CN101868235A - 抑制dsRNA-依赖性蛋白激酶激活和抑制肿瘤生长的组合物和方法 - Google Patents

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H·L·埃雷
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Abstract

本发明涉及在哺乳动物个体中预防和治疗疾病的组合物和方法，该组合物包括至少一种双链RNA依赖性蛋白激酶抑制剂(PKR-I)，该抑制剂在治疗前或者治疗同时给药，其中所述治疗导致dsRNA-依赖性蛋白激酶活化的抑制。本发明的组合物和方法还包括至少一种增效剂，它能够进一步增强PKR-I对磷酸化的抑制。

Description

抑制dsRNA-依赖性蛋白激酶激活和抑制肿瘤生长的组合物和方法
技术领域
本发明涉及在哺乳动物个体中预防和治疗疾病的组合物和方法，它包括至少一种双链RNA依赖性蛋白激酶抑制剂(PKR-I)，该抑制剂在治疗前或者与治疗同时使用，其中所述治疗使得dsRNA-依赖性蛋白激酶的激活受到抑制。本发明的组合物和方法还包括至少一种增效剂，它可以进一步增强对PKR-I磷酸化的抑制。
背景技术
恶病质通常与多种疾病状态有关，包括与严重疾病相关的急性炎性进程和慢性炎性疾病，例如癌症、败血症、充血性心衰、类风湿性关节炎、慢性阻塞性肺病和人类免疫缺陷性病毒感染。它也与其他已知的肌肉萎缩性疾病和病症有关，例如，肌肉缺失症、老年性肌肉质量损失。恶病质造成了所有癌症患者中10％-22％的死亡，造成了由败血症导致的器官功能障碍和外伤事件发生后数日至数周营养不良所产生的约15％的创伤死亡。
癌症患者(尤其是那些胃肠道癌症患者)呈现出进行性骨骼肌萎缩或恶病质，从而进一步导致其生活质量和存活时间下降。患者的癌症恶病质的特征在于厌食、体重下降、过早的饱腹感、虚弱(力量没有实际损失的虚弱感)、瘦肉损失(loss of lean body mass)和多器官功能障碍。与癌症恶病质有关的瘦肉损失不仅使得个体虚弱并使得日常生活困难，而且使得患者虚弱到没有力量进行化疗和/或放疗。
恶病质是由于蛋白合成减少(hypoanabolism)和内源性蛋白分解增加(异化作用)以及因而产生的氨基酸的氧化作用的组合原因所导致的(O′Keefe，S.J.D.等，Cancers Res.，50：1226-1230，1990)。蛋白降解增强的机制归因于泛素蛋白酶体蛋白水解通路的表达增强。Khal，J.等，Int.J.Biochem.Cell.Biol，37：2196-2206，2005。对于癌症恶病质中无法持续进行蛋白合成的机制依然是未知的。然而，直到最近，才有人提出了可以解释恶病质中蛋白合成降低和肌纤维蛋白降解增加的机制。该机制涉及双链RNA-依赖性蛋白激酶(PKR)通过自体磷酸化的激活。通过试剂例如PIF(蛋白水解诱导因子)和Ang II(血管紧张素II)对PKR的激活导致了真核生物起始因子2α(eIF2α)的磷酸化，从而通过与鸟嘌呤核苷酸交换因子(eIF2B)竞争抑制了转译起始，它阻止了eIF2自其GDP结合状态转化为活性GTP结合形式。Russell，S.T.等，Cell.Signalling，19：1797-1806，2007。
通过转译起始调控蛋白合成
转译起始的调控包括(i)启动子甲硫氨酰基转移核糖核酸(met-tRNA)与40s核糖体亚基的结合；和(ii)mRNA与43s预启动复合物的结合。在第一步中，met-tRNA作为真核生物起始因子2(eIF2)和鸟嘌呤核苷三磷酸盐(GTP)的三元复合物与40s核糖体亚基结合。在该步骤后，GTP水解为鸟嘌呤核苷二磷酸盐(GDP)，将eIF2自三元复合物中释放出来。eIF2必须交换GTP和GDP从而参与另一轮的起始。这可以通过另一个真核生物起始因子2(eIF2B)的作用而发生，它介导了鸟嘌呤核苷酸在eIF2上的交换。eIF2B通过eIF2在其α亚基上的eIF2B磷酸化进行调控，这将其自底物转换到eIF2B竞争性抑制剂上。
在第二步中，mRNA与43s预启动复合物的结合需要一组统称为eIF4F的蛋白，它是一种多亚基复合物，由eIF4A(一种RNA螺旋酶)、eIF4B(它与eIF4A结合形成mRNA的5′未转译域中的展开的二级结构)、eIF4E(它与mRNA的5′末端上存在的m7GTP cap结合)和eIF4G(它作为eIF4E、eIF4A和mRNA的结构支架发挥作用)组成。eIF4F复合物共同用于识别、展开并引导mRNA与43s预启动复合物的结合。用于形成eIF4F复合物的eIF4E的有效性似乎可以通过转译阻遏剂eIF4E-结合蛋白1(4E-BP1)进行调控。然后，4E-BP1与eIF4G竞争结合eIF4E，能够将eIF4E隔绝为非活化复合物。4E-BP1的结合可以通过雷帕霉素(mTOR)的激酶哺乳动物靶点的磷酸化进行调控，其中磷酸化作用的增强导致4E-BP1对eIF4E的亲和力下降。
通过PIF和Ang II诱导泛素蛋白酶体通路需要转录因子核因子-κB(NF-κB)的激活。Wyke，S.M.和Tisdale，M.J.，Br.J.Cancers，92：711-721，2005。PKR能够激活上游激酶IκB激酶，它能够导致抑制剂蛋白IκB的降解。然后，IκB的降解导致了NF-κB的释放。NF-κB迁移至细胞核，导致特定基因的转录激活(Zamanian-Daryoush，M.等，Mol.Cell Biol，20：1278-1290，2000)。含有突变体PKR的肌管(Myotubes)不能激活对PIF或Ang II有响应的NF-κB，也不能诱导泛素蛋白酶体通路。这些结果显示，通过PKR诱导泛素蛋白酶体通路需要NF-κB的活性。
氨基酸
20种氨基酸中的9种是人类所必须的，因为机体不能制造它们。这9种氨基酸必须通过个体饮食获得。缺乏一或多种这些氨基酸可能导致负氮平衡，因为蛋白质的降解速度超过了其制造速度，所以其中较之消化的氮更多的氮被排出，这就导致了酶的活性受到破坏和肌肉质量的损失。
合成代谢因子(例如胰岛素、胰岛素样生长因子和氨基酸)能够增加蛋白合成，引起肌肉过度生长。支链氨基酸(尤其是亮氨酸)能够启动信号转导通路(它们通常包含mTOR和eIF2)，它能够调控转译启动。例如，氨基酸缺乏导致eIF2-α磷酸化增强和蛋白合成降低。
在恶病质患者中，游离氨基酸血浆水平一般会降低。最大降低通常出现在支链氨基酸(BCAAs)中，例如亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸。BCAAs占肌肉蛋白中总氨基酸的14-18％，它可以作为构建模块和蛋白合成调节剂。本文中所述三种BCAA中，亮氨酸是最有效的肌肉蛋白合成刺激剂，而其余两种不太有效。据Anthony，J.C.等(J.Nutr.，130：139-145，2000)报道，刺激蛋白合成的机制是通过4E-BP1(eIF4E-结合蛋白1)的高度磷酸化而激活转译起始中的mRNA结合步骤，随后使得eIF4E自未活化的4E-BPI-eIF4E复合物中释放。然后，释放的eIF4E与eIF4G结合形成活化的eIF4F复合物。eIF4F复合物形成的增加促进了43S预启动复合物向mRNA的迁移和聚集，促进了肽链的启动。
尽管BCAAs对PKR活化的作用尚未进行充分研究，但是Eley及其同事最近报道，BCAAs(例如亮氨酸和缬氨酸)能够显著阻止携有恶病质诱导肿瘤(MAC-16)的小鼠的体重损失，从而通过增加蛋白合成和降低分解显著增加骨骼肌湿重。Eley，H.L.等，Biochem J.，407(1)：113-120，2007。亮氨酸对PKR磷酸化的这种作用似乎是由PPI(蛋白磷酸酶I)的表达增加而引起的，它与PKR的N-末端调控域结合并抑制自体磷酸化(Tan，SX.等，J.Biol.Chem.，277：36109-36117，2002)。Eley及其同事的研究第一次报道了当暴露于PIF时亮氨酸能够减弱携有MAC-16肿瘤小鼠的骨骼肌中和鼠类肌管中的PKR和eIF2α的磷酸化。体外应用的亮氨酸的浓度(2mmole/l)与先前Anthony等(J.Nutr.，130：2413-2419，2000)所报道的当亮氨酸以1.35g/kg体重给药时在大鼠血清中的浓度相同。
另一方面，Eley及其同事所报道的携有MAC-16肿瘤的小鼠体重损失与下列两种因素有关：与其结合蛋白4E-BPI结合的eIF4E的量的增加以及由于4E-BPI低度磷酸化所导致的活性eIF4G-eIF4E复合物的进行性降低。这可能归因于mTOR(雷帕霉素的哺乳动物靶点)磷酸化的降低，它可能是导致p70S6k(70kDa核糖体S6激酶)的磷酸化减少的原因。注意到eEF2(真核延伸因子2)有5倍的增加，它也通过转译时间延长的降低而减少了蛋白的合成。亮氨酸治疗通过以下方面逆转了该作用：(1)增加了mTOR和p70S6k；(2)引起4E-BPI的高度磷酸化；(3)降低了与eIF4E结合的4E-BPI的量；(4)引起eIF4G-eIF4E复合物形成的增加；和(5)降低了eIF2α的磷酸化和PKR的活化，分别导致蛋白合成增加和使得蛋白分解的增加降低。
综上所述，PKR抑制剂和营养补充剂(例如支链氨基酸)的组合可以一起用于治疗和预防癌症恶病质或其它与恶病质相关的疾病。
同时，本发明者最近在PCT出版物WO/2007/064618中公开了其工作，它涉及一或多种支链氨基酸(BCAA)、BCAA前体、BCAA代谢物、富含BCAA的蛋白、能够通过调节使得BCAA含量更为丰富的蛋白或其任何组合的给药，用于治疗哺乳动物的肌肉损失。适用于此类给药的营养制剂也已经公开。
恶病质和厌食症的预防和治疗在医学领域中仍然存在问题。有助于恢复癌症或任何患病宿主中肌肉质量损失的营养补充剂在很大程度上仍然是无效的。因此，仍然需要改善临床方法以提高化疗或任何形式的营养和化疗组合应用的细胞毒抗肿瘤疗法的效能。
发明内容
本发明涉及治疗哺乳动物疾病的组合物和方法，它包括至少一种双链RNA依赖性蛋白激酶抑制剂(PKR-I)，该抑制剂在治疗前或者与治疗同时使用，其中所述治疗使得dsRNA-依赖性蛋白激酶的激活受到抑制。另外，本发明的组合物和方法还包括至少一种增效剂，其中所述至少一种增效剂可以增强哺乳动物中对PKR-I磷酸化的抑制。另外，本发明涉及能够增强化疗成分在治疗或改善癌症疾病、自身免疫性疾病或其它疾病中的效能的组合物和方法，其中采用至少一种PKR-I，采用或不采用至少一种营养性化合物。
