KR20210087927A - 장 건강 개선을 위한 제형 - Google Patents

장 건강 개선을 위한 제형 Download PDF

Info

Publication number
KR20210087927A
KR20210087927A KR1020217005853A KR20217005853A KR20210087927A KR 20210087927 A KR20210087927 A KR 20210087927A KR 1020217005853 A KR1020217005853 A KR 1020217005853A KR 20217005853 A KR20217005853 A KR 20217005853A KR 20210087927 A KR20210087927 A KR 20210087927A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
vitamin
active agent
group
intestinal
riboflavin
Prior art date
Application number
KR1020217005853A
Other languages
English (en)
Inventor
마이케 요한나 브루인스
소피 펠바움
탄-판 팜
케빈 프루덴스
로버트 스타이너트
피트로 셀리
길베르토 리타
칼보 에스테파니아 페레즈
빌베르트 시베스마
Original Assignee
디에스엠 아이피 어셋츠 비.브이.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 디에스엠 아이피 어셋츠 비.브이. filed Critical 디에스엠 아이피 어셋츠 비.브이.
Publication of KR20210087927A publication Critical patent/KR20210087927A/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7135—Compounds containing heavy metals
    • A61K31/714—Cobalamins, e.g. cyanocobalamin, i.e. vitamin B12
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/01—Hydrocarbons
    • A61K31/015—Hydrocarbons carbocyclic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/045—Hydroxy compounds, e.g. alcohols; Salts thereof, e.g. alcoholates
    • A61K31/07—Retinol compounds, e.g. vitamin A
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/12—Ketones
    • A61K31/122—Ketones having the oxygen directly attached to a ring, e.g. quinones, vitamin K1, anthralin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A61K31/195—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group
    • A61K31/197—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group the amino and the carboxyl groups being attached to the same acyclic carbon chain, e.g. gamma-aminobutyric acid [GABA], beta-alanine, epsilon-aminocaproic acid or pantothenic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A61K31/20—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having a carboxyl group bound to a chain of seven or more carbon atoms, e.g. stearic, palmitic, arachidic acids
    • A61K31/202—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having a carboxyl group bound to a chain of seven or more carbon atoms, e.g. stearic, palmitic, arachidic acids having three or more double bonds, e.g. linolenic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/35—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom
    • A61K31/352—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom condensed with carbocyclic rings, e.g. methantheline 
    • A61K31/353—3,4-Dihydrobenzopyrans, e.g. chroman, catechin
    • A61K31/355—Tocopherols, e.g. vitamin E
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/365—Lactones
    • A61K31/375—Ascorbic acid, i.e. vitamin C; Salts thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/4164—1,3-Diazoles
    • A61K31/4188—1,3-Diazoles condensed with other heterocyclic ring systems, e.g. biotin, sorbinil
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/4415—Pyridoxine, i.e. Vitamin B6
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/455—Nicotinic acids, e.g. niacin; Derivatives thereof, e.g. esters, amides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/506—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim not condensed and containing further heterocyclic rings
    • A61K31/51—Thiamines, e.g. vitamin B1
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/519—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim ortho- or peri-condensed with heterocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/519—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim ortho- or peri-condensed with heterocyclic rings
    • A61K31/525—Isoalloxazines, e.g. riboflavins, vitamin B2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/59—Compounds containing 9, 10- seco- cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/59—Compounds containing 9, 10- seco- cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems
    • A61K31/593—9,10-Secocholestane derivatives, e.g. cholecalciferol, i.e. vitamin D3
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/14—Prodigestives, e.g. acids, enzymes, appetite stimulants, antidyspeptics, tonics, antiflatulents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/02—Nutrients, e.g. vitamins, minerals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)

Abstract

본 발명은 인간을 비롯한 동물의 결장에 활성제를 전달함으로써 장 건강에 다양한 이점을 제공하는 것이다. 활성 성분은 리보플라빈, 비타민 A, 비타민 C, 비타민 D, 비타민 E, 비타민 K, 엽산, β-카로틴, 비타민 B1, 니아신, 비타민 B5, 비타민 B6, 비오틴, 비타민 B12, 오메가-3 지방산 또는 이들의 조합이 포함된다. 이점은 장에서 하나 이상의 단쇄 지방산 및 이의 염의 농도 증가, 장내 미생물총 다양성 증가, 장내 유익균 증가, 장내 부티레이트 합성 경로 증가, 장의 장벽 기능 개선, 장의 산화환원 전위 감소, 장내 가스 생산량 감소 및 장 면역 반응 자극을 포함한다.

