素B2记录的气体体积比对照组要高(P<0.05)。
在整个孵育时间中，保存类型和处理之间的相互作用没有达到显著性(P<0.05)，这表明尽管盲肠内容物凝结，处理的表现类似。
甲烷产生
关于CH4产生，在新鲜和冷冻接种物之间在培养12h后未观察到差异(P>0.05)。在至多12h的孵育中，在各处理之间在全部气体的CH4比例上没有差异(P>0.05)，尽管在数值上用维生素B2记录的CH4最低。类似地，当CH4产生表示为每单位孵育底物的体积时，在处理之间在6h和12h孵育时没有记录显著差异，尽管在处理之间的排名表明维生素B2在6h孵育下以及在12h孵育下记录的CH4累积最低。
用维生素B2观察到的结果表示该维生素可能对后肠细菌物种的活性具有积极影响，因为众所周知，维生素B2在能量产生中起重要作用，有助于碳水化合物降解。此外，甲烷产生减少可能通过维生素B2可以降低产甲烷菌或古细菌种群的活性来解释。
总挥发性脂肪酸浓度(TVFA)，VFA的摩尔比和氨产生
对于盲肠接种物的保存和各处理之间的总VFA浓度、VFA的摩尔比例或氨浓度均未见差异。这表明通过测试的实验处理，对盲肠发酵特性没有产生重大影响。
总之，维生素B2在胃水平(可能刺激胃蛋白酶的活性)和后肠水平(可以增强微生物活性)均显示出明显的阳性反应。

Claims (41)

1.一种在改善包括人的动物中的肠健康中的应用的活性剂，所述活性剂选自核黄素、维生素A、维生素C、维生素D、维生素E、维生素K、叶酸、β-胡萝卜素、维生素B1、烟酸、维生素B5、维生素B6、生物素、维生素B12、ω-3脂肪酸及其组合，其中所述改善包括或由以下组成：
i.增加所述肠中的至少一种短链脂肪酸或其盐的浓度，
ii.增加所述肠中的微生物组多样性，
iii.增加所述肠中的有益细菌的丰度，
iv.促进或增加所述肠中的丁酸酯合成途径，
v.改善所述肠屏障功能，
vi.减少肠道的氧化还原电位，
vii.减少所述肠中产生的气体量，和/或
viii.刺激肠免疫反应；
其中所述应用包括向动物施用
a)包含有效剂量的活性剂的制剂，其中所述活性剂被递送到大肠；或
b)超生理剂量的活性成分，以使所述动物的肠中存在至少有效量的活性成分；
前提是，如果存在烟酸，则它不是唯一的活性成分；并且如果存在核黄素，则它具有除了增加普氏栖粪杆菌的数量外的改善作用。
2.根据权利要求1所述的活性剂，其中所述动物是人并且所述有效剂量的活性剂是通过延迟释放制剂递送的。
3.根据权利要求1或2所述的活性剂，其中所述改善包括增加所述肠中的至少一种短链脂肪酸或其盐的浓度，或促进或增加所述肠中的丁酸酯合成途径；
并且其中所述短链脂肪酸选自乙酸、丙酸和丁酸或其盐。
4.根据权利要求3所述的活性剂，其中所述活性剂选自：维生素A、β-胡萝卜素、维生素C、核黄素、维生素D、维生素E、维生素K、叶酸、ω3脂肪酸及其组合。
5.根据权利要求3或4所述的活性剂，其中所述包括人的动物患有选自代谢紊乱、2型糖尿病、肥胖症、慢性炎症和动脉粥样化形成的病症。
6.根据权利要求1或2所述的活性剂，其中所述改善包括增加所述肠中的微生物组多样性。
7.根据权利要求6所述的活性剂，其中在所述结肠中的微生物组多样性增加和/或有益细菌的丰度增加。
8.根据权利要求6或7所述的活性剂，其中增加的有益细菌选自氨基酸球菌属、阿克曼氏菌种卵形拟杆菌、双歧杆菌属、产布鲁氏菌、产气荚膜梭菌、产气柯林斯菌、Dorealongicatena、大肠杆菌、真杆菌属、普氏栖粪杆菌、裂果胶毛螺菌、乳酸杆菌属、狄氏副拟杆菌、拉乌尔菌属、罗氏菌属、瘤胃球菌属、链球菌属及其组合。
9.根据权利要求6至8中任一项所述的活性剂，其中增加的细菌选自双歧杆菌、阿克曼氏菌、栖粪杆菌和拟杆菌。
10.根据权利要求6-9中任一项所述的活性剂，其中所述包括人的动物患有选自肠易激疾病、代谢疾病、肥胖症和炎性病症的病症。
11.根据权利要求6-10中任一项所述的活性剂，其中所述活性剂选自：维生素B1、维生素B2、维生素B5、维生素B6、维生素B12、β-胡萝卜素、生物素、维生素C、维生素E、维生素D、叶酸、维生素K、ω3脂肪酸及其组合。
12.根据权利要求1或2所述的活性剂，其中所述改善包括改善肠屏障功能。
13.根据权利要求12所述的活性剂，其中所述包括人的动物患有选自肠易激疾病、克罗恩病、溃疡性结肠炎、肠道渗漏和营养不良的病症。
14.根据权利要求12或13所述的活性剂，其中所述活性剂选自：维生素B2、维生素C、维生素E、ω-3脂肪酸、维生素D、维生素A、叶酸、维生素K1及其混合物。
15.根据权利要求1或2所述的活性剂，其中所述改善包括降低肠道的氧化还原电位。
16.根据权利要求15所述的活性剂，其中降低的氧化还原电位产生选自以下的益处：促进严格厌氧的有益细菌在结肠中的生长；减少肠道中的耐氧致病菌，降低血浆游离硫醇，减少肠道中的炎症以及减少由肠道中的炎症导致的细胞损伤。
17.根据权利要求15或16所述的活性剂，其中所述活性剂选自维生素C、维生素E及其混合物。