在本发明一个实施方案中，所述疾病包括但不限于癌症、炎性疾病、败血症、充血性心衰、类风湿性疾病(包括但不限于强直性脊柱炎)、纤维肌痛、风湿性器官疾病(例如，心脏、肺、肾和脉管炎)、狼疮(包括系统性红斑狼疮)、颞动脉炎和风湿性多肌痛、Sjorgren综合征、类风湿性关节炎、慢性阻塞性肺病、神经退行性疾病、自身免疫性疾病、人类免疫缺陷性病毒感染、与免疫相关的疾病(包括但不限于过敏性疾病、哮喘病以及与移植物、移植或输液有关的疾病)、糖尿病、牛皮癣病、皮肤病、细胞老化、库欣病、风湿热和早衰。
在本发明另一方面，与PKR-I一起应用的至少一种增效剂能够在受影响哺乳动物中促进上述疾病之一的严重性改善或降低。
在本发明另一方面，PKR-I可以是天然的或合成的，可以通过肠道或胃肠外给药，可以单独给药或者与至少一种增效剂组合给药。胃肠外给药的途径包括皮下、静脉内、肌肉内或局部。对于肠道给药而言，可以通过鼻内、口内、鼻胃、口胃或通过胃管(gastric port)、空肠管(jejunal port)或回肠管(ileal port)进行。
在本发明另一方面，组合物为营养性组合物。增效剂可以是PKR抑制剂、PKR-I类似物、PKR磷酸化抑制剂、化疗药物、抑制血管增生药物、血管舒张药物、儿茶素黄烷醇(catechin-flavanol)、生物活性蛋白、支链氨基酸、必需氨基酸、氨基酸、氨基酸类似物、核苷酸、维生素、谷氨酰胺、唾液酸低聚糖、L-茶氨酸、益生素(prebiotic)、益生菌、合生元(synbiotic)、必需脂肪酸、PUFA、MUFA和抗氧化剂。增效剂可以是至少一种L-谷氨酰胺激动剂，例如，L-茶氨酸。核苷酸可以是一种RNA，例如，腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶或胞嘧啶。化疗药物的实例为5-氟尿嘧啶或吉西他滨。氨基酸的实例可以是蛋氨酸、精氨酸、L-瓜氨酸、L-茶氨酸或谷氨酰胺。生物活性成分可以是TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4或TGF-β5。
PKR-I可以作为哺乳动物中细胞生长或细胞复制的抑制剂。可以以放疗或化疗的形式进行治疗。
本发明组合物还可以包括至少一种蛋白磷酸酶-1α(PPl-A)调节剂，其中PP1-A能够使得PKR的磷酸化形式去磷酸。另外，至少一种调节剂为支链氨基酸，可以是亮氨酸、异亮氨酸或缬氨酸。
本发明也包括治疗哺乳动物疾病的方法，该方法包括给予哺乳动物本文中上述组合物，其中所述治疗能够使得治疗的哺乳动物中的dsRNA-依赖性蛋白激酶的活化受到抑制。
本发明的其他特点和优点在随后的详述中显而易见。然而，应当理解，当用于说明本发明的实施方案时，详述只是阐明而非限定本发明。由详细描述，对于本领域技术人员而言显而易见的是，在本发明范围内可以进行各种变化和修改。
附图说明
本发明的这些和其他特征可以根据下面的本发明的各方面的描述以及结合附图而更易于理解，附图描述了本发明的各种实施方案，其中：
图1显示了通过激活PKR而使得骨骼肌中蛋白合成减少和蛋白分解增加的通路。
图2显示了增加PKR抑制剂浓度在体外对MAC16(-)和MAC13(-)肿瘤生长的作用。该实验重复进行三次。与对照的差异表示为c(p＜0.001)。
图3A-3B代表蛋白印迹，它显示了MAC16(1-3列)和MAC13肿瘤(4-6列)中表观磷和全部形式的PKR(3A)和eIF2α(3B)。密度计量分析显示磷酸化的(pHs)与全部(tot)形式的比例，代表了三种不同蛋白印迹的平均值。与MAC16肿瘤的差异表示为b(p＜0.01)或c(p＜0.001)。
图4A-4B显示采用溶剂(DMSO∶PBS，1∶20)对照(1-3列)或浓度为1(4-6列)或5(7-9列)mgkg-1的PKR抑制剂通过每日sac.注射给药(Eley等，2007)治疗携有MAC16肿瘤小鼠对PKR(4A)和eIF2[α](4B)磷酸化的作用。每组中小鼠的数量为n＝6。密度计量分析显示磷酸化的(pHs)与全部(tot)形式的比例，代表三种蛋白疫印迹的平均值。与对照的差异表示为c(p＜0.001)。
图5A-5E表示在MAC16(5A和5C)和MAC13(5B和5D)细胞中PKR抑制剂的浓度对PKR的自体磷酸化(5A和5B)和20S蛋白酶α-亚基表达(5C和5D)的作用。密度计量分析显示了磷酸化的(pHs)与全部(tot)形式的比例，代表了三种不同蛋白印迹的平均值。与对照的差异表示为a(p＜0.05)、b(p＜0.01)或c(p＜0.001)。(5C)表示采用各浓度PKR抑制剂处理的MAC16细胞中通过密度计量测定的20S蛋白酶α-亚基的表达，(5A)表示磷酸化的PKR的水平，(5E)表示它们之间的关系。相关系数为0.957。
图6显示了如方法部分中所述的体外MAC13和MAC16细胞中4小时内的蛋白合成。与MAC16肿瘤的差异表示为c(p＜0.001)。
图7A-7B显示了在MAC16和MAC13肿瘤(7A)中以及在采用PKR抑制剂(以5mgkg-1给药，共4天)或溶剂对照治疗的小鼠中的MAC16肿瘤中(7B)的NF-κB的核积聚，通过EMSA测定。密度计量分析代表了三次不同印迹的平均值。(7A)中与MAC16肿瘤的差异表示为b(p＜0.01)，(7B)中与溶剂对照的差异表示为c(p＜0.001)。
图8表示5FU在体外以0(■)、1(□)、
Figure GPA00001138662100071
和
Figure GPA00001138662100072
的浓度单独使用或与浓度为100和200nM的PKR抑制剂(PKR)组合使用对MAC16细胞生长的作用，吉西他滨以0(■)、3.8(□)、
Figure GPA00001138662100073
和
Figure GPA00001138662100074
的浓度单独使用或者与PKR抑制剂组合使用对MAC16细胞生长的作用。也显示了PKR抑制剂以100和200nM的浓度单独使用的作用。与对照的差异表示为b(p＜0.01)或c(p＜0.001)，而在PKR抑制剂存在下的差异表示为e(p＜0.01)或f(p＜0.001)。
优选实施方案的详述
本发明涉及采用双链RNA蛋白激酶抑制剂(PKR-I)提高化疗药物在治疗癌症中的效能的方法，还可以采用或不采用营养性化合物。
通过采用PKR抑制剂，蛋白合成的抑制受到完全减弱，eIF2α磷酸化的诱导受到阻止(也参见图1)。PKR抑制剂也能够减弱由PIF和Ang II所诱导的蛋白合成的抑制，在恶病质鼠类和人类模型中阻止蛋白酶体表达和活化的增加。解释肌肉恶病质中通过PKR自身磷酸化而使得蛋白合成抑制和蛋白分解增加的可能的机制总结于图1。Eley，HL.和Tisdale，M.J.，J.Biol，282：7087-7097，2007；Eley，HL.和Tisdale，M.J.，Br.J.Cancers，96：1216-1222，2007；和Eley，HL.等，Br.J.Cancers，98(2)：443-449，2008。根据这些发现，PKR抑制剂可以用于治疗性预防癌症患者和其他与恶病质相关疾病患者的肌肉萎缩。
例如，根据本发明者观察，磷酸化形式的PKR和eIF2α的水平在人类癌症患者(无论其体重损失的数量如何)的肌肉中显著增加。在PKR和eIF2α磷酸化之间具有线性关系，这就说明PKR磷酸化导致了eIF2α的磷酸化。然而，随着体重损失水平的增加，肌凝蛋白的水平降低。肌凝蛋白表达与eIF2α磷酸化的程度之间也具有类似的线性关系。这些发现说明PKR磷酸化是癌症患者中肌肉消耗的重要启动子。Eley，HL.等，Br.J.Cancers，98(2)：443-449，2008。
尽管不希望将本发明限定在任何特定的机制，但是，本发明者发现，与化疗药物(例如，5-氟尿嘧啶或吉西他滨)一起组合给予PKR-I较以上两者单独使用能够更有效地降低肿瘤细胞的生长。因此，给予PKR-I能够直接或间接地增强化疗的效能。5-氟尿嘧啶或吉西他滨均为治疗肿瘤(例如，结肠癌)生长中常用的化疗化合物。尽管不希望受理论的限制，但是认为当以非常特殊的浓度(200nM时作用最大，较低和较高的浓度都会降低该作用)引入时，PKR-I能够降低癌症细胞的生长。另外，PKR的抑制进一步降低了暴露于化疗药物的癌症细胞的增殖。与化合物单独使用所观察到的抑制相比，细胞抑制似乎是协同作用(图8)。给予特定营养性化合物(在结构上与PKR-I化合物无关)也能够降低癌细胞的生长并预防癌症恶病质。然而，营养性化合物通过与PKR-I化合物不同的机制发挥作用，所述机制先前描述于Jammi等，Biochem.Biophys.Res.Commun.，308：50-57，2003。
本文中使用的术语“增效剂”或“加强”是指当与其他成分和/或营养性化合物组合使用时能够产生两种成分/化合物的协同作用的化合物或成分，该作用大于每一种单独使用所产生的作用之和。根据本发明，增效剂可以包括但不限于PKR抑制剂、PKR-I类似物、PKR磷酸化抑制剂、营养补充剂或化合物、化疗药物、抗血管增生药物、血管舒张药物、儿茶素黄烷醇、生物活性蛋白、支链氨基酸、必需氨基酸、氨基酸或氨基酸类似物、核苷酸或RNA、维生素、谷氨酰胺、唾液酸低聚糖、L-茶氨酸、益生素、益生菌或合生元、必需脂肪酸、PUFA和/或MUFA和抗氧化剂。
本文中使用的术语“治疗”是指预防性治疗和治疗性治疗或改善疾病治疗，包括对处于患病风险或疑似具有患病风险的患者以及已经患病或者已经被诊断为患病的患者的治疗。这些术语也是指在尚未患病但是易于发展为非健康状态(例如氮失衡或肌肉损失)的个体中保持健康和/或促进健康。因此，“有效量”是能够在个体中治疗疾病或症状的量，或者，更广泛地讲，能够对个体提供营养、生理学或医学益处的量。另外，尽管“个体”或“患者”在本文中通常是指人类，但是本发明并不限于此。因此，术语“个体”或“患者”是指可以自治疗中获益的任何动物。
恶病质
恶病质或消瘦是严重营养不良和负氮平衡状态，其特征在于贫血(血红素下降)、厌食(缺乏食欲或重度食欲不振)、体重下降和肌肉萎缩。恶病质中的生理学、代谢和行为改变与患者主诉的下列症状有关：虚弱、疲劳、胃肠不适、睡眠/觉醒紊乱、疼痛、精神萎靡、呼吸短促、昏睡、抑郁、乏力和对家庭和朋友承担责任的恐惧。恶病质可见于多种疾病，包括但不限于AIDS、癌症、髋部骨折后、慢性心力衰竭、慢性肺疾(例如慢性阻塞性肺疾病和慢性阻塞性肺病)、肝硬化、肾衰、自身免疫性疾病(例如类风湿性关节炎和先天性狼疮)、败血症、肺结核、囊性纤维化、克罗恩病和严重感染。除了这些慢性感染和恶性疾病外，恶病质也出现在广泛外伤后患者和患有发育不良综合征的老年人中。