Description

장 건강 개선을 위한 제형
본 발명은 동물 및 인간의 장 건강을 개선하기 위한 제형에 관한 것이다. 특히, 본 발명의 제형은 하부 장(lower intestinal tract)에서 단쇄 지방산(SCFA)의 농도를 증가시키고/시키거나 하부 장내 부티레이트 합성 경로를 증가시키기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 제형은 추가로 하부 장에서 미생물총(microbiome) 다양성 및/또는 비피도박테리움(Bifidobacterium), 아케르만시아(Akkermansia) 및 파에칼리박테리움(Faecalibacterium)과 같은 유익균의 풍부도를 증가시키거나 조절하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명은 또한 장 장벽 기능을 개선하고 장 면역 반응을 자극하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다.
인간과 동물의 미생물총은 인간/동물의 몸에 살고 있는 미생물의 집합체로, 가장 크고 다양한 미생물 군락이 장에 서식하고 있다. 장내 미생물총은 숙주와 함께 진화하여 미생물에게 안정적인 환경을 제공하는 한편, 미생물은 복잡한 식이 거대 영양소의 소화, 영양소 및 비타민의 생산, 병원균에 대한 방어, 및 면역 체계의 유지 같은 광범위한 기능을 숙주에게 제공한다. 새로운 데이터는 비정상적인 장내 미생물총 구성이 면역 약화, 알레르기, 대사 장애(예: 제 2 형 진성 당뇨병) 및 염증성 장 질환(IBD)을 비롯한 여러 질병과 관련이 있음을 입증하였다. 미생물총이 인간의 건강과 질병에 영향을 미치는 메커니즘중 하나는 질병 발생과 관련된 유해한 대사 산물이나 질병으로부터 보호하는 유익한 대사 산물을 생산하는 능력이다. 식이 섬유뿐만 아니라 상부 장의 숙주 효소에 의해 소화되지 않은 단백질과 펩티드는 맹장과 결장의 미생물에 의해 대사된다. 장내 미생물 발효 활동의 주요 산물은 SCFA, 특히 아세테이트, 프로피오네이트 및 부티레이트이다. 더 많은 증거들이 인간 또는 동물의 장에서 SCFA가 글루코오스 대사, 면역 체계, 위장관의 완전성 및 장벽, 위장 운동을 포함한 일반적인 장 건강과 같은 숙주 대사 성능에 유익한 영향을 끼침을 시사한다.
WO 2007/058523 A1 호는 장 장벽 완전성을 개선하고, 장벽 기능을 개선하고, 장 성숙을 자극하고/하거나 장 장벽 투과성을 감소시키기 위해 약학 조성의 영양제 를 제조하기 위한 n-3 도코사펜타에노산의 용도를 기재한다.
WO 2016/053085 A1 호는 변비, 통과 시간(transit time) 기능 장애 또는 결장 길이 장애의 예방 또는 치료에 사용하기 위한, 우리딘 공급원 및 부티레이트 생성 섬유를 포함하는 조성물을 기재하고 있다.
US 2010/247489 A1 호는 결장에서 가스 형성을 감소시키기 위한, 텅스텐과 같은 특정 미네랄을 포함하는 지연 방출 조성물의 용도를 개시한다. 조성물은 비타민 또는 아세테이트 생성 또는 부티레이트 생성 세균 균주를 추가로 포함할 수 있다.
탄(Tan) 등의 문헌[(2016) Cell Reports, Vol. 15, No. 12, 2809-2824]에서는 마우스를 사용하여 땅콩 알레르기에서의 식이 섬유의 유익한 역할을 조사한다. 탄 등은 이 효과가 장내 미생물총의 재형성, 단쇄 지방산의 증가된 수준 및 수용체 GPR43 및 GPR109a의 활성을 포함한다고 보고한다.
WO 2010/117274 A1 호는 C5 및/또는 C6 단쇄 지방산의 생산을 향상시키는 탄수화물을 기재한다.
WO 2017/182347 A1 호는 비타민 B3를 함유하는 코어를 포함하는 마이크로캡슐을 기재하고 있으며, 이는 2개의 쉘락 층 및 2개의 쉘락 층 사이에 제공된 pH-조절 물질을 포함하는 코팅 층 시스템을 특징으로 한다.
US 9,433,583 B2 호는 결장 직장 선종성 폴립 및 결장 직장 암을 예방하기 위한, 비타민 D 및 임의적으로는 추가 비타민을 포함하는 결장-표적화된 단일 투여 형태를 기재한다.
WO 2014/070014 호는 파에칼리박테리움 프라우스니치(Faecalibacterium prausnitzii)의 개체군을 자극하기 위한 리보플라빈(비타민 B2)의 용도를 기재한다.
본원의 발명자들은 장내 미생물총이 특정 미량 영양소의 존재하에 증가된 양의 SCFA를 생성한다는 것을 발견하였다. 또한, 부티레이트 합성 경로의 증가도 관찰되었다. 추가 연구에서는, 미량 영양소가 장내 미생물 다양성과 미생물 풍부도를 증가시키고 장의 장벽 기능을 개선하며 가스 생성을 감소시킬 수 있음이 확인되었다. 따라서, 본 발명은 다음 항목 [1] 내지 [67]에 관한 것이다:
[1] 제 1 항에 정의된 사용을 위한 활성제; 또는
동물의 장 건강 개선에 사용하기 위한, 리보플라빈, 비타민 A, 비타민 C, 비타민 D, 비타민 E, 비타민 K, 엽산, β-카로틴, 비타민 B1, 니아신, 비타민 B5, 비타민 B6, 비오틴, 비타민 B12, 오메가-3 지방산 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 활성제로서, 이 때 상기 개선이 다음을 포함하거나 이것으로 이루어지고, 상기 사용이 유효 투여량의 활성제를 포함하는 지연 방출 제형을 동물에게 투여하는 것을 포함하며, 상기 활성제의 방출이 장, 바람직하게는 대장까지 지연되는 활성제:
(i) 장에서 하나 이상의 단쇄 지방산 또는 이의 염의 농도 증가,
(ii) 장내 미생물총 다양성 증가,
(iii) 장내 미생물 풍부도 증가,
(iv) 장내 부티레이트 합성 경로의 촉진 또는 증가,
(v) 장의 장벽 기능 개선,
(vi) 장의 산화환원 전위 감소,
(vii) 장내 가스 생산량 감소, 및/또는
(viii) 장 면역 반응 자극.
[2] 상기 개선이 장에서 하나 이상의 단쇄 지방산 또는 이의 염의 농도를 증가시키는 것을 포함하거나 증가시키는 것으로 이루어지고, 상기 하나 이상의 단쇄 지방산이 부티르산, 아세트산, 프로피온산 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 항목 [1]에 따른 사용을 위한 활성제.
[3] 상기 하나 이상의 단쇄 지방산이 부티르산인, 항목 [2]에 따른 사용을 위한 활성제.
[4] 상기 하나 이상의 단쇄 지방산이 아세트산인, 항목 [2]에 따른 사용을 위한 활성제.
[5] 상기 하나 이상의 단쇄 지방산이 프로피온산인, 항목 [2]에 따른 사용을 위한 활성제.
[6] 상기 사용이 하부 장에서 하나 이상의 SCFA의 낮은 농도와 관련된 장애를 치료 또는 예방하는 것을 포함하거나 그것으로 이루어진, 항목 [1] 내지 [5] 중 어느 하나에 따른 사용을 위한 활성제.
[7] 상기 하부 장에서 하나 이상의 SCFA의 낮은 농도와 관련된 상기 장애가 염증성 장애인, 항목 [6]에 따른 사용을 위한 활성제.
[8] 상기 염증성 장애가 만성 염증을 특징으로 하는, 항목 [7]에 따른 사용을 위한 활성제.
[9] 상기 하부 장에서 하나 이상의 SCFA의 낮은 농도와 관련된 상기 장애가 죽종 형성인, 항목 [6]에 따른 사용을 위한 활성제.
[10] 상기 하부 장에서 하나 이상의 SCFA의 낮은 농도와 관련된 상기 장애가 대사 장애인, 항목 [6]에 따른 사용을 위한 활성제.
[11] 상기 대사 장애가 제 2 형 당뇨병 및/또는 비만인, 항목 [10]에 따른 사용을 위한 활성제.
[12] 상기 개선이 장내 미생물총 다양성을 증가시키는 것을 포함하거나 그것으로 이루어진, 항목 [1]에 따른 사용을 위한 활성제.
[13] 상기 사용이 장에서 불충분한 미생물총 다양성과 관련된 장애를 치료 또는 예방하는 것을 포함하거나 그것으로 이루어진, 항목 [12]에 따른 사용을 위한 활성제.
[14] 상기 개선이 인간 장내 비피도박테리움, 아케르만시아 및 파에칼리박테 리움으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 미생물의 풍부도를 증가시키는 것을 포함하거나 그것으로 이루어진, 항목 [1]에 따른 사용을 위한 활성제.
[15] 상기 용도가 IBD, 비만 및 제 2 형 당뇨병을 포함한 대사 장애, 그리고 기타 염증성 질환과 같은 인간 장에서의 불충분한 비피도박테리움, 아케르만시아 또는 파에칼리박테리움 풍부도와 관련된 장애를 치료 또는 예방하는 것을 포함하거나 그것으로 이루어진, 항목 [14]에 따른 사용을 위한 활성제.
[16] 상기 개선이 박테로이데스(Bacteroides), 알리스티페스(Alistipes) 및 파에칼리박테리움으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 미생물의 풍부도를 증가시키는 것을 포함하거나 이것으로 이루어진, 항복 [1]에 따른 사용을 위한 활성제.
[17] 상기 개선이 장내 부티레이트 합성 경로를 촉진 또는 증가시키는 것을 포함하거나 그것으로 이루어진, 항목 [1]에 따른 사용을 위한 활성제.
[18] 상기 사용이 장에서의 불충분한 부티레이트 합성과 관련된 장애를 치료 또는 예방하는 것을 포함하거나 그것으로 이루어진, 항목 [17]에 따른 사용을 위한 활성제.
[19] 동물, 바람직하게는 포유동물의 장의 손상된 장벽 기능과 관련된 질환의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 리보플라빈, 비타민 A, 비타민 C, 비타민 D, 비타민 E, 비타민 K, 엽산, β-카로틴, 비타민 B1, 니아신, 비타민 B5, 비타민 B6, 비오틴, 비타민 B12, 오메가-3 지방산 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 활성제로서, 이 때 상기 사용이 유효 투여량의 활성제를 포함하는 지연 방출 제형을 동물에게 투여하는 것을 포함하며, 상기 활성제의 방출이 대장까지 지연되는 활성제.
[20] 상기 동물 장의 손상된 장벽 기능과 관련된 질환이 장 누수를 특징으로 하는, 항목 [19]에 따른 사용을 위한 활성제.
[21] 상기 장의 손상된 장벽 기능과 관련된 질환이 영양 실조에 의해 발생하는, 항목 [19] 또는 [20]에 따른 사용을 위한 활성제.
[22] 상기 동물 장의 손상된 장벽 기능과 관련된 질환이 염증성 장 질환인, 항목 [19] 또는 [20]에 따른 사용을 위한 활성제.
[23] 상기 염증성 장 질환이 크론병인, 항목 [22]에 따른 사용을 위한 활성제.
[24] 상기 염증성 장 질환이 궤양성 대장염인, 항목 [22]에 따른 사용을 위한 활성제.
[25] 상기 동물이 단위(monogastric) 동물인, 항목 [19]에 따른 사용을 위한 활성제.
[26] 상기 동물이 가금류 또는 돼지인, 항목 [19]에 따른 사용을 위한 활성제.
[27] 상기 지연 방출 제형이 연장 방출 제형인, 항목 [1] 내지 [26] 중 어느 하나에 따른 사용을 위한 활성제.
[28] 상기 활성제의 방출이 대장까지 지연되는, 항목 [1] 내지 [26] 중 어느 하나에 따른 사용을 위한 활성제.
[29] 상기 활성제의 방출이 결장까지 지연되는, 항목 [1] 내지 [26] 중 어느 하나에 따른 사용을 위한 활성제.
[30] 상기 활성제가 리보플라빈으로 이루어지는, 항목 [1] 내지 [29] 중 어느 하나에 따른 사용을 위한 활성제.
[31] 상기 활성제가 비타민 A로 이루어지는, 항목 [1] 내지 [29] 중 어느 하나에 따른 사용을 위한 활성제.
[32] 상기 활성제가 비타민 C로 이루어지는, 항목 [1] 내지 [29] 중 어느 하나에 따른 사용을 위한 활성제.
[33] 상기 활성제가 비타민 D로 이루어지는, 항목 [1] 내지 [29] 중 어느 하나에 따른 사용을 위한 활성제.
[34] 상기 활성제가 비타민 E로 이루어지는, 항목 [1] 내지 [29] 중 어느 하나에 따른 사용을 위한 활성제.
[35] 상기 활성제가 비타민 K로 이루어지는, 항목 [1] 내지 [29] 중 어느 하나에 따른 사용을 위한 활성제.
[36] 상기 활성제가 엽산으로 이루어지는, 항목 [1] 내지 [29] 중 어느 하나에 따른 사용을 위한 활성제.
[37] 상기 활성제가 β-카로틴으로 이루어지는, 항목 [1] 내지 [29] 중 어느 하나에 따른 사용을 위한 활성제.
[38] 상기 활성제가 비타민 B1으로 이루어지는, 항목 [1] 내지 [29] 중 어느 하나에 따른 사용을 위한 활성제.
[39] 상기 활성제가 니아신으로 이루어지는, 항목 [1] 내지 [29] 중 어느 하나에 따른 사용을 위한 활성제.
[40] 상기 활성제가 비타민 B5로 이루어지는, 항목 [1] 내지 [29] 중 어느 하나에 따른 사용을 위한 활성제.
[41] 상기 활성제가 비타민 B6로 이루어지는, 항목 [1] 내지 [29] 중 어느 하나에 따른 사용을 위한 활성제.
[42] 상기 활성제가 비오틴으로 이루어지는, 항목 [1] 내지 [29] 중 어느 하나에 따른 사용을 위한 활성제.
[43] 상기 활성제가 비타민 B12로 이루어지는, 항목 [1] 내지 [29] 중 어느 하나에 따른 사용을 위한 활성제.
[44] 상기 활성제가 적어도 하나의 오메가-3 지방산으로 이루어지는, 항목 [1] 내지 [29] 중 어느 하나에 따른 사용을 위한 활성제.
[45] 상기 활성제가 도코사헥사에노산(DHA), 아이코사펜타에노산(EPA) 또는 이들의 조합으로 이루어지는, 항목 [44]에 따른 사용을 위한 활성제.
[46] 상기 활성제가 DHA로 이루어지는, 항목 [44]에 따른 사용을 위한 활성제.
[47] 상기 활성제가 EPA로 이루어지는, 항목 [44]에 따른 사용을 위한 활성제.
[48] 상기 활성제가 DHA와 EPA의 조합으로 이루어지는, 항목 [44]에 따른 사용을 위한 활성제.
[49] 상기 활성제가 리보플라빈, 비타민 A, 비타민 C, 비타민 D, 비타민 E, 비타민 K, 엽산, β-카로틴, 비타민 B1, 니아신, 비타민 B5, 비타민 B6, 비오틴, 비타민 B12, DHA 및 EPA의 조합으로 이루어지는, 항목 [1] 내지 [29] 중 어느 하나에 따른 사용을 위한 활성제.
[50] 상기 활성제가 체중 1kg당 리보플라빈 최대 2.9mg, 체중 1kg당 비타민 A 최대 42.9μg, 체중 1kg당 비타민 D 최대 3.6μg, 체중 1kg당 비타민 C 최대 28.6mg, 체중 1kg당 비타민 E 최대 14.3mg, 체중 1kg당 비타민 K 최대 143μg, 체중 1kg당 엽산 최대 14.3μg, 체중 1kg당 β-카로틴 최대 0.4mg, 체중 1kg당 비타민 B1 최대 1.4mg, 체중 1kg당 니아신 최대 21.4mg, 체중 1kg당 비타민 B5 최대 14.3mg, 체중 1kg당 비타민 B6 최대 1.4mg, 체중 1kg당 비오틴 최대 35.7μg, 체중 1kg당 비타민 B12 최대 43μg, 체중 1kg당 오메가-3 지방산(들) 71.4mg 또는 이들의 조합의 1일 투여량으로 동물, 바람직하게는 포유동물에게 투여되고, 바람직하게는 EPA가 체중 1kg당 최대 25.7mg이고, DHA가 체중 1kg당 최대 14.3mg인, 항목 [1] 내지 [49] 중 어느 하나에 따른 사용을 위한 활성제.
[51] 활성제와 장용성 층 또는 장용성 껍질(shell)을 포함하는, 활성제를 장에 전달하기 위한 지연 방출 제형으로서, 이 때 상기 활성제가 최대 200mg의 리보플라빈, 최대 3000μg의 비타민 A, 최대 2000mg의 비타민 C, 최대 250μg의 비타민 D, 최대 1000mg의 비타민 E, 최대 10mg의 비타민 K, 최대 1mg의 엽산, 최대 25mg의 β-카로틴, 최대 100mg의 비타민 B1, 최대 1500mg의 니아신, 최대 1000mg의 비타민 B5, 최대 100mg의 비타민 B6, 최대 2500μg의 비오틴, 최대 3000μg의 비타민 B12, 최대 5000mg의 오메가-3 지방산(들) 또는 이들의 조합으로 이루어지고, 바람직하게는 EPA가 최대 1800mg이고 DHA가 최대 1000mg이며, 활성제의 방출이 장까지 지연되는 지연 방출 제형.
[52] 활성제와 장용성 층 또는 장용성 껍질을 포함하는, 활성제를 장에 전달하기 위한 지연 방출 제형으로서, 이 때 상기 활성제가 1 내지 85mg 리보플라빈, 0.2 내지 0.4mg 비타민 A, 400 내지 600mg 비타민 C, 5 내지 80μg 비타민 D, 80 내지 120mg 비타민 E, 80 내지 140μg 비타민 K, 0.3 내지 0.5mg 엽산, 80 내지 120mg 오메가-3 지방산(들) 또는 이들의 조합으로 이루어지고, 상기 활성제의 방출이 장까지 지연되는 지연 방출 제형.
[53] 상기 활성제가 70 내지 80mg 리보플라빈, 0.25 내지 0.35mg 비타민 A, 450 내지 550mg 비타민 C, 15 내지 25μg 비타민 D, 90 내지 110mg 비타민 E, 100 내지 120μg 비타민 K, 0.35 내지 0.45mg 엽산, 90 내지 110mg 오메가-3 지방산(들) 또는 이들의 조합으로 이루어진, 항목 [51] 또는 [52]의 지연 방출 제형.
[54] 상기 활성제의 방출이 결장까지 지연되는, 항목 [51] 내지 [53] 중 어느 하나에 따른 조성물.
[55] 장의 장애 또는 병리학적 질환을 앓지 않는 동물, 바람직하게는 포유동물, 단위 동물 또는 가금류의 장의 상태 또는 건강을 개선하기 위한, 리보플라빈, 비타민 A, 비타민 C, 비타민 D, 비타민 E, 비타민 K, 엽산, β-카로틴, 비타민 B1, 니아신, 비타민 B5, 비타민 B6, 비오틴, 비타민 B12, 오메가-3 지방산 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 활성제의 비-치료적 용도.
[56] 상기 포유동물이 건강한 인간인, 항목 [55]의 비-치료적 용도.
[57] 상기 포유동물이 건강한 성인 인간인, 항목 [55]의 비-치료적 용도.
[58] 상기 개선이 장에서 하나 이상의 단쇄 지방산 또는 이의 염의 농도를 증가시키는 것을 포함하거나 그것으로 이루어진, 항목 [55] 내지 [57] 중 어느 하나의 비-치료적 용도.
[59] 상기 개선이 장내 미생물총 다양성을 증가시킴을 포함하거나 그것으로 이루어진, 항목 [55] 내지 [57] 중 어느 하나의 비-치료적 용도.
[60] 상기 개선이 장내 비피도박테리움, 아케르만시아 및/또는 파에칼리박테리움 풍부도를 증가시키는 것을 포함하거나 그것으로 이루어진, 항목 [55] 내지 [57] 중 어느 하나의 비-치료적 용도.
[61] 상기 개선이 장내 부티레이트 합성 경로를 촉진 또는 증가시키는 것을 포함하거나 그것으로 이루어진, 항목 [55] 내지 [57] 중 어느 하나의 비-치료적 용도.
[62] 상기 개선이 장의 장벽 기능 개선을 포함하거나 그것으로 이루어지고, 상기 활성제가 오메가-3 지방산을 포함하지 않는, 항목 [55] 내지 [57] 중 어느 하나의 비-치료적 용도.
[63] 상기 활성제가 비타민 D3를 포함하지 않는, 항목 [55] 내지 [62] 중 어느 하나의 비-치료적 용도.
[64] 상기 활성제가 오메가-3 지방산을 포함하지 않는, 항목 [55] 내지 [63] 중 어느 하나의 비-치료적 용도.
[65] 건강한 포유동물의 장 기능 유지 또는 개선을 위한, 리보플라빈, 비타민 A, 비타민 D, 비타민 C, 비타민 E, 비타민 K, 엽산, β-카로틴, 비타민 B1, 니아신, 비타민 B5, 비타민 B6, 비오틴, 비타민 B12, 오메가-3 지방산 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 활성제의 비-치료적 용도.
[66] 유효 투여량의 활성제를 포함하는 지연 방출 제형(이 때, 활성제의 방출은 장까지 지연됨) 또는 활성제 과생리적 투여량을 포함하는 사료(이 때, 활성제는 장에서 유효량으로 존재함)를 동물에게 투여함을 포함하는, 동물에서 장 건강을 개선하는 방법으로서, 이 때 상기 개선이 다음을 포함하거나 다음으로 이루어지고, 상기 활성제가 리보플라빈, 비타민 A, 비타민 C, 비타민 D, 비타민 E, 비타민 K, 엽산, β-카로틴, 비타민 B1, 니아신, 비타민 B5, 비타민 B6, 비오틴, 비타민 B12, 오메가-3 지방산 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법:
(i) 장에서 하나 이상의 단쇄 지방산 또는 이의 염의 농도 증가,
(ii) 장내 미생물총 다양성 증가,
(iii) 장내 미생물 풍부도 증가,
(iv) 장내 부티레이트 합성 경로의 촉진 또는 증가,
(v) 장의 장벽 기능 개선,
(vi) 장의 산화환원 전위 감소, 및/또는
(vii) 장내 가스 생산량 감소.
[67] 리보플라빈, 비타민 A, 비타민 C, 비타민 D, 비타민 E, 비타민 K, 엽산, β-카로틴, 비타민 B1, 니아신, 비타민 B5, 비타민 B6, 비오틴, 비타민 B12, 오메가-3 지방산 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 활성제를 과생리적 투여량으로 포함하는 가금류 또는 비-인간 사료로서, 이 때 충분한 양의 활성제가 장에 존재하는 사료.
본 발명은 또한 하기 실시양태에 관한 것이다:
(1) 포유동물의 장에서 하나 이상의 단쇄 지방산(SCFA) 또는 이의 염의 농도를 증가시키는데 사용하기 위한, 리보플라빈, 비타민 A, 비타민 C, 비타민 D, 비타민 E, 비타민 K, 엽산, β-카로틴, 비타민 B1, 니아신, 비타민 B5, 비타민 B6, 비오틴, 비타민 B12, 오메가-3 지방산 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 활성제로서, 이 때 상기 사용이 유효 투여량의 활성제를 포함하는 지연 방출 제형을 포유동물에게 투여함을 포함하고, 상기 활성제의 방출이 장까지 지연되는 활성제.
(2) 상기 하나 이상의 단쇄 지방산이 부티르산, 아세트산, 프로피온산 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 실시양태 (1)에 따라 사용하기 위한 활성제.
(3) 상기 하나 이상의 단쇄 지방산이 부티르산인, 실시양태 (2)에 따라 사용하기 위한 활성제.
(4) 상기 적어도 하나의 단쇄 지방산이 아세트산인, 실시양태 (2)에 따라 사용하기 위한 활성제.
(5) 상기 하나 이상의 단쇄 지방산이 프로피온산인, 실시양태 (2)에 따라 사용하기 위한 활성제.
(6) 상기 사용이 하부 장에서 하나 이상의 SCFA의 낮은 농도와 관련된 장애를 치료 또는 예방하는 것을 포함하거나 그것으로 이루어진, 실시양태 (1) 내지 (5) 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 활성제.
(7) 상기 하부 장에서 하나 이상의 SCFA의 낮은 농도와 관련된 장애가 염증성 장애인, 실시양태 (6)에 따라 사용하기 위한 활성제.
(8) 상기 염증성 장애가 만성 염증을 특징으로 하는, 실시양태 (7)에 따라 사용하기 위한 활성제.
(9) 상기 하부 장에서 하나 이상의 SCFA의 낮은 농도와 관련된 장애가 죽종 형성인, 실시양태 (6)에 따라 사용하기 위한 활성제.
(10) 상기 하부 장에서 하나 이상의 SCFA의 낮은 농도와 관련된 장애가 대사 장애인, 실시양태 (6)에 따라 사용하기 위한 활성제.
(11) 포유동물 장의 손상된 장벽 기능과 관련된 질환의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 리보플라빈, 비타민 A, 비타민 C, 비타민 D, 비타민 E, 비타민 K, 엽산, 오메가-3 지방산 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 활성제로서, 이 때 상기 사용이 유효 투여량의 활성제를 포함하는 지연 방출 제형을 포유동물에게 투여하는 것을 포함하며, 상기 활성제의 방출이 장까지 지연되는 활성제.
(12) 상기 포유동물 장의 손상된 장벽 기능과 관련된 질환이 장 누수를 특징으로 하는, 실시양태 (12)에 따라 사용하기 위한 활성제.
(13) 상기 장의 손상된 장벽 기능과 관련된 질환이 영양 실조에 의해 야기되는, 실시양태 (12) 또는 (13)에 따라 사용하기 위한 활성제.
(14) 상기 포유동물 장의 손상된 장벽 기능과 관련된 질환이 염증성 장 질환인, 실시양태 (12) 또는 (13)에 따라 사용하기 위한 활성제.
(15) 상기 염증성 장 질환이 크론병인, 실시양태 (15)에 따라 사용하기 위한 활성제.
(16) 상기 염증성 장 질환이 궤양성 대장염인, 실시양태 (15)에 따라 사용하기 위한 활성제.
(17) 상기 지연 방출 제형이 연장 방출 제형인, 실시양태 (1) 내지 (16) 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 활성제.
(18) 상기 활성제의 방출이 대장까지 지연되는, 실시양태 (1) 내지 (17) 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 활성제.
(19) 상기 활성제의 방출이 결장까지 지연되는, 실시양태 (1) 내지 (17) 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 활성제.
(20) 상기 활성제가 리보플라빈으로 이루어진, 실시양태 (1) 내지 (19) 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 활성제.
(21) 상기 활성제가 비타민 A로 이루어진, 실시양태 (1) 내지 (20) 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 활성제.
(22) 상기 활성제가 비타민 C로 이루어진, 실시양태 (1) 내지 (21) 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 활성제.
(23) 상기 활성제가 비타민 D로 이루어진, 실시양태 (1) 내지 (22) 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 활성제.
(24) 상기 활성제가 비타민 E로 이루어진, 실시양태 (1) 내지 (23) 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 활성제.
(25) 상기 활성제가 비타민 K로 이루어진, 실시양태 (1) 내지 (24) 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 활성제.
(26) 상기 활성제가 엽산으로 이루어진, 실시양태 (1) 내지 (25) 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 활성제.
(27) 상기 활성제가 하나 이상의 오메가-3 지방산으로 이루어진, 실시양태 (1) 내지 (26) 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 활성제.
(28) 상기 활성제가 도코사헥사에노산(DHA), 아이코사펜타에노산(EPA), 또는 이들의 조합으로 이루어진, 실시양태 (1) 내지 (27) 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 활성제.
(29) 상기 활성제가 DHA로 이루어진, 실시양태 (1) 내지 (28) 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 활성제.
(30) 상기 활성제가 EPA로 이루어진, 실시양태 (1) 내지 (29) 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 활성제.
(31) 상기 활성제가 DHA 및 EPA의 조합으로 이루어진, 실시양태 (1) 내지 (30) 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 활성제.
(32) 상기 활성제가 리보플라빈, 비타민 A, 비타민 C, 비타민 D, 비타민 E, 비타민 K, 엽산, β-카로틴, 비타민 B1, 니아신, 비타민 B5, 비타민 B6, 비오틴, 비타민 B12, DHA 및 EPA의 조합으로 이루어진, 실시양태 (1) 내지 (31) 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 활성제.
(33) 상기 활성제가 체중 1kg당 리보플라빈 0.01 내지 1.2mg, 체중 1kg당 비타민 A 2.9 내지 5.7㎍, 체중 1kg당 비타민 D 0.1 내지 1.1μg, 체중 1kg당 비타민 E 0.2 내지 1.7mg, 체중 1kg당 비타민 K 1.1 내지 2.0μg, 체중 1kg당 엽산 4.3 내지 7.1μg, 체중 1kg당 오메가-3-지방산(들) 1.1 내지 1.7mg 또는 이들의 조합의 1일 투여량으로 포유동물에게 투여되는, 실시양태 (1) 내지 (32) 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 활성제.
(34) 상기 활성제가 체중 1kg당 리보플라빈 1.0 내지 1.1mg, 체중 1kg당 비타민 A 3.6 내지 5.0㎍, 체중 1kg당 비타민 D 0.2 내지 0.4μg, 체중 1kg당 비타민 E 1.3 내지 1.6mg, 체중 1kg당 비타민 K 1.4 내지 1.7μg, 체중 1kg당 엽산 5.0 내지 6.4μg, 체중 1kg당 오메가-3 지방산(들) 1.3 내지 1.6mg, 또는 이들의 조합의 1일 투여량으로 포유동물에게 투여되는, 실시양태 (1) 내지 (33) 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 활성제.
(35) 활성제 및 장용성 코팅을 포함하는, 활성제를 장에 전달하기 위한 지연 방출 제형으로서, 이 때 상기 활성제가 1 내지 85mg 리보플라빈, 0.2 내지 0.4mg 비타민 A, 400 내지 600mg 비타민 C, 5 내지 80μg 비타민 D, 80 내지 120mg 비타민 E, 80 내지 140μg 비타민 K, 0.3 내지 0.5mg 엽산, 80 내지 120mg 오메가-3 지방산(들) 또는 이들의 조합으로 이루어지고, 상기 활성제의 방출이 장까지 지연되는 지연 방출 제형.
(36) 상기 활성제가 70 내지 80mg 리보플라빈, 0.25 내지 0.35mg 비타민 A, 450 내지 550mg 비타민 C, 15 내지 25μg 비타민 D, 90 내지 110mg 비타민 E, 100 내지 120μg 비타민 K, 0.35 내지 0.45mg 엽산, 90 내지 110mg 오메가-3 지방산(들) 또는 이들의 조합으로 이루어진, 실시양태 (35)의 지연 방출 제형.
(37) 상기 지연 방출 제형이 연장 방출 제형인, 실시양태 (35) 또는 (36)의 지연 방출 제형.
(38) 상기 활성제의 방출이 대장, 바람직하게는 결장까지 지연되는, 실시양태 (36) 또는 (37)의 지연 방출 제형.
(39) 상기 활성제의 방출이 결장까지 지연되는, 실시양태 (36) 또는 (37)의 지연 방출 제형.
(40) 리보플라빈을 유일한 활성제로서 포함하는, 실시양태 (36) 내지 (40) 중 어느 하나의 지연 방출 제형.
(41) 비타민 A를 유일한 활성제로서 포함하는, 실시양태 (36) 내지 (40) 중 어느 하나의 지연 방출 제형.
(42) 비타민 C를 유일한 활성제로서 포함하는, 실시양태 (36) 내지 (40) 중 어느 하나의 지연 방출 제형.
(43) 비타민 D를 유일한 활성제로서 포함하는, 실시양태 (36) 내지 (40) 중 어느 하나의 지연 방출 제형.
(44) 비타민 E를 유일한 활성제로서 포함하는, 실시양태 (36) 내지 (40) 중 어느 하나의 지연 방출 제형.
(45) 비타민 K를 유일한 활성제로서 포함하는, 실시양태 (36) 내지 (40) 중 어느 하나의 지연 방출 제형.
(46) 엽산을 유일한 활성제로서 포함하는, 실시양태 (36) 내지 (40) 중 어느 하나의 지연 방출 제형.
(47) β-카로틴을 유일한 활성제로서 포함하는, 실시양태 (36) 내지 (40) 중 어느 하나의 지연 방출 제형.
(48) 비타민 B1을 유일한 활성제로서 포함하는, 실시양태 (36) 내지 (40) 중 어느 하나의 지연 방출 제형.
(49) 니아신을 유일한 활성제로서 포함하는, 실시양태 (36) 내지 (40) 중 어느 하나의 지연 방출 제형.
(50) 비타민 B5를 유일한 활성제로서 포함하는, 실시양태 (36) 내지 (40) 중 어느 하나의 지연 방출 제형.
(51) 비타민 B6을 유일한 활성제로서 포함하는, 실시양태 (36) 내지 (40) 중 어느 하나의 지연 방출 제형.
(52) 비오틴을 유일한 활성제로서 포함하는, 실시양태 (36) 내지 (40) 중 어느 하나의 지연 방출 제형.
(53) 비타민 B12를 유일한 활성제로서 포함하는, 실시양태 (36) 내지 (40) 중 어느 하나의 지연 방출 제형.
(54) 하나 이상의 오메가-3 지방산(들)을 유일한 활성제로서 포함하는, 실시양태 (36) 내지 (40) 중 어느 하나의 지연 방출 제형.
(55) 임의의 장 장애 또는 병리학적 질환을 앓지 않는 포유동물의 장에서 하나 이상의 단쇄 지방산 또는 이의 염의 농도를 증가시키기 위한, 리보플라빈, 비타민 A, 비타민 D, 비타민 C, 비타민 E, 비타민 K, 엽산, β-카로틴, 비타민 B1, 니아신, 비타민 B5, 비타민 B6, 비오틴, 비타민 B12, 오메가-3 지방산 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 활성제의 비-치료적 용도.
(56) 상기 포유동물이 건강한 인간인, 실시양태 (49)의 비-치료적 용도.
(57) 건강한 포유동물의 장 기능 유지 또는 개선을 위한, 리보플라빈, 비타민 A, 비타민 C, 비타민 D, 비타민 E, 비타민 K, 엽산, β-카로틴, 비타민 B1, 니아신, 비타민 B5, 비타민 B6, 비오틴, 비타민 B12, 오메가-3 지방산 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 활성제의 비-치료적 용도.
(58) 상기 포유동물이 인간인, 실시양태 (57)의 비-치료적 용도.
도 1: 상이한 시험 제품을 수용액으로서(위) 또는 에탄올에 용해시켜(아래) 투여했을 때 48시간 발효 후 아세테이트 생산. 각 유형의 모용액에 대한 음성 대조군도 포함되었다. RTG=리보플라빈 테이블 등급, R5P=리보플라빈-5-포스페이트, AA=아스코르브산, RTG+AA=리보플라빈 테이블 등급+아스코르브산, FA=엽산, VK1=비타민 K1, 0080 EE=DHA, 4535 EE=DHA+EPA, 8000 EE=EPA. 각 화합물은 3가지 투여량(0.2×, 1× 및 5×)으로 시험되었다(표 1).
도 2: 상이한 시험 제품을 수용액으로서(위) 또는 에탄올에 용해시켜(아래) 투여했을 때 48시간 발효 후 프로피오네이트 생산. 각 유형의 모용액에 대한 음성 대조군도 포함되었다. RTG=리보플라빈 테이블 등급, R5P=리보플라빈-5-포스페이트, AA=아스코르브산, RTG+AA=리보플라빈 테이블 등급+아스코르브산, FA=엽산, VK1=비타민 K1, 0080 EE=DHA, 4535 EE=DHA+EPA, 8000 EE=EPA. 각 화합물은 3가지 투여량(0.2×, 1× 및 5×)으로 시험되었다(표 1).
도 3: 상이한 시험 제품을 수용액으로서(위) 또는 에탄올에 용해시켜(아래) 투여했을 때 48시간 발효 후 부티레이트 생산. 각 유형의 모용액에 대한 음성 대조군도 포함되었다. RTG=리보플라빈 테이블 등급, R5P=리보플라빈-5-포스페이트, AA=아스코르브산, RTG+AA=리보플라빈 테이블 등급+아스코르브산, FA=엽산, VK1=비타민 K1, 0080 EE=DHA, 4535 EE=DHA+EPA, 8000 EE=EPA. 각 화합물은 3가지 투여량(0.2×, 1× 및 5×)으로 시험되었다(표 1).
도 4: 상이한 시험 제품을 수용액으로서(위) 또는 에탄올에 용해시켜(아래) 투여했을 때 48시간 발효 후 총 SCFA 생산. 각 유형의 모용액에 대한 음성 대조군도 포함되었다. RTG=리보플라빈 테이블 등급, R5P=리보플라빈-5-포스페이트, AA=아스코르브산, RTG+AA=리보플라빈 테이블 등급+아스코르브산, FA=엽산, VK1=비타민 K1, 0080 EE=DHA, 4535 EE=DHA+EPA, 8000 EE=EPA. 각 화합물은 3가지 투여량(0.2×, 1× 및 5×)으로 시험되었다(표 1).
도 5: 트랜스웰 플레이트(transwell plate)에서 동시 배양된 Caco-2 및 배상세포의 개략도. 경상피 전기 저항(TEER)의 측정은 분극된 세포 사이에 형성된 단단한 결합의 완전성에 대한 정보를 제공한다. '장 누수'는 장 투과성이 증가하는 특징이 있으며, 세포에 스트레스를 가하여 시험관 내에서 얻을 수 있다. 정단부 또는 기저측부 스트레스 인자의 추가는 대조군 세포에 비해 TEER의 상당한 시간-의존적 감소 및 루시퍼 옐로우(Lucifer yellow) 세포간 플럭스 속도의 증가로 이어진다.
도 6: 건강한 장 세포 모델에서 장 완전성에 대한 비타민과 오메가-3-지방산의 영향. 값은 48시간 발효 샘플로 처리된 세포의 경상피 전기 저항(TEER)과 0시간 발효 샘플로 처리된 세포의 TEER 간의 차이로 표시된다. 각 화합물은 3가지 투여량(0.2×, 1× 및 5×)으로 시험되었다(표 1).
도 7: 장 누수 세포 모델의 기저측부 유도에서 장 완전성에 대한 비타민과 오메가-3-지방산의 영향. 값은 48시간 발효 샘플로 처리된 세포의 경상피 전기 저항(TEER)/루시퍼 옐로우와 0시간 발효 샘플로 처리된 세포의 TEER/루시퍼 옐로우 간의 차이로 표시된다. 각 화합물은 3가지 투여량(0.2×, 1× 및 5×)으로 시험되었다(표 1).
도 8: 장 누수 세포 모델의 정단부 유도에서 장 완전성에 대한 비타민과 오메가-3-지방산의 영향. 값은 48시간 발효 샘플로 처리된 세포의 경상피 전기 저항(TEER)/루시퍼 옐로우와 0시간 발효 샘플로 처리된 세포의 TEER/루시퍼 옐로우 간의 차이로 표시된다. 각 화합물은 3가지 투여량(0.2×, 1× 및 5×)으로 시험되었다(표 1).
도 9: 상이한 시험 제품을 수용액으로서(위) 또는 에탄올에 용해시켜(아래) 투여했을 때 24시간 발효 후의 섀넌(Shannon) 다양성 지수. 각 유형의 모용액에 대한 음성 대조군도 포함되었다. 각 화합물은 3가지 투여량(0.2×, 1× 및 5×)으로 시험되었다(표 1).
도 10: 상이한 시험 제품을 수용액으로서(위) 또는 에탄올에 용해시켜(아래) 투여했을 때 24시간 발효 후 비피도박테리움의 상대적 풍부도(%). 각 유형의 모용액에 대한 음성 대조군도 포함되었다. 각 화합물은 3가지 투여량(0.2×, 1× 및 5×)으로 시험되었다(표 1).
도 11: 상이한 시험 제품을 수용액으로서(위) 또는 에탄올에 용해시켜(아래) 투여했을 때 24시간 발효 후 부티레이트 경로로의 아세틸-CoA 발효에 관련된 유전자의 상대적 풍부도(%). 각 유형의 모용액에 대한 음성 대조군도 포함되었다. 각 화합물은 3가지 투여량(0.2×, 1× 및 5×)으로 시험되었다(표 1).
도 12: HT29 세포에 의한 GROa-CXCL1 생산에 대한 비타민과 오메가-3 지방산의 효과. 데이터는 pg/ml로 표시된다.
도 13: HT29 세포에 의한 IL-8 생산에 대한 비타민과 오메가-3 지방산의 효과. 데이터는 pg/ml로 표시된다.
도 14: HT29 세포에 의한 MIP3A-CCL20 생산에 대한 비타민과 오메가-3 지방산의 효과. 데이터는 pg/ml로 표시된다.
도 15: 상이한 시험 제품을 수용액으로서(위) 또는 에탄올에 용해시켜(아래) 투여했을 때 상이한 시간 간격(0 내지 6시간, 6 내지 24시간 및 24 내지 48시간) 동안의 가스 압력(kPa). 각 유형의 모용액에 대한 음성 대조군도 포함되었다. 각 화합물은 3가지 투여량(0.2×, 1× 및 5×)으로 시험되었다(표 1).
도 16: 공여자 C(위) 또는 공여자 D(아래)에 있어서 상이한 시험 제품을 투여한 후 상이한 시간 간격(0 내지 6시간, 6 내지 24시간 및 24 내지 48시간) 동안의 총 SCFA 생산. 음성 대조군(블랭크)도 포함되었다. 각 화합물은 3가지 투여량(0.2×, 1× 및 5×)으로 시험되었다(표 2).
도 17: 공여자 C 및 공여자 D의 배설물 접종물을 사용하여 24시간 배양한 후 대조군 배양액 및 시험 제품을 사용한 배양액에서의 비피도박테리아세아에(Bifidobacteriaceae)의 풍부도(log(세포/ml)).
도 18: 대조군으로서의 물과 보충된 비타민 사이의 브레이-커티스(Bray-Curtis) 거리(베타 다양성). 기준점으로 제공되는, 24시간에서의 두 대조군 사이의 브레이-커티스 거리를 보여주는 점선.
도 19: 대조군으로서의 물 및 보충된 비타민에서의 섀넌 다양성 지수(알파 다양성). 24시간에서의 물 대조군에서의 알파 다양성 값을 보여주는 점선. 이 기준 대조군보다 큰 다양성 지수 값은 다양성의 증가로 보여진다.
도 20A 및 도 20B: 그룹 A(녹색 색조), B(금색 색조) 및 C(분홍색 색조)의 육계(broiler)에서의 맹장 미생물총 프로필의 가중(A) 및 비-가중(B) 유니프랙(Unifrac) 거리에 기반한 주 좌표 분석(PCoA). 샘플은 제공된 색상 범례에 따라 밝음(초기 샘플)에서 어두움(말기 샘플)까지 상이한 색상 색조로 채워진 점으로 표시된다. 제 1 및 제 2 좌표 축이 각 플롯에 보고되고; 각 축에 의해 설명되는 데이터 세트의 변동 백분율이 보고된다.
도 21A 내지 도 21F: T1(A, D), T2(B, E) 및 T3(C, F) 시점에서 취한 육계에서의 맹장 미생물총 프로필의 가중(A 내지 C) 및 비-가중(D 내지 E) 유니프랙 거리를 기반으로 한 주 좌표 분석(PCoA). 샘플은 도 1에서와 같이 다양한 색상으로 채워진 점으로 표시되는데, 그룹 A는 녹색, 그룹 B는 금색, 그룹 C는 분홍색이다. 제 1 및 제 2 좌표 축이 각 플롯에 보고되고, 각 축에 의해 설명되는 데이터 세트의 변동 백분율이 보고된다.
도 22: T1(A, D), T2(B, E) 및 T3(C, F) 시점에서 취한 육계의 맹장 미생물총에서 페이쓰(Faith) PD 지수(A 내지 C) 및 관찰된 OTU의 수(D 내지 F)로서 측정된 알파 다양성. 모든 샘플에서의 다양성 지수의 박스(box) 및 휘스커(whiskers) 분포가 표시된다. 녹색, 금색 및 분홍색 색조는 각각 그룹 A, B 및 C의 닭을 구별하는데 사용된다. *, 통계적으로 유의한 차이(P<0.0001).