18.根据权利要求1或2所述的活性剂，其中所述改善是减少所述肠中产生的气体的量。
19.根据权利要求18所述的活性剂，其中所述活性剂是维生素B2、维生素C、维生素E及其组合。
20.根据权利要求1或2所述的活性剂，其中所述改善是刺激肠免疫反应。
21.根据权利要求20所述的活性剂，其中所述免疫反应是选自以下的免疫反应分子的增加：GROa-CXCL1、MIP3A-CCL20、白介素8及其组合。
22.根据权利要求20或21所述的活性剂，其中所述活性剂选自：维生素B2、维生素E、维生素D、维生素A和维生素K及其混合物。
23.一种用于改善包括人的动物中的肠健康的方法，其中所述改善包括或由以下组成：
i.提高所述肠中的至少一种短链脂肪酸或其盐的浓度，
ii.增加所述肠中的微生物组多样性，
iii.增加所述肠中的有益细菌的丰度，
iv.促进或增加所述肠中的丁酸酯合成途径，
v.改善肠屏障功能，
vi.降低所述肠道的氧化还原电位，
vii.减少所述肠中产生的气体量，和/或
viii.刺激肠免疫反应；
其包括向所述动物施用选自核黄素、维生素A、维生素C、维生素D、维生素E、维生素K、叶酸、β-胡萝卜素、维生素B1、烟酸、维生素B5、维生素B6、生物素、维生素B12、ω-3脂肪酸及其组合的活性剂，其中所述活性剂存在于
a)包含有效剂量的所述活性剂的制剂，其中所述活性剂被递送到大肠；或
b)超生理剂量的活性成分，以使动物肠中存在至少有效量的所述活性成分；
前提是，如果存在烟酸，则它不是唯一的活性成分；并且如果存在核黄素，则它具有除了增加普氏栖粪杆菌的数量外的改善作用。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述动物是人，并且所述活性剂被递送到肠。
25.根据权利要求23所述的方法，其中所述活性剂是超生理剂量的。
26.根据权利要求23所述的方法，其中所述改善是增加动物中的至少一种短链脂肪酸和/或增加丁酸酯合成途径的活性。
27.根据权利要求26所述的方法、其中所述动物患有选自代谢紊乱、2型糖尿病、肥胖症、慢性炎症和动脉生成的病症。
28.根据权利要求26所述的方法，所述方法包括施用至少一种选自维生素A、维生素C、核黄素、维生素E、叶酸、β-胡萝卜素、ω3脂肪酸及其组合的活性剂。
29.根据权利要求23所述的方法，其中所述改善是增加所述肠中的微生物组多样性，或增加所述肠中的有益细菌的丰度。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述活性剂选自维生素B1、核黄素、维生素B5、维生素B12、β-胡萝卜素、生物素、维生素C、维生素E、维生素D、叶酸、维生素K、ω3脂肪酸及其组合；前提是如果核黄素是活性剂，那么其出于除增加普氏栖粪杆菌的丰度外的目的存在。
31.根据权利要求29所述的方法，所述方法是在有需要的包括人的动物中治疗、预防或减轻肠易激综合症、代谢疾病、肥胖症或炎性病症的症状的方法，所述方法包括：向动物的结肠施用增强活性剂的量的有益细菌；所述活性剂选自维生素B1、核黄素、维生素B5、维生素B12、β-胡萝卜素、生物素、维生素C、维生素E、维生素D、叶酸、维生素K、ω3脂肪酸及其组合；前提是如果核黄素是活性剂，那么其出于除增加普氏栖粪杆菌的丰度外的目的存在。
32.根据权利要求23所述的方法，其中所述改善是刺激肠免疫反应。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述包括人的动物患有急性或慢性炎症。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述活性剂选自核黄素、维生素E、维生素A、维生素K及其组合。
35.根据权利要求32所述的方法，其中所述改善是减少所述肠道的氧化还原电位，其导致选自以下的益处：
促进严格厌氧的有益细菌在结肠中的生长；
减少所述肠道中的耐氧致病菌；
减少所述肠道中的炎症；和
减少由所述肠道中的炎症引起的肠道细胞损伤。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述试剂选自核黄素、维生素C、维生素E及其混合物。
37.根据权利要求23所述的方法，其中所述改善是治疗、预防或减少所述肠道中产生的气体量。
38.根据权利要求23或37所述的方法，其中所述活性剂选自维生素B2、维生素C及其组合。
39.根据权利要求23所述的方法，其中所述改善是改善肠道屏障功能。
40.根据权利要求39所述的方法，其中改善屏障功能是治疗、预防或减轻选自肠易激疾病、克罗恩病、溃疡性结肠炎、肠道渗漏和营养不良的病症的症状的方法。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述试剂选自核黄素、维生素C、维生素E、ω-3脂肪酸、维生素D、维生素A、叶酸、维生素K及其混合物。
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