两种主要因素是癌症恶病质的原因：(1)食欲不振，和(2)对压力的代谢性响应，它导致肌肉先损失，损失的速度大于只是由于缺乏营养而导致的损失。因此，改善癌症患者肌肉质量损失速度的营养补充剂具有重要的临床作用。
肿瘤的作用不单单表现为癌症恶病质。通常还出现蛋白质、脂肪和碳水化合物的改变。例如，碳水化合物代谢异常包括总葡萄糖转化速度增加、肝脏糖异生增加、糖耐量和血糖水平升高。通常也可以观察到脂肪分解增加、游离脂肪酸增加和甘油转化增加、高脂血和脂蛋白脂肪酶活性降低。与癌症恶病质有关的体重损失不仅是由于机体脂肪减少造成的，而且是由于总机体蛋白量降低造成的，并伴有广泛的骨骼肌萎缩。蛋白周转增加和氨基酸氧化失调也是重要的。响应于癌症而产生的宿主源性因素的存在有可能是恶病质的原因，例如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)或恶液质素、白介素-1(IL-I)、IL-6、γ-干扰素(γ-IFN)和前列腺素类(PGs；例如，PGE2)。
体重损失在肺癌和胃肠道癌患者中极为常见，导致机体脂肪和肌肉蛋白的极大损失，而非肌肉蛋白不受影响。尽管机体脂肪的损失对能量储存而言是非常重要的，但是它也是导致无法行动并最终损害呼吸肌肉功能的骨骼肌蛋白损失的原因，导致由于坠积性肺炎而死亡。尽管恶病质通常伴有厌食症，但是单独使用营养补充剂不能保持稳定的体重和由于脂肪组织和水的增加而非瘦机体质量所获得的任何体重。
双链(ds)RNA依赖性蛋白激酶(PKR)
本文中使用的术语“PKR”是指具有蛋白功能的蛋白，或者称为下列蛋白：“双链RNA依赖性蛋白激酶”、“双链RNA依赖性eIF-2α激酶”、“DAI”(Jimenez-Garcia，等，J.Cell Sci.106：11-12，1993)、“dSI”、“p68(人类)或p65(鼠类)激酶”(Lee，等，J.Interferon Cytokine Res.16：1073-1078，1996)或dsRNA-PK。也可以参见：Clemens，等，J.Interferon Res.13：241，1993。PKR已知具有激酶活性的唯一经过确认的dsRNA-结合蛋白。PKR为丝氨酸/苏氨酸激酶，该酶的激活需要dsRNA结合以及随后的自磷酸化(Galabru，J.& Hovanessian，A.，J.Biol.Chem.262：15538-15544，1987；Meurs，E.等，Cell，62：379-390，1990)。鉴定得最为充分的体内PKR底物为真核启动因子-2(eIF-2α)的α亚基，一旦磷酸化，它能够最终抑制细胞和病毒蛋白合成(Hershey，J.W.B.，Ann.Rev.Biochem.60：717-755，1991)。PKR的这种特殊功能揭示了作为介导IFN-α和IFN-β的抗病毒和抗增生活性的机制之一。PKR的其他生物学功能是推定其作为信号传导者的作用。Kumar等证实，PKR可以磷酸化IκBα，导致核因子-κB(NF-κB)的释放和活化(Kumar，A.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91，6288-6292，1994)。鉴于已经充分鉴定了IFN-b启动子中的NF-κB位点，这可以代表通过PKR介导IFN-b转译的dsRNA活化的一种机制(Visvanathan，K.V.&Goodbourne，S.，EMBO J.，8，1129-1138，1989)。
PKR的活化包括在串联至双链RNA中的两个分子结合，然后在发生于分子中的事件中彼此磷酸化。(Wu等1997，J.Biol.Chem 272：1291-1296)。PKR参与到作为体内控制机制的细胞凋亡的过程中，包括抗病毒活性、细胞生长调控和肿瘤生长(Donze等EMBO J.，14：3828-3834，1995；Lee等，Virology，199：491-496，1994；Jagus等Int.J.Biochem.Cell.Biol.1989，vol.9：1576-86)。
PKR抑制剂(PKR-Is)
PKR参与了各种细胞过程，包括信号转导、分化和凋亡。根据本发明，可以采用PKR抑制剂(PKR-I)治疗与细胞响应异常有关的疾病，例如，神经退行性疾病(例如亨廷顿病、阿尔茨海默病和帕金森病)。可以适用于本发明组合物、试剂盒和方法的PKR抑制剂包括那些描述于下列文献的抑制剂：Shimazawa等，Neurosci.Lett.，409：192-195，2006；Peel，J.Neuropathol.Exp.Neurol，63：97-105，2004；Bando等，Neurochem.Int.，46：11-18，2005；Peel等，Hum.Mol.Genet.，10：1531-1538，2001；和Chang等，J.Neurochem.83：1215-1225，2002。
PKR-I的类似物也可以包括但不限于2-氨基嘌呤(2-AP)，9-(4-溴-3，5-二甲基-吡啶-2-基)-6-氯代-9H-嘌呤-2-基胺，9-(4-溴-3，5-二甲基-吡啶-2-基甲基)-6-氯代-9H-嘌呤-2-基胺磷酸盐，9-(4-溴-3，5-二甲基-吡啶-2-基甲基)-6-氯代-9H-嘌呤-2-基胺盐酸盐，6-溴-9-(4-溴-3，5-二甲基-吡啶-2-基甲基)-9H-嘌呤-2-基胺，6-溴-9-(4-溴-3，5-二甲基-1-氧基-吡啶-2-基甲基)-9H-嘌呤-2-基胺，2-(2-氨基-6-氯代-嘌呤-9-基甲基)-3，5-二甲基-吡啶-4-醇，9-(4-烯丙基氧基-3，5-二甲基-吡啶-2-基甲基)-6-氯代-9H-嘌呤-2-基胺，6-氯代-9-[4-(2-乙氧基-乙氧基)-3，5-二甲基-吡啶-2-基甲基]-9H-嘌呤-2-基胺，6-氯代-9-(4-环丙基甲氧基-3，5-二甲基-吡啶-2-基甲基)-9H-嘌呤-2-基胺，6-氯代-9-(4-异丁氧基-3，5-二甲基-吡啶-2-基甲基)-9H-嘌呤-2-基胺，6-氯代-9-(4-氯代-3，5-二甲基-吡啶-2-基甲基)-9H-嘌呤-2-基胺，6-氯代-9-(3，5-二甲基-吡啶-2-基甲基)-9H-嘌呤-2-基胺和6-溴-9-(4-甲氧基-3，5-二甲基-吡啶-2-基甲基)-9H-嘌呤-2-基胺磷酸盐。PKR抑制剂类似物描述于Jammi等，Biochem.Biophys.Res.Commun.，308：50-57，2003(Calbiochem Cat.No.527450)。
术语“PKR表达”是指编码PKR的核酸序列的转录和转译，其产物包括前体RNA、mRNA、多肽、转译后处理的多肽及其衍生物，包括获自其它种属的PKRs，例如鼠科或类人猿酶类。例如，用于PKR表达的分析包括自磷酸化分析(Der和Lau，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，92：8841-8845，1995)、eIF2α磷酸化分析(Zamanian-Daryoush，M.等，Oncogenes，18：315-326，1999)、通过PKR免疫沉淀法进行的激酶分析和激酶体外分析(Zamanian-Daryoush，M.等，Mol.Cell.Biol，20：1278-1290，2000)。PKR表达和/或产物的典型分析包括蛋白分析(例如蛋白印迹法)和PKR mRNA分析(例如逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)分析)、Northern印迹分析、斑点印迹分析或根据编码PKR的核酸序列采用适当标记的探针进行的原位杂交分析。
如上所述，PKR为能够使得一系列其它细胞蛋白磷酸化的蛋白，这些蛋白与机体或细胞中蛋白的分解有关。这些靶向降解的蛋白不限于横纹肌蛋白，也包括结构性或调控性细胞蛋白(例如，酶和信号蛋白，肌动蛋白丝等)。因此，PKR蛋白的抑制能够改变控制细胞蛋白降解的机制。抑制PKR预期能够干扰正常蛋白代谢并限制新蛋白的降解和合成。
根据本发明给予PKR-I而获得的用途和益处讨论如下：
在癌症治疗应用中：因为PKR-抑制剂(PKR-I)能够抑制与泛素介导的蛋白体(proteosomal)通路有关的蛋白降解，所以认为PKR-I能够减少肿瘤细胞的复制，并因此能够降低肿瘤生长，如本文中所提供的实施例所示。PKR-I的用途也可以促进肿瘤细胞数量的减少。肿瘤抑制的机制尚未完成阐明，但是可能包括干扰控制细胞复制循环的蛋白以及保持细胞完整性所必需的细胞内蛋白。
如上所述，PKR-I可以用于抑制通常在癌症恶病质中上调的骨骼肌蛋白的降解。癌症恶病质通常导致瘦肌肉组织的快速损失，因此增加了患者的死亡风险。
与系统给药不同，向肿瘤内局部注射PKR-I应当能够保持正常骨骼肌代谢(包括蛋白分解)，同时通过限制细胞内蛋白代谢而限制了肿瘤细胞生长。
在自身免疫性疾病中：严重炎症(hyperinflammation)通常导致能够调控炎性响应的蛋白的过度产生。因为严重炎症与肌肉损失直接相关并使得外伤的恢复减慢，因此需要调节炎性响应。因此，相信通过给予PKR-I以限制能够产生炎症调节蛋白(例如，急性期蛋白(CRP)，白介素(IL-6、IL-Is)等))的细胞的过量产生可以获得益处。
处于平衡和受控状态的自身免疫是免疫监视潜在肿瘤细胞所必须的。尽管自身免疫具有某些副作用，但是它仍然是重要和天生的过程。因此，防止与能够产生蛋白类细胞活素有关的免疫细胞的过度产生预期能够限制免疫响应并防止自身免疫性疾病。
例如，在系统性红斑狼疮(SLE)中，PKR在激活的SLE T细胞中过度表达，它与eIF2α磷酸化的增加有关。PKR的高度表达和随后的eIF2α的磷酸化可能与对SLE患者T细胞中有丝分裂的受损转译和增生性响应是相关的，至少是部分相关。Grolleau，A.等，J.Clin.Invest.，106(12)：1561-1568，2000。