도 23: 육계 맹장 생태계의 문(phylum) 수준 미생물총 프로필. 각 가용 시점(T1, T2, T3)에 있어서 그룹 A, B 및 C의 육계 맹장 미생물총의 평균 계통 발생 프로필이 문 수준에서의 파이 차트로 제공되고; 세균 분류군은 그래픽 표현을 위해 사용 가능한 모든 샘플의 최소 1%에서 >0.1%로서 필터링되었다.
도 24: 육계 맹장 생태계의 과(family) 수준 미생물총 프로필. 각 가용 시점(T1, T2, T3)에 있어서 그룹 A, B 및 C의 육계 맹장 미생물총의 평균 계통 발생 프로필이 과 수준에서의 파이 차트로 제공되고; 세균 분류군은 그래픽 표현을 위해 사용 가능한 모든 샘플의 최소 1%에서 >0.5%로서 필터링되었다.
도 25: 육계의 맹장 미생물총에서의 세균 과의 상대적 풍부도 분포. 세 가지 시점(왼쪽에서 오른쪽으로)에서의 모든 샘플중 상대적 풍부도(%)의 박스 및 휘스커 분포가 하나 이상의 시점에서 세 그룹(A, B, C) 간에 상당한 차이를 나타내는 과에 대해 도시된다. 녹색, 금색 및 분홍색 색조는 각각 그룹 A, B 및 C의 닭을 구별하는데 사용된다. 통계적 유의성에 도달했을 때(P<0.05) 베자미니-호허그(Bejamini-Hocherg) 수정 P 값이 보고된다.
도 26: 육계의 맹장 미생물총에서 세균 속의 상대적 풍부도 분포. 최소 1가지 시점에서 세 그룹(A, B, C) 간에 유의한 차이를 나타내는 속에 대해 3가지 시점(왼쪽에서 오른쪽으로)에서 모든 샘플에서의 상대적 풍부도(%)의 박스 및 휘스커 분포가 표시된다. 녹색, 금색 및 분홍색 색조는 각각 그룹 A, B 및 C의 닭을 구별하는데 사용된다. 베자미니-호허그 수정 P 값은 통계적 유의성에 도달했을 때(P <0.05) 보고된다.
도 27: 그룹 A(녹색 색조), 그룹 B(금색 색조) 및 그룹 C(분홍색 색조)의 육계에서 회장 미생물총 프로필의 가중(A) 및 비-가중(B) 유니프랙 거리를 기반으로 한 주 좌표 분석 PCoA. 샘플은 제공된 색상 범례에 따라 밝음(초기 샘플)에서 어두움(말기 샘플)까지 상이한 색상 색조로 채워진 삼각형으로 표시된다. 제 1 및 제 2 좌표 축이 각 플롯에 보고되고, 각 축에 의해 설명되는 데이터 세트의 변동 백분율이 보고된다.
도 28: 시점 T1(A, D), T2(B, E) 및 T3(C, F)에서 취한 육계에서 회장 미생물총 프로필의 가중(A 내지 C) 및 비-가중(D 내지 F) 유니프랙 거리를 기반으로 한 주 좌표 분석 PCoA. 샘플은 그룹 A의 경우 녹색, 그룹 B의 경우 금색, 그룹 C의 경우 분홍색으로 도 27에서와 같이 상이한 색상 색조로 채워진 삼각형으로 표시된다. 제 1 및 제 2 좌표 축이 각 플롯에 보고되고, 각 축에 의해 설명되는 데이터 세트의 변동 백분율이 보고된다.
도 29: 시점 T1(A, D), T2(B, E) 및 T3(C, F)에서 취한 육계의 회장 미생물총에서 페이쓰 PD 지수(A 내지 C) 및 관찰된 OTU의 수(D 내지 F)로 측정되는 알파 다양성. 모든 샘플에서의 다양성 지수의 박스 및 휘스커 분포가 표시된다. 녹색, 금색 및 분홍색 색조가 각각 그룹 A, B 및 C의 닭을 구분하는데 사용된다. 통계적으로 유의한 차이[크루스칼 월리스(Kruskall Wallis) 시험]가 해당 P 값으로 표시된다.
도 30: 육계 회장 생태계의 문 수준 미생물총 프로필. 사용 가능한 각 시점(T1, T2, T3)에서 그룹 A, B 및 C에 있는 육계의 회장 미생물총의 평균 계통 발생 프로필이 문 수준 세균에서 파이 차트로서 제공되고; 분류군은 그래픽 표현을 위해 사용 가능한 모든 샘플 중 최소 1개에서 >0.1%로서 필터링되었다.
도 31: 육계 회장 생태계의 과 수준 미생물총 프로필. 각 가용 시점(T1, T2, T3)에서 그룹 A, B 및 C에 있는 육계의 회장 미생물총의 평균 계통 발생 프로필이 과 수준 세균에서 파이 차트로서 제공되고; 분류군은 그래픽 표현을 위해 사용 가능한 모든 샘플 중 최소 1개에서 >0.5%로서 필터링되었다.
도 32: 육계 회장 미생물총에서 펩토스트렙토코카세아에(Peptostreptococcaceae) 과의 상대적 풍부도 분포. 3가지 시점(왼쪽에서 오른쪽으로)에서 모든 샘플에서의 상대적인 풍부도의 박스 및 휘스커 분포가 표시된다. 녹색, 금색 및 분홍색 색조가 각각 그룹 A, B 및 C의 닭을 구분하는데 사용된다. 통계적 유의성에 도달했을 때(P<0.05) 베자미니 호허그 수정 P 값이 보고된다.
도 33: 그룹 A(녹색 색조), 그룹 B(금색 색조) 및 그룹 C(분홍색 색조)의 육계에서 새끼(litter) 미생물총 프로필의 가중(A) 및 비-가중(B) 유니프랙 거리를 기반으로 한 주 좌표 분석 PCoA. 샘플은 밝음(초기 샘플)에서 어두움(말기 샘플)까지 상이한 색상 색조로 채워진 삼각형으로 표시된다. 제 1 및 제 2 좌표 축이 각 플롯에 보고되고, 각 축에 의해 설명되는 데이터 세트의 변동 백분율이 보고된다.
도 34: 새끼 생태계의 문 수준 미생물총 프로필. 사용 가능한 각 시점(T1, T2, T3)에서 그룹 A, B 및 C에 있는 육계의 새끼 미생물총의 평균 계통 발생 프로필이 문 수준 세균에서 파이 차트로서 제공되고; 분류군은 그래픽 표현을 위해 사용 가능한 모든 샘플 중 최소 1개에서 >0.1%로서 필터링되었다.
도 35: 새끼 생태계의 과 수준 미생물총 프로필. 각 가용 시점(T1, T2, T3)에서 그룹 A, B 및 C에 있는 육계의 새끼 미생물총의 평균 계통 발생 프로필이 과 수준 세균에서 파이 차트로서 제공되고; 분류군은 그래픽 표현을 위해 사용 가능한 모든 샘플 중 최소 1개에서 >0.5%로서 필터링되었다.
도 36: DSM 맹장 샘플 C281 pH 7.13의 물 추출물의 1H-NMR 스펙트럼. 다운필드(downfield) 영역(방향족 영역)의 작은 신호를 더 잘 인식하기 위해 A의 수직 스케일이 확대된다.
도 37: A) 모든 샘플의 비닝되고(binned) 정규화된 1H NMR 스펙트럼의 PCA 점수 플롯과 B) 특이치 샘플이 없는 PCA 점수(그래픽은 R 소프트웨어를 사용하여 수행됨).
도 38: A) 61개 샘플의 비닝되고 정규화된 1H NMR 스펙트럼의 PLS-DA 점수 플롯(여기에서, 3개 그룹은 시점에 따라 선형으로 분리되는 것으로 보임). B) 대조군[A] 및 처리된 그룹[B+C]을 고려한 PLS-DA 점수 플롯[그래픽은 파이톤(Python) 소프트웨어를 사용하여 수행됨].
도 39: 5.793ppm (d)에서 우라실 신호 적분의 박스 플롯; 샘플은 하기 시점에 따라 비교된다: A) 14일에 해당하는 T0에서; B) 28일에 해당하는 T1에서; 및 C) T2에서 42일까지.
도 40: 2.0447ppm (m)에서 글루타메이트 신호 적분의 박스 플롯; 샘플은 하기 시점에 따라 비교된다: A) 14일에 해당하는 T0에서; B) 28일에 해당하는 T1에서; 및 C) T2에서 42일까지. 우라실은 모든 처리에서 특히 샘플 C의 경우 42일까지 농도를 증가시키는 것으로 보인다.
도 41: 1.470ppm (d)에서 알라닌 신호 적분의 박스 플롯; 샘플은 하기 시점에 따라 비교된다: A) 14일에 해당하는 T0에서; B) 28일에 해당하는 T1에서; 및 C) T2에서 42일까지.
도 42: 3.920ppm (s)에서 크레아틴 신호 적분의 박스 플롯; 샘플은 하기 시점에 따라 비교된다: A) 14일에 해당하는 T0에서; B) 28일에 해당하는 T1에서; 및 C) T2에서 42일까지.
도 43: 0.883ppm (t)에서 부티레이트 신호 적분의 박스 플롯; 샘플은 하기 시점에 따라 비교된다: A) 14일에 해당하는 T0에서; B) 28일에 해당하는 T1에서; 및 C) T2에서 42일까지.
도 44: 1.0446ppm (m)에서 프로피오네이트 신호 적분의 박스 플롯; 샘플은 하기 시점에 따라 비교된다: A) 14일에 해당하는 T0에서; B) 28일에 해당하는 T1에서; 및 C) T2에서 42일까지.
도 45: 1.0909ppm (s)에서 아세테이트 신호 적분의 박스 플롯; 샘플은 하기 시점에 따라 비교된다: A) 14일에 해당하는 T0에서; B) 28일에 해당하는 T1에서; 및 C) T2에서 42일까지.
도 46: 평균 대사 산물의 신호 적분 대 시간의 로그정규(LogNormal) 피팅(fit). 비교는 표준 편차를 오차 막대로 사용하여 처리 그룹별로 수행된다. 반투명 영역은 피팅의 95% 페이쓰 구간을 정의한다.
도 47: 모든 샘플(63개 샘플)의 모든 정규화된 기능적 특징(6361 데이터)의 PCA 점수 플롯.
도 48: 각 시점에 있어서 대조군(그룹 A)과 비교한 처리된 그룹(그룹 B 및 C)의 정규화된 기능적 특징의 PCA 점수 플롯.
도 49: 각 가용 시점(T1, T2, T3)에 있어서 세 가지 상이한 그룹 A, B 및 C의 육계 맹장에서의 1차 KEGG 대사 경로.
도 50: 각 가용 시점(T1, T2, T3)에 있어서 세 가지 상이한 그룹 A, B 및 C의 육계 맹장에서의 환경 정보 처리 및 대사 경로(KEGG 데이터베이스)의 상대적인 풍부도(통계적으로 유의한 상대적 풍부도). 녹색 및 빨간색 박스는 각각 그룹 B 및 C와 관련이 있고, 파란색 박스는 그룹 A와 관련되어 있다. 각 그래프의 오른쪽 상단에 P 값이 표시된다.
도 51: 각 가용 시점(T1, T2, T3)에 있어서 세 가지 상이한 그룹 A, B 및 C의 육계 맹장에서 상대적 풍부도가 ≥0.5%인 2차 KEGG 대사 경로.
도 52: 부티레이트 합성을 위한 네 가지 상이한 경로와 해당 유전자(단백질 이름)가 표시된다. 주요 기질이 도시된다. 말단 유전자는 빨간색으로 강조된다. L2Hgdh, 2-하이드록시글루타레이트 데하이드로게나제; Gct, 글루타코네이트 CoA 트랜스퍼라제(α, ß 서브유닛); HgCoAd, 2-하이드록시-글루타릴-CoA 데하이드로게나제(α, ß, γ 서브유닛); Gcd, 글루타코닐-CoA 데카복실라제(α, ß 서브유닛); Thl, 티올라제; hbd, ß-하이드록시부티릴-CoA 데하이드로게나제; Cro, 크로토나 제; Bcd, 부티릴-CoA 데하이드로게나제(전자 전달 단백질 α, ß 서브유닛 포함); KamA, 리신-2,3-아미노뮤타제; KamD,E, _ß-리신-5,6-아미노뮤타제(α, ß 서브유닛); Kdd, 3,5-디아미노헥사노에이트 데하이드로게나제; Kce, 3-케토-5-아미노헥사 노에이트 절단 효소; Kal, 3-아미노부티릴-CoA 암모니아 리아제; AbfH, 4-하이드록시부티레이트 데하이드로게나제; AbfD, 4-하이드록시부티릴-CoA 데하이드라타제; Isom, 비닐아세틸-CoA 3,2-이소머라제(AbfD와 동일한 단백질); 4Hbt, 부티릴-CoA:4-하이드록시부티레이트 CoA 트랜스퍼라제; But, 부티릴-CoA:아세테이트 CoA 트랜스퍼라제; Ato, 부티릴-CoA:아세토아세테이트 CoA 트랜스퍼라제(α, ß 서브유닛); Ptb, 포스페이트 부티릴트랜스퍼라제; Buk, 부티레이트 키나제. 개별 부티릴-CoA 트랜스퍼라제에 대한 보조 기질이 표시된다. 바이탈(Vital) 등 (2014).
정의
명세서 및 청구 범위 전체에 사용된 용어 "유익균"은 다음 속으로부터 선택되는 적어도 하나의 세균 분류군을 포함한다: 애시드아미노코쿠스(Acidaminococcus), 아케르만시아(Akkermansia), 박테로이데스(Bacteroides), 비피도박테리움(Bifidobacterium), 블라우티아(Blautia), 클로스트리듐(Clostridium), 콜린셀라(Collinsella), 도레아(Dorea), 에스케리치아 콜리(Escherichia coli), 유박테리움(Eubacterium), 파에칼리박테리움(Faecalibacterium), 라크노스피라(Lachnospira), 락토바실러스(Lactobacillus), 파라박테로이데스(Parabacteroides), 라오울텔라(Raoultella), 로세부리아(Roseburia), 루미노코쿠스(Ruminococcus), 프레보텔라(Prevotella) 및 크리스텐세넬라(Christensenella). 또한 하기 과 에리시펠로트리카세아에(Erysipelotrichaceae), 코리오박테리아세아에(Coriobacteriaceae), 바르네시엘라세아에(Barnesiellaceae)도 유익균 분류군에 포함될 수 있다.
명세서 및 청구 범위 전체에서 사용된 바와 같이, "니아신"이 언급될 때, 이는 유일한 활성제가 아니다. 존재하는 경우, 이는 적어도 다른 활성제와 조합되고, 바람직하게는 니아신은 존재하지 않는다.
"과생리적" 투여량은 "과영양"과 동일한 의미, 즉 유효량 이상의 활성 성분이 동물의 장, 바람직하게는 하부 장 및/또는 결장에 존재하고 세균 개체군에 바로 영양을 공급하는데 사용될 수 있도록, 동물에 대한 활성 성분 권장량보다 높은 투여량을 의미한다.
"유일한 활성제"는 장, 바람직하게는 결장에 존재하는 유일한 활성제가 표시된 것임을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "장"은 소장 및 대장으로 구성된 위장관 부분을 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "비타민 A"는 레티놀, 레티날, 레티노산 및 프로비타민 A 카로티노이드(가장 특히는, β-카로틴)로부터 선택되는 화합물을 의미한다. 바람직한 실시양태에서, 비타민 A는 레티놀이다. 본원에 사용된 비타민 A의 농도 또는 양은 레티놀 등가물을 의미한다.
용어 "비타민 E"는 α-토코페롤 활성을 갖는 화합물을 의미한다. 바람직한 실시양태에서, 비타민 E는 α-토코페롤 및 이의 에스테르, 특히 α-토코페롤 아세테이트이다. 여기에 언급된 비타민 E의 농도 또는 양은 알파-토코페롤 등가물을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "비타민 D"는 비타민 D3를 의미한다. 25-하이드록시비타민 D3가 바람직하게는 비-인간 종에서 비타민 D3 대신 또는 이에 추가하여 사용될 수 있다. 25-하이드록시비타민 D3와 비타민 D3의 상대적인 강도는 약 40:1이므로 이에 따라 25-하이드록시비타민 D3의 투여량을 조정해야 한다.
용어 "리보플라빈"은 리보플라빈 및 이의 에스테르, 특히 리보플라빈-5'-포스페이트를 포함한다.
용어 "엽산"은 엽산 및 이의 약학적으로 허용되는 염을 의미한다.
용어 "비타민 C"는 아스코르브산, 이의 약학적으로 허용되는 염(예를 들어, 아스코르브산나트륨 및 아스코르브산칼슘) 및 이의 약학적으로 허용되는 에스테르(특히 아스코르빌 팔미테이트)를 의미한다.
용어 "비타민 K"에는 비타민 K1 및 비타민 K2가 포함된다.
용어 "β-카로틴"은 β-카로틴 또는 프로비타민 A를 의미한다.
용어 "비타민 B1"은 티아민, 아뉴린(aneurine) 및 이들의 약학적인 염(예: 티아민 모노니트레이트)을 의미한다.
용어 "니아신"은 니코틴산, 비타민 B3, 피리딘-3-카복실산을 의미하고, 니코틴아미드 또는 니아신아미드를 포함한다. 이는 적어도 하나의 다른 활성 성분과 조합하여 존재할 수 있지만, 이것이 유일한 활성 성분인 경우 이는 본 발명에서 특별히 제외된다.
용어 "비타민 B5"는 판토텐산 및 이의 약학적으로 허용되는 염(예: 판토텐산칼슘)을 의미하고, 이의 유도체 판토테놀 또는 판테놀을 포함한다.
용어 "비타민 B6"는 피리독살 포스페이트를 의미하고, 피리독살 5'포스페이트를 포함한다.
용어 "비오틴"은 비타민 B7, 비타민 H, 코엔자임 R, 바이오페이덤(biopeiderm)을 의미한다.
용어 "비타민 B12"는 코발라민을 의미하고, 모든 형태의 비타민 B12(예: 시아노코발라민 및 메틸코발라민)를 포함한다.
"오메가-3 지방산"은 n-3 위치에 이중 결합을 갖는 다중 불포화 지방산이다. 바람직한 실시양태에서, 오메가-3 지방산은 아이코사펜타에노산(EPA) 또는 도코사헥사에노산(DHA) 또는 둘 모두의 조합이다.
상세한 설명
한 양태에서, 본 발명은 동물에서 장 건강을 개선하는데 사용하기 위한, 리보플라빈, 비타민 A, β-카로틴, 비타민 C, 비타민 D, 비타민 E, 비타민 K, 엽산, β-카로틴, 비타민 B1, 니아신(존재하는 경우), 비타민 B5, 비타민 B6, 비오틴, 비타민 B12, 오메가-3 지방산 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 활성제에 관한 것이며, 이 때 상기 개선은
(i) 장에서 하나 이상의 단쇄 지방산 또는 이의 염의 농도 증가,
(ii) 장내 미생물총 다양성 증가,
(iii) 장내 유익균의 미생물 풍부 증가,
(iv) 장내 부티레이트 합성 경로의 촉진 또는 증가,
(v) 장의 장벽 기능 개선,
(vi) 장의 산화환원 전위 감소,
(vii) 장내 가스 생산량 감소,
(viii) 장 면역 반응 자극
을 포함하거나 이것들로 이루어지고,
상기 사용은 동물에게
a) 유효 투여량의 활성제를 포함하는 제형(이 때, 활성제는 대장으로 전달됨); 또는
b) 적어도 유효량의 활성 성분이 동물의 장에 존재하도록 하는 과생리적 투여량의 활성 성분
을 투여함을 포함하되,
니아신이 활성제인 경우 이는 유일한 활성제가 아니고; 리보플라빈이 존재하는 경우 이는 파에칼리박테리움 프라우스니치의 양을 증가시키는 것 외의 개선 효과를 갖는다.
전형적으로, 상기 사용은 포유동물일 수 있는 동물에게 유효 투여량의 활성제를 포함하는 지연 방출 제형(이 경우, 활성제의 방출은 대장까지 또는 결장까지 지연됨)을 투여하거나, 활성제가 결장으로 직접 전달되는 비-경구 경로에 의해 투여함을 포함한다. 지연 방출 제형 및 이들의 제조는 아래에서 더 자세히 설명된다.
동물이 단위 농장 동물 또는 가금류와 같은 비-인간인 경우, 투여는 지연 방출 제형을 통해(이로써 활성제의 방출이 대장까지 지연됨), 또는 유효 투여량의 활성제가 장에 존재하도록 사료에 과생리적 투여량을 사용함으로써 이루어질 수 있다. 동물이 인간인 경우, 투여는 지연 방출 제형의 투여, 비-경구 경로를 통한 투여 및/또는 과생리적 투여량의 사용에 의한 투여를 비롯한, 명세서에 상세히 기재된 바와 같은 다수의 방식으로 수행될 수 있다.
일부 실시양태에서, 니아신은 본 발명의 활성제중 하나로 간주되지 않는다.
단쇄 지방산 증가/부티레이트 합성 촉진
본원에 사용된 용어 "단쇄 지방산"(SCFA)은 2 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 지방산을 지칭한다. SCFA에는 포름산, 아세트산, 프로피온산, 부티르산, 2-메틸프로판산, 3-메틸부탄산 및 헥산산이 포함된다. 가장 중요한 SCFA는 아세트산, 프로피온산 및 부티르산이다.
동물의 결장에서 하나 이상의 SCFA 농도의 "증가"는 활성제가 투여되지 않은 동물의 SCFA 농도에 대해 상대적이다. 활성제가 투여되지 않은 동물은 본원에서 "대조군 동물"로 언급된다. 바람직하게는, 동물의 결장에서 하나 이상의 SCFA 농도의 "증가"는 활성제가 투여되지 않은 동일한 동물의 SCFA 농도에 대해 상대적이다. 즉, 이 상황에서 대조군 동물은 일반적으로 활성제 투여 시작 전의 동일한 동물이다. 바람직하게는, 대조군 동물은 적어도 28일 동안 영양 보충제의 형태로 본원에 언급된 활성제를 받지 않았다. 일부 실시양태에서 동물은 포유동물이고; 일부 실시양태에서 동물은 돼지와 같은 단위 동물이다. 일부 실시양태에서, 동물은 가금류이다.
한 실시양태에서, 아세트산의 농도는 활성제의 투여시 증가된다. 다른 실시양태에서, 프로피온산의 농도는 활성제의 투여시 증가된다. 다른 실시양태에서, 부티르산의 농도는 활성제의 투여시 증가된다. 또 다른 실시양태에서, 아세트산, 프로피온산 및 부티르산의 농도는 활성제의 투여시 증가된다.
한 실시양태에서, 하나 이상의 SCFA의 농도는 활성제의 단일 투여시 증가된다. 다른 실시양태에서, 하나 이상의 SCFA의 농도는 2일 연속 투여되는 활성제의 2회 투여시에 증가된다. 다른 실시양태에서, 하나 이상의 SCFA의 농도는 7일 연속 투여되는 활성제의 7회 투여시 증가된다. 또 다른 실시양태에서, 하나 이상의 SCFA의 농도는 14일 연속 투여되는 활성제의 14회 투여시 증가된다. 바람직하게는, 하나 이상의 SCFA(예를 들어, 아세트산, 프로피온산 및/또는 부티르산)의 농도는 21일 연속 투여되는 활성제의 21회 투여시 증가된다. 가장 바람직하게는, 하나 이상의 SCFA(예를 들어, 아세트산, 프로피온산 및/또는 부티르산)의 농도는 활성제의 28회 투여시 증가되고, 이는 연속 28일동안 1일 1회 투여된다.
결장 내 SCFA의 농도는 대조군의 결장 내 SCFA 농도에 비해 5% 이상, 바람직하게는 10% 이상, 15% 이상 또는 20% 이상 증가할 수 있다. 대조군에서는 활성제가 투여되지 않았다.
결장 내 SCFA의 농도는 활성제가 투여된 포유동물로부터 배설물 샘플을 얻고 하나 이상의 SCFA의 농도를 측정하여 결정할 수 있다.
일반적으로 알려진 SCFA의 농도를 측정하는 방법(예: 가스 크로마토그래피에 의해)은 당업자에게 알려져 있다. 예를 들어, 드 와이트(De Weirdt) 등 (2010)(DOI: 10.1111/j.1574-6941.2010.00974.x)은 적절한 방법을 기재한다.
다르게는, 활성제 투여시 하나 이상의 SCFA의 증가는 본 출원의 실시예에 기재된 바와 같이 시험관내 모델로서 반응기 및 배설물 현탁액을 사용하여 결정될 수 있다.
활성제의 투여는 부티레이트 경로로의 아세틸-CoA 발효에 관련된 유전자의 상대적인 풍부도를 증가시키는 것으로 추가로 밝혀졌다. 따라서, 본 발명은 부티레이트 합성 경로의 활성화 또는 증가를 위한 활성제의 용도에 관한 것이다. 부티레이트 경로로의 아세틸-CoA 발효에 관련된 유전자의 상대적 풍부도는 실시예에 기재된 바와 같이 결정될 수 있다.
본원에 기재된 활성제는 포유동물의 결장에서 하나 이상의 SCFA의 농도를 증가시키고/시키거나 장의 장벽 기능을 개선하는데 효과적인 미량 영양소이다. 비타민 A, 비타민 C, 리보플라빈, 비타민 D, 비타민 E, 비타민 K, 엽산 및 오메가-3 지방산은 특정 농도로 투여될 때 포유동물의 결장에서 하나 이상의 SCFA 농도를 증가시킬 수 있는 것으로 밝혀졌다.
부티레이트 경로를 증가시키는데 바람직한 활성제는 비타민 A, 비타민 C, 리보플라빈, 비타민 E, 엽산, β-카로틴, 오메가-3 지방산 및 이들의 조합이다. 이 작용에 의해 치료, 개선 또는 예방되는 질환에는 대사 장애, 제 2 형 당뇨병, 비만, 만성 염증 및 죽종 형성이 포함된다.
따라서, 본 발명의 또 다른 실시양태는 비타민 A, 비타민 C, 리보플라빈, 비타민 E, 엽산, β-카로틴, 오메가-3 지방산 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 활성제를 투여하는 것을 포함하는, 대사 장애, 제 2 형 당뇨병, 비만, 만성 염증 및 죽종 형성으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환을 앓는 인간을 비롯한 동물에서 적어도 하나의 단쇄 지방산을 증가시키고/시키거나 부티레이트 합성 경로 활성을 증가시키는 방법이다.
본 발명의 다른 실시양태는 인간을 비롯한 동물의 장 건강 개선에 사용하기 위한 활성제이며, 이 때 개선은 장에서 하나 이상의 단쇄 지방산 또는 이의 염의 농도를 증가시키거나; 장내 부티레이트 합성 경로를 촉진 또는 증가시키는 것을 포함하며; 단쇄 지방산은 아세트산, 프로피온산, 부티르산 및 이들의 염으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 또 다른 실시양태는 장에서 하나 이상의 단쇄 지방산 또는 이의 염의 농도를 증가시키는데 사용하기 위한, 비타민 A, β-카로틴, 비타민 C, 리보플라빈, 비타민 D, 비타민 E, 비타민 K, 엽산, 오메가-3 지방산 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 활성제이다.
본 발명의 또 다른 실시양태는 인간을 비롯한 동물의 장 건강 개선에 사용하기 위한 활성제이며, 이 때 개선은 장에서 하나 이상의 단쇄 지방산 또는 이의 염의 농도를 증가시키거나; 장내 부티레이트 합성 경로를 촉진 또는 증가 시킴을 포함하며; 인간을 비롯한 동물은 대사 장애, 제 2 형 당뇨병, 비만, 만성 염증 및 죽종 형성으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환을 앓는다.
미생물총 다양성 및 유익균 강화
활성제의 투여가 장내 미생물총 다양성을 증가시키는 것으로 추가로 관찰되었다. 따라서, 본 발명은 장내 미생물총 다양성, 바람직하게는 결장 미생물총 다양성을 증가시키기 위한 활성제의 용도에 관한 것이다. 미생물총 다양성은 인간, 돼지 및 가금류의 예에 설명된대로 결정될 수 있다.
특히, 본 발명자들은 활성제의 보충이 인간에서 유익균, 바람직하게는 락토바실러스, 비피도박테리움, 아케르만시아 및 파에칼리박테리움의 상대적 풍부도를 증가시킴을 발견하였다. 따라서, 본 발명은 유익균, 바람직하게는 장, 바람직하게는 결장에서 락토바실러스, 비피도박테리움, 아케르만시아 및/또는 파에칼리박테리움 중 적어도 하나를 포함하는 유익균의 상대적 풍부도를 증가시키기 위한 활성제의 용도에 관한 것이다.
예를 들어, 가금류에서는 박테로이데스와 파에칼리박테리움이 증가한다. 따라서, 또 다른 실시양태는 동물에게 과생리적 투여량의 활성제를 투여하는 것을 포함하는, 동물에서 유익균을 증가시키는 방법이다.
유익균의 풍부도가 증가하면 과민성 대장 증후군, 대사 질환, 비만 및 염증 상태의 증상을 치료, 예방 또는 경감할 수 있다.
바람직한 활성제는 비타민 B1, 리보플라빈, 비타민 B5, 비타민 B12, β-카로틴, 비오틴, 비타민 C, 비타민 E, 비타민 D, 엽산, 비타민 K, 오메가-3 지방산 및 이들의 조합이다. 그러나, 리보플라빈이 활성제인 경우, 이는 파에칼리박테리움 프라우스니치의 풍부도를 증가시키는 것 이외의 목적으로 존재한다.
따라서, 본 발명의 또 다른 실시양태는 동물의 결장에 유익균 향상량의 활성제를 투여함을 포함하는, 과민성 대장 증후군, 대사 질환, 비만 또는 염증 상태의 증상을 치료, 예방 또는 경감시킬 필요가 있는 인간을 비롯한 동물에서 이들 증상을 치료, 예방 또는 경감시키는 방법이며, 활성제는 비타민 B1, 리보플라빈, 비타민 B5, 비타민 B12, β-카로틴, 비오틴, 비타민 C, 비타민 E, 비타민 D, 엽산, 비타민 K, 오메가-3 지방산 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되되, 리보플라빈이 활성제인 경우, 이는 파에칼리박테리움 프라우스니치의 풍부도를 증가시키는 것 이외의 목적으로 존재한다.
본 발명의 또 다른 실시양태는 장 건강 개선에 사용하기 위한 활성제이며, 이 때 개선은 장내 미생물총 다양성 증가 및/또는 결장에서 유익균의 풍부도 증가를 포함한다. 증가되는 유익균은 애시드아미노코쿠스, 아케르만시아 종, 박테로이데스 오바투스(Bacteroides ovatus), 비피도박테리움 종, 블라우티아 프로둑타(Blautia producta), 클로스트리듐 코클레아툼(Clostridium cocleatum), 콜린셀라 아에로파시엔스(Collinsella aerofaciens), 도레아 롱기카테나(Dorea longicatena), 에스케리치아 콜리, 유박테리움 종, 파에칼리박테리움 프라우스니치, 라크노스피라 펙티노쉬자(Lachnospira pectinoshiza), 락토바실러스 종, 파라박테로이데스 디스타소니스(Parabacteroides distasonis), 라오울텔라 종, 로세부리아 종, 루미노코쿠스 종(Ruminococcus spp.), 스트렙토코쿠스 종(Streptococcus spp.) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되되, 리보플라빈이 존재하는 경우 이는 파에칼리박테리움 프라우스니치의 양을 증가시키는 것 이외의 개선 효과를 갖는다. 바람직하게는, 증가되는 세균는 비피도박테리움, 아케르만시아, 파에칼리박테리움 및 박테로이데스로 이루어진 군으로부터 선택된다.
활성제는 과민성 대장 증후군, 대사 질환, 비만 및 염증 질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환을 겪고 있는 인간을 비롯한 동물에서 사용될 수 있다. 바람직하게는, 활성제는 비타민 B1, 비타민 B2, 비타민 B5, 비타민 B6, 비타민 B12, β-카로틴, 비오틴, 비타민 C, 비타민 E, 비타민 D, 엽산, 비타민 K, 오메가-3 지방산 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
면역 반응 자극
또한, 활성제 투여시 24시간 장 회분 발효로부터의 유출물로 세포를 처리한 후, 결장 상피 세포주 HT29에 의한 특정 마커 및 사이토카인의 생성이 증가하는 것으로 관찰되었다. 바이오마커 및 사이토카인에는 GROa-CXCL1, IL-8 및 MIP3A-CCL20이 포함된다.
GROa-CXCL1은 염증에 중요한 역할을 하고 호중구에 대한 화학 유인제 작용을 하는 케모카인이다. 이는 미생물 사멸을 위해 조직 부위에서 호중구를 모집하고 활성화하여 숙주 면역 반응을 활성화한다. CXCL1은 또한 미생물 방어를 위해 프로테아제 및 활성 산소 종(ROS)의 방출을 활성화하는 것으로 알려져 있다.
인터류킨-8(IL-8)은 호중구 이동 능력이 있는 것으로 알려진 화학 유인 사이토카인으로, 강화된 화학 주성에 도움이 된다. 이는 표적 세포에서 화학 주성을 유도하여 호중구 및 기타 과립구가 감염 부위로 이동하도록 한다.
MIP3A-CCL20은 또한 이펙터 및 기억 T 림프구, 미성숙 DC 및 수용체 CCR6을 발현하는 천연 B 세포를 임의적으로는 유인하는 케모카인이다. CCL20은 위장관 및 피부와 같은 면역학적 장벽에서 구성적으로 발현된다.
이러한 모든 바이오마커는 면역 반응의 활성화를 반영한다.
면역 반응을 자극하면 만성 염증뿐만 아니라 급성 염증을 포함한 질환에 도움이 될 수 있다.
바람직한 활성제는 리보플라빈, 비타민 E, 비타민 A, 비타민 K 및 이들의 조합이다.
따라서, 본 발명의 또 다른 실시양태는 장 면역 반응을 자극하고, 면역 약화의 증상을 개선하고, 전신 항-염증 반응을 생성할 필요가 있는 동물의 결장에 유효 투여량의 활성제를 사용 및/또는 투여함으로써 장 면역 반응을 자극하고, 면역 약화의 증상을 개선하고, 전신 항-염증 반응을 생성시키기 위한 활성제의 용도이며, 이 때 활성제는 리보플라빈, 비타민 E, 비타민 A, 비타민 K 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 실시양태는 면역 자극 유효 투여량의 활성제를 동물의 결장에 투여함을 포함하는, 만성 또는 급성 염증의 증상을 치료, 예방 또는 경감시키는 방법이며, 여기에서 활성제는 리보플라빈, 비타민 E, 비타민 A, 비타민 K 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 또 다른 실시양태는 장 건강을 개선에 사용하기 위한 활성제이며, 이 때 개선은 장 면역 반응을 자극하는 것이다. 바람직하게는, 사용은 GROa-CXCL1, MIP3A-CCL20, 인터류킨 8 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 면역 반응 분자를 증가시키는 것이다. 바람직하게는, 활성제는 비타민 B2, 비타민 E, 비타민 D, 비타민 A 및 비타민 K, 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 실시양태는 리보플라빈, 비타민 E, 비타민 A, 비타민 K 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 활성제를 장에 투여함을 포함하는, 급성 또는 만성 염증을 앓는 인간을 비롯한 동물에서 장 면역 반응을 개선하는 방법이다.
산화환원 전위
일반적으로 비타민 C 및 E와 같은 항산화 화합물은 결장에 도달하지 않지만, 항산화 비타민과 화합물의 대장으로의 결장 표적 전달은 장의 산화환원 전위를 감소시킬 수 있다. 이러한 낮아진 산화환원 전위는, 특히 장내 미생물총 환경이, 극혐기성 유익 미생물의 성장을 방해하고/하거나 내기성(aerotolerant) 병원성 유기체의 성장을 촉진하고/하거나 숙주 세포에 염증 및 세포 손상을 유발하는 더 많은 산소 및/또는 산소 라디칼의 존재에 직면하는 상황에서, 정상적인 장내 미생물총의 구성 및 활성의 교란과 관련된 증상을 상쇄할 수 있다.
따라서, 본 발명의 또 다른 실시양태는 장내 산화환원 전위를 낮추고, 이에 따라 내기성 병원성 유기체의 성장을 감소시키고, 장 염증 및 결과적인 세포 손상을 감소시키고, 유익한 극혐기성 세균의 성장을 촉진하기 위한, 활성제, 바람직하게는 비타민 C 및/또는 E의 용도이다.
더욱이, 본 발명의 또 다른 실시양태는 염증성 장 질환과 같은 다양한 염증 질환에서 전신 산화환원 상태의 척도인 혈장 유리 티올을 낮추기 위한, 활성제, 바람직하게는 비타민 C 및/또는 E의 용도이다.
따라서, 본 발명의 또 다른 실시양태는 장의 산화환원 전위를 감소시킬 필요가 있는 사람을 비롯한 동물에게 리보플라빈, 비타민 C, 비타민 E 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 활성제를 투여함을 포함하는, 장의 산화환원 전위를 감소시키는 방법이며, 이는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 이점을 초래한다:
결장에서 극혐기성 유익균의 성장 촉진;
장내 내기성 병원성 유기체 감소;
장내 염증 감소; 및
장에서 염증으로 인한 장내 세포 손상의 감소.
가스 생산
폐쇄 배양 시스템에서 결장 배양을 수행하였다. 이를 통해 압력계로 측정할 수 있는 헤드스페이스의 가스 축적을 평가할 수 있었다. 가스 생산은 미생물 활동의 척도, 따라서 잠재적으로 프리바이오틱 기질의 발효 속도의 척도이다. 이는 프리바이오틱 소비시 팽만감과 소화기 웰빙에 대한 지표로서 사용될 수 있다.
실시예에서 입증되는 바와 같이, 활성제, 바람직하게는 비타민 B2 및/또는 비타민 C를 사용하여 장에서 생성되는 가스의 양을 줄일 수 있다.
따라서, 본 발명의 또 다른 실시양태는 비타민 B2, 비타민 C 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 활성제를 대장에 전달함을 포함하는, 장내 가스 생산량 감소를 치료, 예방 또는 경감시키는 방법이다.
장 장벽 강화
Caco-2 및 HT29-MTX-E12 세포의 공동 배양액을 사용하여 발효 전후의 상청액의 보호 효과를 평가하였다. 경상피 전기 저항(TEER) 판독 값은 컨플루언트(confluent) 단일층의 견고성과 상관 관계가 있으며[스리니바산(Srinivasan) 등 2015], 장 장벽 강도의 지표로서 사용될 수 있다. 장의 장벽 강도 감소는 과민성 대장 증후군, 크론병, 궤양성 대장염, 장 누수 및 영양 실조를 포함한 여러 질환과 관련된 상태에서 볼 수 있다.
장 장벽을 개선하기 위한 바람직한 활성제는 리보플라빈, 비타민 C, 비타민 E, 오메가-3 지방산, 비타민 D, 비타민 A, 엽산, 비타민 K 및 이들의 혼합물이다. 따라서, 본 발명의 또 다른 실시양태는 과민성 대장 증후군, 크론병, 궤양성 대장염, 장 누수 및 영양 실조로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환의 증상을 치료, 예방 또는 경감시킬 필요가 있는 인간을 비롯한 동물에게 리보플라빈, 비타민 C, 비타민 E, 오메가-3 지방산, 비타민 D, 비타민 A, 엽산, 비타민 K 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 활성제를 투여함을 포함하는, 상기 질환의 증상을 치료, 예방 및 완화시키는 방법이다.
본 발명의 또 다른 실시양태는 장 건강을 개선하기 위한 활성제의 용도이며, 이 때 개선은 장의 장벽 기능 개선을 포함한다. 과민성 대장 증후군, 크론병, 궤양성 대장염, 장 누수 및 영양 실조로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환을 겪고 있는 사람을 포함한 동물에서 사용할 수 있다. 바람직하게는 활성제는 비타민 B2, 비타민 C, 비타민 E, 오메가-3 지방산, 비타민 D, 비타민 A, 엽산, 비타민 K1 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된다.
투여량 및 농도
본원에 사용된 투여량은 포유동물이 일반적인 영양 목적으로 섭취하는 활성 성분에 추가하는 것으로 의도된다. 대신 이들은 장내 미생물의 속, 종 및 균주 수준에서 전체적으로 장내 미생물총 환경에 대해 작용한다. 활성제는 포유동물에 의해 직접 대사되는 것으로 의도되지 않으며 결장의 세균 개체군에 의해 이용되도록 의도된다. 따라서, 아래에 보고되는 양은 일반적인 식단에 추가하여 동물에 의해 소비될 것이지만, 방출 지연으로 인해 동물이 이들을 바로 이용할 수 있는 것은 아니기 때문이다.
Figure pct00001
바람직하게는, 리보플라빈은 결장에서의 국소 농도가 0.01mg/ml 이상, 바람직하게는 0.1mg/ml 이상, 더욱 바람직하게는 0.5mg/ml 이상, 가장 바람직하게는 1.25mg/ml 이상, 예컨대 약 1.4mg/ml이 되도록 하는 양으로 투여된다. 결장에서 바람직한 국소 농도는 약 0.01mg/ml 내지 약 5mg/ml, 또는 약 0.1mg/ml 내지 약 4mg/ml, 또는 약 0.5mg/ml 내지 약 3mg/ml, 또는 약 1.25mg/ml 내지 약 2mg/ml이다.
가금류에 적합한 한 실시양태에서, 과생리적 양은 권장 투여량의 적어도 약 10배 또는 심지어 20배일 수 있는데, 예를 들어 권장되는 1일 투여량이 5mg인 경우, 사료에 투여되는 양은 리보플라빈이 결장에 존재하도록 하기 위해 50mg 또는 100mg이다.
바람직하게는, 비타민 E는 결장에서의 국소 농도가 0.01mg/ml 이상, 바람직하게는 0.05mg/ml 이상, 가장 바람직하게는 0.1mg/ml 이상이 되도록 하는 양으로 투여된다. 결장에서의 바람직한 국소 농도는 약 0.01mg/ml 내지 약 5mg/ml, 보다 바람직하게는 약 0.03mg/ml 내지 약 4mg/ml, 가장 바람직하게는 약 0.05mg/ml 내지 약 3mg/ml이다.
바람직하게는, 아스코르브산은 결장에서의 국소 농도가 0.05mg/ml 이상, 바람직하게는 0.1mg/ml 이상, 가장 바람직하게는 0.5mg/ml 이상이 되도록 하는 양으로 투여된다. 결장에서의 바람직한 국소 농도는 약 0.05mg/ml 내지 약 50mg/ml, 보다 바람직하게는 약 0.1mg/ml 내지 약 20mg/ml, 가장 바람직하게는 약 1mg/ml 내지 약 10mg/ml이다.
바람직하게는, 비타민 D는 결장에서의 국소 농도가 0.01μg/ml 이상, 바람직하게는 0.03μg/ml 이상, 가장 바람직하게는 0.04μg/ml 이상 또는 0.1μg/ml 이상이 되도록 하는 양으로 투여된다. 결장에서의 바람직한 국소 농도는 약 0.01㎍/ml 내지 약 20㎍/ml, 더욱 바람직하게는 약 0.03㎍/ml 내지 약 10㎍/ml, 가장 바람직하게는 약 0.04㎍/ml 내지 약 2㎍/ml 또는 약 0.1㎍/ml 내지 약 2㎍/ml 범위이다.
바람직하게는, 비타민 A는 결장에서의 국소 농도가 0.05㎍/ml 이상, 바람직하게는 0.1㎍/ml 이상, 가장 바람직하게는 0.2㎍/ml 이상이 되도록 하는 양으로 투여된다. 결장에서의 바람직한 국소 농도는 약 0.05㎍/ml 내지 약 20㎍/ml, 더욱 바람직하게는 약 0.1㎍/ml 내지 약 10㎍/ml, 더욱 바람직하게는 약 0.2㎍/ml 내지 약 5㎍/ml 범위이다.
바람직하게는, 비타민 K는 결장에서의 국소 농도가 0.01mg/ml 이상, 바람직하게는 0.03mg/ml 이상, 가장 바람직하게는 0.04mg/ml 이상이 되도록 하는 양으로 투여된다. 결장에서의 바람직한 국소 농도는 약 0.01mg/ml 내지 약 5mg/ml, 보다 바람직하게는 약 0.03mg/ml 내지 약 1mg/ml, 가장 바람직하게는 약 0.05mg/ml 내지 약 0.5mg/ml이다.
바람직하게는, 엽산은 결장에서의 국소 농도가 0.1㎍/ml 이상, 바람직하게는 0.5㎍/ml 이상, 가장 바람직하게는 1㎍/ml 이상이 되도록 하는 양으로 투여된다. 결장에서의 바람직한 국소 농도는 약 0.1㎍/ml 내지 약 20㎍/ml, 더욱 바람직하게는 약 0.5㎍/ml 내지 약 15㎍/ml, 가장 바람직하게는 약 1㎍/ml 내지 약 10㎍/ml이다.
바람직하게는, β-카로틴은 결장에서의 국소 농도가 적어도 5㎍/ml, 바람직하게는 적어도 40㎍/ml, 가장 바람직하게는 적어도 100㎍/ml가 되도록 하는 양으로 투여된다. 결장에서의 바람직한 국소 농도는 약 5㎍/ml 내지 약 20mg/ml, 더욱 바람직하게는 약 40㎍/ml 내지 약 10mg/ml, 가장 바람직하게는 약 100㎍/ml 내지 약 5mg/ml이다.
바람직하게는, 비타민 B1은 결장에서의 국소 농도가 1㎍/ml 이상, 바람직하게는 10㎍/ml 이상, 가장 바람직하게는 20㎍/ml 이상이 되도록 하는 양으로 투여된다. 결장에서의 바람직한 국소 농도는 약 1㎍/ml 내지 약 10mg/ml, 보다 바람직하게는 약 10㎍/ml 내지 약 5mg/ml, 가장 바람직하게는 약 20㎍/ml 내지 약 1mg/ml이다.
바람직하게는, 니아신은 결장에서의 국소 농도가 0.5㎍/ml 이상, 바람직하게는 1㎍/ml 이상, 가장 바람직하게는 2㎍/ml 이상 또는 3㎍/ml 이상이 되도록 하는 양으로 투여된다. 결장에서의 바람직한 국소 농도는 약 0.5㎍/ml 내지 약 1mg/ml, 보다 바람직하게는 약 1㎍/ml 내지 약 500㎍/ml, 가장 바람직하게는 약 2㎍/ml 내지 약 100㎍/ml의 범위이다. 니아신이 투여되는 경우, 이는 유일한 활성제가 아니다.
바람직하게는, 비타민 B5는 결장에서의 국소 농도가 0.05mg/ml 이상, 바람직하게는 0.1mg/ml 이상, 가장 바람직하게는 0.4mg/ml 이상이 되도록 하는 양으로 투여된다. 결장에서의 바람직한 국소 농도는 약 0.05mg/ml 내지 약 100mg/ml, 보다 바람직하게는 약 0.1mg/ml 내지 약 50mg/ml, 가장 바람직하게는 약 0.4mg/ml 내지 약 20mg/ml이다.