在过敏症中：对各种抗原或效应物的过敏反应是通过蛋白样免疫球蛋白E(IgE)介导的，当它们与抗原(例如花粉)接触时通过B-细胞产生。因此，人们认为PKR-I的使用可以通过限制B细胞而减少IgE的产生从而使得人们获益。这与被称为Omalizumab(Xolair(R)-Novartis)的不同类型化合物所提供的功能相似。与蛋白分解抑制剂不同，Omalizumab为单克隆抗体，用于与过敏有关的哮喘治疗，目的在于降低变态反应的超敏性。
在慢性阻塞性肺病(COPD)中：因为与COPD(包括“慢性支气管炎”)有关的疾病通常与呼吸道中能够产生黏液的杯状细胞的增生和肥大有关，因此相信PKR-I的使用能够减轻与COPD有关的症状。因此，黏液分泌(与呼吸道阻塞有关)的减少对于采用PKR-I治疗的人有益。另外，COPD与炎症、随后的使得呼吸道狭窄的疤痕以及组织重塑有关。
在局部应用中：相信PKR-I可能对各种皮肤病有益，包括但不限于特应性皮炎、湿疹和银屑病。在特应性皮炎中，免疫系统的过多反应使得皮肤红肿、刺激和疼痛，它可以通过给予PKR-I加以控制。
在免疫营养中：调节炎症和减少感染的免疫营养(例如SecondGeneration Impact
Figure GPA00001138662100141
)的使用在癌症手术患者中极为常见。PKR-I对细胞活素产生的进一步控制预期能够降低炎性细胞活素的过度表达。
在化疗中：近期的研究表明，当细胞周期在G0阶段(细胞衰老)停止时，分离自牛奶的特定生物活性肽类具有细胞保护特性。相信PKR-I能够改变控制细胞周期的蛋白降解。因此，在化疗和放疗进行时限制细胞复制应当能够保护健康细胞。
在糖尿病中：对于I型糖尿病而言，与上面所述的自身免疫相似。在II型糖尿病中，在完全胰岛素依赖型成人发病糖尿病之前，胰腺的β细胞分泌过量的胰岛素。因此，相信PKR-I可以在局部性给药中用于防止胰岛素的过度分泌。
在库欣病中：库欣病是由于脑垂体腺中肿瘤的存在而引起的，它能够促进过量皮质醇的分泌。因此，相信局部和/或系统性给予PKR-I能够防止肿瘤生长，可能减少皮质醇的合成。在其他慢性压力响应(其中皮质醇能够促进瘦体重损失)中也可以发现其他益处。
在器官移植中：PKR-I的使用可以减少免疫蛋白的表达，该蛋白可以与外源性抗原反应从而加速器官排斥反应。
在风湿热和风湿性器官疾病中：风湿热和风湿性器官疾病是炎性疾病，它可以发展为未经治疗或正在治疗的链球菌感染的罕见并发症，它是由A组链球菌感染所引起的。风湿热和风湿性器官疾病的确切原因尚不明确，但是医学研究集中在对由特定类型链球菌所产生的抗原响应的免疫系统的异常上。源自感染的抗原响应导致抗体的产生，它错误地攻击了器官、肌肉和关节。对风湿热和风湿性器官疾病尚无治疗方法，但是对该疾病的医学治疗包括抗生素处方以治疗链球菌感染并防止进一步感染，也包括其他药物，用于缓解疾病症状。因此，可以暂时性地减少抗体的产生以便于为抗生素治疗提供时间，这可以通过PKR-I抑制蛋白合成而得以实现。
在早衰中：早衰(希腊语“老龄”)特别是指Hutchinson-Gilford早衰综合征，或者通常是指其他加速老化的疾病。早衰是一种非常罕见的疾病，其中与年龄有关的某些特征通常会加速出现，很少会影响到年龄超过13的儿童。它是一种遗传性疾病，但是偶尔会发生，不在家族内遗传。早衰没有已知的治疗方法，但是已经有了多个发现。建议采用生长激素(Sadeghi-Nejad，A.等，J.Pediatr.Endocrinol.Metab.，20(5)：633-637，2007)和法尼基转移酶抑制剂(Meta，M.等，Trends Mol.Med.，12(10)：480-487，2006)治疗。在2003年，M.Eriksson等报道，早衰可能是从新显性并是在新胎儿或者在父母之一的配子的细胞分化过程中形成的。它是由染色体1上的LMNA(Lamin A)基因中的突变引起的。在早衰中，酶(蛋白酶)所需要的将Prelamin A裂解为Lamin A的识别位点发生突变。Lamin A无法产生，Prelamin A在核膜上积聚，导致独特的核发泡(Lans，H.等，Nature，440(7080)：32-34，2006)。这就导致了早衰的过早衰老症状。将早老患者细胞与获自LMNA年轻和老年人类个体的皮肤细胞进行比较的研究发现，在早衰细胞和老年人细胞中存在相似的缺陷，包括某些核蛋白的下调、DNA损害增加以及导致异染色体减少的组蛋白的去甲基化。PKR-抑制剂的使用能够减少蛋白(例如与核层功能障碍有关的蛋白(例如，Prelamin A))的表达，据报道所述蛋白导致了过早老化。
除非另外说明，本文中使用的术语“氨基酸”是指至少一种：必需氨基酸，例如异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、缬氨酸或组氨酸；有条件的必需氨基酸，例如酪氨酸、半胱氨酸、精氨酸或谷氨酰胺；或非必需氨基酸，例如甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、天门冬酰胺、牛磺酸或肉毒碱。
除非另外说明，本文中使用的术语“必需氨基酸”(EAA)是指至少一种来源的氨基酸之一：异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、缬氨酸和组氨酸。
另外，精氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺和酪氨酸被认为是有条件的必需氨基酸，意味着它们并非饮食中正常需要的，但是必须通过外源性供给无法足量合成它们的特定的人群。
本文中使用的术语“支链氨基酸”是指至少一种氨基酸，例如亮氨酸、异亮氨酸或缬氨酸。
L-茶氨酸或γ-乙基氨基-L-谷氨酸(也称为SuntheanineTM)为仅在茶叶中发现的独特的氨基酸，例如红茶、乌龙茶和绿茶(茶树(Camellia sinensis)浸剂)。茶氨酸与谷氨酰胺有关，可以通过血脑屏障。因为可以进入脑内，所以茶氨酸具有精神作用。当与咖啡因一起应用时，茶氨酸可以降低精神和身体的压力，可以产生放松的感觉并提高认知能力和改善情绪。L-茶氨酸能够促进α-脑波的产生，提高放松指数。它也可以增强对微生物感染甚至是肿瘤的天然抗性。50-200mg的剂量可以产生放松作用。用于提高免疫系统功能的L-茶氨酸的剂量尚未有建议；然而，试点研究中志愿者每天可以消耗约600mL茶。
本文中使用的“益生素”为不能消化的食物成分，当进入宿主或个体的消化道时，相对于致病菌，它可以选择性刺激一种或有限数目的有益菌群的生长和/或活性。益生素包括酵母菌、酵母菌培养物、真菌培养物和已知的膳食纤维，例如多糖和低聚糖，如低聚果糖(FOS)和瓜尔豆胶，特别是部分水解的瓜尔豆胶(PHGG)和果胶。“益生菌”实际上是细菌群，当进入宿主和个体的消化道时，它们能够群集并产生有益的作用。优选益生菌包括一或多种乳酸杆菌和双歧杆菌。术语“合生元”是指益生素和益生菌的混合物，它们可以通过改善宿主或个体消化道中活菌膳食补充剂的存活和引入而有益地影响宿主。
“必需脂肪酸”或“EFA”是指任何可以被机体利用的脂肪酸，可以分类为饱和的、多不饱和的或单不饱和的脂肪酸，可以在自然界中发现或者可以以合成方法产生。EFA可以包括(不加限定)胆固醇、前列腺素类、卵磷脂、胆碱、纤维醇、共轭的亚麻酸、豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、油酸、[α]-亚麻酸、十二碳五烯酸、二十二碳五烯酸、二十碳六烯酸、亚麻酸、γ-亚麻酸、ω-3脂肪酸、ω-6脂肪酸、ω-9脂肪酸、多不饱和脂肪酸、长链多不饱和脂肪酸、花生四烯酸、单不饱和脂肪酸、脂肪酸前体和脂肪酸衍生物。本发明的用于预防或治疗恶病质或厌食症的可使用的组合物可以包括至少一种EFAs混合物的组合产物。
上述每日提供的营养素可以取决于个体的体重、性别、年龄和/或疾病。
营养干预
在定期放疗和/或化疗过程中为了增加细胞毒性使用的或者为了获得预期效果而与本发明PKR-I组合使用的定向营养剂如下：
在细胞毒性中：诱导游离基的营养素应当能够增加对患病细胞和肿瘤细胞的破坏。实例包括下列：
a.铁，亚硝酸盐/硝酸盐类；
b.低水平的维生素E、C、B-复合物以及硒和其他抗氧化剂；
c.提高肌醇六磷酸(二价螯合剂)、L-茶氨酸以阻断谷氨酰胺摄入。
在细胞保护中，下列营养素应当能够防止正常细胞在化疗过程中免于免疫攻击和细胞损害及损伤：
a.抗氧剂：谷氨酰胺，半胱氨酸，维生素A、C、E和硒；
b.用于合成代谢的赖氨酸→正亮氨酸(BCAA类似物)；
c.用于合成代谢的核苷酸(或循环中的核苷酸片段)；
d.高多不饱和脂肪酸(PUFA)/单不饱和脂肪酸(MUFA)，它能够增加膜的流动性并防止反应性氧化剂的破坏；
e.唾液酸低聚糖，它能够改善肠道细胞的健康并降低致病性微生物和化合物的渗透性。
产品(例如益生菌、益生素和合生元)的使用已有充分地证明。例如，益生菌已知能够：(a)将与抗生素、轮状病毒感染、化疗有关的腹泻的频率和时间降低并将旅行者腹泻的频率和时间降低至较轻的程度；(b)刺激细胞和体液免疫；和(c)减少不适宜的代谢产物，例如结肠中的铵和前致癌酶。益生菌在癌症预防中可能起作用。参见Schrezenmeir，J.等，Am.J.Clin.Nutr.，73(Suppl.)：361S-364S，2001。本文中使用的术语“益生菌”是指含有足够数量的活的定义的微生物的制品或产品，它能够改变宿主隔室中的微生物区系(通过引入或群集)，从而在宿主中发挥有益的作用。术语“益生素”是指无法消化的食物成分，它能够通过选择性刺激结肠中一种或有限数目的细菌的生长和/或活性而有益地影响宿主。例如，通过摄取某些物质(例如低聚果糖、菊粉、转半乳糖化的低聚糖和大豆低聚糖)可以增加双歧杆菌。当产品含有益生菌和益生素时，采用术语“合生元”。因为术语“合生元”暗示有协同作用，它适用于其中益生素化合物选择性有益于益生菌化合物的产品。从严格意义上讲，它是含有低聚果糖和益生菌产双岐杆菌(bifidogenic)的产品。参见Schrezenmeir，J.等，2001同上。
与营养性化合物一起使用激酶抑制剂或者单独使用激酶抑制剂能够增强化疗药物在治疗癌性肿瘤中的疗效。其它益处包括代谢通路的营养性调节，该通路能够调节肌肉损失，特别是癌症恶病质。
当给予PKR-I时，双链RNA蛋白激酶的磷酸化使得细胞(MAC16实体瘤)的生长减少，当与化疗药物(例如，5-氟尿嘧啶或吉西他滨)组合使用时较它们两者单独使用时更为有效。