바람직하게는, 비타민 B6은 결장에서의 국소 농도가 적어도 1㎍/ml, 바람직하게는 적어도 5㎍/ml, 가장 바람직하게는 적어도 10㎍/ml가 되도록 하는 양으로 투여된다. 결장에서의 바람직한 국소 농도는 약 1㎍/ml 내지 약 3mg/ml, 보다 바람직하게는 약 5㎍/ml 내지 약 1mg/ml, 가장 바람직하게는 약 10㎍/ml 내지 약 500㎍/ml이다.
바람직하게는, 비오틴은 결장에서의 국소 농도가 1㎍/ml 이상, 바람직하게는 2㎍/ml 이상, 가장 바람직하게는 4㎍/ml 이상이 되도록 하는 양으로 투여된다. 결장에서의 바람직한 국소 농도는 약 1㎍/ml 내지 약 1mg/ml, 보다 바람직하게는 약 2㎍/ml 내지 약 500㎍/ml, 가장 바람직하게는 약 4㎍/ml 내지 약 200㎍/ml 범위이다.
바람직하게는, 비타민 B12는 결장에서의 국소 농도가 0.01㎍/ml 이상, 바람직하게는 0.03㎍/ml 이상, 가장 바람직하게는 0.05㎍/ml 이상이 되도록 하는 양으로 투여된다. 결장에서의 바람직한 국소 농도는 약 0.01㎍/ml 내지 약 10㎍/ml, 더욱 바람직하게는 약 0.03㎍/ml 내지 약 5㎍/ml, 가장 바람직하게는 약 0.05㎍/ml 내지 약 2㎍/ml 범위이다.
바람직하게는, 오메가-3 지방산은 결장에서의 국소 농도가 0.02mg/ml 이상, 바람직하게는 0.05mg/ml 이상, 가장 바람직하게는 0.1mg/ml 이상이 되도록 하는 양으로 투여된다. 결장에서의 바람직한 국소 농도는 약 0.02mg/ml 내지 약 2mg/ml, 보다 바람직하게는 약 0.05mg/ml 내지 약 1.5mg/ml, 가장 바람직하게는 약 0.1mg/ml 내지 약 1mg/ml이다. 다른 실시양태에서, 오메가-3 지방산은 결장에서의 국소 농도가 0.02mg/ml 이상, 바람직하게는 0.05mg/ml 이상, 가장 바람직하게는 0.1mg/ml 이상이 되도록 하는 양으로 투여된다. 결장에서의 바람직한 국소 농도는 약 0.02mg/ml 내지 약 100mg/ml, 보다 바람직하게는 약 0.05mg/ml 내지 약 75mg/ml, 가장 바람직하게는 약 0.1mg/ml 내지 약 60mg/ml이다. 다른 실시양태에서, 활성제는 체중 1kg당 최대 2.9mg의 리보플라빈, 체중 1kg당 최대 42.9μg의 비타민 A, 체중 1kg당 최대 3.6μg의 비타민 D, 체중 1kg당 최대 28.6mg의 비타민 C, 체중 1kg당 최대 14.3mg의 비타민 E, 체중 1kg당 최대 143μg의 비타민 K, 체중 1kg당 최대 14.3μg의 엽산, 최대 0.4mg의 β-카로틴, 최대 1.4mg의 비타민 B1, 최대 21.4mg의 니아신, 최대 14.3mg의 비타민 B5, 최대 1.4mg의 비타민 B6, 최대 35.7μg의 비오틴, 최대 43μg의 비타민 B12, 체중 1kg당 71.4mg의 오메가-3 지방산(들) 또는 이들의 조합의 1일 투여량으로 포유동물에게 투여되고, 이 때 바람직하게는, EPA는 체중 1kg당 최대 25.7mg이고 DHA는 체중 1kg당 최대 14.3mg이다.
또 다른 실시양태는 활성제와 장용성 층 또는 장용성 껍질을 포함하는, 활성제를 장에 전달하기 위한 지연 방출 제형이며, 이 때 상기 활성제는 최대 200mg의 리보플라빈, 최대 3000μg의 비타민 A, 최대 2000mg의 비타민 C, 최대 250μg의 비타민 D, 최대 1000mg의 비타민 E, 최대 10mg의 비타민 K, 최대 1mg의 엽산, 최대 25mg의 β-카로틴, 최대 100mg의 비타민 B1, 최대 1500mg의 니아신, 최대 1000mg의 비타민 B5, 최대 100mg의 비타민 B6, 최대 2500μg의 비오틴, 최대 3000μg의 비타민 B12, 최대 5000mg의 오메가-3 지방산(들) 또는 이들의 조합으로 이루어지고, 이 때 바람직하게는, EPA는 최대 1800mg이고 DHA는 최대 1000mg이며, 활성제의 방출은 장까지 지연된다.
또 다른 실시양태는 활성제 및 장용성 층 또는 장용성 껍질을 포함하는, 활성제를 장에 전달하기 위한 지연 방출 제형이며, 여기서 상기 활성제는 1 내지 85mg 리보플라빈, 0.2 내지 0.4mg 비타민 A, 400 내지 600mg 비타민 C, 5 내지 80μg 비타민 D, 80 내지 120mg 비타민 E, 80 내지 140μg 비타민 K, 0.3 내지 0.5mg 엽산, 80 내지 120mg 오메가-3 지방산(들) 또는 이들의 조합으로 이루어지고, 이 때 활성제의 방출은 장까지 지연된다.
또 다른 실시양태는 상기 활성제가 70 내지 80mg 리보플라빈, 0.25 내지 0.35mg 비타민 A, 450 내지 550mg 비타민 C, 15 내지 25μg 비타민 D, 90 내지 110mg 비타민 E, 100 내지 120μg 비타민 K, 0.35 내지 0.45mg 엽산, 90 내지 110mg 오메가-3 지방산(들) 또는 이들의 조합으로 이루어진 지연 방출 제형이다.
한 실시양태에서, 리보플라빈은 유일한 활성제로서 투여된다.
다른 실시양태에서, 비타민 A는 유일한 활성제로서 투여된다.
다른 실시양태에서, 비타민 C는 유일한 활성제로서 투여된다.
다른 실시양태에서, 비타민 D는 유일한 활성제로서 투여된다.
다른 실시양태에서, 비타민 E는 유일한 활성제로서 투여된다.
다른 실시양태에서, 비타민 K는 유일한 활성제로서 투여된다.
다른 실시양태에서, 오메가-3-지방산(들)은 유일한 활성제로서 투여된다.
한 실시양태에서, 엽산은 유일한 활성제로서 투여된다.
다른 실시양태에서, β-카로틴은 유일한 활성제로서 투여된다.
다른 실시양태에서, 비타민 B1은 유일한 활성제로서 투여된다.
다른 실시양태에서, 비타민 B5는 유일한 활성제로서 투여된다.
또 다른 실시양태에서, 비타민 B6은 유일한 활성제로서 투여된다.
다른 실시양태에서, 비오틴은 유일한 활성제로서 투여된다.
다른 실시양태에서, 비타민 B12는 유일한 활성제로서 투여된다.
다른 실시양태에서, DHA는 유일한 활성제로서 투여된다.
또 다른 실시양태에서, EPA는 유일한 활성제로서 투여된다.
다른 실시양태에서, EPA 및 DHA는 유일한 활성제로서 투여된다.
다른 실시양태에서, 활성제는 리보플라빈, 비타민 A, 비타민 D, 비타민 E, 비타민 K, 엽산, EPA 및 DHA의 조합으로 구성된다. 또 다른 실시양태에서, 활성제는 리보플라빈, 비타민 A, 비타민 C, 비타민 D, 비타민 E, 비타민 K, 엽산, EPA 및 DHA의 조합으로 구성된다. 또 다른 실시양태에서, 활성제는 리보플라빈, 비타민 A, 비타민 C, 비타민 D, 비타민 E, 비타민 K, 엽산, β-카로틴, 비타민 B1, 니아신, 비타민 B5, 비타민 B6, 비오틴, 비타민 B12, EPA 및 DHA의 조합으로 구성된다.
한 실시양태에서, 본 발명의 지연 방출 제형은 1일 1회 투여된다. 다른 실시양태에서, 제형은 1일 2회 또는 2일마다 1회씩 투여된다.
한 실시양태에서, 활성제는 포유동물에게 투여된다. 포유동물은 말, 소, 돼지, 개 또는 고양이일 수 있다. 보다 바람직하게는, 포유동물은 인간, 예를 들어 성인 인간이다. 한 실시양태에서, 성인 인간은 적어도 20, 또는 적어도 25, 또는 심지어 적어도 30의 체질량 지수(BMI)를 갖는다. 예를 들어, BMI는 25 내지 35, 또는 26 내지 34, 또는 27 내지 33, 또는 28 내지 32 범위이다.
치료 또는 예방되는 질환
본 발명의 제 1 양태에 따르면, 활성제는 하나 이상의 SCFA(들)의 농도를 증가시키기 위해 투여된다. 따라서, 결장에서 손상된 SCFA 수준과 관련된 임의의 질환을 치료하거나 예방할 수 있다. SCFA의 수준이 건강한 개인의 수준에 비해 현저히, 예를 들어 10% 이상, 20% 이상 또는 30% 이상까지 감소되면 이는 손상된 것이다. 결장에서의 농도에 대한 척도로서 배설물 농도를 취할 수 있다.
본 발명에 따라 치료 또는 예방되는 질환은 염증 상태, 염증, 특히 만성 염증을 특징으로 하는 장애, 및 죽종 형성을 포함한다. 또한 제 2 형 당뇨병이나 비만과 같은 대사 장애를 치료하거나 예방하거나 개선할 수 있다. 또한 면역력 약화 나 알레르기도 치료할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 장에서 장벽 기능을 개선하거나 강화하기 위해 활성제가 투여된다. 한 실시양태에서는, 소장의 장벽 기능이 개선되거나 강화된다. 다른 실시양태에서는, 대장의 장벽 기능이 개선되거나 강화된다. 다른 실시양태에서는, 결장의 장벽 기능이 개선되거나 강화된다. 따라서, 증가된 장 투과성과 관련된 임의의 질환 또는 장애가 치료, 개선 또는 예방될 수 있다. 치료되는 질환은 장 투과성 증가를 특징으로 하는 장애, 장 병증(예: 환경 장 병증, 영양 실조로 인한 장 병증), 염증성 장 질환(예: 크론병 또는 궤양성 대장염) 및 과민성 대장 증후군을 포함하지만, 이들로 한정되지는 않는다.
장 장벽 기능의 완전성은 모델 시스템에서 초기 경상피 전기 저항(TEER)을 측정하여 결정할 수 있다(실시예 참조). 다르게는, 장의 장벽 기능의 완전성은 정단부에서 기저측부 구획으로의 루시퍼 옐로우의 수송을 측정하여 결정할 수 있다(실시예 참조). 인간의 경우 장 투과성은 세균성 지질 다당류 또는 지질 다당류 코어 부분에 대한 항체의 순환 농도를 결정하여 간접적으로 측정하거나, 이중 당 흡수 시험을 통해 직접 측정할 수 있다[도쇼(Dorshow) 등, Scientific Reports volume 7, Article number: 10888 (2017)]. 예를 들어, 이중 당 섭취 후 소변의 락툴로오스:만니톨 비를 결정할 수 있다. 다르게는, 혈액 알파-1 항트립신; 마이엘로퍼옥시다제 및/또는 REG1B 단백질을 결정할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 대장 발효 동안 가스 생성을 감소시켜 장의 건강을 개선하고 팽만감을 줄이며 잠재적으로 섬유 및 프리바이오틱 치료에 대한 순응도를 높이는 것이다.
제형
본 명세서에서 사용된 "지연 방출"은 투여 직후보다 늦은 시점에서의 활성제의 방출을 의미한다. 바람직하게는, "지연 방출"은 경구 투여시 즉시 방출 제형에 비해 지연된 방식으로 대장에 활성제를 전달함을 의미한다.
"장용성 층"은 코어를 둘러싸는 층으로서, 코어는 활성제를 포함하고 층은 위액에 대한 내성을 부여한다. "장용성 껍질"은 활성제를 둘러싸거나 캡슐화하는 껍질 또는 매트릭스이며, 껍질은 위액에 대한 내성을 부여한다. 다르게는, 매트릭스 기반 전달 시스템을 사용할 수 있다. 매트릭스 기반 시스템은 코팅 물질의 개별 층을 갖지 않지만, 활성제가 매트릭스 내에 다소 균일하게 분포되어 있다. 또한, 활성제가 예컨대 섬유 매트릭스(효소-유발됨)에 매립되고 장용성 코팅이 위에 있는 결장-방출 시스템이 있다.
인간에 대한 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 제형은 경구 투여를 위한 고체 투여 형태이다. 제형은 캡슐, 펠렛, 비드, 구, 미니 구, 정제, 미니 정제 또는 과립의 형태일 수 있으며, 임의적으로는 소장 이전에, 바람직하게는 결장 이전에 활성제의 방출을 방지하는 지연 방출 코팅 또는 껍질로 코팅된다.
경구 투여시 활성제의 지연 방출, 특히 회장 또는 대장에서 표적 방출을 위한 코팅, 껍질 또는 매트릭스 물질은 당 업계에 공지되어 있다. 이들은 특정 pH 이상에서 붕해되는 코팅 물질, 위장관에서 특정 체류 시간이 지나면 붕해되는 코팅 물질, 및 장의 특정 부위의 미생물에 특이적인 효소 유발 요인으로 인해 붕해되는 코팅 물질로 세분화될 수 있다. 상이한 카테고리의 코팅 또는 껍질 물질이 일반적으로 조합되어 사용된다. 대장을 표적으로 하기 위한 이 세 가지 상이한 카테고리의 코팅 또는 껍질 물질은 예를 들어 반살(Bansal) 등의 문헌(Polim. Med. 2014, 44, 2,109-118)에서 검토된 바 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, 지연 방출 코팅은 pH-의존적으로 붕해되는 코팅 물질, 시간-의존적으로 붕해되는 코팅 물질, 장내 환경(예를 들어, 회장 및 대장의 장내 환경)에서 효소 유발 요인으로 인해 붕해되는 코팅 물질 및 이들의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 성분을 포함한다.
pH-의존적으로 붕해되는 코팅 물질로는 폴리비닐 아세테이트 프탈레이트, 셀룰로오스 아세테이트 트리멜리테이트, 하이드록시프로필 메틸셀룰로오스 프탈레이트 HP-50, HP-55 또는 HP-55S, 셀룰로오스 아세테이트 프탈레이트, 셸락, 하이드록시프로필 메틸셀룰로오스 아세테이트 석시네이트(HPMCAS), 폴리(메타크릴산, 에틸아크릴레이트) 1:1 [유드라짓(Eudragit)® L100-55, 유드라짓® L30D-55], 폴리(메타크릴산, 메틸 메타크릴레이트) 1:1 (유드라짓® L-100, 유드라짓® L12.5), 폴리(메타크릴산, 메틸 메타크릴레이트) 1:2 (유드라짓® S-100, 유드라짓® S12,5 및 유드라짓® FS30D)를 포함한다.
시간-의존적으로 붕해되는 코팅 물질로는 유드라짓® RL, 유드라짓®RS 및 에틸셀룰로오스가 있다.
대장 환경에서 효소 유발 요인으로 인해 붕해되는 코팅 물질은 콘드로이틴 설페이트, 펙틴, 구아 검, 키토산, 이눌린, 락툴로오스, 라피노오스, 스타키오스, 알기네이트, 덱스트란, 잔탄 검, 로커스트 빈 검, 아라비노갈락탄, 사이클로덱스트린, 풀루란, 카라기난, 스클레로글루칸, 키틴, 커둘란, 레반, 아밀로펙틴, 전분, 아밀로오스, 저항성 전분 및 아조 결합을 파괴하는 세균에 의해 분해되는 아조 화합물을 포함한다.
한 실시양태에서 제형은 활성제를 포함하는 조성물로 채워진 장용성 캡슐을 포함한다. 장용성 캡슐은 위의 산성 환경에 대한 내성을 부여한다. 예를 들어, 소프트젤 제형은 활성제를 용액으로 전달하면서도 고체 투여 형태의 이점을 제공할 수 있다. 소프트젤 캡슐은 물에 쉽게 용해되지 않는 소수성 활성제에 특히 적합하다. 비타민 K 및 오메가-3 지방산은 바람직하게는 소프트젤 캡슐로 제조된다.
또 다른 실시양태에서, 제형은 (i) 활성제를 포함하는 코어, 및 (ii) 장용성 코팅과 같은 지연 방출 코팅을 포함하는 정제이다. 이는 하드젤 캡슐일 수 있다.
약물 방출은 소장까지 지연될 수 있다. 다른 실시양태에서, 약물의 방출은 원위 소장까지 지연된다. 또 다른 실시양태에서, 약물의 방출은 결장까지 지연된다.
예를 들어, 하나의 제형은 활성제 및 장용성 층 또는 장용성 껍질을 포함할 수 있으며, 여기서 활성제는 최대 200mg 리보플라빈, 최대 3000μg 비타민 A, 최대 2000mg 비타민 C, 최대 250μg 비타민 D, 최대 1000mg 비타민 E, 최대 10mg 비타민 K, 최대 1mg 엽산, 최대 25mg β-카로틴, 최대 100mg 비타민 B1, 최대 1500mg 니아신, 최대 1000mg 비타민 B5, 최대 100mg 비타민 B6, 최대 2500μg 비오틴, 최대 3000μg 비타민 B12, 최대 5000mg 오메가-3 지방산(들) 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 EPA는 최대 1800mg이고 DHA는 최대 1000mg이며, 활성제의 방출은 장까지 지연된다.
본 발명의 또 다른 양태는 장 장애 또는 병리학적 상태를 앓지 않는 포유동물의 장에서 하나 이상의 단쇄 지방산 또는 이의 염의 농도를 증가시키기 위한, 리보플라빈, 비타민 A, 비타민 C, 비타민 D, 비타민 E, 비타민 K, 엽산, β-카로틴, 비타민 B1, 니아신, 비타민 B5, 비타민 B6, 비오틴, 비타민 B12, 오메가-3 지방산 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 활성제의 비-치료적 용도이되, 니아신이 활성제인 경우 이는 유일한 활성제가 아니다. 포유동물는 바람직하게는 건강한 인간이다.
본 발명의 또 다른 양태는 건강한 포유동물, 바람직하게는 건강한 인간의 장 기능을 유지 또는 개선하기 위한, 리보플라빈, 비타민 A, 비타민 C, 비타민 D, 비타민 E, 비타민 K, 엽산, β-카로틴, 비타민 B1, 니아신, 비타민 B5, 비타민 B6, 비오틴, 비타민 B12, 오메가-3 지방산 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 활성제의 비-치료적 용도이되, 니아신이 활성제인 경우 이는 유일한 활성제가 아니다.
본 발명의 한 가지 고려 사항은 사용되는 활성제가 포유동물 수용자에게 영양을 제공하고자 의도된 것이 아니며, 오히려 그들은 대장 미생물 개체군에 직접적으로 혜택을 주어 간접적으로 포유동물에게 혜택을 주고자 의도되었다는 것이다. 따라서, 투여량은 포유동물의 식단의 일부인 비타민, 지방산 및 기타 영양소의 정상적인 일일 소비량에 추가되는 것을 의미한다. 따라서, 위장 및 바람직하게는 소장에서 흡수를 우회함으로써 미생물 개체군에 영양을 공급하고 장 장벽을 손상시키지 않고 최적의 성능을 유지할 수 있다. 따라서, 본 발명의 제형은 건강한 장을 유지하는데 도움이 된다.
본 발명자들은 또한 전반적인 소화에 대한 유익한 효과를 관찰하였다. 실시예에 나타난 바와 같이, 비타민 B2를 보충한 돼지는 보충되지 않은 돼지에 비해 펩신-HCl에서 배양된 기질(사료 또는 돼지 위 내용물)에서 더 높은 DM 소화율을 나타냈다. 이는 놀라운 일이었고 분명히 위장 기능에 대한 긍정적인 효과이다. 또한 본 발명자들은 돼지의 맹장 내용물을 사용하여 대장 발효에 유익한 효과, 즉 메탄 생성 감소를 관찰하였다. 이론에 얽매이고 싶지는 않지만, 본 발명자들은 비타민 B2가 메탄 생성 세균 또는 고세균 개체군의 활동을 감소시켜 결과적으로 환경에 긍정적인 영향을 미칠 수 있다는 사실에 의해 이를 설명할 수 있다고 생각한다.
실시예
실시예 1
물질 및 방법
공여자 및 샘플 준비
장 회분 발효 배양 시작시 시험관내 실험의 제 1 세트에서는, (g/l): 2.5 K2HPO4, 10.9 KH2PO4, 2 NaHCO3, 2 효모 추출물, 2 펩톤, 1 뮤신, 0.5 시스테인, 2 트윈(Tween) 80, 2 글루코오스, 2 전분, 2 셀로비오스, 0.1 NaCl, 0.01 MgSO4.7H2O, 0.01 CaCl2.6H2O, 0.05 헤민, 0.5개 담즙 염을 함유하는 개질된 영양 배지에 모든 시험 성분을 모용액으로부터 첨가하였다.
물에서 준비된 모용액으로부터 다음 화합물을 첨가하였다:
● 리보플라빈 테이블 등급(약어 RTG),
● 리보플라빈-5-포스페이트(R5P),
● 아스코르브산 과립 분말(AA),
● 건조 비타민 E 50 CWS-S(E 50 CWS-S),
● 건조 비타민 D3 100 CWS(D3 100 CWS),
● 건조 비타민 A 아세테이트 325 CWS/A,
● 리보플라빈 테이블 등급+아스코르브산,
● 엽산.
다른 화합물은 에탄올에서 제조하였다:
● 비타민 K1(VK1),
● MEG-3 0080 EE 오일(MEG-3 0080 EE),
● MEG-3 4535 EE 오일(MEG-3 4535 EE),
● MEG-3 8000 EE 오일(MEG-3 8000 EE).
각 화합물은 세 가지 다른 농도에서 시험되었으며; 개요는 표 1에 나와 있다. 에탄올은 항균 효과가 있는 것으로 알려져 있으므로, 각 유형의 모용액에 대해 두개의 블랭크를 포함시켰다. 미생물 군집의 공급원으로서 선택된 공여자로부터 새로 준비된 배설물 현탁액을 반응기에 첨가하였다. 각 반응기의 부피는 70ml이다. 블랭크를 제외한 모든 시험은 표 1에 명시된 바와 같이 단일 반복으로 수행되어 40개의 독립적인 배양액을 생성시켰다. 사전 스크리닝 실험 및 최종 실험의 배양 조건은 37℃, 진탕(90rpm) 하에서, 혐기성 조건에서, 48시간이었다. DNA는 발효 전(0시간 발효) 및 발효 후(24시간 발효)에 각 발효 플라스크에서 수집한 유출물 샘플에서 추출하였고, 샷건(Shotgun) 시퀀싱에 의한 미생물총 구성 분석에 사용하였다. 유출물 샘플은 각 발효 플라스크에서 발효 전(0시간 발효) 및 발효 후(48시간 발효)에 수집하고, 0.22μm 필터를 통해 여과하여 멸균하고, 단쇄 지방산(SCFA), 면역학적 바이오마커 정량화 및 세포 배양 시스템의 시험관내 분석에 사용하였다.
최종 실험의 실험 설정
미량영양소 DSM 제품 투여량 명칭 반응기중 DSM 제품의 최종 농도(mg/ml) 반응기중 미량영양소의 최종 농도
1 비타민 B2 리보플라빈 테이블 등급(RTG)
 0.2× 0.06mg/ml 0.06 mg/ml
2 1× 0.29mg/ml 0.29 mg/ml
3 5× 1.43mg/ml 1.43 mg/ml
4 비타민 B2 포스페이트 리보플라빈-5-포스페이트(R5P) 0.2× 0.06mg/ml 0.06 mg/ml
5 1× 0.29mg/ml 0.29 mg/ml
6 5× 1.43mg/ml 1.43 mg/ml
7 비타민 C 아스코르브산 과립상 분말(AA) 0.2× 0.43mg/ml 0.43 mg/ml
8 1× 2.14mg/ml 2.14 mg/ml
9 5× 10.71mg/ml 10.71 mg/ml
10 비타민 E 건조 비타민 E 50 CWS-S (E 50 CWS-S) 0.2× 0.14mg/ml 0.07 mg/ml2
11 1× 0.71mg/ml 0.36 mg/ml2
12 5× 3.57mg/ml 1.79 mg/ml2
13 비타민 D3 건조 비타민 D3 100 CWS (D3 100 CWS) 0.2× 0.02mg/ml 0.04 ㎍/ml
14 1× 0.09mg/ml 0.21 ㎍/ml
15 5× 0.43mg/ml 1.07 ㎍/ml
16 비타민 A 건조 비타민 A 아세테이트 325 CWS/A (325 CWS/S) 0.2× 1.57㎍/ml 0.18 ㎍/ml1
17 1× 7.86㎍/ml 0.90 ㎍/ml1
18 5× 39.29㎍/ml 4.52 ㎍/ml1
19 비타민 B2+비타민 C 리보플라빈 TG+아스코르브산 (RTG+AA) 0.2× 0.06mg/ml RTG
0.43mg/ml AA		 0.06mg/ml RTG
0.43mg/ml AA
20 1× 0.29mg/ml RTG
2.14mg/ml AA		 0.29mg/ml RTG
2.14mg/ml AA
21 5× 1.43mg/ml RTG
10.71mg/ml AA		 1.43mg/ml RTG
10.71mg/ml AA
22 엽산 엽산(FA) 0.2× 0.29㎍/ml 0.29 ㎍/ml
23 1× 1.43㎍/ml 1.43 ㎍/ml
24 5× 7.14㎍/ml 7.14 ㎍/ml
25 비타민 K1 비타민 K1 (VK1) 0.2× 0.01mg/ml 0.01 mg/ml
26 1× 0.04mg/ml 0.04 mg/ml
27 5× 0.18mg/ml 0.18 mg/ml
28 DHA MEG-3® 0080 EE 오일 (0080 EE) 0.2× 0.14mg/ml 0.11 mg/ml
29 1× 0.71mg/ml 0.54 mg/ml
30 5× 3.57mg/ml 2.68 mg/ml
31 DHA+EPA MEG-3® 4535 EE 오일 (4535 EE) 0.2× 2.86mg/ml 1.22+0.90 mg/ml
32 1× 14.29mg/ml 6.14+4.57 mg/ml
33 5× 71.43mg/ml 30.71+22.85 mg/ml
34 EPA MEG-3® 8000 EE 오일 (8000 EE) 0.2× 1.71mg/ml 1.29 mg/ml
35 1× 8.57mg/ml 6.43 mg/ml
36 5× 42.86mg/ml 32.14 mg/ml
1: 레티놀 등가물
2: 알파-토코페롤 등가물
시험관내 실험의 제 2 세트에서는, 단기 결장 배양 시작시, 시험 성분을 결장에 존재하는 기초 영양소(예: 뮤신과 같은 숙주-유래 글리칸)를 함유하는 영양 배지에 첨가하였다. 제품당 세 가지 투여량을 시험하였다. 이 특정 프로젝트에 사용된 영양 배지를 다시 NaCl, MgSO4, CaCl2, 헤민 및 담즙 염과 탄소원 글루코오스, 전분 및 셀로비오스로 보충하였다. 제품 배양에 사용된 것과 동일한 영양 배지를 포함하지만 제품을 추가하지 않은 블랭크를 각 공여자에 대해 포함시켰다. 이를 통해 영양 배지에서 화합물의 발효로 인해 발생하는 세균 군집의 배경 활동을 평가할 수 있다. 결장 미생물총의 공급원으로 건강한 성인 2명의 배설물 접종물을 추가하였다. 37℃에서, 진탕하에(90rpm) 및 혐기성 조건에서 48시간 동안 배양을 수행하였으며, 빛으로부터 보호하였다. 다음 화합물을 시험하였다:
● 티아민 하이드로클로라이드
● β-카로틴 10% CWS/S
● 니아신아미드 PC
● D-판토텐산칼슘
● 피리독신 하이드로클로라이드
● D-비오틴
● 비타민 B12 결정.
각 화합물을 세 가지 상이한 농도에서 시험하였으며; 개요는 아래 표 2에 나와 있다.
두 번째 실험 결과
비타민 DSM 제품 투여량 명칭 반응기중 DSM 제품의 최종 농도(1ml당) 반응기에 첨가된 비타민의 최종 농도
1 β-카로틴 β-카로틴 10% CWS/S
 0.2× 0.48mg 0.048 mg/ml
2 1× 2.40mg 0.24 mg/ml
3 5× 12.00mg 1.20 mg/ml
4 B1 티아민 하이드로클로라이드 0.2× 0.02mg 0.02 mg/ml
5 1× 0.11mg 0.11 mg/ml
6 5× 0.56mg 0.56 mg/ml
7 B3 니아신아미드 PC 0.2× 0.003mg 0.003 mg/ml
8 1× 0.01mg 0.01 mg/ml
9 5× 0.07mg 0.07 mg/ml
10 B5 D-판토텐산칼슘 0.2× 0.45mg 0.45 mg/ml
11 1× 2.25mg 2.25 mg/ml
12 5× 11.25mg 11.25 mg/ml
13 B6 피리독신 하이드로클로라이드 0.2× 0.01mg 0.01 mg/ml
14 1× 0.06mg 0.06 mg/ml
15 5× 0.31mg 0.31 mg/ml
16 B7 D-비오틴 0.2× 5.00mcg 5.00 mcg/ml
17 1× 25.00mcg 25.00 mcg/ml
18 5× 125.00mcg 125.00 mcg/ml
19 B12 비타민 B12 결정 0.2× 0.06mcg 0.06 mcg/ml
20 1× 0.30mcg 0.30 mcg/ml
21 5× 1.50mcg 1.50 mcg/ml
단쇄 지방산
단쇄 지방산(SCFA)은 미생물 탄수화물 대사(아세테이트, 프로피오네이트 및 부티레이트) 또는 단백질 대사(분지형 SCFA)의 척도이며 정상적인 GI 미생물총의 일반적인 발효 패턴과 비교될 수 있다. 위의 두 세트의 시험관내 실험에 있어서 0, 6, 24 및 48시간의 배양 후에 SCFA 분석을 위한 샘플을 분석하였다.
내부 표준으로 2-메틸 헥산산을 첨가한 후, 디에틸 에테르로 샘플에서 SCFA를 추출하였다. 모세관 무-지방산 EC-1000Econo-Cap 컬럼(치수: 25mm×0.53mm, 필름 두께 1.2mM; 알테크(Alltech), 벨기에 라르네), 불꽃 이온화 검출기 및 분할 인젝터가 장착된 GC-2014 가스 크로마토그래프[시마즈(Shimadzu), 네덜란드 's-헤르토겐보쉬]를 사용하여 추출물을 분석하였다. 주입 부피는 1mL였고, 온도 프로파일은 110℃에서 160℃로 설정하였으며, 온도를 1분당 6℃ 증가시켰다. 운반 가스는 질소였고, 주입기와 검출기의 온도는 각각 100℃와 220℃였다. 각각 아세테이트, 프로피오네이트, 부티레이트, 발레레이트 및 카프로에이트의 몰 농도를 합하고, 이소부티레이트, 이소발레레이트 및 이소카프로에이트 몰 농도를 합산하여, 비-분지형 및 분지형 SCFA의 생산을 계산하였다. 총 SCFA 생산은 비-분지형 SCFA와 분지형 SCFA의 합으로 정의되었다.
세포 배양
Caco-2 및 HT29-MTX-E12 세포의 공동 배양액을 이용하여, 두 세트의 시험관내 실험에 대해 발효 전(0시간) 및 발효 후(48시간) 상청액의 보호 효과를 평가하였다.
CaCo-2 ECACC 86010202 및 HT29-MTX-E12 ECACC 12040401 세포(모두 European Collection of Cell Cultures에서, 영국 살리스베리)를, 4.5g/L D-글루코오스, 4mM L-글루타민, 1mM 피루브산나트륨, 1% MEM 비-필수 아미노산, 50μg/mL 젠타마이신[라이프 테크놀로지즈 유럽 비.브이.(Life Technologies Europe B.V.), 스위스 주그] 및 10% 열-비활성화 FBS[시그마-알드리치(Sigma-Aldrich), 스위스 부흐스]로 보충된 DMEM 배지 중에서 37℃에서 5% CO2 대기중에서 배양하였다. 0.25% 트립신/EDTA(라이프 테크놀로지즈 유럽 비.브이., 스위스 주그)를 사용하여 서브-컨플루언트(Sub-confluent) 세포를 트립신화시키고, 1주일에 2회씩 1:5 내지 1:10의 비로 계대시켰다. 55 내지 85회 계대된 세포를 이 연구에 사용하였다.
코닝(Corning) HTS 트랜스웰(Transwell)-24 시스템 PET 막, 0.4μM 기공 크기, 세포 성장 면적 0.33cm2/웰[코닝 비브이(Corning BV), 네덜란드 암스테르담]에서 7:3의 비(Caco-2:HT29-MTX-E12)로 20000세포/웰의 밀도로 세포를 접종하였고, 위에서 설명한대로 배양하였다. 2일 내지 3일마다 배지를 바꾸어주었다.
건강한 장 모델에서 장벽 완전성 측정
두 세트의 시험관내 실험에 있어서, 세포를 13일동안 배양한 후, STX100 전극이 장착된 EVOM2 전압계[EVOM, 월드 프리시젼 인스트루먼츠(World Precision Instruments), 독일 베를린]를 사용하여 초기 경상피 전기 저항(TEER) 판독값을 얻었다. TEER 값은 컨플루언트 단일층의 단단함과 상관 관계가 있다[스리니바산(Srinivasan) 등 2015].
배경 TEER(삽입물)을 전체 TEER(세포 단일층+삽입물)에서 빼서 단일층 저항을 산출한 다음 삽입물의 면적과 곱하여 표면적에 대해 정규화하였다(스리니바산 등 2015). 단일층의 완전성은 TEER를 측정하여 기초 수준에서 결정되었다. 300Ωcm2의 TEER은 단단한 단일층으로 간주되었다(결과 섹션 참조). 그 후, 세포를 대조군으로서 멸균 여과된 발효 상청액 또는 발효 배지로 처리하였다(성장 배지에서 1:20 희석). 24시간 배양 후, 각 세포 단일층에 걸친 저항을 다시 측정하고 각 삽입물의 초기 TEER에 비해 TEER의 변화 백분율을 계산하여 건강한 장 모델을 나타내었다. 모든 TEER 측정은 삽입물이 포함된 플레이트를 37℃ 가온 플레이트에 배치하여 수행하였으며, 동일한 기간에 수행하였다.
장 누수 모델의 장벽 완전성 측정
두 세트의 시험관내 실험에 있어서, TEER 값에 의해, 또한 정단부에서 기저측부 구획으로의 루시퍼 옐로우의 수송을 측정함으로써, 스트레스 인자 시험 후 세포 단일층의 완전성을 평가하였다(장 누수 모델). 5.5mM D-(+)-글루코오스, 중탄산나트륨을 함유하고 4mM L-글루타민, 20mM HEPES(라이프 테크놀로지즈 유럽 비.브이., 스위스 주그)가 보충된, Ca2+ 및 Mg2+가 포함된 HBSS(Hank's Balanced Salt Solution) pH 7.4로 구성된 예열된 HBSS 수송 완충액을 모든 투과성 실험에 사용하였다. 삽입물을 저장소 트레이를 사용하여 HBSS로 두 번 헹구고, 100㎕ HBSS를 삽입물의 정단부 부위에 추가한 다음 새로운 HBSS가 있는 새로운 웰로 이동시키고, 배양기에서 60분 동안 37℃에서 평형화시킨 다음 TEER 측정을 수행하여 기준선 저항 판독값을 수득하였다.
루시퍼 옐로우 CH 이리튬 염(시그마-알드리치, 스위스 부흐스)을 HBSS에 최종 농도 100㎍/ml로 용해시켰다. 기저측부 스트레스 인자 EtOH[머크, 카가아(Merck, KgaA), 독일 다름스타트]를 HBSS에서 5%로 희석시켰다. 정단부 스트레스 인자 람노리피드 R90[AGAE 테크놀로지즈(Technologies), 미국 코발리스]을, 루시퍼 옐로우를 함유하는 HBSS에 350㎍/ml의 최종 농도로 용해시켰다. 모든 용액을 매번 신선하게 제조하였다.
기저측부 챔버로부터의 HBSS 수송 완충액을 먼저 흡인해낸 다음, 정단부 챔버로부터의 HBSS를 흡인해내고, 루시퍼 옐로우 용액으로 교체하였다. 정단부 스트레스 인자 시험을 위해, 350μg/ml 람노리피드를 포함하는 루시퍼 옐로우 용액 또는 대조군 웰용의 스트레스 인자가 없는 루시퍼 옐로우 용액을 정단부 구획에 로딩한 후, 블랭크 HBSS를 기저측부 챔버에 첨가하였다. 기저측부 스트레스 인자 시험을 위해, 루시퍼 옐로우 용액을 모든 웰의 정단부에 첨가하고, HBSS중 5% EtOH 또는 대조군 웰용의 블랭크 HBSS를 기저측부 구획에 넣었다.
37℃에서 3시간 배양한 후, TEER 값을 측정하여 세포 단일층의 투과성을 평가하였다. TEER 데이터는 초기 값의 백분율로 표시되었다.
TEER 측정 후, 100μl 분취량 샘플을 기저측부 부위에서 이중으로 추출하여, 수송된 루시퍼 옐로우의 양을 정량화하였다. 96-웰 형광 플레이트 판독기[스펙트라맥스(Spectramax) M5 씨리즈 다중-모드 마이크로플레이트 판독기, 몰레큘라 디바이시즈(Molecular Devices), 미국 캘리포니아주 써니베일]에서 형광 수준(420nm에서 여기 및 530nm에서 방출)을 측정하였다.
샷건 시퀀싱에 의한 미생물총 구성 분석
첫 번째 시험관내 실험 세트의 경우 비드-비팅(bead-beating) 단계의 추가 및 앞서 기재된 바와 같이[맥코맥(McCormack) 등, 2018] 용해 온도를 95℃로 증가시킨 것을 제외하고는, 제조업체의 지침에 따라 QIAamp DNA 스툴 미니키트[퀴아젠(Qiagen), 영국 크롤리]를 사용하여 연구 전반에 걸쳐 수집된 모든 샘플에서 총 DNA를 추출하였다.
DNA 단리 후, Qubit 고감도 DNA 어세이[써포 피셔(Thermo Fisher)]를 이용하여 DNA를 정량화하였다. 하기와 같이 수정한 제조업체의 지침에 따라 일루미나 넥스테라(Illumina Nextera) XT 키트[일루미나(Illumina)]를 사용하여 전체 메타게놈 라이브러리를 준비하였다: 첫째, 태그멘테이션(tagmentation) 시간을 7분으로 증가시키고; 둘째, 제품의 지수 혼입 및 앰퓨어(Ampure) 정제 후, 애질런트(Agilent) 고감도 칩(애질런트) 상에서 실행하여 샘플을 각각 개별적으로 사이징하고, Teagasc 시퀀싱 플랫폼(Sequencing Platform) SOP에 따라 Qubit 고감도 DNA 어세이(써모 피셔)를 이용하여 정량화하였다. 그런 다음, 샘플을 등몰로 풀링하고 NextSeq 500/550 v2 고출력 시약 키트(300회 사이클)를 사용하여 일루미나 NextSeq 500에서 시퀀싱하였다. 모든 시퀀싱은 표준 일루미나 시퀀싱 프로토콜에 따라 Teagasc 시퀀싱 설비에서 수행하였다.
전달된 미가공 FASTQ 서열 파일을 다음과 같이 품질 검사하였다: 불량한 품질 및 중복 판독 제거, 및 SAM과 피카드(Picard) 도구의 조합을 사용하여 트리밍을 구현하였다. 분류는 크라켄(Kraken) 소프트웨어를 사용하여 판독값에 할당되었고, 기능 분석은 슈퍼 포커스(Super focus)로 수행하였다.
두 번째 시험관내 실험 세트의 경우, 반드퓨트(Vandeputte) 등 (2017)에 따라 두 가지 기술을 조합하여, 상이한 처리에 의해 유도된 커뮤니티 이동을 매우 상세하게 맵핑하였다: 1) 16S-표적화된 일루미나 시퀀싱, PCR-기반 방법에 의해, 미생물 서열을 포화될 때까지 증폭시켜, 상이한 계통 발생 수준(미생물 문, 과 및 OTU 수준)에서 상이한 분류군의 비례 풍부도를 제공함. 2) 유세포 분석을 통한 샘플의 총 세균 세포의 정확한 정량화. 16S-표적화된 일루미나의 고해상도 계통 발생 정보와 유세포 분석을 통한 세포 수의 정확한 정량화를 결합하여, 반응기 내부의 상이한 분류학적 개체를 정량적으로 열거하였다.
HT29 세포 배양 및 면역학적 바이오마커의 정량화
두 세트의 시험관내 실험을 위해, 어메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection)(미국 버지니아주 마나사스)에서 HT29 세포를 얻었다. 10% 소 태아 혈청(FBS), 50유닛/ml 페니실린, 50μg/ml 스트렙토마이신, L-글루타민 및 비-필수 아미노산(라이프 테크놀로지즈 유럽 비.브이., 스위스 주그)이 보충된 DMEM에서 세포를 배양하였다. 세포를 웰당 8×105 세포로 12-웰 플레이트에 접종하고 2일의 예비 배양 후에 사용하였다. 처리 전 18시간 동안 0.25% FBS를 함유하는 DMEM에서 이 세포들을 굶겼다. 100ng/mL의 TNF-α 또는 멸균 여과되고 0.25% FBS를 함유하는 DMEM에서 1:20으로 희석된 발효 상청액으로 세포를 24시간 동안 처리하였다. 모든 처리는 3회 수행하였다. 결과적으로, 루미넥스 테크놀로지(Luminex Technology)[리퀴칩 웍스테이션(LiquiChip Workstation) IS 200, 퀴아젠, 독일 힐덴] 및 바이오-플렉스 프로 휴먼 사이토카인 패널 키트(Bio-Plex Pro Human Cytokine Panel kit)[바이오-라드(Bio-Rad), 미국 캘리포니아주 허큘레스] 또는 루미넥스 스크리닝 어세이 키트[R&D 시스템즈, 인코포레이티드(R&D Systems, Inc.), 미국 미네소타주 미네아폴리스]를 사용하여 제조업체의 지시에 따라 HT29 상청액에서 사이토카인, 케모카인 및 인터류킨을 정량하였다. 데이터는 루미넥스 IS 2.3 소프트웨어로 수집하였고 리퀴칩 분석기 소프트웨어(퀴아젠, 독일 힐덴)로 평가하였다.
가스 생산
두 세트의 시험관내 실험에 대해, 위에서 설명한 바와 같이 폐쇄 배양 시스템에서 결장 배양을 수행하였다. 이를 통해 압력계로 측정될 수 있는 헤드스페이스의 가스 축적을 평가할 수 있었다. 가스 생산은 미생물 활동의 척도이며, 따라서 잠재적인 프리바이오틱 기질의 발효 속도의 척도이다.
결과
도 1 내지 15에 도시된 첫 번째 실험 세트:
비타민과 오메가-3 지방산 투여시 48시간 발효 후 아세테이트 생산과 관련하여, 다음과 같은 관찰이 이루어졌다:
상응하는 대조군에 비해,
- 비타민 E를 1× 및 5× 투여량으로 보충하면 아세테이트 생산이 증가한다.
- 비타민 A를 1× 투여량으로 보충하면 아세테이트 생산이 증가한다.
- 비타민 B2+C를 1× 투여량으로 보충하면 아세테이트 생산이 증가한다.
- 엽산을 0.2×, 1× 및 5× 투여량으로 보충하면 아세테이트 생산이 증가한다.
- 비타민 K1을 0.2×, 1× 및 5× 투여량으로 보충하면 아세테이트 생산이 증가한다.
- DHA를 0.2×, 1× 및 5× 투여량으로 보충하면 아세테이트 생산이 증가한다.
- DHA+EPA를 0.2× 및 1× 투여량으로 보충하면 아세테이트 생산이 증가한다.
- EPA를 0.2× 및 1× 투여량으로 보충하면 아세테이트 생산이 증가한다.
비타민과 오메가-3 지방산 투여시 48시간 발효 후 프로피오네이트 생산과 관련하여, 다음과 같은 관찰이 이루어졌다:
상응하는 대조군에 비해,
- 비타민 E를 1× 투여량으로 보충하면 프로피오네이트 생산이 증가한다.
- 비타민 D를 1× 및 5× 투여량으로 보충하면 프로피오네이트 생산이 증가한다.
- 비타민 A를 0.2×, 1× 및 5× 투여량으로 보충하면 프로피오네이트 생산이 증가한다.
- 비타민 B2+C를 0.2× 투여량으로 보충하면 프로피오네이트 생산이 증가한다.
- 엽산을 0.2×, 1× 및 5× 투여량으로 보충하면 프로피오네이트 생산이 증가한다.
- 비타민 K1을 0.2×, 1× 및 5× 투여량으로 보충하면 프로피오네이트 생산이 증가한다.
- DHA를 0.2×, 1× 및 5× 투여량으로 보충하면 프로피오네이트 생산이 증가한다.
- DHA+EPA를 0.2×, 1× 및 5× 투여량으로 보충하면 프로피오네이트 생산이 증가한다.
- EPA를 0.2×, 1× 및 5× 투여량으로 보충하면 프로피오네이트 생산이 증가한다.
비타민과 오메가-3 지방산 투여시 48시간 발효 후 부티레이트 생산과 관련하여, 다음과 같은 관찰이 이루어졌다:
상응하는 대조군에 비해,
- 비타민 B2를 5× 투여량으로 보충하면 부티레이트 생산이 증가한다.
- 비타민 B2-5-포스페이트을 5× 투여량으로 보충하면 부티레이트 생산이 증가한다.
- 비타민 D를 0.2× 및 1× 투여량으로 보충하면 부티레이트 생산이 증가한다.
- 비타민 A를 0.2×, 1×, 5× 투여량으로 보충하면 부티레이트 생산이 증가한다.
- 엽산을 0.2×, 1× 및 5× 투여량으로 보충하면 부티레이트 생산이 증가한다.
- 비타민 K1을 0.2×, 1× 및 5× 투여량으로 보충하면 부티레이트 생산이 증가한다.
- DHA를 0.2×, 1× 및 5× 투여량으로 보충하면 부티레이트 생산이 증가한다.
- DHA+EPA를 0.2× 및 1× 투여량으로 보충하면 부티레이트 생산이 증가한다.
- EPA를 0.2×, 1× 및 5× 투여량으로 보충하면 부티레이트 생산이 증가한다.
비타민과 오메가-3 지방산 투여시 48시간 발효 후 총 SCFA 생산과 관련하여, 다음과 같은 관찰이 이루어졌다:
상응하는 대조군에 비해,
- 비타민 E를 1× 투여량으로 보충하면 총 SCFA 생산이 증가한다.
- 비타민 D를 1× 및 5× 투여량으로 보충하면 총 SCFA 생산이 증가한다.
- 비타민 A를 0.2× 및 5× 투여량으로 보충하면 총 SCFA 생산이 증가한다.
- 엽산을 0.2×, 1× 및 5× 투여량으로 보충하면 총 SCFA 생산이 증가한다.
- 비타민 K1을 0.2×, 1× 및 5× 투여량으로 보충하면 총 SCFA 생산이 증가한다.
- DHA를 0.2×, 1× 및 5× 투여량으로 보충하면 총 SCFA 생산이 증가한다.
- DHA+EPA를 0.2× 및 1× 투여량으로 보충하면 총 SCFA 생산이 증가한다.
- EPA를 0.2× 및 1× 투여량으로 보충하면 총 SCFA 생산이 증가한다.
건강한 장 세포 모델에서 0시간 발효 샘플로 처리된 세포의 TEER를 뺀 후 48시간 발효 샘플로 처리된 세포의 TEER 측정과 관련하여(도 6), 다음과 같은 관찰이 이루어졌다:
상응하는 대조군에 비해,
- 0.2× 투여량의 비타민 B2-5-포스페이트 발효 샘플로 처리된 세포는 TEER을 증가시킨다.
- 1× 투여량의 비타민 C 발효 샘플로 처리된 세포는 TEER을 증가시킨다.
- 1× 및 5× 투여량의 비타민 E 발효 샘플로 처리된 세포는 TEER을 증가시킨다.
- 0.2×, 1× 및 5× 투여량의 DHA+EPA 발효 샘플로 처리된 세포는 TEER을 증가시킨다.
- 0.2×, 1× 및 5× 투여량의 EPA 발효 샘플로 처리된 세포는 TEER을 증가시킨다.
장 누수 세포 모델의 기저측부 유도에서 0시간 발효 샘플로 처리된 세포의 TEER를 뺀 후 48시간 발효 샘플로 처리된 세포의 TEER 측정과 관련하여(도 7), 다음과 같은 관찰이 이루어졌다:
상응하는 대조군에 비해,
- 0.2× 투여량의 비타민 B2 발효 샘플로 처리된 세포는 TEER을 증가시킨다.
- 0.2× 투여량의 비타민 B2+비타민 C 발효 샘플로 처리된 세포는 TEER을 증가시킨다.
- 0.2× 투여량의 비타민 E 발효 샘플로 처리된 세포는 TEER을 증가시킨다.
- 0.2× 및 1× 투여량의 DHA+EPA 발효 샘플로 처리된 세포는 TEER을 증가시킨다.
- 0.2× 및 1× 투여량의 EPA 발효 샘플로 처리된 세포는 TEER을 증가시킨다.
장 누수 세포 모델의 기저측부 유도에서 0시간 발효 샘플로 처리된 세포의 TEER를 뺀 후 48시간 발효 샘플로 처리된 세포의 루시퍼 옐로우 측정과 관련하여(도 7), 다음과 같은 관찰이 이루어졌다:
상응하는 대조군에 비해,
- 0.2× 투여량의 비타민 B2 발효 샘플로 처리된 세포는 루시퍼 옐로우를 감소시킨다.
- 0.2× 투여량의 비타민 B2+비타민 C 발효 샘플로 처리된 세포는 루시퍼 옐로우를 감소시킨다.
- 0.2× 투여량의 비타민 E 발효 샘플로 처리된 세포는 루시퍼 옐로우를 감소시킨다.
- 0.2× 투여량의 DHA+EPA 발효 샘플로 처리된 세포는 루시퍼 옐로우를 감소시킨다.
장 누수 세포 모델의 정단부 유도에서 0시간 발효 샘플로 처리된 세포의 TEER를 뺀 후 48시간 발효 샘플로 처리된 세포의 TEER 측정과 관련하여(도 8), 다음과 같은 관찰이 이루어졌다:
상응하는 대조군에 비해,
- 0.2× 투여량의 비타민 B2 발효 샘플로 처리한 세포는 TEER를 증가시킨다.
- 0.2× 투여량의 비타민 B2-5-포스페이트 발효 샘플로 처리된 세포는 TEER를 증가시킨다.
- 0.2× 및 1× 투여량의 비타민 C 발효 샘플로 처리된 세포는 TEER를 증가시킨다.
- 0.2× 투여량의 비타민 B2+비타민 C 발효 샘플로 처리된 세포는 TEER를 증가시킨다.
- 0.2×, 1×, 5× 투여량의 비타민 E 발효 샘플로 처리된 세포는 TEER를 증가시킨다.
- 5× 투여량의 비타민 D 발효 샘플로 처리된 세포는 TEER를 증가시킨다.
- 0.2×, 1× 및 5× 투여량의 비타민 A 발효 샘플로 처리된 세포는 TEER를 증가시킨다.
- 0.2× 및 1× 투여량의 엽산 발효 샘플로 처리된 세포는 TEER를 증가시킨다.
- 0.2× 투여량의 DHA+EPA 발효 샘플로 처리된 세포는 TEER를 증가시킨다.
- 0.2×, 1× 및 5× 투여량의 EPA 발효 샘플로 처리된 세포는 TEER를 증가시킨다.
장 누수 세포 모델의 정단부 유도에서 0시간 발효 샘플로 처리된 세포의 TEER를 뺀 후 48시간 발효 샘플로 처리된 세포의 루시퍼 옐로우 측정과 관련하여(도 8), 다음과 같은 관찰이 이루어졌다:
상응하는 대조군에 비해,
- 0.2× 투여량의 비타민 B2 발효 샘플로 처리된 세포는 루시퍼 옐로우를 감소시킨다.
- 0.2× 투여량의 비타민 B2-5-포스페이트 발효 샘플로 처리된 세포는 루시퍼 옐로우를 감소시킨다.
- 0.2× 및 1× 투여량의 비타민 C 발효 샘플로 처리된 세포는 루시퍼 옐로우를 감소시킨다.
- 0.2× 투여량의 비타민 B2+비타민 C 발효 샘플로 처리된 세포는 루시퍼 옐로우를 감소시킨다.
- 1× 및 5× 투여량의 비타민 E 발효 샘플로 처리된 세포는 루시퍼 옐로우를 감소시킨다.
- 1× 및 5× 투여량의 비타민 A 발효 샘플로 처리된 세포는 루시퍼 옐로우를 감소시킨다.
- 0.2× 투여량의 비타민 K1 발효 샘플로 처리된 세포는 루시퍼 옐로우를 감소시킨다.
- 0.2× 투여량의 DHA+EPA 발효 샘플로 처리된 세포는 루시퍼 옐로우를 감소시킨다.
비타민과 오메가-3 지방산 투여시 24시간 발효 후 미생물총 알파 다양성과 관련하여 다음과 같은 관찰이 이루어졌다:
상응하는 대조군에 비해,
- 1× 및 5× 투여량으로 비타민 B2를 보충하면 미생물총 다양성이 증가한다.
- 0.2× 및 1× 투여량으로 비타민 B2-5-포스페이트를 보충하면 미생물총 다양성이 증가한다.
- 5× 투여량으로 비타민 C를 보충하면 미생물총 다양성이 증가한다.
- 0.2×, 1× 및 5× 투여량으로 비타민 E를 보충하면 미생물총 다양성이 증가한다.
- 0.2× 및 5× 투여량으로 비타민 D를 보충하면 미생물총 다양성이 증가한다.
- 1× 및 5× 투여량으로 비타민 A를 보충하면 미생물총 다양성이 증가한다.
- 1× 및 5× 투여량으로 비타민 B2+비타민 C를 보충하면 미생물총 다양성이 증가한다.
- 0.2× 및 1× 투여량으로 엽산을 보충하면 미생물총 다양성이 증가한다.
- 0.2×, 1× 및 5× 투여량으로 비타민 K1을 보충하면 미생물총 다양성이 증가한다.
- 0.2×, 1× 및 5× 투여량으로 DHA를 보충하면 미생물총 다양성이 증가한다.
- 1× 및 5× 투여량으로 DHA+EPA를 보충하면 미생물총 다양성이 증가한다.
- 0.2×, 1× 및 5× 투여량으로 EPA를 보충하면 미생물총 다양성이 증가한다.
비타민과 오메가-3 지방산 투여시 24시간 발효 후 비피도박테리움의 상대적 풍부도와 관련하여 다음과 같은 관찰이 이루어졌다:
상응하는 대조군에 비해,
- 비타민 B2를 1× 및 5× 투여량으로 보충하면 비피도박테리움의 상대적 풍부도가 증가한다.
- 비타민 B2-5-포스페이트를 0.2× 및 1× 투여량으로 보충하면 비피도박테리움의 상대적 풍부도가 증가한다.
- 비타민 C를 1× 투여량으로 보충하면 비피도박테리움의 상대적 풍부도가 증가한다.
- 비타민 E를 0.2×, 1×, 5× 투여량으로 보충하면 비피도박테리움의 상대적 풍부도가 증가한다.
- 비타민 D를 0.2× 및 5× 투여량으로 보충하면 비피도박테리움의 상대적 풍부도가 증가한다.
- 비타민 A를 1× 투여량으로 보충하면 비피도박테리움의 상대적 풍부도가 증가한다.
- 비타민 B2+비타민 C를 1× 및 5× 투여량으로 보충하면 비피도박테리움의 상대적 풍부도가 증가한다.
- 엽산을 0.2× 및 1× 투여량으로 보충하면 비피도박테리움의 상대적 풍부도가 증가한다.
- 비타민 K1을 0.2× 투여량으로 보충하면 비피도박테리움의 상대적 풍부도가 증가한다.
- DHA를 0.2× 및 5× 투여량으로 보충하면 비피도박테리움의 상대적 풍부도가 증가한다.
- DHA+EPA를 5× 투여량으로 보충하면 비피도박테리움의 상대적 풍부도가 증가한다.
- EPA를 0.2×, 1× 및 5× 투여량으로 보충하면 비피도박테리움의 상대적 풍부도가 증가한다.
다른 유익균에 대해서도 유사한 관찰이 이루어졌다.
비타민과 오메가-3 지방산 투여시 24시간 발효 후 부티레이트 경로로의 아세틸-CoA 발효에 관련되는 유전자의 상대적 풍부도와 관련하여, 다음과 같은 관찰이 이루어졌다:
상응하는 대조군에 비해,
- 비타민 B2를 1× 및 5× 투여량으로 보충하면 부티레이트 경로로의 아세틸-CoA 발효에 관련되는 유전자의 상대적 풍부도가 증가한다.
- 비타민 B2-5-포스페이트를 0.2× 및 1× 투여량으로 보충하면 부티레이트 경로로의 아세틸-CoA 발효에 관련되는 유전자의 상대적 풍부도가 증가한다.
- 비타민 C를 5× 투여량으로 보충하면 부티레이트 경로로의 아세틸-CoA 발효에 관련되는 유전자의 상대적 풍부도가 증가한다.
- 비타민 E를 0.2× 투여량으로 보충하면 부티레이트 경로로의 아세틸-CoA 발효에 관련되는 유전자의 상대적 풍부도가 증가한다.
- 비타민 D를 0.2× 투여량으로 보충하면 부티레이트 경로로의 아세틸-CoA 발효에 관련되는 유전자의 상대적 풍부도가 증가한다.
- 비타민 A를 1× 및 5× 투여량으로 보충하면 부티레이트 경로로의 아세틸-CoA 발효에 관련되는 유전자의 상대적 풍부도가 증가한다.
- 비타민 B2+비타민 C를 5× 투여량으로 보충하면 부티레이트 경로로의 아세틸-CoA 발효에 관련되는 유전자의 상대적 풍부도가 증가한다.
- 엽산을 0.2× 투여량으로 보충하면 부티레이트 경로로의 아세틸-CoA 발효에 관련되는 유전자의 상대적 풍부도가 증가한다.
- 비타민 K1을 0.2×, 1× 및 5× 투여량으로 보충하면 부티레이트 경로로의 아세틸-CoA 발효에 관련되는 유전자의 상대적 풍부도가 증가한다.
- DHA를 0.2×, 1× 및 5× 투여량으로 보충하면 부티레이트 경로로의 아세틸-CoA 발효에 관련되는 유전자의 상대적 풍부도가 증가한다.
- DHA+EPA를 0.2×, 1× 및 5× 투여량으로 보충하면 부티레이트 경로로의 아세틸-CoA 발효에 관련되는 유전자의 상대적 풍부도가 증가한다.
- EPA를 0.2×, 1× 및 5× 투여량으로 보충하면 부티레이트 경로로의 아세틸-CoA 발효에 관련되는 유전자의 상대적 풍부도가 증가한다.
비타민과 오메가-3 지방산 투여시 24시간 발효 유출물로 처리한 후 HT29 세포에 의한 GROa-CXCL1 생산과 관련하여, 다음과 같은 관찰이 이루어졌다:
상응하는 대조군에 비해,
- 비타민 B2를 1× 및 5× 투여량으로 보충하면 GROa-CXCL1 생산이 증가한다.
- 비타민 E를 5× 투여량으로 보충하면 GROa-CXCL1 생산이 증가한다.
- 비타민 B2+비타민 C를 1× 투여량으로 보충하면 GROa-CXCL1 생산이 증가한다.
- DHA를 0.2×, 1× 및 5× 투여량으로 보충하면 GROa-CXCL1 생산이 증가한다.
- DHA+EPA를 0.2×, 1× 및 5× 투여량으로 보충하면 GROa-CXCL1 생산이 증가한다.
- EPA를 1× 및 5× 투여량으로 보충하면 GROa-CXCL1 생산이 증가한다.
비타민과 오메가-3 지방산 투여시 24시간 발효 유출물로 처리한 후 HT29 세포에 의한 IL-8 생산과 관련하여, 다음과 같은 관찰이 이루어졌다:
상응하는 대조군에 비해,
- 비타민 B2를 1× 및 5× 투여량으로 보충하면 IL-8 생산이 증가한다.
- 비타민 B2-5-포스페이트를 5× 투여량으로 보충하면 IL-8 생산이 증가한다.
- 비타민 E를 0.2×, 1× 및 5× 투여량으로 보충하면 IL-8 생산이 증가한다.
- 비타민 A를 0.2× 및 5× 투여량으로 보충하면 IL-8 생산이 증가한다.
- 비타민 B2+비타민 C를 1× 투여량으로 보충하면 IL-8 생산이 증가한다.
- 엽산을 0.2× 및 5× 투여량으로 보충하면 IL-8 생산이 증가한다.
- 비타민 K1을 0.2× 투여량으로 보충하면 IL-8 생산이 증가한다.
- DHA를 0.2×, 1× 및 5× 투여량으로 보충하면 IL-8 생산이 증가한다.
- DHA+EPA를 0.2×, 1× 및 5× 투여량으로 보충하면 IL-8 생산이 증가한다.
- EPA를 0.2×, 1× 및 5× 투여량으로 보충하면 IL-8 생산이 증가한다.
비타민과 오메가-3 지방산 투여시 24시간 발효 유출물로 처리한 후 HT29 세포에 의한 MIP3A-CCL20 생산과 관련하여, 다음과 같은 관찰이 이루어졌다:
상응하는 대조군에 비해,
- 비타민 E를 0.2×, 1× 및 5× 투여량으로 보충하면 MIP3A-CCL20 생산이 증가한다.
- 비타민 D를 0.2×, 1× 및 5× 투여량으로 보충하면 MIP3A-CCL20 생산이 증가한다.
- 비타민 A를 0.2×, 1× 및 5× 투여량으로 보충하면 MIP3A-CCL20 생산이 증가한다.
- 비타민 K1을 0.2×, 1× 및 5× 투여량으로 보충하면 MIP3A-CCL20 생산이 증가한다.
- DHA를 0.2×, 1× 및 5× 투여량으로 보충하면 MIP3A-CCL20 생산이 증가한다.
- DHA+EPA를 0.2×, 1× 및 5× 투여량으로 보충하면 MIP3A-CCL20 생산이 증가한다.
- EPA를 0.2×, 1× 및 5× 투여량으로 보충하면 MIP3A-CCL20 생산이 증가한다.
비타민과 오메가-3 지방산 투여시 48시간 발효 후 가스 생산과 관련하여 다음과 같은 관찰이 이루어졌다:
상응하는 대조군에 비해,
비타민 C를 1× 및 5× 투여량으로 보충하면 가스 생산이 감소한다.
비타민 E를 1× 및 5× 투여량으로 보충하면 가스 생산이 감소한다.
비타민 C 및 B2를 1× 및 5× 투여량으로 보충하면 가스 생산이 감소한다.
도 16 내지 도 19에 도시된 시험관내 실험의 두 번째 세트:
비타민과 β-카로틴 투여시 48시간 발효 후 아세테이트 생산과 관련하여, 다음과 같은 관찰이 이루어졌다:
- 상응하는 대조군에 비해, 1× 및 5× 투여량으로 β-카로틴을 보충하면 두 공여자 모두에서 아세테이트 생산이 증가한다.
비타민 투여시 48시간 발효 후 프로피오네이트 생산과 관련하여, 다음과 같은 관찰이 이루어졌다:
- 1× 및 5× 투여량으로 β-카로틴을 보충하면 두 공여자 중 한 명(공여자 C)에서 프로피오네이트 생산이 증가한다
- 상응하는 대조군에 비해, 0.2× 투여량으로 비타민 B5를 보충하면 두 공여자 중 한 명(공여자 C)에서 프로피오네이트 생산이 증가한다.
비타민 투여시 48시간 발효 후 부티레이트 생산과 관련하여 다음과 같은 관찰이 이루어졌다:
- 1× 투여량으로 β-카로틴을 보충하면 두 공여자 모두에서 부티레이트 생산이 증가한다
- 상응하는 대조군에 비해, 0.2× 투여량으로 β-카로틴을 보충하면 두 공여자 중 한 명(공여자 C)에서 부티레이트 생산이 증가한다.
비타민 및 β-카로틴 투여시 48시간 발효 후 총 SCFA 생산과 관련하여, 다음과 같은 관찰이 이루어졌다:
- 상응하는 대조군에 비해, 1× 및 5× 투여량으로 β-카로틴을 보충하면 두 공여자 모두의 총 SCFA 생산이 증가한다
- 상응하는 대조군에 비해, 5× 투여량으로 비타민 B5를 보충하면 두 공여자 모두의 분지형 SCFA 생산이 감소한다.
비타민 투여시 24시간 발효 후 비피도박테리아세아에의 상대적 풍부도와 관련하여 다음과 같은 관찰이 이루어졌다:
상응하는 대조군에 비해,
- β-카로틴을 1× 및 5× 투여량으로 보충하면 두 공여자 모두에서 비피도박테리아세아에의 상대적 풍부도가 증가한다
- 비타민 B5를 5× 투여량으로 보충하면 두 공여자 모두에서 비피도박테리아세아에의 상대적 풍부도가 증가한다
- 비오틴을 0.2×, 1× 및 5× 투여량으로 보충하면 두 공여자 중 한 명(공여자 D)에서 비피도박테리아세아에의 상대적 풍부도가 증가한다
- 피리독신을 1× 및 5× 투여량으로 보충하면 두 공여자 중 한 명(공여자 D)에서 비피도박테리아세아에의 상대적 풍부도가 증가한다.
비타민 투여시 24시간 발효 후 에게르텔라세아에(Eggerthellaceae)의 상대적 풍부도와 관련하여, 다음과 같이 관찰되었다:
- 상응하는 대조군에 비해, 5× 투여량으로 β-카로틴을 보충하면 두 공여자 모두에서 에게르텔라세아에의 상대적 풍부도가 증가한다.
비타민 투여시 24시간 발효 후 데설포비브리오나세아에(Desulfovibrionaceae)의 상대적 풍부도와 관련하여, 다음과 같은 관찰이 이루어졌다:
상응하는 대조군에 비해,
- 5× 투여량으로 β-카로틴을 보충하면 두 공여자에서 데설포비브리오나세아에의 상대적 풍부도가 감소한다
- 5× 투여량으로 비타민 B5를 보충하면 두 공여자 중 한 명(공여자 C)에서 데설포비브리오나세아에의 상대적 풍부도가 감소한다.
비타민 투여시 24시간 발효 후 아케르만시아세아에(Akkermansiaceae)의 상대적 풍부도와 관련하여 다음과 같은 관찰이 이루어졌다:
상응하는 대조군에 비해,
- β-카로틴을 5× 투여량으로 보충하면 두 공여자 모두에서 아케르만시아세아에의 상대적 풍부도가 증가한다
- 티아민을 1× 투여량으로 보충하면 두 공여자 중 한 명(공여자 C)에서 아케르만시아세아에의 상대적 풍부도가 증가한다
- 니아신아미드를 0.2× 투여량으로 보충하면 두 공여자 중 한 명(공여자 C)에서 아케르만시아세아에의 상대적 풍부도가 증가한다
- 비타민 B5를 0.2× 투여량으로 보충하면 두 공여자 중 한 명(공여자 D)에서 아케르만시아세아에의 상대적 풍부도가 증가한다
- 피리독신을 0.2×, 1× 및 5× 투여량으로 보충하면 두 공여자 중 한 명(공여자 D)에서 아케르만시아세아에의 상대적 풍부도가 증가한다
- 비오틴을 0.2× 투여량으로 보충하면 두 공여자 중 한 명(공여자 D)에서 아케르만시아세아에의 상대적 풍부도가 증가한다
- 비타민 B12를 0.2× 및 1× 투여량으로 보충하면 두 공여자 중 한 명(공여자 D)에서 아케르만시아세아에의 상대적 풍부도가 증가한다.
비타민 투여시 24시간 발효 후 프레보텔라세아에(Prevotellaceae)의 상대적 풍부도와 관련하여 다음과 같은 관찰이 이루어졌다:
상응하는 대조군에 비해,
- 1× 투여량으로 β-카로틴을 보충하면 두 공여자 중 한 명(공여자 C)에서 프레보텔라세아에의 상대적 풍부도가 증가한다
- 5× 투여량으로 피리독신을 보충하면 두 공여자 중 한 명(공여자 C)에서 프레보텔라세아에의 상대적 풍부도가 증가한다.
비타민 투여시 24시간 발효 후 클로스트리디아세아에(Clostridiaceae)의 상대적 풍부도와 관련하여 다음과 같이 관찰되었다:
- 1× 투여량으로 β-카로틴을 보충하면 두 공여자 중 한 명(공여자 C)에서 클로스트리디아세아에의 상대적 풍부도가 상응하는 대조군에 비해 증가한다.
비타민 투여시 24시간 발효 후 에리시펠로트리카세아에(Erysipelotrichaceae)의 상대적 풍부도와 관련하여 다음과 같은 관찰이 이루어졌다:
상응하는 대조군에 비해,
- 티아민을 5× 투여량으로 보충하면 두 공여자 중 한 명(공여자 C)에서 에리시펠로트리카세아에의 상대적 풍부도가 증가한다
- 니아신아미드를 1× 및 5× 투여량으로 보충하면 두 공여자 중 한 명(공여자 C)에서 에리시펠로트리카세아에의 상대적 풍부도가 증가한다
- 피리독신을 1× 투여량으로 보충하면 두 공여자 중 한 명(공여자 C)에서 에리시펠로트리카세아에의 상대적 풍부도가 증가한다
- 비오틴을 0.2× 및 1× 투여량으로 보충하면 두 공여자 중 한 명(공여자 C)에서 에리시펠로트리카세아에의 상대적 풍부도가 증가한다
- 비타민 B12를 1× 및 5× 투여량으로 보충하면 두 공여자 중 한 명(공여자 C)에서 에리시펠로트리카세아에의 상대적 풍부도가 증가한다
- 비타민 B5를 1× 투여량으로 보충하면 두 공여자 중 한 명(공여자 D)에서 에리시펠로트리카세아에의 상대적 풍부도가 증가한다.
비타민 투여시 24시간 발효 후 코리오박테리아세아에(Coriobacteriaceae)의 상대적 풍부도와 관련하여 다음과 같이 관찰되었다:
- 1× 및 5× 투여량으로 β-카로틴을 보충하면 두 공여자 중 한 명(공여자 D)에서 코리오박테리아세아에의 상대적 풍부도가 상응하는 대조군에 비해 증가한다.
비타민 투여시 24시간 발효 후 바르네시엘라세아에(Barnesiellaceae)의 상대적 풍부도와 관련하여 다음과 같은 관찰이 이루어졌다:
상응하는 대조군에 비해,
- 5× 투여량으로 β-카로틴을 보충하면 두 공여자 중 한 명(공여자 D)에서 바르네시엘라세아에의 상대적 풍부도가 증가한다
- 1× 투여량으로 비오틴을 보충하면 두 공여자 중 한 명(공여자 D)에서 바르네시엘라세아에의 상대적 풍부도가 증가한다.
비타민 투여시 24시간 발효 후 파에칼리박테리움 프라우스니치의 상대적 풍부도와 관련하여, 다음과 같이 관찰되었다:
상응하는 대조군에 비해,
- β-카로틴을 1× 및 5× 투여량으로 보충하면 두 공여자 중 한 명(공여자 D)에서 파에칼리박테리움 프라우스니치의 상대적 풍부도가 증가한다
- 비타민 B5를 0.2×, 1× 및 5× 투여량으로 보충하면 두 공여자 중 한 명(공여자 D)에서 파에칼리박테리움 프라우스니치의 상대적 풍부도가 증가한다
- 피리독신을 0.2×, 1× 및 5× 투여량으로 보충하면 두 공여자 중 한 명(공여자 D)에서 파에칼리박테리움 프라우스니치의 상대적 풍부도가 증가한다
- 비오틴을 0.2×, 1× 및 5× 투여량으로 보충하면 두 공여자 중 한 명(공여자 D)에서 파에칼리박테리움 프라우스니치의 상대적 풍부도가 증가한다
- 비타민 B12를 0.2×, 1× 및 5× 투여량으로 보충하면 두 공여자 중 한 명(공여자 D)에서 파에칼리박테리움 프라우스니치의 상대적 풍부도가 증가한다.
비타민 투여시 24시간 발효 후 베일로넬라세아에(Veillonellaceae)의 상대적 풍부도와 관련하여 다음과 같은 관찰이 이루어졌다:
상응하는 대조군에 비해,
- 1× 및 5× 투여량으로 β-카로틴을 보충하면 두 공여자 중 한 명(공여자 D)에서 베일로넬라세아에의 상대적 풍부도가 증가한다
- 0.2× 투여량으로 비타민 B5를 보충하면 두 공여자 중 한 명(공여자 D)에서 베일로넬라세아에의 상대적 풍부도가 증가한다
- 5× 투여량으로 피리독신을 보충하면 두 공여자 중 한 명(공여자 D)에서 베일로넬라세아에의 상대적 풍부도가 증가한다.
미생물총 다양성과 관련하여 다음과 같은 관찰이 이루어졌다:
1× 및 5× 투여량으로 β-카로틴을 보충하면 두 공여자 모두에서 베타 다양성이 증가한다.
0.2× 투여량으로 β-카로틴을 보충하면 두 공여자 중 한 명(공여자 D)에서 베타 다양성이 증가한다.
5× 투여량으로 비타민 B5를 보충하면 두 공여자 모두에서 베타 다양성이 증가한다.
0.2× 및 1× 투여량으로 β-카로틴을 보충하면 두 공여자 중 한 명(공여자 D)에서 베타 다양성이 증가한다.
0.2×, 1× 및 5× 투여량으로 비타민 B6을 보충하면 두 공여자 중 한 명(공여자 D)에서 베타 다양성이 증가한다.
0.2×, 1× 및 5× 투여량으로 비타민 B12를 보충하면 두 공여자 중 한 명(공여자 D)에서 베타 다양성이 증가한다.
1× 투여량으로 비타민 B7을 보충하면 두 공여자 모두에서 베타 다양성이 증가한다.
5× 투여량으로 비타민 B7을 보충하면 두 공여자 중 한 명(공여자 D)에서 베타 다양성이 증가한다.
1× 투여량으로 비타민 B1을 보충하면 두 공여자 중 한 명(공여자 C)에서 베타 다양성이 증가한다.
5× 투여량으로 비타민 B1을 보충하면 두 공여자 중 한 명(공여자 D)에서 베타 다양성이 증가한다.
0.2× 및 5× 투여량으로 비타민 B3을 보충하면 두 공여자 중 한 명(공여자 D)에서 베타 다양성이 증가한다.
1× 투여량으로 비타민 B1을 보충하면 두 공여자 중 한 명(공여자 C)에서 베타 다양성이 상응하는 대조군에 비해 증가한다.
0.2× 및 5× 투여량으로 비타민 B5를 보충하면 두 공여자 중 한 명(공여자 D)의 알파 다양성이 증가한다.
5× 투여량으로 비타민 B6을 보충하면 두 공여자 중 한 명(공여자 D)의 알파 다양성이 증가한다.
0.2× 및 1× 투여량으로 비타민 B12를 보충하면 두 공여자 중 한 명(공여자 D)의 알파 다양성이 증가한다.
0.2× 투여량으로 비타민 B7을 보충하면 두 공여자 모두에서 알파 다양성이 증가한다.
5×의 투여량으로 비타민 B7을 보충하면 두 공여자 중 한 명(공여자 D)의 알파 다양성이 증가한다.
0.2× 및 1× 투여량으로 비타민 B1을 보충하면 두 공여자 중 한 명(공여자 C)의 알파 다양성이 증가한다.
1× 투여량으로 비타민 B3를 보충하면 두 공여자 중 한 명(공여자 C)의 알파 다양성이 증가한다.
실시예 2
인간에게 사용하기 위한 제형
각각 단일 활성 성분을 함유하는 다음 제형을 제조하고, 유드라짓® S 100 중합체로 코팅된 장용성-코팅된 경질 젤라틴 캡슐[캡슈젤(Capsugel)]에 충전하였다.
인간 사용을 위한 제형
미량영양소 제품 형태 캡슐 1개당 분말 또는 오일 캡슐 1개당 비타민
비타민 B2 리보플라빈 TG 75mg 75mg
비타민 C 아스코르브산 미세 과립 500mg 500mg
비타민 B2+C 리보플라빈 TG
아스코르브산 미세 과립		 75mg
500mg/d		 75mg
500mg
비타민 A 건조 비타민 A 팔미테이트 250 S/N-B 3.3mg 0.25mg RE1
비타민 D 건조 비타민 D3 100 SD/S 24mg 0.06mg
비타민 K 비타민 K1(VK1) 110㎍ 110㎍
엽산 엽산(FA) 400㎍ 400㎍
DHA MEG-3® 0080 EE 오일 (0080 EE) 133mg 100mg
DHA+EPA MEG-3® 4535 EE 오일 (4535 EE) 133mg 100mg
EPA MEG-3® 8000 EE 오일 (8000 EE) 133mg 100mg
비타민E 건조 비타민 E 50% CWS/S 298mg 100mg a-TE2
1: 레티놀 등가물
2: 토코페롤 등가물
제형은 바람직하게는 연속 28일 이상 동안 1일 1회 투여하기에 적합하다.
실시예 3
가금류 모델
동일한 유전을 특징으로 하는 120마리의 닭(모두 암컷)으로 구성된 3개의 그룹을 동일한 환경 조건을 특징으로 하는 3개의 별도의 방에 수용하고, 3가지 상이한 식단을 제공하였다: (A) 대조군 식단(5mg/kg 리보플라빈); (B) 대조군 식단+50mg/kg 비타민 리보플라빈; (C) 대조군 식단+100mg/kg 비타민 리보플라빈.
사료 공급 프로그램에 따라 사료가 변경될 때에 상응하는 특정한 날에 각 그룹을 3회 샘플링하였다(즉, S1=14일, S2=28일, S3=38/42일).
42일 육계(시험 종료)의 무게는 2.6kg이었고 하루에 약 205g의 사료를 먹었다. 따라서, 시험된 3가지 투여량은 각각 5, 50 및 100mg/kg 사료에서 0,38, 3,82 및 7,65mg/kg 체중의 리보플라빈 섭취량에 해당하고, 체중 1kg당 섭취량은 체중이 낮을수록 훨씬 높다. 아래 표 4는 육계의 이론적 성장과 첨가되는 리보플라빈의 양을 보여준다.
이론적 성장
일령 체중 사료 섭취량 누적 사료 섭취량 리보플라빈(mg/kg 사료)
(일) (g) (g/하루) (g) 5 50 100
0 42
7 180 30 150 0.83 8.33 16.67
14 450 65 495 0.72 7.22 14.44
21 875 100 1090 0.57 5.71 11.43
28 1420 140 1970 0.49 4.93 9.86
35 2035 180 3107 0.44 4.42 8.85
실험 종료시 42일령 2680 205 4460 0.38 3.82 7.65
49 3310 225 5976 0.34 3.40 6.80
각 샘플링(즉, S1, S2 및 S3) 동안 한 그룹당 총 40 마리의 닭이 인도적으로 안락사되었고 9개의 새끼 샘플을 수집한다(즉, 3개 샘플/그룹).
맹장 샘플 미생물총 분석
제 1 시점의 120개, 제 2 시점의 119개(그룹 C의 닭 1마리 누락), 제 3 시점의 118개(그룹 B의 닭 1마리, 그룹 C의 닭 1마리 누락)를 포함하여 총 741개의 맹장 샘플을 건강 미생물 생태부(Unit of Microbial Ecology of Health)에 의해 분석하였다.
물질 및 방법
맹장 샘플에서의 DNA 추출: 상업용 키트인 드니시 파워소일 키트(DNeasy PowerSoil kit)(퀴아젠, 독일 힐덴)를 선택하고, 제조업체의 지침에 따라 사용 가능한 모든 맹장 샘플에 적용하였다. 나노드랍(Nanodrop) 기기를 사용하여 DNA 수율을 측정하였다.
16S rRNA 유전자 PCR 증폭 및 시퀀싱. 일루미나 오버행 어댑터 시퀀스와 함께 341F 및 785R 프라이머를 사용하여, 16S rRNA 유전자의 V3-V4 초가변(hypervariable) 영역을 PCR 증폭시켰다. 암퓨어 XP 비즈(AMPure XP Beads) 자기 비드[벡크맨 쿨터(Beckman Coulter), 미국 캘리포니아주 브레아]를 사용하여 앰플리콘 정제를 수행하였다. 색인화된 라이브러리를 준비하기 위해, 넥스테라(Nextera) XT DNA 라이브러리 프렙 키트(Library Prep Kit)(일루미나, 미국 캘리포니아주 샌 디에고)를 사용하였다. 추가 자기 비드 정제 단계를 수행하고, Qubit 3.0 형광계[인비트로젠(Invitrogen)]를 사용하여 라이브러리를 정량화한 다음 4nM에서 풀링하였다. 라이브러리 풀을 NaOH 0.2N로 변성시키고 6pM까지 희석시켰다. 시퀀싱은 제조업체의 지침(일루미나)에 따라 2×250bp 페어드 엔드 프로토콜(paired end protocol)을 이용하여 일루미나 MiSeq 플랫폼에서 수행하였다.
생물 정보학 및 통계. PANDAseq[마셀라(Masella) 등, 2012]와 QIIME2[카포라소(Caporaso) 등, 2010; https://qiime2.org]를 결합한 파이프라인을 사용하여, 미가공 시퀀스를 처리하였다. 키메라 서열 제거 후 고품질 판독값을 필터링하고, dada2로 수행한 개방-참조(open-reference) 전략을 통해 99%의 분류학적 임계값에 따라 고해상도 OTU(operational taxonomic unit)로 비닝하였다[칼라한(Callahan) 등, 2016]. vsearch 분류기[로그네스(Rognes) 등, 2016] 및 SILVA 데이터베이스[쿼스트(Quast) 등, 2013]를 참조로 사용하여, 분류 체계를 할당하였다. 페이쓰 PD 지수와 관찰된 OTU의 수를 사용하여 알파 다양성을 측정하였다. 통계는 라이브러리 vegan, made4, PMCMR로 구현된 R 소프트웨어 3.1.3(https://www.r-project.org/)에서 실행되는 R 스튜디오(Studio) 소프트웨어 버전 1.0.136을 사용하여 수행하였다. 베타 다양성은 가중 유니프랙 거리를 계산하여 추정하였고, PCoA(Principal Coordinates Analyses)로 시각화하였다. 비건 패키지의 아도니스 함수를 사용하여 분산의 순열 다변량 분석에 의해, 샘플 그룹 간 분리의 유의성을 시험하였다. 적어도 1%의 샘플에서 0.5%의 최소 상대 풍부도를 나타내는 세균 계통 발생 그룹(속, 과, 문)을 추가 분석 및 그래픽 시각화를 위해 보관하였다. 샘플 그룹 간의 구성 차이는 크루스칼-월리스(Kruskal-Wallis) 시험을 이용하여 시험하였다. 베자미니-호흐버그 방법을 이용하여, 다중 비교를 위해 P 값을 수정하였다.
결과
741개 DNA 샘플에서 얻은 16S rRNA 앰플리콘을 시퀀싱하여 1,099에서 15,182에 이르는 4,986,865개의 고품질 시퀀스를 생성시켰으며, 샘플당 평균 값은 6,490±2715개 서열이다. 99% 유사성을 기반으로 하여 판독값을 20,950개의 OTU로 클러스터링하였다.
처음에, 그룹 B 닭의 모든 이용 가능한 샘플에 대한 베타 다양성 분석(도 20)은 그룹 A 및 그룹 C에 대한 맹장의 미생물총 구조 측면에서 서로 다른 종방향 궤적을 보여준다.
가중 유니프랙 거리를 이용하여 전체 샘플 세트를 플로팅할 때 이러한 경향이 특히 분명한(도 20A) 반면, 비-가중 유니프랙 거리를 사용하여 얻은 PCoA가 다른 그룹간에 더 많은 겹침을 보여준다(도 20B). 이는 그룹 B에서 육계의 미생물총의 차이가 아마도 우세한 종이 아닌 가장 풍부한 세균 종에 있을 가능성이 높음을 나타낸다.
T1, T2 및 T3 시점의 샘플을 개별적으로 사용하여 동일한 분석을 수행하였다 (도 21). 그룹 A, B 및 C의 T1 샘플은 대부분 겹치는(도 21A 및 21D) 반면, 그룹 B 샘플은 특히 가중 유니프랙 측정법이 사용되는 경우 T2 및 T3에서 다른 샘플과 별도로 클러스터링되기 시작한다(도 21B 및 21C).
반대로 생물 다양성 측면에서(알파 다양성, 도 18), 그룹 C의 닭에게 투여된 영양 체계는 시점 T2 및 T3에서 "관찰된 OTU" 측정법에 의해 계산된 종 풍부도의 상당한 증가를 유도한다(P<0.0001)(도 22E 및 22F).
평균 미생물총 프로필의 시각화는 세 실험 그룹 간의 구성 차이가 문 수준에서 인식될 수 있음을 강조하였다(도 23). 그룹 B에서, 박테로이데테스(Bacteroidetes) 문(도 23의 파란색)의 상대적 풍부도는 T2에서 눈에 띄게 증가하는 반면, 그룹 A에서는 박테로이데테스 풍부도가 T3에서만 증가한다. 그룹 C에 투여된 식단은 이러한 증가를 부분적으로 억제하는 것으로 보인다. 과 수준의 구성 분석(도 24)에서는, 그룹 B에 투여된 식단만이 박테로이다세아에 과의 점진적인 증가를 촉진하는(도 24에서 진한 파란색) 반면, 그룹 A 및 그룹 C에서는 박테로이데테스 문이 대부분 평균적으로 리케넬라세아에 과(도 24에서 하늘색)에 속하는 세균으로 구성됨이 밝혀졌다. 이 관찰은 과(도 25) 및 속 수준(도 25) 모두에서 통계적으로 확인되었다. 박테로이다세아에 과 및 박테로이데스 속은 가능한 모든 시점에서 그룹 B에서 유의하게 더 높은 풍부도를 보여준다. 대조적으로, 리케넬라세아에 과 및 이의 알리스티페스 속은 그룹 A와 그룹 C에서 T3에서만 더 높은 풍부도를 보여준다.
상이하게도, 그룹 C의 육계에 대해 얻은 평균 과 수준 프로필은 비피도박테리아세아에의 풍부도(도 24에서 노란색)가 점진적으로 증가함(T1에서 T3로)을 보여 주는데, 이는 그룹 A와 B에서는 보이지 않는다(도 24). 이 차이의 유의성은 T2와 T3에서 과(도 25) 및 속 수준(비피도박테리움 속, 도 26)에서 확인되었다. 과 수준에서는, 비피도박테리아세아에의 증가가 악티노박테리아(Actinobacteria) 문에 속하는 또 다른 과인 코리오박테리아세아에의 손상으로 이어짐이 강조되었다(도 25).
가장 흥미롭게도, 속 수준 분석은 그룹 B와 C에 투여된 두 식이 요법이, T1에서 대조군 A에 비해 그룹 B와 C에서 상당히 높은 파에칼리박테리움의 상대적인 풍부도의 증가를 가속화하는 것으로 나타났다(도 26). 다음 시점에서는 세 그룹으로부터의 파에칼리박테리움의 상대적 풍부도가 크게 다르지 않다. 이 종적인 경향은 파에칼리박테리움 속이 속하는 루미노코카세아에(Ruminococcaceae)과에서 관찰된 경향을 반영한다(도 25). 시점 T2에서 루미노코카세아에 과에 속하는 또 다른 속인 [유로박테리움] 코프로스타놀리게네스(coprostanoligenes) 그룹은 대조군 A에 비해 그룹 B과 그룹 C에서 더 높은 풍부도를 나타낸다(도 26).
생산 사이클(시점 T1, T2 및 T3)에 따른 세 그룹의 육계(그룹 A, B, C)에서의 회장 미생물총에 대한 설명
첫 번째 관찰에서 사용 가능한 모든 회장 샘플에 대한 베타 다양성 분석(도 27)은 세 가지 상이한 닭 그룹(A, B, C)에서 채취한 샘플이 맹장 미생물총의 경우 관찰된 것과는 달리 미생물총 구조 측면에서 뚜렷한 종방향 궤적을 따르지 않음을 보여주었다. 실제로 세 그룹의 샘플은 샘플 거리 계산에 사용되는 가중 및 비-가중 유니프렉 측정법의 경우 둘 다에서 겹친다(도 27A 및 27B).
741개 DNA 샘플에서 얻은 16S rRNA 앰플리콘을 시퀀싱하여 1,099에서 15,182에 달하는 4,986,865개의 고품질 서열을 생성시켰으며, 샘플당 평균 값은 6,490±2715개 서열이다. 99% 유사성을 기반으로 하여 판독값을 20,950개의 OTU로 클러스터링하였다.
이는 다른 시점에서 채취한 샘플을 별도의 PCoA에 플로팅하여 확인하였다(도 28).
생물 다양성 측면에서(알파 다양성, 도 29), 그룹 B와 C의 닭에게 투여된 영양 체계는 최초 시점에 그룹 A에 비해 회장 생태계의 다양성(페이쓰 PD 지수로 계산) 면에서의 상당한 감소를 유도한다(T1, P<0.001, 도 29A). 반대로, 동일한 식이(그룹 B 및 C)는 시점 T2 및 T3에서 "관찰된 OTU" 측정법에 의해 계산된 종 풍부도 측면에서 증가를 유도한다(시점 T2에서만 유의함, P<0.0001)(도 29E 및 29F).
평균 미생물총 프로필의 시각화는 문 수준에서 회장 미생물총이 맹장에 대해 보고된 것을 반영하며 대부분의 세균이 피르미쿠테스(Firmicutes) 문에 속한다는 것을 강조하였다(도 30의 녹색). 그러나, 더 낮은 계통 발생 수준(과)에서는, 회장 미생물총의 특성이 분명하며, 락토바실라세아에(Lactobacillaceae)(피르미쿠테스 문에 속하는 과)가 모든 가용 시점에서 크게 우세하다(도 31에서 연보라색).
종단 분석은 영양 체계(그룹 A, B 및 C)에 관계없이 T1에서 T3으로 갈 때 엔테로박테리아세아에의 점진적인 감소를 강조하였다(도 31에서 빨간색). 또한, 펩토스트렙토코카세아에(Peptostreptococcaceae)(도 31의 연한 녹색)에 유리하게 클로스트리디아세아에(Clostridiaceae)가 T1에서 T3으로 갈 때 점진적으로 감소하는 것을 확인할 수 있다(도 31의 짙은 녹색). 이는 크루스칼-월리스 시험에 의해 확인된 바와 같이 그룹 A 및 그룹 C 닭에서 채취한 샘플에서 T3에서 특히 분명하다(P<0.0001, 도 32). 펩토스트렙토코카세아에는 육계의 장에서 알려지지 않은 기능을 가진 세균 분류군이다. 닭의 맹장 미생물총에 초점을 맞춘 연구는 식이, 보충제 및 항생제 치료의 변화에 대한 이 분류군의 풍부도에서의 변화를 강조한 반면[문야카(Munyaka) 등, 2016; 코스타(Costa) 등, 2017; 자이츠(Zeits) 등, 2019], 회장 미생물총에 대한 연구는 여전히 너무 드물기 때문에 펩토스트렙토코카세아에 변화에 대한 가능한 기능적 역할을 가설하기가 어렵다.
생산 사이클(시점 T1, T2 및 T3)에 따른 세 가지 육계 그룹(그룹 A, B, C)의 새끼 미생물총에 대한 설명
첫 번째 관찰에서, 사용 가능한 모든 새끼 샘플에 대한 베타 다양성 분석 (도 33)은 비-가중 유니프랙 측정법을 이용하여 샘플 사이의 거리를 계산하였을 때(아도니스 시험, 평균 미생물총 프로필의 시각화) 미생물총 구조 측면에서 다른 샘플과 별도로 그룹 C 클러스터의 닭을 가진 박스에서 채취한 샘플이 문 수준에서 회장 미생물총이 맹장에 대해 보고된 내용을 반영하고 대부분의 세균이 피르미쿠테스 문에 속함을 강조하였음을 보여주었다(도 30의 녹색). 그러나, 더 낮은 계통 발생 수준(과)에서는 회장 미생물총의 특성이 분명하며, 락토바실라세아에(피르미쿠테스 문에 속하는 과)가 이용 가능한 모든 시점에서 크게 우세하다(도 31에서 연보라색).
종단 분석은 영양 체계(그룹 A, B 및 C)에 관계없이 T1에서 T3으로 갈 때 엔테로박테리아세아에의 점진적인 감소를 강조하였다(도 31에서 빨간색). 또한, 펩토스트렙토코카세아에(도 31의 연한 녹색)에 유리하게 클로스트리디아세아가 T1에서 T3으로 갈 때 점진적으로 감소하는 것을 확인할 수 있다(도 31의 짙은 녹색). 이는 크루스칼-월리스 시험에 의해 확인된 바와 같이 그룹 A 및 그룹 C 닭에서 채취한 샘플에서 T3에서 특히 분명하다(P<0.0001, 도 32). 펩토스트렙토코카세아에는 육계의 장에서 알려지지 않은 기능을 가진 세균 분류군이다. 닭의 맹장 미생물총에 초점을 맞춘 연구는 식이, 보충제 및 항생제 치료의 변화에 대한 이 분류군의 풍부도에서의 변화를 강조한 반면(문야카 등, 2016; 코스타 등, 2017; 자이츠 등, 2019), 회장 미생물총에 대한 연구는 여전히 너무 드물기 때문에 펩토스트렙토코카세아에 변화에 대한 가능한 기능적 역할을 가설하기는 어렵다.
생산 사이클(시점 T1, T2 및 T3)에 따른 세 가지 육계 그룹(그룹 A, B, C)의 새끼 미생물총에 대한 설명
첫 번째 관찰에서, 사용 가능한 모든 새끼 샘플에 대한 베타 다양성 분석 (도 33)은 비-가중 유니프랙 측정법을 이용하여 샘플 사이의 거리를 계산하였을 때(아도니스 시험, 평균 미생물총 프로필의 시각화) 미생물총 구조 측면에서 다른 샘플과 별도로 그룹 C 클러스터의 닭을 가진 박스에서 채취한 샘플이 문 수준에서 회장 미생물총이 맹장에 대해 보고된 내용을 반영하고 대부분의 세균이 피르미쿠테스 문에 속함을 강조하였음을 보여주었다(도 30의 녹색). 그러나, 더 낮은 계통 발생 수준(과)에서는 회장 미생물총의 특성이 분명하며, 락토바실라세아에(피르미쿠테스 문에 속하는 과)가 이용 가능한 모든 시점에서 크게 우세하다(도 31에서 연보라색; P=0.006, 도 33B).
이는 가중 유니프랙 거리를 기반으로 한 분석에 의해 확인되지 않았으며(도 33A), 이는 그룹 C 새끼 미생물총과 다른 새끼 간의 차이가 우세한 세균 분류군에 있을 수 있음을 나타낸다. 또한, 비-가중 유니프랙 거리를 기반으로 한 PCoA에서 그룹 C 새끼와 다른 새끼 샘플 사이의 분리는 제 2 배열 축(MDS2)을 따라 위치했으며, 이는 데이터 세트에서 전체 변동성의 9.4%만을 설명하는데 기여하였다(도 33B).
평균 미생물총 프로필의 시각화(도 34 및 35)는 문 및 과 수준에서 크게 우세한 단일 분류군이 없음을 강조하였다. 그러나, 분석된 데이터 세트에서는 새끼 미생물총의 세균 구성(과 또는 속 수준) 및 종 풍부도/다양성(데이터는 표시되지 않음)의 유의한 차이가 강조되지 않았다.
대사체 분석
분석된 샘플
처음 시점부터 수집된 21개, 두 번째 시점으로부터 21개, 세 번째 시점으로부터 21개의 맹장 샘플을 포함하여 총 63개의 샘플이 이탈리아 볼로냐 대학의 농업 및 식품 과학과의 Bio-NMR 그룹 및 산업 농업 식품 연구 부서간 센터(CIRI)에 제공되었다.
샘플 준비
다음과 같이 세분화된 63개의 샘플에 대해 예비 분석을 수행하였다: 10mg/kg의 비타민 B2가 공급된 대조군 샘플(A), 50mg/kg의 비타민 B2가 공급된 처리된 샘플(B), 100mg/kg의 비타민 B2가 공급된 처리된 샘플(C). 5분 동안 1mL의 탈이온수와 볼텍스 혼합한 다음 14,000rpm 및 4℃에서 10분동안 원심분리하여 핵 자기 공명(NMR) 분석을 위해 샘플을 준비하였다. pH 7.40으로 설정된 0.1% TSP(3-(트리메틸실릴)프로피온산-d4), NaN3 2mM을 함유하는 100μL의 D2O 1.5M 포스페이트 완충 용액에 약 540mL의 상청액을 첨가하였다. 분석 전에 샘플을 다시 10분동안 원심분리한 다음 590uL을 NMR 튜브로 옮겼다.
NMR 스펙트럼 획득