另外，给予PKR-抑制剂可以用于减少活性形式的促炎症反应细胞活素核因子-κ-B(NF-κB)。NF-κB可能与某些肿瘤细胞对化疗药物的耐药性有关，例如吉西他滨(Arlt，A.等，Oncogene，22(21)：3243-3251，2003)和5-FU(Uetsuka，H.等，Exp Cell Res.，289(1)：27-35，2003)。因此，给予PKR-抑制剂可以直接或间接地增强化疗的性能。它们两者均为治疗肿瘤生长(例如结肠癌)中常用的化合物。
本发明者已经证明，当以非常特定的浓度给药(在200nM时具有最大作用，较低和较高的浓度作用减弱)时，PKR-抑制剂能够降低癌细胞的生长。PKR的抑制可以进一步降低暴露于化疗药物的癌细胞的增生。与单独使用任一化合物所观察到的抑制相比，细胞抑制似乎具有协同作用(见图8)。给予特定的营养性化合物(在结构上与PKR-抑制剂化合物无关)应当也能够降低癌细胞的生长并预防癌症恶病质。然而，营养性化合物通过与上述PKR-抑制剂化合物不同的机制起作用(Jammi等2003)。
化疗所造成的免疫抑制的营养性缓解：
某些化疗药物已知能够导致免疫抑制，两个实例包括5-氟尿嘧啶和吉西他滨。
5-氟尿嘧啶(5-FU)为常规化疗药物，可以用于某些类型癌症的治疗，包括：肠癌、乳癌、胃癌和食道癌。与5-FU使用相关的并发症降低了对感染的抵抗力。5-FU可以降低骨髓的白细胞产生，使得患者更易感染。
吉西他滨为用于治疗下列癌症的化疗药物：非小细胞肺癌、胰腺癌、膀胱癌和乳癌。吉西他滨也可以降低骨髓的白细胞产生，使得患者更易受感染影响。免疫功能的显著降低通常在给予治疗剂量后的第7天开始出现，对感染的抵抗力通常在化疗后的10-14天最低。血细胞通常稳定地增加并在下一疗程开始前回归正常水平。
谷氨酰胺可以通过支持免疫功能而为接受化疗的患者提供益处。前面已经建议了营养素与化疗的相互作用。抗氧剂通过过早地分解细胞内的药物而降低了化疗的效能，这对健康细胞是有益的，但是不是肿瘤细胞所期望的。氨基酸谷氨酰胺可以促进化疗药物分解，因为它是细胞内抗氧剂谷胱甘肽(GSH)的组成部分(Rouse，K.等，Annals Surge.，221(4)：420-426，1995)。因此，采用氨基酸L-茶氨酸阻断细胞对谷氨酰胺的摄取已经建议为增强多柔比星化疗效果的方法(Sugiyama，T.和Adzuki，Y.，Biochip.Biophys.Act，1653(2)：47-59，2003)。然而，并非所有的研究都支持这种对抗谷氨酰胺的主张(Rubio，IT.等，Ann Surg.，227(5)：772-778，1998)。GSH可以促进化疗化合物的降解从而保护细胞，但是谷氨酰胺也是正常免疫细胞功能的重要组成部分。尽管已有证据建议减少谷氨酰胺，然而免疫功能的这种作用需要与患者的健康和恢复折衷考虑。
免疫营养：化疗效能的过度夸示(采用PKR-抑制剂)有可能增加患者感染的风险。感染和感染的风险可能会降低肿瘤专家给予成功治疗所必需的攻击性剂量的意愿。另外，感染也可能会损害患者耐受有效治疗方案的能力以及损害患者自与治疗相关的合并症或手术伤口恢复/愈合的能力。含有各成分(包括抗炎脂肪酸(例如二十碳五烯酸和二十碳六烯酸)、氨基酸L-精氨酸及其前体、L-瓜氨酸和核糖核酸)的营养补充剂能够通过T-细胞激活、成熟和降低炎症而促进免疫健康。
生物活性奶源蛋白：生物活性奶源蛋白提供了生物活性肽类的来源(例如，转化生长因子-β(同工型1-3))，它能够在健康细胞中延缓或暂时中止细胞周期分化。这些生物活性蛋白需要通过处理(例如酸化)而激活，因此，普通奶不合适。给予这些奶源性生物活性蛋白能够保护与蛋白接触的细胞，例如口腔、食道和胃肠道上皮细胞。生物活性肽类可以通过降低快速分化细胞对化疗药物(含或不含PKR-抑制剂)损害的易感性而起作用。
核苷酸(例如，核糖核酸)：化合物(例如，腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶)可以对接受化疗的癌症患者提供免疫系统支持，特别是如果化疗方案是与增效剂例如PKR-抑制剂组合应用时。核苷酸可以支持骨髓制造及其产物(包括红细胞和T-细胞(免疫细胞))的成熟。另外，正在对核苷酸促进药物吸收的可能性进行研究，因此，核苷酸的营养补充作用应当通过增加肿瘤细胞对化疗药物的摄取并支持免疫功能而发挥。
血管生成和血管舒张营养剂：能够促进血管生成和血液流动的营养素也能够增加化疗药物向代谢活性组织的传递。在癌症患者中不建议给予营养性氨基酸L-精氨酸和/或L-瓜氨酸以及儿茶素黄烷醇化合物(它可以作为癌症化疗预防药物)，因为它们可能促进血管生成、促进扩散性肿瘤的快速生长。然而，增加血液向肿瘤的传送也能够增加细胞毒性化疗药物的摄取。
给予含有或不含特定营养素的PKR-抑制剂减轻癌症恶病质
癌症恶病质、心脏病恶病质及其它可能的疾病(包括肌肉缺失症、HIV/AIDS等)中的肌肉蛋白损失可以通过亚基组合(subunit association)和/或上调的蛋白体产物加以调控。该过程中的步骤之一包括激活真核生物起始因子2-α(eIF2a)。通过磷酸化而激活eIF2a可以促进蛋白体蛋白降解。给予PKR-抑制剂能够降低eIF2a分子的激活(磷酸化)，从而降低蛋白体的激活并降低肌肉蛋白分解。
通过给予含有或不含其它营养素的PKR-抑制剂而增加化疗的效能并抑制癌症恶病质的过程能够增加化疗药物对肿瘤细胞的作用。本发明的益处是它可以减少发挥临床相关疗效所必需的给药的时间长度或剂量的数量。先前已经进行的研究评价了抑制PKR的化合物，但是它尚未证实PKR的抑制具有癌症治疗益处。其它益处也可以通过给予PKR-抑制剂和特定的营养性化合物(包括氨基酸、脂肪酸、核酸)而获得，它可以进一步增强化疗并减弱与毒性有关的治疗。
PKR-抑制剂能够阻断与癌症恶病质和治疗抗性的肿瘤有关的PKR的磷酸化。我们的结果证实了这些化合物在癌症治疗中具有令人兴奋的疗效。另外，特定营养素(间接地作用于不同的蛋白(PPI)或PKR以降低PKR的磷酸化)的使用也建议它们在癌症治疗中作为联合治疗成分是具有疗效的。与药用化合物相比，营养素(氨基酸，多酚类)的益处为：其它作用机制、价格、安全性以及通过可选择性的零售渠道的可获得性。
本文中使用的术语“活性药物”、“活性成分”、“活性化合物”或者在某些情况下“化合物”的意义可以理解为是相当的。
术语“PKR的生物学活性”和“在生物学上有活性的PKR”是指与PKR或者PKR片段、衍生物或类似物相关的任何生物学活性，例如酶活性，特别是包括自磷酸化活性和激酶活性，包含底物磷酸化，所述底物例如真核转译启动因子2(elF-2)和转录因子例如NF-κB。
“离体”是指自其中获得细胞或者自其中分离细胞系的有机物机体的外面。离体应用可以包括完整细胞的使用，或者采用无细胞系统(即在体外的)，例如裂解物。
“体内”是指自其中获得细胞或者自其中分离细胞系的有机物机体内。
“人类细胞”是指分离自人类的处于任何发展阶段的细胞。
“患者或个体”是指任何动物。
动物包括但不限于鸟类和哺乳动物，哺乳动物包括但不限于啮齿类(鼠科)、水生哺乳动物、家畜(例如犬、lupines、兔和猫)、农场动物(例如羊(绵羊)、猪、牛、山羊(hircrine)和马(equine))和人类。其中当使用术语动物或哺乳动物或其复数时，预期它也可以用于在上下文中能够发挥作用或预期能够发挥作用的任何动物。可以采用本发明方法、组合物和试剂盒治疗的其它动物包括蜥蜴、蛇、鱼和鸟。
“哺乳动物”是指包括但不限于啮齿类(鼠科)、水生哺乳动物、家畜(例如犬、lupines、兔和猫)、农场动物(例如羊(绵羊)、猪、牛、山羊和马)和人类。其中当使用术语哺乳动物时，预期它也可以用于通过哺乳动物能够发挥作用或预期能够发挥作用的任何动物。
本文中使用的术语“残基”或“氨基酸残基”或“氨基酸”是指结合进蛋白、多肽或肽(统称“肽类”)的氨基酸。所述氨基酸可以是天然存在的氨基酸，除非另外说明，它可以包括已知的天然氨基酸的类似物，其功能与天然存在的氨基酸相似。
术语“癌症”是指各种类型的恶性肿瘤，它们中的大多数都可以侵入周围的组织，转移至不同的位置(PDR Medical Dictionary第一版(1995))。
术语“赘生物”和“肿瘤”是指异常组织，它通过细胞增生较正常组织更快地生长，并在除去启动增生的刺激后继续生长(PDR Medical Dictionary第一版(1995))。此类异常组织部分或完全缺乏组织结构和与正常组织的功能协调，它可以是良性的(即良性肿瘤)或恶性的(即恶性肿瘤)。
短语“治疗与异常细胞增生有关的疾病”包括预防个体中的肿瘤生长或者降低个体中已经存在的肿瘤的生长。所述抑制也可以是对肿瘤自一个部位向另一个部位转移的抑制。在一个方面，肿瘤对本文中所述的一或多种转译启动抑制剂是敏感的。本发明预期包括的肿瘤类型的实例包括但不限于那些与下列癌症有关的肿瘤：乳癌、皮肤癌、骨癌(包括骨髓和造血组织癌症)、前列腺癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、肝癌、肺癌、脑癌、喉癌、胆囊癌、胰腺癌、直肠癌、副甲状腺癌、甲状腺癌、肾上腺癌、免疫系统癌、神经组织癌、头颈癌、结肠癌、胃癌、支气管癌和/或肾癌。
本文中使用的术语“实验样品”是指获自有关个体的生物学样品。例如，实验样品可以是生物学液体样品(例如，血清、痰液、尿液)、组织样品(例如，活组织检查)或细胞样品(例如，脸颊刮屑)。本文中使用的“正常样品”或“普通样品”是指获自健康(即非恶性)生物学液体样品、组织样品或细胞样品的生物学样品。本文中使用的术语“生物学样品”应当包括分离自个体的组织、细胞和生物学液体以及个体中存在的组织、细胞和体液。生物学样品可以是任何生物学组织或体液或细胞。典型的生物学样品包括但不限于唾液、淋巴液、血液、血细胞(例如白细胞)、脂肪细胞、宫颈细胞、脸颊细胞、喉细胞、乳腺细胞、肌肉细胞、皮肤细胞、肝细胞、脊椎细胞、骨髓细胞、组织(例如，肌肉组织、宫颈组织、皮肤组织、脊椎组织、肝组织等)、细针活检样品、尿液、脑脊髓液和腹膜液或其细胞。生物学样品也可以包括组织切片，例如为组织学目的而取的冷冻切片。生物学样品可以获自哺乳动物，包括但不限于马、牛、羊、猪、山羊、兔、豚鼠、大鼠、小鼠、沙鼠、非人类灵长类和人类。生物学样品也可以包括获自微生物的细胞(例如，细菌细胞、病毒细胞、酵母细胞)及其部分。