600.13MHz의 주파수에서 작동하는 어밴스(AVANCE) III 분광계[브루커(Bruker), 이탈리아 밀라노]를 사용하여 298K에서 양성자 NMR(1H-NMR) 스펙트럼을 기록하였다. 사전 포화에 의해 산화중수소(HOD; Hydrogen Deuterium Oxide) 잔류 신호를 억제하는 한편, 칼-퍼셀-메이붐-길(Carr-Purcell-Meiboom-Gill) 필터 27를 자유 유도 붕괴 시퀀스에 포함시킴으로써 천천히 텀블링하는 분자의 광범위한 신호를 제거하였다. 필터는 총 328ms의 시간 동안 800μs로 분리된 400개 에코의 트레인으로 구성되었다. 각 스펙트럼은 7211.54-Hz 스펙트럼에서 32K 데이터 포인트를 사용하여 256개의 과도 상태를 합산하여 획득하였다(수집 시간 2.27초). 재순환 지연은 조사중인 양성자의 종방향 이완 시간을 고려하여 8초로 설정하였다. 자동 명령 apk0.noe를 사용하여 탑 스핀(Top Spin) 3.0(브루커)으로 각 스펙트럼을 처리하였는데, 이는 원샷 기준선 및 위상 보정에서 수행되고 1Hz의 라인-확장 계수를 적용하여 수행된다. 화학적 이동 및 다중성을 문헌과 비교하고 Chenomx NMR 슈트 8.1 소프트웨어를 사용하여 피크를 할당하였다.
1 H-NMR 스펙트럼 전처리
푸리에 변환, 위상 및 기준선 보정 후, 내부 표준 TSP에 할당된 0.00ppm의 화학적 이동을 참조하여 스펙트럼을 보정하였으며; 물 신호와 함께 스펙트럼 주변 영역이 제거되었다. 그 후, 이 유형의 샘플에 대해 가장 잘 작동하기 때문에 두개의 다른 영역에서 개별적으로 확률적 몫 알고리즘(PQN)을 사용하여 스펙트럼을 정규화시켰다(영역 비례). 정규화 후 가능한 통계 분석 전에 스펙트럼을 각각 0.0183ppm의 100개의 데이터 지점 간격으로 비닝하였다. 그 결과, 새로운 스펙트럼 프로필은, 텍스트 파일에 매트릭스로 저장되고 다변량 통계 분석(Multivariate Statistical Analysis; MvSA)을 위해 R 및 파이톤 공간에 넣어지는 410개의 비닝된 데이터로 구성되었다.
통계 분석
MvSA를 비닝된 데이터 세트 매트릭스에 적용하였다. 구체적으로, 주 성분 분석(Principal Component Analysis; PCA) 및 부분 최소 제곱 판별 분석(Partial Least Square Discriminant Analysis; PLS-DA)을 채택하였다. PCA는 단일 유형의 ' 오믹스 데이터를 탐색하고 가장 큰 변동 원인을 식별하는데 사용되는 한편, 다단계 접근 방식은 생물학적 샘플 간의 생물학적 변이와는 별도로 개체 내에서 치료 효과를 강조하는 것을 목표로 한다(이 경우, 각각 비타민 B2 50 및 100mg/kg으로 처리된 그룹 B 및 C에 속하는 샘플).
결과
NMR 스펙트럼
도 36은 pH 7.13에서 C281로 칭해지는 샘플의 1H-NMR 스펙트럼을 보고한다.
화학적 이동 및 다중성을 문헌과 비교하고 Chenomx NMR 슈트 8.1 소프트웨어를 사용하여 여러 대사 산물을 할당하였다(다중성의 약어: s=단일선, dd=이중선의 이중선, d=이중선, t=삼중선 및 m=다중선(복잡한 패턴을 나타냄)). 1) 부티레이트 (t: 0.899ppm, m: 1.562ppm, t: 2.165ppm); 2) 류신 (t: 0.959ppm, m: 1.702ppm, m: 3.734ppm); 3) 발린 (d: 0.978ppm, d: 1.030, m: 2.261ppm, d: 3.583ppm); 4) 프로피오네이트 (t: 1.060ppm, q: 2.188ppm); 5) 에탄올 (t: 1.189ppm, q: 3.664ppm); 6) 락테이트 (d: 1.335ppm, q: 4.124ppm); 7) 알라닌 (d: 1.485ppm, q: 3.792ppm); 8) 아세테이트 (s: 1.925ppm); 9) 글루타메이트 (m: 2.047ppm, m: 2.134ppm, t: 2.339ppm, m: 2.371, q: 3.768ppm); 10) 석시네이트 (s: 2.409ppm); 11) 아스파테이트 (q: 2.692ppm, dd: 2.815ppm, q: 3.893ppm); 12) 디메틸아민 (s: 2.714ppm); 13) 트리메틸아민 (s: 2.878ppm); 14) 크레아틴 (s: 3.011ppm, s: 3.918ppm); 15) 포르메이트 (s: 8.461ppm); 16) 우라실 (d: 5.810ppm, d: 7.550ppm); 17) 페닐알라닌 (m: 7.434ppm, m: 7.382ppm, d: 7.337ppm); 18) 티로신 (d: 7.198ppm, d: 6.907ppm); 19) 푸마레이트 (s: 6.525ppm); 20) 타우린 (t: 3.429ppm, t: 3.273ppm).
다변량 통계 분석
먼저, 그룹을 분리하고 특이치 샘플을 식별할 수 있는 최상의 치수 감소 모델을 찾기 위하여, 크기 감소를 위한 상이한 비-감독 방법(PCA, 인자 분석, 독립 구성요소 분석, 커널 구동 PCA) 및 분류기[랜덤 포레스트(Random Forest), ADA부스티드 디시젼 트리(ADABoosted Decision Tree), 서포트 벡터 머신(Support Vector Machine)]를 결합하였다. 도 37에는 비닝되고 영역 스케일링된 데이터 세트에서 수행된, 스케일링되지 않은 PCA의 결과가 나와 있다. 도 37A의 PCA는 2개의 특이치 (각각 T3-A-C250 및 T3-A-C261인 샘플 44 및 46)의 존재를 보여준다. 이러한 특이치를 제외한 후 새로운 PCA의 결과는 도 37B에 나와 있다. 처음 두 주 성분은 전체 분산의 84%를 담당하지만, 가시적인 경향이나 분리가 표시되지 않으며 더 이상 특이치도 보이지 않는다.
감독되지 않는 방법으로부터 분리가 강조되지 않았기 때문에, 감독된 접근 방식을 적용할 필요가 있게 되었다(도 38). 이상치 필터링 후 각각 437개의 스펙트럼 특징을 가진 61명의 피험자를 최종 PLS-DA에 이용하였다[자이만스카(Szymanska, E.) 등, 2012]. 5-구성요소 PLS-DA 모델을 표준 스케일 데이터에서 트레이닝시켰으며, 첫 번째 3-PLS 방향의 조합이 시간 그룹 분리, 특히 첫 번째 방향을 식별하는데 가장 유익하다(도 38A). 따라서, 첫 번째 3-PLS 방향을 선형 커넬 써포트 벡터 분류기(Linear Kernel Support Vector Classifier)에 공급하여 최상의 예측 정확도를 얻었는데, 평균 예측 정확도는 약 89%이다. ADA부스팅 트리 분류기도 비교를 위해 평가하였는데, 약간 더 나쁜 성능 평균을 나타내었다[발데스(Valdes, G.), 등, 2016]. 이 결과는 2d-PLS-DA 공간 투영과 일치하는데, 여기에서 3개의 그룹은 시간을 변수로 고려할 때 선형적으로 분리될 수 있는 것으로 보이는 반면; 대조군 샘플 대 처리 샘플을 고려할 때 유의한 분리가 나타나지 않는 것으로 보인다(도 38B). 사용된 파이프라인의 모든 단계는 내부적으로 교차 검증되었으며, 오버피팅(overfitting)을 피하기 위해 계층화된 10겹 교차 검증이 구현된 분류 및 예측 단계에 특히 주의를 기울였다. 신호 대 잡음비를 향상시키고 유익하지 않은 스펙트럼 신호를 필터링하기 위해, PLS-DA 평균 가중치를 평활화 및 기준선 보정 후 추출된 스펙트럼에서 가장 유익한 신호에 연결하였다.
분리에 관여하는 주요 대사 산물은 다음과 같다: 우라실(도 39), 글루타메이트(도 40), 알라닌(도 41), 크레아틴(도 42), 부티레이트(도 43), 프로피오네이트(도 44) 및 아세테이트(도 45). 이들 도면에서, 각 대사 산물의 적분 면적을 서로 다른 시간(14일, 28일 및 38/42일에 해당하는 T0-T1-T2)에서 샘플 간에 비교하였다.
우라실의 적분 면적(도 39)은 모든 처리에서, 특히 농도가 다른 것보다 항상 높은 샘플 C의 경우, 농도가 42일(T2)까지 증가하는 것으로 보인다. 글루타메이트(도 40)는 특히 샘플 A와 B에서 28일(T1) 후 농도가 증가하는 경향을 보여주며, T3에서 일정하게 유지된다. 또한, 알라닌의 적분(도 41)은 T1에서 증가하지만 무엇보다도 샘플 C의 경우 증가한다. 대조적으로, 크레아틴은 T2에서 샘플 A와 B에 대해서만 증가하는 경향이 있지만 T3에서는 농도가 감소한다(도 42).
도 43 및 도 44는 스펙트럼에서 확인된 유기산과 관련이 있다. 이전의 것과 마찬가지로, 구간 피크의 적분을 시점에 따라 세 그룹 간에 비교하였다. 도 43 및 도 44는 부티레이트와 프로피오네이트의 결과를 보여준다.
부티레이트(도 43)는 처리와 시간 모두에 의해 영향을 받지 않는 것으로 보인다. 실제로 모든 샘플에서 T0, T1 및 T2의 평균 적분 면적은 거의 같은 양이다. 아세테이트에 대해서도 동일한 경향이 나타난다(도 45). 프로피오네이트의 경우 증가하는 경향이 나타난다(도 44).
결과는 데이터 부족의 영향을 받으며, 이러한 이유 때문에 이들로부터 유의한 경향이 발생하지 않는다는 점을 강조하는 것이 중요한다. 이러한 이유로, 추가 분석을 수행하였으며 4가지 주요 대사 산물의 추세를 피팅하였는데; 도 46은 할당된 유기산의 적분 면적이 각 그룹에서 시간에 따라 어떻게 변하는지 보여준다.
균유전체학 분석
분석된 샘플
볼로냐 대학교(UNIBO) 농업 및 식품 과학부 식품 안전 연구소에, 첫 번째 시점부터 수집한 맹장 샘플 21개, 두 번째 시점으로부터 21개, 그리고 세 번째 시점으로부터 21개 샘플을 비롯한 총 63개의 샘플을 제공하였다.
균유전체학 분석 방법론
균유전체학 시퀀싱을 위한 DNA 추출
비드-비팅 절차를 이용하여 맹장 내용물의 각 샘플로부터 DNA를 추출한다. 간단히 말해서, 0.25g의 맹장 내용물을 마그나 라이서 그린 비즈(MagNA Lyser Green Beads)[로슈(Roche), 이탈리아 밀라노]와 함께 1ml 용해 완충액(500mM NaCl, 50mM 트리스-Cl, pH 8.0, 50mM EDTA, 4% SDS)에 현탁시키고, 6500rpm에서 25초동안 마그나 라이서(MagNA Lyser)(로슈)에서 균질화시킨다. 이어, 샘플을 70℃에서 15분동안 가열한 다음 원심분리하여 세균 세포 파편에서 DNA를 분리한다. 용해 완충액의 두 번째 300μl 분취량으로 이 과정을 반복한다. 그런 다음, 샘플에 대해 10M v/v 암모늄 아세테이트(시그마, 이탈리아 밀라노) 침전, 이어 이소프로판올(시그마) 침전 및 70% 에탄올[카를로 에르바(Carlo Erba), 이탈리아 밀라노] 세척을 수행하고, 100ul 1× 트리스-EDTA(시그마)에 재현탁시킨다. 이어, 샘플을 무-DNase RNase(로슈)로 처리하고 4℃에서 하룻밤동안 배양한 다음, 약간 수정한 제조업체의 지침에 따라 QIAmp® DNA 스툴 미니 키트(퀴아젠, 이탈리아 밀라노)를 통해 처리한다. 샘플을 바이오스펙트로미터(BioSpectrometer)®[에펜도르프(Eppendorf), 이탈리아 밀라노]에서 측정하여, DNA 양과 품질을 평가한다. DNA 품질 점수(즉, 1.8과 2.0 사이의 A260/280nm 비)를 준수하는 모든 샘플을, 넥스테라(Nextera) XT DNA 라이브러리 제조 키트(일루미나, 미국 캘리포니아주 샌 디에고)를 사용하는 라이브러리 제조에 제출한다. 그런 다음, 페어드-엔드 모드에서 150b에서 NextSeq500(일루미나)을 사용하여, 평균 크기가 300 내지 500bp이고 최소 농도가 4pM인 모든 라이브러리를 시퀀싱한다.
시퀀싱 전략 및 플랫폼
페어드 엔드에서 모든 샘플을 시퀀싱하였다. 평균 판독 길이는 300bp였다. 일루미나의 NextSeq500을 사용하여 시퀀싱을 수행하였다. 제출된 메타게놈은 20Mbp에서 12Gbp 사이의 출력을 특징으로 하였다.
생물 정보학 분석
MGRast(MR)(https://www.mg-rast.org)[키건(Keegan) 등, 2016] 생물 정보학 파이프라인을 사용하여, 미가공 판독치의 필터링 및 트리밍을 수행하였다. 또한, 기본 설정 매개변수(e-값 컷오프: <1e-5, 최소. % 식별 컷오프: 60%, 및 최소 배열 길이 컷오프: 15)를 사용하여, MG-RAST v3.6 메타게놈 분석 서버[메이어(Meyer) 등, 2008]에서 기능 주석 달기를 수행하였다. 기능 분류를 위해, SEED 및 KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) 식별자를 사용하여 유전자를 SEED 및 KEGG 분류에 각각 맵핑하였다.
통계 분석
통계 분석을 위해 STAMP v2.0.8 소프트웨어[팍스(Parks) 및 바이코(Beiko), 2010; 팍스 등, 2014]를 사용하여 비교 기능 프로파일링을 수행하였다. 시퀀싱 노력의 차이로 인한 편향을 제거하기 위해 각 메타게놈 데이터 세트의 유전자 히트 총 수로 개별 기능에 대한 유전자 히트 수를 나눔으로써, 유전자 수를 정규화시켰다. 메타게놈에서 차별적으로 풍부한 SEED 또는 KEGG 기능을 확인하기 위해, 벤자미니-호흐버그 FDR(False Discovery Rate) 다중 시험 보정 방법 및 p-값 <0.05을 갖는 양면 웰치(Welch's) 정확도 시험을 적용함으로써, 다른 메타게놈에 비해 상대적인 유전자 풍부도의 통계 시험을 수행하였다.
결과
먼저, '기능적 특징 데이터'를 기반으로 한 주 성분 분석(PCA)은 그룹 간 분리를 허용하고 임의의 특이치 샘플을 식별할 수 있는 최상의 치수 감소 모델을 찾는 것이었다. 도 47에는, 6361 기능적 특징을 가진 63명의 피험자에 대해 수행된 PCA의 결과가 보고된다. 처음 두 주 성분이 전체 분산의 81%를 담당하고; 처리된 그룹(그룹 B 및 C)과 대조군(그룹 A) 사이의 명확한 가시적 분리가 표시된다. 시점과 관련하여서는 분리가 식별될 수 없었다.
생산 사이클(시점 T1, T2 및 T3)에 따른, 세 그룹의 육계(그룹 A, B, C)에서의 1차 KEGG 대사 경로에 대한 설명
사용 가능한 각 시점(T1, T2, T3)에 있어서 세 가지 다른 그룹 A, B 및 C의 육계 맹장의 KEGG 데이터베이스를 기반으로 한 레벨 1에서의 평균 기능 유전자 프로필의 시각화는 세 실험 그룹 간의 구성 차이가 레벨 1(도 49)에서 인지될 수 있음을 강조하였다. 특히 그룹 A에서, 유전 정보 처리의 상대적 풍부도(도 49의 주황색)는 처리된 그룹과 비교하여 각 시점에서 통계적으로 유의한 증가를 나타냈다 (표 5). 대조적으로 환경 정보 처리의 상대적 풍부도(도 50A)는 그룹 A에 비해 그룹 B와 C(표 5)에서 각 시점에서 통계적으로 유의한 증가를 보였다. 더욱이, 대사의 상대적 풍부도(도 50B)는 28일령에서 그룹 A에 비해 그룹 B와 C에서 통계적으로 증가한 반면, 유기체 시스템은 그룹 B와 C에 비해 그룹 A에서 통계적으로 증가하였다(표 5).
각 시점(T1, T2, T3)에서 처리된 그룹(그룹 B 및 C)과 대조군(그룹 A) 간에 통계적으로 유의한 차이를 나타내는 육계 맹장에서의 1차 KEGG 대사 경로의 상대적풍부도 ≥0.1%
레벨 1 p-값(보정)* 그룹 C 그룹 B 그룹 A
T1
유전 정보 처리 0.0240 22.537±0.872 21.896±1.253 25.387±1.568
T2
유전 정보 처리 0.0133 25.106±1.729 23.629±0.479 27.613±1.379
유기체 시스템 0.0072 0.382±0.053 0.595±0.488 1.461±0.509
T3
유전 정보 처리 0.0039 24.394±0.850 23.156±0.423 26.942±11.544
*=베자미니 호허그 수정 P 값은 통계적 유의성에 도달했을 때(P<0.05) 보고된다.
생산 사이클(시점 T1, T2 및 T3)에 따른, 세 그룹의 육계(그룹 A, B, C)에서의 2차 KEGG 대사 경로에 대한 설명
상대적 풍부도가 ≥0.5%인 2차 KEGG 대사 경로의 시각화는 각 시점에 있어서 세 실험 그룹 간의 구성 차이를 인지할 수 있음을 강조한다(도 51)(즉, 14일에서의 번역, 전사; 28일에서의 막 수송, 번역, 복제 및 수선; 42일에서의 막 수송, 번역, 복제 및 수선, 뉴클레오티드 대사).
특히 그룹 B와 C에서, 각 시점의 보조 인자 및 비타민 대사의 상대적 풍부도는 그룹 A에 비해 통계적으로 유의하게 증가하였다(아래 표 6, 7 및 8에서 밝은 회색). 대조적으로, 번역, 전사 및 환경 적응의 상대적 풍부도는 그룹 B 및 C에 비해 그룹 A에서 각 시점에서 통계적으로 유의하게 증가하였다(표 5에서 흰색으로 표시됨).
다른 경로를 살펴보면, 막 수송, 복제 및 수선, 다른 2차 대사 산물의 생합성, 테르페노이드 및 폴리케티드의 대사 및 기타 아미노산의 대사의 상대적인 풍부도가 28일령 및 42일령에 그룹 A에 비해 그룹 B 및 C에서 통계적으로 증가하였다(표 7 및 8에서 주황색). 대조적으로, 번역, 에너지 대사, 신호 전달, 전사, 감염성 질환 및 환경 적응의 상대적 풍부도는 28일령 및 42일령에 그룹 B 및 C에 비해 그룹 A에서 통계적으로 증가하였다(표 7 및 8에서 흰색). 마지막으로, 지질 대사의 상대적 풍부도는 28일령에 그룹 A에 비해 그룹 B 및 C에서 상당한 증가를 보여주지만(표 6 및 7에서 연한 회색), 접힘, 분류 및 분해, 세포 신호교환 및 신호 전달 분자 및 상호 작용은 28일령에 그룹 B 및 C에 비해 그룹 A에서 통계적으로 증가하였다(표 7에서 흰색).
육계 맹장에서 상대적 풍부도가 ≥0.5%이고 T1(14일령)에서 (그룹 B 및 C)와 대조군(그룹 A) 사이에서 통계적으로 유의한 차이를 보이는 2차 KEGG 대사 경로
레벨 2 p-값(수정됨)* 그룹 C 그룹 B 그룹 A
번역 0.0098 10,204±0.525 9.818±0.757 12.623±1.188
보조인자 및 비타민의 대사 0.0087 4.108±0.161 4.465±0.143 3.040±0.526
전사 0.0090 2.619±0.110 2.461±0.112 3.641±0.521
액체 대사 0.0073 2.344±0.055 2.413±0.070 1.938±0.196
환경 적응 0.0171 0.276±0.029 0.230±0.022 0.558±0.135
*=베자미니 호허그 수정된 P 값은 통계적 유의성에 도달했을 때(P<0.05) 보고된다.
육계 맹장에서 상대적 풍부도가 ≥0.5%이고 T2(28일령)에서 처리된 그룹(그룹 B 및 C)과 대조군(그룹 A) 간에 통계적으로 유의한 차이를 보이는 2차 KEGG 대사 경로
레벨 2 p-값
(수정됨)* 		그룹 C 그룹 B 그룹 A
막 수송 0.0043 11.788±0.410 10.367±0.833 6.866±0.394
번역 0.0060 11.706±0.930 10.792±0.311 14.352±0.948
복제 및 수선 0.0038 7.563±0.538 7.041±0.347 5.692±0.295
보조인자 및 비타민의 대사 0.0073 4.027±0.279 4.496±0.113 2.803±0.092
에너지 대사 0.0205 3.334±0.160 3.419±0.141 4.153±0.435
신호 전달 0.0046 3.184±0.101 3.577±0.520 4.569±0.945
폴딩, 분류 및 분해 0.0313 3.130±0.104 3.207±0.203 3.385±0.158
전사 0.0036 2.706±0.182 2.589±0.098 4.184±0.301
액체 대사 0.0040 2.202±0.067 2.248±0.059 1.704±0.151
글리칸 생합성 및 대사 0.0060 1.788±0.123 2.008±0.263 1.150±0.337
다른 2차 대사산물의 생합성 0.0298 1.455±0.170 1.541±0.140 1.236±0.154
테르페노이드 및 폴리케티드의 대사 0.0044 1.084±0.045 1.124±0.064 0.661±0.039
감염성 질환 0.0249 0.543±0.071 0.571±0.073 0.708±0.116
다른 아미노산의 대사 0.0039 0.514±0.046 0.537±0.045 0.339±0.042
수송 및 이화작용 0.0038 0.485±0.033 0.979±0.502 1.287±0.487
환경 적응 0.0048 0.310±0.038 0.273±0.030 0.692±0.085
세포 신호교환 0.0155 0.023±0.034 0.298±0.576 1.063±0.806
신호 전달 분자 및 상호작용 0.0156 0.013±0.019 0.158±0.302 0.639±0.482
*=베자미니 호허그 수정된 P 값은 통계적 유의성에 도달했을 때(P<0.05) 보고된다.
육계 맹장에서 상대적 풍부도가 ≥0.5%이고 T3(42일령)에서 처리된 그룹(그룹 B 및 C)과 대조군(그룹 A) 간에 통계적으로 유의한 차이를 보이는 2차 KEGG 대사 경로
레벨 2 p-값
(수정됨)* 		그룹 C 그룹 B 그룹 A
막 수송 0.0073 11.743±0.425 10.848±0.881 7.385±1.133
번역 0.0073 11.290±0.425 10.486±0.187 13.515±1.282
복제 및 수선 0.0249 7.356±0.338 6.952±0.213 6.435±0.476
뉴클레오티드 대사 0.0122 5.801±0.075 5.658±0.113 6.350±0.302
보조인자 및 비타민의 대사 0.0093 4.123±0.229 4.683±0.158 3.505±0.627
에너지 대사 0.0443 3.473±0.141 3.491±0.118 4.287±0.512
신호 전달 0.0209 3.204±0.113 3.518±0.261 3.630±0.429
전사 0.0133 2.648±0.096 2.562±0.060 3.776±0.587
세포 성장 및 사멸 0.0105 1.901±0.069 1.862±0.042 1.526±0.202
글리칸 생합성 및 대사 0.0346 1.836±0.057 2.170±0.304 1.417±0.501
테르페노이드 및 폴리케티드의 대사 0.0266 1.077±0.028 1.130±0.055 0.865±0.165
수송 및 이화작용 0.0120 0.574±0.074 1.046±0.320 0.923±0.221
감염성 질환 0.0123 0.561±0.034 0.591±0.058 0.773±0.169
다른 아미노산의 대사 0.0367 0.547±0.039 0.618±0.073 0.459±0.089
환경 적응 0.0113 0.325±0.034 0.288±0.020 0.596±0.200
*=베자미니 호허그 수정된 P 값은 통계적 유의성에 도달했을 때(P<0.05) 보고된다.
생산 사이클(시점 T1, T2 및 T3)에 따른, 세 그룹의 육계(그룹 A, B, C)에서의 3차 KEGG 대사 경로에 대한 설명
3차 KEGG 대사 경로를 분석하면, 실험군 간에 14일령에 차이가 보고되지 않았으며(데이터는 보고되지 않음), 다수의 경로가 28일령 및 42일령에 유의한 차이를 보였다(아래 표 9 및 표 10).
특히 28일 및 42일령에 상대적인 풍부도가 ≥0.1%인 19개 경로(ABC 수송체, DNA 복제, 피리미딘 대사, 상동 재조합, 펜토오스 포스페이트 경로, 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판 생합성, 니코티네이트 및 니코틴아미드 대사, 페닐프로파노이드 생합성, 황 릴레이 시스템, 글리세로포스포리피드 대사, 메탄 대사, 판토테네이트 및 CoA 생합성, 셀레노 화합물 대사, 폴레이트 생합성, 이노시톨 포스페이트 대사, 리소좀, 부타노에이트 대사, 비오틴 대사, 포스포네이트 및 포스피네이트 대사)는 그룹 A에 비해 그룹 B 및 C에서 통계적으로 유의하게 증가하였다(표 9 및 표 10에서 밝은 회색). 대조적으로, 상대적인 풍부도가 ≥0.1%인 9가지 경로(알라닌, 아스파테이트 및 글루타메이트 대사, 퓨린 대사, RNA 폴리머라제, RNA 분해, 2성분 시스템, 피루베이트 대사, 뉴클레오티드 절제 수선, 발린, 류신 및 이소류신 분해, 리신 분해)는 그룹 B 및 C에 비해 그룹 A에서 통계적으로 유의하게 증가하였다(표 9 및 표 10에서 흰색).
또한, 27가지 경로(아미노 아실-tRNA 생합성, 당분해/글루코오스 신생합성, 산화적 인산화, 전분 및 슈크로오스 대사, 아르기닌 및 프롤린 대사, 갈락토오스 대사, 아미노 당 및 뉴클레오티드 당 대사, 펩티도글리칸 생합성, 히스티딘 대사, 포스포트랜스퍼라제 시스템(PTS), 테르페노이드 주쇄 생합성, 프럭토오스 및 만노오스 대사, 지방산 생합성, 시트레이트 사이클 (TCA 사이클), 염기 절제 수선, 미스매치 수선, 티로신 대사, 글리옥실레이트 및 디카복실레이트 대사, 세균 화학주성, 퍼옥시좀, 기타 글리칸 분해, 글루타티온 대사, 비타민 B6 대사, 제아틴 생합성, 리포폴리사카라이드 생합성, 트립토판 대사, 칼슘 신호 전달 경로)는 그룹 A에 비해 그룹 B 및 C에서 28일령에 유의한 증가를 나타냈다(표 9에서 밝은 회색).
특히 흥미로운 것은 지방산 생합성, 포스포트랜스퍼라제 시스템(PTS) 및 부타노에이트 대사와 같은 대사 경로가 처리된 그룹에서 증가하고 SCFA 생산과 연결된다는 것이다. 또한, 니코티네이트 및 니코틴아미드 대사, 판토테네이트 생합성, 폴레이트 생합성, 비오틴 대사 및 비타민 B6 대사와 같은 B 비타민 경로에 대해 처리된 그룹(그룹 B 및 C)에서 통계적으로 유의한 증가가 보고되었다.
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
SCFA 및 글루코시다제와 관련된 유전자의 풍부도 평가
단쇄 지방산(SCFA)이 장 생리학에서 중요한 역할을 하기 때문에, 본 발명자들은 부티레이트 및 프로피오네이트 합성으로 이어지는 대사 경로를 구체적으로 분석하였다. 문헌에 기재된 바와 같이 부티레이트 생산으로 이어지는 4가지 가능한 경로가 있다. 첫 번째이자 주요한 것은 아세틸-CoA 아세틸트랜스퍼라제를 기반으로 한 것이었다(도 39).
본 발명자들의 연구에서 부티레이트 생산과 관련된 유전자의 상대적인 풍부도를 살펴보면, 본 발명자들은 28일령에 7개 이상의 대사 기능 및 42일령에 5개 이상의 대사 기능이 그룹 A에 비해 처리된 그룹(그룹 B 및 그룹 C)에서 통계적으로 유의하게 증가하였음을 확인하였다(아래 표 11). 이 증거는 파에칼리박테리움 및 유박테리움 같은 상이한 미생물 속과 관련될 수 있으며[폴란스키(Polansky) 등, 2016, 롤랜드(Rowland) 등, 2018], 리비에르(Reviere) 등 (2016)에 의해 보고된 바와 같이 비피도박테리아의 교차 먹이 활동에 의해 관련될 수 있다. 이 모든 속은 미생물 분석에 의해 본 발명자들의 연구에서 확인되었으며, 이러한 결과는 비타민 B2로 처리된 동물에서 잠재적인 부티레이트 생산을 예측할 수 있다.
28일 및 42일령에 처리된 그룹(그룹 B 및 C)과 대조군(그룹 A) 사이에서 통계적으로 유의한 차이를 나타내는, 육계 맹장에서의 부티레이트 생산(KEGG 및 SEED 데이터베이스)과 관련된 기능성 유전자의 상대적 풍부도 백분율
기능 p-값
(수정됨)* 		그룹 C 그룹 B 그룹 A
28일
buk; 부티레이트 키나제 [EC:2.7.2.7] 0.0193 0.0753±0.0151 0.1071±0.010 0.0236±0.0055
ptb; 포스페이트 부티릴트랜스퍼라제 [EC:2.3.1.19] 0.0128 0.0457±0.0067 0.0532±0.011 0.0043±0.0040
4-하이드록시부티레이트 데하이드로게나제 [EC:1.1.1.61] 0.0104 0.0029±0.008 0.0028±0.0007 0.0003±0.0002
but; 부티레이트-아세토아세테이트 CoA-트랜스퍼라제 서브유닛 A (EC 2.8.3.9) 0.0089 0.0023±0.0006 0.0022±0.0006 0.0005±0.0004
atoD; 아세테이트 CoA-트랜스퍼라제 알파 서브유닛 [EC:2.8.3.8] 0.0379 0.004±0.0008 0.004±0.001 0.001±0.001
D-베타-하이드록시부티레이트 데하이드로게나제 (EC 1.1.1.30) 0.0405 0.0038±0.0005 0.0036±0.0010 0.0011±0.0013
트랜스-2-에노일-CoA 리덕타제 (NAD+) [EC:1.3.1.44] 0.0128 0.0013±0.0005 0.0014±0.0004 0.0003±0.0003
42일
buk; 부티레이트 키나제 [EC:2.7.2.7] 0.0490 0.0801±0.0078 0.1055±0.0095 0.0517±0.0338
ptb; 포스페이트 부티릴트랜스퍼라제 [EC:2.3.1.19] 0.0302 0.0439±0.0053 0.0434±0.0152 0.0103±0.0089
4-하이드록시부티레이트 데하이드로게나제 [EC:1.1.1.61] 0.0314 0.0031±0.0003 0.0025±0.0006 0.0007±0.0005
but; 부티레이트-아세토아세테이트 CoA-트랜스퍼라제 서브유닛 A (EC 2.8.3.9) 0.0145 0.0028±0.0007 0.0022±0.0008 0.0005±0.0005
트랜스-2-에노일-CoA 리덕타제 (NAD+) [EC:1.3.1.44] 0.0319 0.0014±0.0004 0.0017±0.0006 0.0001±0.0001
*=베자미니 호허그 수정된 P 값은 통계적 유의성에 도달했을 때(P<0.05) 보고된다.
매우 흥미로운 것은 그룹 A와 비교하여 처리된 그룹(그룹 B 및 C)의 육계 맹장에서 ß-갈락토시다제와 관련된 기능 유전자의 상대적 풍부도가 통계적으로 유의하게 증가했다는 증거였다(아래 표 12). 이 결과는 미생물총 분석에서 보고된 바와 같이 처리된 그룹에서 락토바실러스 종[샤이마(Shaima) 등, 2017] 뿐만 아니라 비피도박테리아의 증가에 의해 설명될 수 있다. 인간의 경우, 이 효소는 락토오스 발효를 촉진시키는 결장에서 풍부하게 발견되고, 이의 활성을 측정하여 결장의 미생물총이 장내 락토오스를 발효시키는 능력을 나타낸다.
28일 및 42일령에 처리된 그룹(그룹 B와 C)과 대조군(그룹 A) 사이에서 통계적으로 유의한 차이를 보이는, 육계 맹장에서의 ß-갈락토시다제(KEGG 및 SEED 데이터베이스)와 관련된 기능 유전자의 상대적 풍부도 백분율
기능 p-값
(수정됨)* 		그룹 C 그룹 B 그룹 A
28일
베타-갈락토시다제 (EC 3.2.1.23) 0.0063 0.384±0.040 0.775±0.211 0.252±0.031
베타-갈락토시다제 (EC 3.2.1.23), LacA 계열 0.0062 0.183±0.003 0.182±0.003 0.009±0.001
베타-갈락토시다제 소형 서브유닛 (EC 3.2.1.23) 0.0161 0.008±0.002 0.008±0.001 0.003±0.002
42일
베타-갈락토시다제 (EC 3.2.1.23) 0.0407 0.419±0.023 0.923±0.204 0.629±0.324
*=베자미니 호허그 수정된 P 값은 통계적 유의성에 도달했을 때(P<0.05) 보고된다.
결론
● 그룹 B와 C에 투여된 두 식이 요법은, 대조군 식이에 비해, 육계의 생산 사이클의 제 1 시기(T1) 동안 파에칼리박테리움 속에 속하는 잘 알려진 항-염증 및 건강-증진 세균의 증가를 포함하는 맹장 미생물총의 변화를 유도하였다. 생산 사이클의 제 2 및 제 3 시기(T2 및 T3) 동안, 파에칼리박테리움의 상대적인 풍부도는 세 그룹 사이에서 유의한 차이를 보이지 않았다. 종합하면, 본 결과는 육계의 생산 사이클 동안 파에칼리박테리움이 자연적으로 증가하고(대조군 식이, 그룹 A), 그룹 B와 그룹 C의 육계에게 투여되는 식이 요법이 이러한 증가를 촉진함을 강조하는 것으로 보인다.
● 그룹 C에 투여된 식단은 또한 다른 건강-증진 그룹인 비피도박테리움의 풍부도를 점진적으로 증가시켰으며 대조군 식단(그룹 A에 투여)과 관련하여 종 풍부도를 증가시켰다. 대조적으로, 그룹 B에 투여된 식단은 전체 생산 사이클에 걸쳐 박테로이데스 풍부도의 증가에 바람직하였다.
● 박테로이데스 증가는 박테로이데테스 문의 다른 일원인 리케넬라세아에(알리스티페스)를 손상시킨다.
● 그룹 B와 C의 육계에게 투여된 두 가지 식단은 회장 미생물총 구성과 다양성에 미미한 영향을 미쳤으며, 새끼 샘플에서는 미생물총에 대한 큰 영향이 검출되지 않았다.
● 앞에서 언급했듯이, 대사 연구를 위해 선택한 샘플의 부족은 데이터 및 결과의 품질에 영향을 미쳤다. 따라서, 모든 샘플의 분석을 포함하여 보다 강력한 데이터 세트를 갖는 것이 중요하다. 그러나, 아세테이트, 글루타메이트, 프로피오네이트 및 부티레이트와 같은 대사 산물이 처리의 영향을 받는 것이 분명해 보인다.
● 6361개의 기능적 특징을 가진 63명의 피험자에서 수행된 PCA는 처리된 그룹(그룹 B 및 C)과 대조군(그룹 A) 사이의 분리를 야기하는 비타민 B2의 명백한 효과를 보여주었다. 이 결과는 분석 시간의 함수로 강조되지 않았다.
● 1차 KEGG 대사 경로를 고려할 때, 그룹 A(비타민 B2 5ppm)에서는 유전 정보 처리 및 유기체 시스템의 상대적인 풍부도가 증가하는 한편, 처리된 그룹(비타민 B2 50 및 100ppm)에서는 환경 정보 처리 및 대사가 증가한다.
● 상대적 풍부도가 ≥0.5%인 2차 KEGG 대사 경로를 살펴보면 결과는 각 시점에 있어서 세 실험 그룹 간의 현저한 구성 차이를 강조한다. 특히, 보조 인자와 비타민의 대사, 막 수송, 복제 및 수선, 다른 2차 대사 산물의 생합성, 테르페노이드 및 폴리케티드의 대사 및 기타 아미노산의 대사의 상대적 풍부도는 비타민 B2 50 및 100ppm으로 처리된 그룹에서 증가한다. 반면, 비타민 B2가 5ppm인 대조군에서는 번역, 에너지 대사, 신호 전달, 전사, 전염성 질환 및 환경 적응이 통계적으로 증가하였다.
● 3차 KEGG 대사 경로를 살펴보면, 14일령에는 실험군간에 차이가 보고되지 않았으며, 많은 경로가 28일령과 42일령에 유의한 차이를 보였다. 특히 흥미로운 것은 지방산 생합성, 포스포트랜스퍼라제 시스템(PTS) 및 부타노에이트 대사와 같은 대사 경로가 처리된 군(비타민 B2 50 및 100ppm)에서 증가하였고 SCFA 생산과 관련이 있다는 것이다. 또한, 니코티네이트 및 니코틴아미드 대사, 판토테네이트 생합성, 폴레이트 생합성, 비오틴 대사 및 비타민 B6 대사와 같은 비타민 B 경로에 대해 처리된 그룹에서의 통계적으로 유의한 증가가 보고되었다.
● 부티레이트 생성과 관련하여 28일령에 최소 7개, 42일령에 5개 이상의 대사 기능이 대조군(5ppm 비타민 B2)에 비해 처리된 그룹(비타민 B2 50 및 100ppm)에서 통계적으로 증가하였다. 이 증거는 리비에르 등(2016)에 의해 보고된 비피도박테리아의 교차 섭식 활동에 의해 파에칼리박테리움 및 유박테리움[잼(Zam) 등, 2016, 롤랜드 등, 2018] 같은 다른 미생물 속과 관련될 수 있다. 이 모든 속은 미생물 분석에 의해 본 연구에서 확인되었으며, 이러한 결과는 비타민 B2로 처리된 동물에서 잠재적인 부티레이트 생산을 예측할 수 있다.
실시예 4
돼지 모델
물질 및 방법
3마리의 돼지에게 4주 동안 상업적 사료를 제공하였다. 사료는 보리, 밀, 대두박을 주원료로 포함하였으며, 주요 화학 구성은 다음과 같았다(g/kg): 조단백 151, 조지방 34, 조섬유 40, 회분 55. 실험 기간이 시작될 때(평균 23.9±1.01Kg)와 마지막에(평균 43.3±3.56Kg) 동물의 체중을 개별적으로 측정하였다. 적응 30일 후 동물을 도살하였다. 유리 전극 pH 측정기[크리슨(CRISON) 507, 크리슨(CRISON), 스페인 바르셀로나)를 사용하여 위, 소장 및 후장 내용물의 pH를 직접 측정하였다. 위 및 소장 내용물은 즉시 여과 및 채취하고 -20℃에서 보관하여 생체 외 소화율을 평가하기 위한 소화 접종으로 사용되었다. 맹장 내용물과 관련하여 한 부분을 즉시 채취하여 20ml 튜브에 분배하고 액체 질소에서 냉동하고 -80℃에서 보관하여 시험관내 가스 생산 연구를 위한 냉동 접종물로 사용하였다. 다른 부분은 신선한 발효 접종물로 직접 사용되었다.
시험관내 효소 소화
돼지의 위와 소장에서 효소 소화율을 결정하기 위해 두 가지 실험을 수행하였다:
A. 외인성 효소 사용:
보이센(Boisen) 및 페르난데즈(Fernandez)(1997)의 3단계 방법에 따라 시험관내 효소 소화율을 측정하기 위해, 0.5g의 기질만 포함하거나 3가지 유바이오틱스가 보충된 기질 0.5g을 함유하는 삼각 플라스크(총 부피 100mL)를 각 처리에 대해 2회 배양하였다. 소화율은 하기를 이용하여 결정하였다:
[1] 펩신
[2] 펩신+판크레아틴
[3] 펩신+판크레아틴+비스코자임
B. 위 내용물 및 소장 내용물 사용:
유사한 효소 소화 절차를 따랐지만, 이 경우에는 펩신과 판크레아틴 용액을 각 동물의 위 내용물 및 소장 내용물로 대체하여 보이센 및 페르난데즈(1997)의 세 번째 단계를 제거하였다. 소화율은 하기를 사용하여 결정하였다:
위 내용물(9mL)
위 내용물+소장 내용물(9mL)
시험관내 가스 생산
맹장 내용물의 미생물 발효 패턴은 가스 생산 기술[테오도루(Theodorou) 등, 1994. Anim Feed Sci Technol 48: 185-1-97]에 의해 시험관 내에서 연구되었다. 맹장 전에 발생하는 소화 과정을 시뮬레이션하기 위해, 0.8g의 사전 소화된 사료(보이센 및 페르난데즈 1997 Anim Feed Sci Technol 51: 29-43의 절차에 따라 펩신-HCl 및 판크레아틴 배양에서 연속적으로 배양하였음)를 단독으로 또는 비타민 B2로 보충하여 기질로서 사용하였다. 먼저, 각 처리를 위해 3개의 유리 병(110mL 총 부피)을 배양 용액 56mL로 채웠다. 각 처리를 위해 돼지 3마리 각각의 맹장 내용물을 CO2 대기하에 배양 용액과 2:1로 혼합하였으며, 워링 블렌더로 수분간 균질화시켰다(맹장 내용물은 총 배양 용액 0.20을 시사함). 이어, 혼합물 24mL를 각 병에 첨가하여 총 액체 부피 80mL를 채웠다. 또한, 기질이 없는 병 3개도 블랭크로 포함하였다. 병을 CO2 스트림하에 밀봉하고 39℃에서 12시간 동안 배양하였다. TP804 압력 게이지가 장착된 HD 2124.02 압력계[델타 옴(Delta Ohm), 이탈리아 카셀레 디 셀바자노]를 사용하여, 전체 배양 기간에 걸쳐 2시간마다 압력을 기록하였다. 판독 값은 동일한 조건하에 동일한 병에서 기록된 압력과 알려진 공기 부피(n=103; R2=0.996) 사이에 미리 설정된 선형 회귀 방정식에 의해 부피로 변환되었다. 각 배양 시간에 대해 기록된 가스 부피는 배양된 유기물(OM) 단위당으로 표현되었다. 메탄(CH4) 농도는 매 6시간 간격으로 측정하였다. 6시간 및 12시간 배양 샘플을 수집하고, 0.1N HCl로 1:1 산성화시키거나 0.5M PO4H3와 2mg/ml 4-메틸 발레르산과 0.5M PO4H3의 탈단백질화 혼합물 0.5ml에 첨가하였으며, 각각 암모니아 및 휘발성 지방산(VFA) 농도 측정을 위해 -20℃에서 저장하였다. 시험관 내 가스 생산 절차는 신선한 접종물과 냉동 접종물 둘 다에 대해 동일하지만, 맹장 내용물의 냉동 샘플을 해동시키기 위해 5분 동안 38℃에서 미리 유지시켰다는 유일한 차이점이 있다.
가스 생산의 경우, 공여자 돼지를 블록으로, 내용물(신선 대 냉동)을 주 플롯으로, 처리를 서브 플롯으로 고려하여 분할-플롯 디자인으로 각 배양 시간에 대해 결과를 분석하였다. 소화기 내용물(위장 대 소장)에서 얻은 결과를 메인 플롯으로 분석하기 위해 동일한 디자인을 사용했다. 실험적 변동성의 원인이 없기 때문에, 시험관내 효소 결과는 통계적으로 분석되지 않았다. 차이는 P<0.05일 때 유의한 것으로 간주되었고, 유의성 경향은 0.05 ￡ P<0.10일 때 고려되었으며, 유의할 경우 차이를 P<0.05에서 터키 t 시험(Tukey t test)에 의해 비교하였다.
결과
생체외 및 효소 소화
위 내용물을 사용하면 기질 소화율이 대조군에 비해 비타민 B2를 가질 때 가장 높은(P<0.05) 것으로 관찰되었다. 이러한 차이는 소장 내용물로 소화시킨 후 최소화되었으며, 처리 간 차이는 기록되지 않았다(P>0.05).
외인성 효소로 관찰된 기질 소화율의 결과는 소화물 내용물로 기록된 결과와 일치했지만, 펩신-HCl 소화 정도는 위장 내용물보다 약간 낮았다. 따라서, 펩신-HCl에서 배양했을 때 비타민 B2가 보충된 기질을 사용하여 기록된 소화율은 다른 처리보다 높았다. 그러나, 처리가 (P+판크레아틴) 및/또는 (P+P+비스코자임)에서 배양되었을 때 처리 간의 차이는 관찰되지 않았다. 결과는 두 가지 방법이 돼지의 효소 소화를 평가하는데 유효함을 나타낸다.
시험관내 가스 생산
평균적으로, 신선한 맹장 내용물로 배양된 처리로부터의 가스 생산 패턴은 냉동 맹장 내용물로 기록된 것과 다르지 않았으나(P>0.05); 4시간 배양에서는 신선한 내용물을 사용한 가스의 부피가 더 높은 경향이 있었다(P=0.081). 평균적으로, 비타민 B2를 사용하여 기록된 가스의 부피는 4, 10 및 12시간 배양에서 대조군보다 더 높았다(P<0.05).
배양 기간 동안 보존 유형과 처리 사이의 상호 작용은 유의하지 않았으며(P<0.05), 이는 맹장 내용물의 응결에도 불구하고 처리가 유사하게 작용했음을 나타낸다.
메탄 생산
CH4 생산과 관련하여, 신선한 접종물과 냉동 접종물 사이에서 12시간 배양을 따라 차이(P>0.05)가 기록되지 않았다. 12시간 배양까지, 총 가스의 CH4 비율에 대한 처리 간의 차이(P>0.05)가 기록되지 않았지만, 수치적으로 비타민 B2를 사용하여 기록된 CH4가 가장 낮았다. 유사하게, CH4 생산이 배양 기질 단위당 부피로 표현되었을 때, 6시간 또는 12시간 배양에서 처리간에 유의한 차이가 기록되지 않았으나, 처리 사이의 순위는 비타민 B2가 6시간 배양 및 12시간 배양에서 가장 낮은 축적된 CH4를 기록한 것으로 나타났다.
비타민 B2를 사용하여 관찰된 결과는, 비타민 B2가 에너지 생성에 중요한 역할을 하여 탄수화물 분해를 돕는 것으로 알려져 있기 때문에, 이 비타민이 후장 세균 종의 활성에 긍정적인 영향을 미칠 수 있음을 의미한다. 또한, 메탄 생성의 감소는 비타민 B2가 메탄 생성 세균 또는 고세균 개체군의 활동을 감소시킬 수 있다는 사실에 의해 설명될 수 있다.
총 휘발성 지방산 농도(TVFA), VFA의 몰 비율 및 암모니아 생산
맹장 접종물의 보존의 경우 총 VFA의 농도, VFA의 몰 비율 또는 암모니아 농도에 대한 처리 간의 차이가 기록되지 않았다. 이는 시험된 실험 처리에 의해 맹장 발효 프로필에 대한 주요 효과가 촉진되지 않았음을 나타낸다.
결론적으로, 비타민 B2는 위장 수준에서 명백한 긍정적인 반응(펩신 활동을 자극할 수 있음) 및 후장 수준에서 명백한 긍정적인 반응(미생물 활동을 향상시킴)을 보였다.

Claims (41)

  1. 인간을 비롯한 동물의 장 건강 개선에 사용하기 위한, 리보플라빈, 비타민 A, 비타민 C, 비타민 D, 비타민 E, 비타민 K, 엽산, β-카로틴, 비타민 B1, 니아신, 비타민 B5, 비타민 B6, 비오틴, 비타민 B12, 오메가-3 지방산 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 활성제로서,
    상기 개선이
    i. 장에서 하나 이상의 단쇄 지방산 또는 이의 염의 농도 증가,
    ii. 장내 미생물총 다양성 증가,
    iii. 장내 유익균의 풍부도 증가,
    iv. 장내 부티레이트 합성 경로의 촉진 또는 증가,
    v. 장의 장벽 기능 개선,
    vi. 장의 산화환원 전위 감소,
    vii. 장내 가스 생산량 감소, 및/또는
    viii. 장 면역 반응 자극
    을 포함하거나 이것으로 이루어지고,
    상기 사용이
    a) 대장으로 전달되는 유효 투여량의 활성제를 포함하는 제형; 또는
    b) 적어도 유효량의 활성 성분이 동물의 장에 존재하도록 하는 과생리적 투여량의 활성 성분
    을 동물에게 투여함을 포함하되,
    니아신이 존재하는 경우, 니아신이 유일한 활성 성분이 아니고,
    리보플라빈이 존재하는 경우, 리보플라빈이 파에칼리박테리움 프라우스니치(Faecalibacterium prausnitzii)의 양을 증가시키는 것 외의 개선 효과를 갖는, 활성제.
  2. 제 1 항에 있어서,
    동물이 인간이고, 유효 투여량의 활성제가 지연 방출 제형에 의해 전달되는, 활성제.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    개선이 장에서 하나 이상의 단쇄 지방산 또는 이의 염의 농도 증가; 또는 장내 부티레이트 합성 경로의 촉진 또는 증가를 포함하고,
    상기 단쇄 지방산이 아세트산, 프로피온산, 부티르산 및 이들의 염으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 활성제.
  4. 제 3 항에 있어서,
    비타민 A, β-카로틴, 비타민 C, 리보플라빈, 비타민 D, 비타민 E, 비타민 K, 엽산, 오메가-3 지방산 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 활성제.
  5. 제 3 항 또는 제 4 항에 있어서,
    인간을 비롯한 동물이 대사 장애, 제 2 형 당뇨병, 비만, 만성 염증 및 죽종 형성으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환을 앓는, 활성제.
  6. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    개선이 장내 미생물총 다양성 증가를 포함하는, 활성제.
  7. 제 6 항에 있어서,
    미생물총 다양성이 증가되고/되거나 유익균의 풍부도가 결장에서 증가되는, 활성제.
  8. 제 6 항 또는 제 7 항에 있어서,
    증가되는 유익균이 애시드아미노코쿠스(Acidaminococcus), 아케르만시아 종(Akkermansia sp.), 박테로이데스 오바투스(Bacteroides ovatus), 비피도박테리움 종(Bifidobacterium spp.), 블라우티아 프로둑타(Blautia producta), 클로스트리듐 코클레아툼(Clostridium cocleatum), 콜린셀라 아에로파시엔스(Collinsella aerofaciens), 도레아 롱기카테나(Dorea longicatena), 에스케리치아 콜리(Escherichia coli), 유박테리움 종(Eubacterium spp.), 파에칼리박테리움 프라우스니치(Faecalibacterium prausnitzii), 라크노스피라 펙티노쉬자(Lachnospira pectinoshiza), 락토바실러스 종(Lactobacillus spp.), 파라박테로이데스 디스타소니스(Parabacteroides distasonis), 라오울텔라 종(Raoultella spp.), 로세부리아 종(Roseburia spp.), 루미노코쿠스 종(Ruminococcus spp.), 스트렙토코쿠스 종(Streptococcus spp.) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 활성제.
  9. 제 6 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
    증가되는 세균이 비피도박테리움, 아케르만시아, 파에칼리박테리움 및 박테로이데스로 이루어진 군으로부터 선택되는, 활성제.
  10. 제 6 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
    인간을 비롯한 동물이 과민성 대장 증후군, 대사 질환, 비만 및 염증 상태로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환을 앓는, 활성제.
  11. 제 6 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
    비타민 B1, 비타민 B2, 비타민 B5, 비타민 B6, 비타민 B12, β-카로틴, 비오틴, 비타민 C, 비타민 E, 비타민 D, 엽산, 비타민 K, 오메가-3 지방산 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 활성제.
  12. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    개선이 장의 장벽 기능 개선을 포함하는, 활성제.
  13. 제 12 항에 있어서,
    인간을 비롯한 동물이 과민성 대장 증후군, 크론병, 궤양성 대장염, 장 누수 및 영양 실조로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환을 앓는, 활성제.
  14. 제 12 항 또는 제 13 항에 있어서,
    비타민 B2, 비타민 C, 비타민 E, 오메가-3 지방산, 비타민 D, 비타민 A, 엽산, 비타민 K1 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 활성제.
  15. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    개선이 장의 산화환원 전위 감소를 포함하는, 활성제.
  16. 제 15 항에 있어서,
    감소되는 산화환원 전위가 결장에서 극혐기성 유익균의 성장 촉진, 장내 내기성 병원성 유기체 감소, 혈장 유리 티올 감소, 장내 염증 감소, 및 장내 염증으로 인한 세포 손상 감소로 이루어진 군으로부터 선택되는 이점을 야기하는, 활성제.
  17. 제 15 항 또는 제 16 항에 있어서,
    비타민 C, 비타민 E 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 활성제.
  18. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    개선이 장내 가스 생산량 감소인, 활성제.
  19. 제 18 항에 있어서,
    비타민 B2, 비타민 C, 비타민 E 또는 이들의 조합인 활성제.
  20. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    개선이 장 면역 반응 자극인, 활성제.
  21. 제 20 항에 있어서,
    면역 반응이 GROa-CXCL1, MIP3A-CCL20, 인터류킨 8 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 면역 반응 분자의 증가인, 활성제.
  22. 제 20 항 또는 제 21 항에 있어서,
    비타민 B2, 비타민 E, 비타민 D, 비타민 A, 비타민 K 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 활성제.
  23. 리보플라빈, 비타민 A, 비타민 C, 비타민 D, 비타민 E, 비타민 K, 엽산, β-카로틴, 비타민 B1, 니아신, 비타민 B5, 비타민 B6, 비오틴, 비타민 B12, 오메가-3 지방산 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 활성제를 동물에게 투여함을 포함하는, 인간을 비롯한 동물의 장 건강을 개선하는 방법으로서,
    상기 개선이
    i. 장에서 하나 이상의 단쇄 지방산 또는 이의 염의 농도 증가,
    ii. 장내 미생물총 다양성 증가,
    iii. 장내 유익균의 풍부도 증가,
    iv. 장내 부티레이트 합성 경로의 촉진 또는 증가,
    v. 장의 장벽 기능 개선,
    vi. 장의 산화환원 전위 감소,
    vii. 장내 가스 생산량 감소, 및/또는
    viii. 장 면역 반응 자극
    을 포함하거나 이것으로 이루어지고,
    상기 활성제가
    a) 대장으로 전달되는 유효 투여량의 활성제를 포함하는 제형; 또는
    b) 적어도 유효량의 활성 성분이 동물의 장에 존재하도록 하는 과생리적 투여량의 활성 성분
    에 존재하되,
    니아신이 존재하는 경우, 니아신이 유일한 활성 성분이 아니고,
    리보플라빈이 존재하는 경우, 리보플라빈이 파에칼리박테리움 프라우스니치의 양을 증가시키는 것 외의 개선 효과를 갖는, 방법.
  24. 제 23 항에 있어서,
    동물이 인간이고, 활성제가 대장으로 전달되는, 방법.
  25. 제 23 항에 있어서,
    활성제가 과생리적 투여량으로 존재하는, 방법.
  26. 제 23 항에 있어서,
    개선이 동물에서 하나 이상의 단쇄 지방산을 증가시키고/시키거나 부티레이트 합성 경로 활성을 증가시키는 것인, 방법.
  27. 제 26 항에 있어서,
    동물이 대사 장애, 제 2 형 당뇨병, 비만, 만성 염증 및 죽종 형성으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환을 앓는, 방법.
  28. 제 26 항에 있어서,
    비타민 A, 비타민 C, 리보플라빈, 비타민 E, 엽산, β-카로틴, 오메가-3 지방산 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 활성제를 투여함을 포함하는 방법.
  29. 제 23 항에 있어서,
    개선이 장내 미생물총 다양성 증가 또는 장내 유익균의 풍부도 증가인, 방법.
  30. 제 29 항에 있어서,
    활성제가 비타민 B1, 리보플라빈, 비타민 B5, 비타민 B12, β-카로틴, 비오틴, 비타민 C, 비타민 E, 비타민 D, 엽산, 비타민 K, 오메가-3 지방산 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되되,
    리보플라빈이 활성제인 경우, 리보플라빈이 파에칼리박테리움 프라우스니치의 풍부도를 증가시키는 것 이외의 목적으로 존재하는, 방법.
  31. 제 29 항에 있어서,
    유익균 강화량의 활성제를 동물의 결장에 투여함을 포함하는, 과민성 대장 증후군, 대사 질환, 비만 또는 염증 상태의 증상을 치료, 예방 또는 경감시킬 필요가 있는 인간을 비롯한 동물에서 상기 증상을 치료, 예방 또는 경감시키는 방법으로서,
    상기 활성제가 비타민 B1, 리보플라빈, 비타민 B5, 비타민 B12, β-카로틴, 비오틴, 비타민 C, 비타민 E, 비타민 D, 엽산, 비타민 K, 오메가-3 지방산 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되되,
    리보플라빈이 활성제인 경우, 리보플라빈이 파에칼리박테리움 프라우스니치의 풍부도를 증가시키는 것 이외의 목적으로 존재하는, 방법.
  32. 제 23 항에 있어서,
    개선이 장 면역 반응 자극인, 방법.
  33. 제 32 항에 있어서,
    인간을 비롯한 동물이 급성 또는 만성 염증을 앓는, 방법.
  34. 제 33 항에 있어서,
    활성제가 리보플라빈, 비타민 E, 비타민 A, 비타민 K 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  35. 제 32 항에 있어서,
    개선이 장의 산화환원 전위 감소이고, 이로 인해 결장에서 극혐기성 유익균의 성장 촉진, 장내 내기성 병원성 유기체 감소, 장내 염증 감소, 및 장내 염증으로 인한 장내 세포 손상 감소로 이루어진 군으로부터 선택되는 이점을 야기하는, 방법.
  36. 제 35 항에 있어서,
    활성제가 리보플라빈, 비타민 C, 비타민 E 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  37. 제 23 항에 있어서,
    개선이 장내 가스 생산량 감소를 치료, 예방 또는 경감시키는 것인, 방법.
  38. 제 23 항 또는 제 37 항에 있어서,
    활성제가 비타민 B2, 비타민 C 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  39. 제 23 항에 있어서,
    개선이 장의 장벽 기능 개선인, 방법.
  40. 제 39 항에 있어서,
    장의 장벽 기능 개선이 과민성 대장 증후군, 크론병, 궤양성 대장염, 장 누수 및 영양 실조로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환의 증상을 치료, 예방 또는 경감시키는 방법인, 방법.
  41. 제 40 항에 있어서,
    활성제가 리보플라빈, 비타민 C, 비타민 E, 오메가-3 지방산, 비타민 D, 비타민 A, 엽산, 비타민 K 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
KR1020217005853A 2018-08-29 2019-08-28 장 건강 개선을 위한 제형 KR20210087927A (ko)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP18191556 2018-08-29
EP18191556.2 2018-08-29
EP19173182 2019-05-07
EP19173182.7 2019-05-07
PCT/EP2019/073012 WO2020043797A1 (en) 2018-08-29 2019-08-28 Formulations for improving gut health