MAC16肿瘤可以获自化学诱导的、可移种的结肠腺癌的已确立的系列(MAC)，可以通过特定的细胞系产生，该细胞系于1989年3月8日存放于Porton Down，Salisbury，Wiltshire，United Kingdom的Public HealthLaboratory Service Centre用于微生物学和研究的欧洲动物细胞培养物保藏中心(European Collection of Animal Cell Cultures)(ECACC)，其临时保藏号为8903016。
MAC16肿瘤为中度完全分化的腺癌，在小鼠中系列传代已经多年。已经发现，它似乎可以代表可以在人类患者中诱导恶病质的更令人满意的肿瘤实验模型，尤其是到目前为止，已经发现在小肿瘤负担时(小于1％体重)它通常能够产生实际上的体重损失并且不会减少食物或水的摄取。
药用组合物
本文中所述的本发明的化合物或成分为能够影响eIF2α或PKR磷酸化或者能够使得影响eIF2α或PKR磷酸化的化合物的作用增强的化合物或成分，例如可以通过抑制eIF2α或PKR磷酸化而进行影响。本发明的化合物或成分可以制成适合于给药的药用组合物。
包括至少一种PKR-I抑制剂、至少一种PKR-I磷酸化抑制剂和/或PKR-I增效剂的本发明组合物可以通过肠道或胃肠外给药。肠胃外给药可以选自下列形式：皮下、静脉内、肌肉内和局部给药。肠道给药可以是下列形式：片剂、液体、凝胶、香囊、粉末、锭剂、薄膜剂、胶类和胶囊。另外，肠道给药方法的途径可以选自鼻内、体内(interiorly)、鼻胃、口胃、胃(gastric port)、空肠(jejunal port)和回肠(ileal port)。
本发明组合物通常含有上述化合物和可药用载体。本文中使用的术语“可药用载体”应当包括可以与药物给药配伍的任何和所有的溶剂、分散介质、包衣材料、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。用于药物活性成分的此类介质和成分的使用在本领域中是众所周知的。除了与活性成分不相容的任何常规介质或成分外，可以考虑任何常规介质或成分在组合物中的使用。补充营养剂也可以结合到本发明的组合物中。
本发明的药用组合物可以制成与其预期的给药途径相适应的形式。例如，用于胃肠外、皮内或皮下的溶液或混悬液可以包括下列成分：无菌稀释剂，例如注射用水、盐水溶液、固化油类、聚乙二醇类、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗菌成分，例如苄基醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧剂，例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，例如乙二胺四乙酸；缓冲剂，例如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；用于调节张力的成分，例如氯化钠或葡萄糖。可以采用酸或碱调节pH，例如盐酸或氢氧化钠。肠胃外制剂可以封装在由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。
适合于注射使用的药用组合物包括无菌水溶液(其中水可溶)或分散液和可以即席制成无菌注射溶液或分散液的无菌粉末。对于静脉内给药而言，适当的载体包括生理盐水、无菌水、Cremophor ELTM(BASF，Parsippany，N.J.)或磷酸盐缓冲的盐水(PBS)。在任何情况下，组合物必须是无菌的，应当是流动的，流动的程度应当是易于注射的。在生产和储存条件下必须是稳定的，必须进行防腐以对抗微生物(例如细菌和真菌)的污染作用。载体可以是溶剂或分散介质，含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其适当的混合物。通过例如应用包衣材料(例如卵磷脂)、在分散液的情况下维持需要的粒径以及使用表面活性剂，可以保持适当的流动性。微生物作用的预防可以通过各种抗菌剂和抗真菌剂来完成，例如对羟基苯甲酸酯类、氯代丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等。在多种情况下，组合物中可以优选包括等渗剂，例如蔗糖、多元醇类(例如甘露醇、山梨醇)、氯化钠。延长可注射组合物的吸收可以通过在组合物中含有延缓吸收的成分来完成，例如单硬脂酸铝和明胶。
无菌注射溶液可以通过将需要量的活性成分在适当的溶剂中与一种上面列举的成分或上面列举的成分的组合物结合进行制备，如果需要，随后可以进行过滤除菌。通常，分散液可以通过将活性成分在无菌载体中混合而制备，所述载体含有基础分散介质和需要的其它选自上面所列举的成分。对于用于制备无菌注射溶液的无菌粉末而言，优选的制备方法为真空干燥和冷冻干燥，它能够获得活性成分加上任何其他需要的成分的粉末，所述各成分可以获自其预先经过滤除菌的溶液。
口服组合物通常包含惰性稀释剂或可食用载体。它们可以包封在明胶胶囊中或者压制成片剂。为了进行口服给药治疗，活性成分可以与赋形剂结合，以片剂、锭剂或胶囊的形式使用。口服组合物也可以采用液体载体制备，用作漱口剂，其中液体载体中的成分可以口服应用，漱口(swished)、吐出(expectorated)或吞咽(swallowed)。也可以包含作为组合物一部分的可药用的粘合剂和/或辅助材料。片剂、丸剂、胶囊、锭剂等可以含有任何下列具有相似特性的成分：粘合剂，例如微晶纤维素、黄芪胶或明胶；赋形剂，例如淀粉或乳糖；崩解剂，例如藻酸、羧甲基淀粉钠(Primogel)或玉米淀粉；润滑剂，例如硬脂酸镁或Sterotes；助流剂，胶体二氧化硅；甜味剂，例如蔗糖或糖精；或矫味剂，例如薄荷、水杨酸甲酯或橙矫味剂。
在一个实施方案中，本发明化合物可以与能够保护该成分对抗其自机体快速消除的载体一起制备，例如控释制剂，包括植入剂和微囊化传递系统。可以采用生物可降解的、生物可相容的聚合物，例如乙烯-乙酸乙烯酯、聚酐类、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯类和聚乳酸。用于制备此类制剂的方法对于本领域技术人员而言是显而易见的。原料也可以获自商业：AlzaCorporation和Nova Pharmaceuticals，Inc。脂质体混悬液(包括靶向感染细胞的脂质体，含有能够对抗病毒抗原的单克隆抗体)也可以用作可药用载体。这些可以根据本领域技术人员已知的方法制备，例如，描述于U.S.Pat.No.4,522,811中的方法，它以其全部内容引入本文作为参考。
营养组合物
化疗和放疗不仅能够有效破坏癌细胞，而且它们也可以通过引起这些细胞的过早死亡而伤害非癌细胞。另外，本发明化合物不仅可以通过抑制PKR的磷酸化而抑制肿瘤细胞的生长，而且也可以提高化疗药物在癌症患者中的效能。如上所讨论，本发明组合物可以单独包括至少一种PKRI，或者至少一种PKRI与至少一种增效剂的组合。除了制成用于药用目的的制剂外，这些化合物也可以制成营养性制品以获得需要的目的，如上文所述。
本发明的营养组合物可以是膳食形式(例如补充剂)或营养制剂的形式(例如医用食品或饮料产品)，例如，完全食品形式、部分食品形式，作为食品添加剂或者作为可溶粉末。粉末可以与液体混合，例如水或其他液体，例如奶或果汁。
或者，营养制品不仅包括本发明化合物，可以是完全营养食品，即可以包含矿物质、维生素、微量元素和脂肪和/或脂肪酸，从而它们可以用作唯一的营养来源，基本上可以供给所有每日需要量的维生素、矿物质、碳水化合物、脂肪和/或脂肪酸、蛋白质等。
因此，本发明的营养组合物可以为营养成分平衡的完全食品形式，例如适合于口服或管食，例如通过鼻胃管、鼻十二指肠管、食管造口术、胃造口术或空肠造口术的管的方法，或者通过外周或全胃肠外营养。优选，本发明组合物用于口服给予。
本发明的营养组合物可以用于促进肌肉蛋白合成或者控制肿瘤诱导的体重损失，例如恶病质，如癌症恶病质。它也可以用作患有自身免疫性疾病或其他疾病并进行化疗的患者的营养补充剂。
在本发明的一个特征中，营养组合物还可以包含但不限于生物活性蛋白、支链氨基酸、必需氨基酸、氨基酸或氨基酸类似物、核苷酸或RNA、维生素、谷氨酰胺、唾液酸低聚糖、L-茶氨酸、益生素、益生菌或合生元、必需脂肪酸、PUFA和/或MUFA、食用油和抗氧剂。
食用油可以用于制备本发明的营养组合物。食用油包括但不限于油菜籽油、中链甘油三酯(MCT)、鱼油、大豆油、大豆卵磷脂油、玉米油、红花油、葵花籽油、高油酸葵花籽油、高油酸红花油、橄榄油、琉璃苣籽油、黑加仑油、月见草油和亚麻籽油。
本发明营养组合物还可以包含可溶性纤维，例如琼脂，藻酸盐，carubin，果胶及其衍生物，例如源自水果和蔬菜的果胶，更优选获自柑橘类水果和苹果的果胶，β-葡聚糖，例如燕麦β-葡聚糖，卡拉胶，例如κ、λ和ι卡拉胶，帚叉藻胶，菊粉、阿拉伯半聚乳糖，纤维素及其衍生物，硬葡聚糖，洋车前子(psyllium)，例如洋车前子种壳，黏胶和胶类。根据本发明，胶类和黏胶优选植物分泌物。特别的是，本文中使用的术语“胶”是指通常可以获自蔬菜的胶类，更特别是指魔芋胶、黄原胶、瓜尔豆胶(瓜拉尼胶)、刺槐豆胶、塔拉豆胶、黄芪胶、阿拉伯胶、梧桐胶、盖提胶、结冷胶及其它相关梧桐胶，苜蓿粉、三叶草粉，胡芦巴粉，罗望子粉。天然和改良的(例如水解的)可溶性纤维可以用于本发明。根据本发明，可以优选采用瓜尔豆胶，例如水解的瓜尔豆胶。
上文中所述任选营养剂的日常使用可以取决于个体的体重、性别、年龄和/或医学状态。
本发明的营养组合物可以包含一或多种脂肪酸(例如多不饱和脂肪酸)、益生素或益生菌或者益生素和益生菌的组合产品(合生元)和生物活性化合物或提取物。
营养组合物可以提供至少100％(例如100％)的U.S.RDA的每日剂量的维生素和矿物质，例如钙、镁、铁、锌、磷、维生素D、维生素K。它也可以含有抗氧剂，包括但不限于谷氨酰胺、半胱氨酸、维生素A、C、E和硒。它也可以特别含有大量的维生素E，它可以用在组合物中以促进肌肉蛋白合成或控制肿瘤诱导的体重损失，例如恶病质，如癌症恶病质。
本发明的营养组合物可以为医用食物或饮料产品，例如以口服营养剂的形式应用，例如健康饮料，即冲的饮料，任选作为软饮料，包括果汁、奶昔、酸奶、冰果露或大豆饮料，可以是糕点或者分散在任何种类的食物中，例如烘烤产品、燕麦糕点、乳品糕点、小吃食品、汤类、早餐燕麦片、营养早餐、糖果、tabs、小面包、饼干、薄脆饼干(例如脆米饼)和乳制品。