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20210087927A true KR20210087927A (ko) 2021-07-13

Family

ID=67770532

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020217005853A KR20210087927A (ko) 2018-08-29 2019-08-28 장 건강 개선을 위한 제형

Country Status (10)

Country Link
US (1) US20220288103A1 (ko)
EP (1) EP3843784A1 (ko)
JP (1) JP2021535086A (ko)
KR (1) KR20210087927A (ko)
CN (1) CN112638421A (ko)
AU (2) AU2019328475B2 (ko)
BR (1) BR112021003633A2 (ko)
CO (1) CO2021003893A2 (ko)
MX (1) MX2021002207A (ko)
WO (1) WO2020043797A1 (ko)

Families Citing this family (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111938158B (zh) * 2020-08-18 2023-07-07 广东弘元普康医疗科技有限公司 一种防止肠道Akkermansia muciniphila菌丰度降低的组合物
EP4236914A1 (en) * 2020-10-28 2023-09-06 DSM IP Assets B.V. Direct delivery of vitamins to inhibit microbial pathogens
US20230404970A1 (en) * 2020-10-28 2023-12-21 Dsm Ip Assets B.V. Direct delivery of vitamins to rebalance gut microbiome after exposure to antibiotics
EP4280891A1 (en) * 2021-01-19 2023-11-29 DSM IP Assets B.V. Methods of selectively promoting gastrointestinal microbial growth
KR20230154047A (ko) * 2021-03-05 2023-11-07 디에스엠 아이피 어셋츠 비.브이. 소화관 마이크로바이옴에서 블라우티아 종의 개체수를 증가시키는 방법
CN114452275A (zh) * 2022-02-25 2022-05-10 中国科学技术大学 维生素B5在制备预防和/或治疗Th17细胞相关疾病的药物或制剂中的应用
WO2023237675A1 (en) 2022-06-10 2023-12-14 Dsm Ip Assets B.V. Vitamin b2 for use in improving gut health
WO2023237686A1 (en) * 2022-06-10 2023-12-14 Dsm Ip Assets B.V. Combinations comprising vitamin c and lactobacillus rhamnosus
WO2023237680A1 (en) 2022-06-10 2023-12-14 Dsm Ip Assets B.V. Combinations comprising vitamin c and bifidobacterium animalis ssp. lactis
WO2023237685A1 (en) 2022-06-10 2023-12-14 Dsm Ip Assets B.V. Combinations comprising vitamin and bacillus coagulans
WO2023237673A1 (en) 2022-06-10 2023-12-14 Dsm Ip Assets B.V. Combinations comprising vitamin c and bifidobacterium animalis ssp. lactis
WO2023237678A1 (en) 2022-06-10 2023-12-14 Dsm Ip Assets B.V. Combinations comprising vitamin c and bifidobacterium animalis ssp. lactis
WO2023237681A1 (en) * 2022-06-10 2023-12-14 Dsm Ip Assets B.V. Combinations comprising vitamin c and bifidobacterium animalis ssp. lactis
WO2023237688A1 (en) 2022-06-10 2023-12-14 Dsm Ip Assets B.V. Combinations comprising vitamin c and lactobacillus rhamnosus
WO2023237672A1 (en) 2022-06-10 2023-12-14 Dsm Ip Assets B.V. Vitamin b1 for use in improving gut health
WO2023237677A1 (en) 2022-06-10 2023-12-14 Dsm Ip Assets B.V. Combinations comprising vitamin c and bifidobacterium animalis ssp. lactis
WO2023237682A1 (en) 2022-06-10 2023-12-14 Dsm Ip Assets B.V. Combinations comprising vitamin b2 and lactobacillus rhamnosus
WO2023237674A1 (en) 2022-06-10 2023-12-14 Dsm Ip Assets B.V. Vitamin b2 for use in improving gut health
WO2023237676A1 (en) 2022-06-10 2023-12-14 Dsm Ip Assets B.V. Vitamins for use in improving gut health
WO2023237689A1 (en) 2022-06-10 2023-12-14 Dsm Ip Assets B.V. Combinations comprising vitamin c and lactobacillus rhamnosus
WO2023237679A1 (en) 2022-06-10 2023-12-14 Dsm Ip Assets B.V. Combinations comprising vitamin b2 and lactobacillus rhamnosus
WO2023237683A1 (en) 2022-06-10 2023-12-14 Dsm Ip Assets B.V. Combinations comprising vitamin c and bacillus coagulans
WO2023237687A1 (en) 2022-06-10 2023-12-14 Dsm Ip Assets B.V. Combinations comprising vitamin b2 and lactobacillus rhamnosus
WO2023237684A1 (en) 2022-06-10 2023-12-14 Dsm Ip Assets B.V. Combinations comprising vitamin c and lactobacillus rhamnosus
CN117899078A (zh) * 2023-12-08 2024-04-19 中国科学技术大学 维生素b6在制备预防和/或治疗nlrp6炎症小体相关疾病的药物中的应用

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2432358A1 (en) * 2003-06-13 2004-12-13 Medical Futures Inc. Nutritional supplementation for treating deficiency states in bowel disease
JP4694777B2 (ja) * 2003-08-01 2011-06-08 日東薬品工業株式会社 生菌組成物
WO2007058523A1 (en) 2005-11-17 2007-05-24 N.V. Nutricia Composition with docosapentaenoic acid
DE102006062250A1 (de) 2006-12-22 2008-06-26 Roland Saur-Brosch Verwendung einer Zusammensetzung aus Mineralstoffen und/oder Vitaminen und gegebenenfalls acetogenen und/oder butyrogenen Bakterien zur oralen oder rektalen Verabreichung für die Behandlung und Vorbeugung von abdominalen Beschwerden
WO2009157759A1 (en) * 2008-06-23 2009-12-30 N.V. Nutricia Nutritional composition for improving the mammalian immune system
WO2010117274A1 (en) 2009-04-08 2010-10-14 Stichting Top Institute Food And Nutrition Carbohydrates enhancing the production of a c5 and/or a c6 scfa
MX2013011834A (es) * 2011-04-12 2014-02-11 Nestec Sa Composiciones nutricionales que incluyen acidos grasos de cadena ramificada y metodos para utilizar las mismas.
US9433583B2 (en) 2011-04-22 2016-09-06 Frank J. Farrell Colon vitamin
EP3345606A1 (en) 2012-11-01 2018-07-11 Rijksuniversiteit Groningen Methods and compositions for stimulating beneficial bacteria in the gastrointestinal tract
WO2016053085A1 (en) 2014-09-30 2016-04-07 N.V. Nutricia Composition comprising a uridine source and butyrate producing fibres for preventing gastrointestinal disorders
US9668991B1 (en) * 2015-12-09 2017-06-06 International Business Machines Corporation SCFA colonic composition
CN115176998A (zh) * 2016-04-14 2022-10-14 可劳迈戴斯有限公司 烟酰胺核苷、烟酸核苷、烟酰胺单核苷酸和烟碱基化合物衍生物在婴儿配方中的用途
WO2017182347A1 (en) 2016-04-19 2017-10-26 Conaris Research Institute Ag Shellac microcapsule formulations and compositions for topical intestinal delivery of vitamin b3
CN108117991B (zh) * 2017-11-03 2021-03-30 湖南海路生物科技有限公司 检测乙酸、异丁酸和/或戊酸含量的产品在制备揭示便秘患者的肠道微生态存在失衡的产品中的用途
CN107927794A (zh) * 2017-12-20 2018-04-20 北京康比特体育科技股份有限公司 一种益生菌功能食品组合物及其制备方法
CN108185195A (zh) * 2018-02-07 2018-06-22 佛山市雷米高动物营养保健科技有限公司 快速减少犬排泄物异味的食用组合物及其制备方法与应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN112638421A (zh) 2021-04-09
JP2021535086A (ja) 2021-12-16
AU2019328475B2 (en) 2023-02-16
EP3843784A1 (en) 2021-07-07
AU2021100940A4 (en) 2021-04-29
CO2021003893A2 (es) 2021-04-19
BR112021003633A2 (pt) 2021-07-27
AU2019328475A1 (en) 2021-02-18
WO2020043797A1 (en) 2020-03-05
MX2021002207A (es) 2021-07-15
US20220288103A1 (en) 2022-09-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR20210087927A (ko) 장 건강 개선을 위한 제형
Ghosh et al. Regulation of intestinal barrier function by microbial metabolites
Pham et al. Vitamins, the gut microbiome and gastrointestinal health in humans
Goncalves et al. Fat-soluble vitamin intestinal absorption: absorption sites in the intestine and interactions for absorption
Zhang et al. Evaluation of the efficacy of chlorogenic acid in reducing small intestine injury, oxidative stress, and inflammation in chickens challenged with Clostridium perfringens type A
CN101868235A (zh) 抑制dsRNA-依赖性蛋白激酶激活和抑制肿瘤生长的组合物和方法
Wan et al. Protective effects of lycopene on mitochondrial oxidative injury and dysfunction in the liver of aflatoxin B1-exposed broilers
US20230105336A1 (en) Direct delivery of antioxidants to the gut
Li et al. Eugenol, a major component of clove oil, attenuates adiposity, and modulates gut microbiota in high‐fat diet‐fed mice
KR101850308B1 (ko) 홍국 추출물을 포함하는 장 건강 개선용 조성물
Pacheva et al. Targeted biomedical treatment for autism spectrum disorders
Burgos-Edwards et al. Effects of gastrointestinal digested polyphenolic enriched extracts of Chilean currants (Ribes magellanicum and Ribes punctatum) on in vitro fecal microbiota
Wei et al. Grape seed procyanidins improve intestinal health by modulating gut microbiota and enhancing intestinal antioxidant capacity in weaned piglets
Hu et al. Effects of Lactobacillus plantarum FZU3013-fermented Laminaria japonica on lipid metabolism and gut microbiota in hyperlipidaemic rats
Zhao et al. Multi-omics reveals the mechanisms underlying Lactiplantibacillus plantarum P8-mediated attenuation of oxidative stress in broilers challenged with dexamethasone
Wen et al. Effects of stevia extract on production performance, serum biochemistry, antioxidant capacity, and gut health of laying hens
Ge et al. Preparation of microgels loaded with lycopene/NMN and their protective mechanism against acute liver injury
KR101862132B1 (ko) 홍국 추출물을 포함하는 장 건강 개선용 조성물
WO2019217275A1 (en) Methods and compositions for treating or preventing gut barrier dysfunction
Wei et al. Dietary organic acids modulate gut microbiota and improve growth performance of nursery pigs. Microorganisms. 2021; 9: 110
JP6426991B2 (ja) 体脂肪減少促進剤
CA3045073C (en) Nutritional composition useful in the treatment of neoplastic diseases
WO2022163663A1 (ja) 遺伝子突然変異を抑制する薬剤及び健康食品
Salles et al. Associating Inulin with a Pea Protein Improves Fast-Twitch Skeletal Muscle Mass and Muscle Mitochondrial Activities in Old Rats. Nutrients 2023, 15, 3766
Hong et al. Association analysis of transcriptome and quasi-targeted metabolomics reveals the regulation mechanism underlying broiler muscle tissue development at different levels of dietary guanidinoacetic acid