优选本发明组合物可以以营养制品的形式给予，例如部分食品，例如以健康饮品的形式给予，例如即开即用饮品(ready-to-use drink)。
固体口服剂型可以根据共知的方法制备，例如通过常规混合、制粒、成型、溶解或冷冻干燥的方法制备。
本文中所述或引用的文章、专利和专利申请以及所有其他文献和电子信息均以其全部内容引入本文作为参考，如同每一个出版物被具体并独立地引入作为参考。本申请人保留将获自任何此类文章、专利、专利申请或其他文献的任何和所有材料和信息引入本申请的权利。
本文中说明性地描述的本发明可以在缺乏任何元素、限制的情况下适当地实施，此方面不在本文中特别公开。因此，例如，术语“包含”、“包括”、“含有”等应当从广义上理解，不加限定。另外，本文中采用的术语和表述可以用作描述性术语并不加限定，在使用此类术语和表述时，不应当排除任何相当的描述的特征及其部分，但是公认的是，各种修改在本发明所要求保护的范围内是可能的。因此，应当理解，尽管本发明已经通过优选的实施方案和任选的特征进行了特别公开，但是，本公开所包含的本发明的修改和变通可以由本领域技术人员所实施，此类修改和变通包含在本发明范围内。
在本文中对本发明进行了广义地和一般性地描述。一般性公开所包含的每一种狭义的种类和亚组群也构成本发明的一部分。这包括采用限制性条款或负面限定排除的任何种属的主题的本发明的通用表述，无论排除的材料是否在本文中特别说明。
另外，当本发明的特征或方面采用Markush形式进行表述时，本领域技术人员可以理解本发明也采用了Markush形式中的任何单一成员或亚组进行了描述。
实施例
本公开在下列实施例中进行了进一步定义。应当理解，当对优选的实施方案进行说明时，这些实施例仅通过说明的方式给出。根据上面的讨论和这些实施例，本领域技术人员可以确定本公开的优选的特征，在不背离其精神和范围的情况下，可以进行各种改变和修改以适应各种用途和情况。
材料
胎牛血清(FCS)和RPMI 1640组织培养基购自Invitrogen(Paisley，Scotland)。L-[2，6-3H]苯丙氨酸(spec，act.，2.00TBqmmol-1)，Hybond A硝基纤维素膜和增强型化学发光剂(ECL)开发试剂盒获自AmershamBiosciences(Bucks，UK)。对抗含磷的兔单克隆抗体和总PKR购自NewEngland Biolabs(Herts，UK)。对抗含磷eIF2α的兔多克隆抗血清获自Abcam(Cambridge，UK)，对抗总eIF2α的抗血清获自Santa CruzBiotechnology(CA)。过氧化物酶结合的山羊抗兔抗体购自Dako Ltd(Cambridge，UK)。PKR抑制剂和PhosphoSafeTM提取试剂获自MerckEurolab Ltd(Leics，UK)。EMSA(电泳迁移率变动分析)凝胶迁移分析试剂盒获自Panomics(CA，USA)。吉西他滨(Gemzar
Figure GPA00001138662100291
)由Eli Lilly and Co(Basingstoke，UK)捐赠。5-氟尿嘧啶购自Sigma Aldridge(Dorset，UK)。
肿瘤的维持
MAC16(由Cowen等第一次描述(J.Natl.Cancer Inst.，64：675-681，1980))为携有化学诱导的可移种结肠腺癌的已确立系列(MAC)的纯NMRI鼠系。MAC16肿瘤为中度分化良好的腺癌，它在小鼠中系列传代已经多年。它代表了更令人满意的肿瘤实验模型，它诱导人类患者中的恶病质，尤其是到目前为止，已经发现在小肿瘤负担时(小于1％体重)它通常能够产生实际上的体重损失并且不会减少食物或水的摄取(Bibby，M.C.等，J.Natl.Cancer Inst.，78：539-546，1987)。
在5％CO2的空气环境中，将MAC16和MAC13肿瘤在体外于37℃在含有10％FCS的RPMI 1640培养基中繁殖。为了进行细胞生长分析，将细胞以每孔0.5×105个细胞(MAC13)或每孔1×105个细胞(MAC16)在24孔多孔皿中接种，在加入药物前使其积聚24小时。三天后测定细胞数目，而细胞以指数方式生长。
根据Bibby等，J.Natl.Cancer Inst.，78(3)：539-546，1987所述方法，通过将片段经皮下(s.c.)植入侧腹，将MAC16和MAC13肿瘤在NMRI小鼠体内传代。为保持恶病质，用于传代的MAC16肿瘤选自已确定有体重损失的供体动物，当平均体重损失达5％时开始治疗。将动物随机分为6组，它们接受溶剂(DMSO(二甲基亚砜)∶PBS(磷酸盐缓冲盐水)；1∶20)或PKR抑制剂治疗，该抑制剂以1和5mg/kg每天通过s.c.注射给药。当体重损失达20％时，通过颈部错位处死动物。所有的动物实验都依据British HomeOffice批准的严格方案实施，依据的道德准则符合UKCCR指南所要求的标准(Workman，P.等，Br.J.Cancer，77：1-10，1998)。
蛋白合成测定
根据Eley，HL.和Tisdale，M.J.，J.Biol.Chem.，282(10)：7087-7097，2007所述方法，通过在4小时内L-[2，6-3H]苯丙氨酸掺入蛋白的量而测定MAC16和MAC13细胞中的蛋白合成。通过除去组织培养介质中止反应，采用冰冷的无菌PBS洗涤三次。除去PBS，加入冰冷的0.2M高氯酸，随后于4℃温育20分钟。除去高氯酸后，加入0.3M NaOH，随后于4℃温育30分钟。于37℃再温育20分钟继续进行反应，加入0.2M高氯酸。将混合物置于冰上20分钟。于4℃以700g离心5分钟后，将含有蛋白的沉淀溶于0.3M NaOH中，测定放射活性。采用标准蛋白比色分析(Sigma)测定蛋白含量。
蛋白印迹分析(Western Blot Analysis)
将肿瘤样品(约10mg)在500μl的PhosphoSafeTM提取试剂中匀化，以15,000g于4℃离心15分钟。细胞质蛋白部分(10μg)在10％十二烷硫酸钠/聚丙烯酰胺凝胶(SDS/PAGE；对于eIF2α而言6％)上分解。将分解的蛋白转移到0.45μm硝基纤维膜上，于4℃采用5％Marvel的Tris-缓冲的盐水溶液(pH 7.5)封闭过夜。然后将膜在0.5％Tween-缓冲的盐水中或在TBS-Tween中洗涤15分钟，然后加入一级抗体。一级抗体以1∶1000的稀释比例使用，而含磷eIF2α以1∶500的稀释比例使用。采用一级抗体洗涤膜15分钟，每5分钟采用0.1％TBS-Tween缓冲液改变。二级抗体以1∶1000的稀释比例使用，洗涤45分钟。通过ECL显影，将膜显影3-6分钟。通过显影密度计扫描印迹以量化差异。
电泳迁移变动分析(EMSA)
DNA-结合蛋白通过低渗溶解分离自肿瘤样品，随后根据Andrews和Faller所述方法进行核的高盐提取(Nucleic Acids Res.，19(9)：2499，1991)。根据生产商说明书，采用Panomics EMSA“凝胶迁移”试剂盒进行EMSA。
统计分析
至少三次重复实验的结果表示为平均±SEM。
通过单向方差分析(ANOVA)确定各组之间平均值的差异，随后进行Tukey-Kramer多重比较分析。小于0.05的P值被认为具有显著差异。
结果
在癌症患者中，体重损失不仅能够独立说明生存时间缩短，而且也可以降低对治疗的响应，也可能判断源自治疗的毒性(Ross，P.J.等，Br.J.Cancer，90(10)：1905-1911，2004)。体重损失可以归因于细胞因子和肿瘤因子所诱导的骨骼肌和脂肪组织的进行性萎缩，例如蛋白水解诱导因子(PIF)和脂肪动员因子(LMF)(Tisdale，M.J.，Curr.Opin.Clin.Nutr.Metab.Care，5(4)：401-405，2002)。此类因子可以影响代谢，不仅是在宿主组织中，而且在原发性肿瘤和转移肿瘤中。因此，LMF能够诱导肿瘤中解偶联蛋白(UCP)2的表达，据认为它与游离基的解毒作用有关，这可以保护肿瘤细胞免于细胞毒性药物产生的游离基损害(Sanders，P.M.和Tisdale，M.J.，Br.J.Cancer，90(6)：1274-1278，2004)。乳癌细胞中PIF核肽(dermicidin)的表达能够促进细胞生长和生存并能够降低血清依赖性(serumdependency)(Porter，D.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，100：10931-10936，2003)。通过与dsRNA-依赖性蛋白激酶PKR激活(通过自磷酸化)有关的机制激活转录因子核因子-κB(NF-κB)，PIF能够促进肌肉萎缩(Eley和Tisdale，2007)。最近在携有恶病质诱导的MAC16肿瘤小鼠中采用低分子量PKR抑制剂进行的研究(Eley等，2007)表明，它不仅能够减轻肌肉萎缩，而且也能抑制肿瘤生长。这是令人惊奇的，因为与能够诱导恶病质的人类肿瘤相似，MAC16肿瘤具有高度的化学耐药性(Double，J.A.和Bibby，M.C，J.Natl.Cancer Inst.，81(13)：988-994，1989)。这是第一次报道显示，PKR的抑制诱导了肿瘤生长的抑制，该作用的机理研究为化学耐药性肿瘤的治疗提供了深刻见解。
在PKR和肿瘤生长之间的一种可能的联系涉及到NF-κB的激活。NF-κB的激活与肿瘤细胞的存活和增殖以及侵入和血管生成有关，还与肿瘤转移的危急事件有关(Karin，M.，Nature，441(7092)：431-436，2006)。据报道，NF-κB在多种肿瘤类型中可能被构成性激活，包括结直肠癌(Kojima，M.等，Anticancer Res.，24(2B)：675-681，2004)、胰腺癌(Wang，W.等，Clin.Cancer Res.，5：119-127，1999)和肝细胞癌(Tai，D.I.等，Cancer，89：2274-2281，2000)。与NF-κB的构成性激活有关的因素包括肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-1(IL-I)、pH和组织缺氧(Baldwin，A.S.，J.Clin.Invest.，107(3)：241-243，2001)。恶病质诱导的肿瘤所导致的PIF的产生也可能导致NF-κB的构成性激活，如同它在恶病质动物骨骼肌中的作用(Wyke，S.M.等，Br.J.Cancer，91(9)：1742-1750，2004)。通过白藜芦醇抑制NF-κB在骨骼肌中的活化也能够在携有MAC16肿瘤的小鼠中抑制肿瘤生长，尽管对其机制尚未进行研究。NF-κB能够通过调节半胱天冬酶的活性而激活基因的转录，从而抑制细胞凋亡(Karin，M.等，Nat.Immunol.，3(3)：221-227，2002)。NF-κB所导致的细胞凋亡受到抑制使得肿瘤对化疗和放疗产生抗性(Bharti，A.C.和Aggarwal，B.B.，Ann.NY Acad..Sci，973：392-395，2002)，这可以解释产生恶病质(cachexigenic)的肿瘤为什么对治疗如此抵抗。
该研究对PKR抑制剂对MAC16肿瘤生长的作用与其对MAC13肿瘤生长的作用进行了比较，MAC13肿瘤在组织学上与MAC16肿瘤相似，但不会诱导恶病质(Beck，S.A.和Tisdale，M.J.，Cancer Res.，47：5919-5923，1987)，同时对肿瘤生长的抑制机制进行了研究。
先前的研究(Eley，HL.和Tisdale，M.J.，J.Biol，282：7087-7097，2007)表明，低分子量PKR抑制剂(8-[1-(1H-咪唑-4-基)亚甲-(Z)-基]-6，8-二氢-噻唑并[5，4-e]吲哚-7-酮)能够在小鼠中降低恶病质诱导的MAC16肿瘤的生长。该结果在图2中显示，说明它也可以抑制MAC16肿瘤在体外的生长，在200nM时作用最大，而它对MAC13肿瘤的生长没有作用，即使其浓度达1000nM。两种肿瘤均为小鼠大肠腺癌，通过长期给予1，2-二甲基肼所诱导产生(Cowen，D.M.等，J.Natl.Cancer Inst.，64(3)：675-681，1980)，但是MAC16能够诱导恶病质(Bibby，M.C.等，J Natl Cancer Inst.，78(3)：539-546，1987)，而MAC13不能。图2中的结果显示，含磷PKR(图3A)和含磷eIF2α(图3B)均能够在MAC16肿瘤中高水平表达，但是在MAC13肿瘤中不能。然而，PKR和eIF2α两者的总水平在两种肿瘤类型中是相似的。采用PKR抑制剂治疗携有MAC16肿瘤的小鼠能够完全减弱PKR(图4A)和eIF2α(图4B)的磷酸化的增加，而对PKR和eIF2α的总水平没有影响。采用PKR抑制剂治疗MAC16细胞，在200nM的浓度时对细胞生长产生了最大抑制，而较高的浓度产生的抑制作用较小(图2)。为了观察该作用是否与PKR的自磷酸化抑制有关，在MAC16和MAC13两种细胞中测定了抑制剂对含磷PKR和总PKR的作用(图5)。在小鼠的实体肿瘤中，MAC16细胞显示高水平的含磷PKR，而MAC13显示非常低的水平。PKR抑制剂在200-300nM时能够最大化地抑制MAC16细胞中PKR的自磷酸化，而在较高浓度时它的作用很弱(图5A)。PKR抑制剂对MAC13细胞中PKR的低水平自磷酸化没有作用(图5B)。在两个细胞系中，抑制剂对细胞中的总PKR均无作用。因为PKR的激活能够诱导20S蛋白酶体在骨骼肌中表达(Eley，HL.和Tisdale，M.J.，J.Biol，282：7087-7097，2007)，测定抑制剂的作用。MAC16(图5C)和MAC13(图5D)细胞能够表达20S蛋白酶体，但是该表达在MAC16中高于在MAC13细胞中。另外，PKR抑制剂能够降低20S蛋白酶体在MAC16中的表达(图5C)，但是在MAC13细胞中不能(图5D)。另外，20S蛋白酶体的表达(图5C)和PKR的表达(图5A)之间具有线性相关性(相关系数0.957)，采用不同浓度的PKR抑制剂(图5E)，这说明20S蛋白酶体的表达也可以通过PKR在MAC16细胞中表达加以控制。
与MAC13肿瘤相比，MAC16肿瘤中蛋白合成受到显著抑制(图6)，可能是由于eIF2α磷酸化的增加。这说明PKR的磷酸化对于MAC16肿瘤的存活是重要的。PKR的功能之一为它能够激活NF-κB(Zamanian-Daryoush，M.等，Mol Cell Biol，20：1278-1290，2000)。图7A中的数据显示NF-κB在MAC16肿瘤中具有高水平的构成性激活，但是在MAC13肿瘤中没有。采用PKR抑制剂治疗携有MAC16肿瘤的小鼠能够降低NF-κB在肿瘤中的构成性激活，说明它起因于PKR的激活。
NF-κB的激活显示其在胰腺癌对吉西他滨(Arlt，A.等，Oncogene，22(21)：3243-3251，2003)和胃癌对5-氟尿嘧啶(5-FU)(Uetsuka，H.等，ExpCell Res.，289(1)：27-35，2003)的耐药性中起到了重要作用。为了测定PKR抑制剂下调NF-κB是否能够增加MAC16细胞对吉西他滨和5FU的敏感性，测定单独使用所述成分或者与PKR抑制剂(浓度为100或200nM)组合使用对细胞生长的作用(图8)。以1-10μM的浓度单独使用5FU能够对MAC16细胞的生长产生显著的抑制作用，采用两种浓度的PKR抑制剂能够显著增强该作用。同样，两种浓度的PKR抑制剂也能够增强吉西他滨对MAC16细胞生长的抑制作用。这些结果表明PKR抑制剂可能用于对细胞毒性药物具有敏感性的人类肿瘤。
讨论
早期的研究说明PKR可以作为肿瘤抑制剂，因为采用催化的无活性突变型PKR使得3T3细胞的转染能够导致细胞转化(Koromilas，A.E.等，Science，257：1685-1689，1992)，而Ml骨髓白血病细胞中野生型PKR活性的上调导致转化的表型逆转或凋亡(Raveh，T.等，J.Biol.Chem.，271(41)：25479-25484，1996)。然而，最近的研究(Kim，S.H.等，Oncogene，19(27)：3086-3094，2000；Yang，YL.等，EMBO J.，14(24)：6095-6106，1995)对该理论提出了质疑。因为PKR缺乏性转基因小鼠是正常的，不会增加肿瘤的发生率(Yang等，1995)。另外，PKR的自磷酸化和eIF2α的磷酸化在乳癌细胞系裂解液中较在未转化的上皮细胞系裂解液中高40倍(Kim，S.H.等，Oncogene，19(27)：3086-3094，2000)，在黑素瘤细胞中也高于在培养物中未转染的黑素细胞(Kim，S.H.等，Oncogene，21(57)：8741-8748，2002)。另外，结肠中正常粘膜向腺瘤和癌的转化与PKR的表达增加一致(Kim等，2002)。未转化细胞系中较低的PKR活性部分归因于较低的PKR蛋白水平，部分归因于P58(一种已知的细胞PKR抑制剂)的存在(Kim，S.H.等，2000)。
目前的研究显示恶病质小鼠肿瘤中自磷酸化的PKR的表达上调。活化的PKR与NF-κB的核结合增加有关，该结合可以通过抑制PKR的活化而减弱。NF-κB在此类肿瘤中的激活与临床数据相关，该临床数据说明恶病质为促炎症反应状态(McMillan，D.C.等，Nutr.Cancer，31(2)：101-105，1998)。在鼠科肿瘤对(MAC16/MAC13)中，采用低分子量PKR抑制剂治疗能够抑制MAC16的增生率，这显示了磷酸化的PKR的上调，但是对MAC13肿瘤没有影响，它没有显示PKR的活化。该结果说明恶病质诱导的肿瘤(显示存在激活的PKR)可能对PKR抑制剂的抗肿瘤作用更为敏感。令人惊奇的是，PKR抑制剂在浓度为200nM时对PKR的抑制具有最大作用，而增加浓度却较低了抑制作用。在存在PIF的鼠科肌管中也发现了相似的情况(Eley和Tisdale，2007)。PKR抑制剂与PKR中的ATP-结合位点有关，在无细胞转译分析中，另一个ATP-结合位点定向的抑制剂(2-氨基嘌呤)也发现了相似的情况(Jammi等，Biochem.Biophys.Res.Commun.，308：50-57，2003)。该作用归因于具有转译机制的其他成分的非特异性抑制。然而，较高浓度的抑制剂能够与PKR结合从而启动构象改变，这能够诱导自磷酸化，与采用ATP相同(Lemaire，P.A.等，J.Mol.Biol，345(1)：81-90，2005)。
先前的研究(Zamanian-Daryoush等，2000)显示，PKR可以激活NF-κB。PKR可以通过其催化域与上游激酶IKK相互作用，它可以将IκB中的关键丝氨酸残基磷酸化，导致其降解，释放游离NF-κB，然后它能够迁移至其在核DNA上的特殊位点。PKR对IKK的激活似乎通过蛋白与蛋白的相互作用而发生，它能够刺激IKKβ的自磷酸化，而非直接磷酸化(Bonnet，M.C.等，Mol.Cell.Biol，20(13)：4532-4542，2000)。然而，eIF2在α-亚基上的磷酸化也显示能够激活NF-κB(Jiang，J.Y.等，Mol.Cell.Biol.，23(16)：5651-5663，2003)。这说明了另一种机制，通过该机制，可以采用PKR的抑制下调NF-κB的活化。PKR抑制剂对NF-κB的构成性活化的抑制可能是至少部分与肿瘤生长率的抑制有关。PKR能够介导由多种不同刺激物通过eIF2α磷酸化和NF-κB的活化诱导的细胞凋亡(Gil，J.和Esteban，M.，Apoptosis.5(2)：107-114，2000)。然而，PKR也能够激活存活通路，也能够通过NF-κB介导，它能够延缓细胞凋亡(Donzé，O.等，EMBO J.，23：564-571，2004)。所以，如同NF-κB，PKR可以促进肿瘤细胞的存活或死亡。除了促进生长，NF-κB能够通过增强促血管形成因子(例如血管内皮生长因子)而提高肿瘤的血管生成能力(Xiong，H.Q.等，Int.J.Cancer，108(2)：181-188，2004)，NF-κB-调节的基因产物能够促进癌细胞的迁移和侵入(Yebra，M.等，Mol.Biol.Cell，6：841-850，1995)。尽管NF-κB与超过150种靶基因的调控有关，但是通过抑制PKR的自磷酸化而抑制其活化不会在小鼠中产生毒性，这建议了一种治疗癌症的新方案。最近的研究(Kunnumakkara，A.B.等，Cancer Res.，67(8)：3853-6861，2007)显示，姜黄素(一种NF-κB激活抑制剂)能够在体外抑制人胰腺癌细胞系的生长，在体内增强吉西他滨的抗肿瘤活性。显示NF-κB在促进胰腺癌的吉西他滨抗性中起到了关键作用(Arlt等，2003)，在人胃癌细胞系对5-FU和吉西他滨的耐药性中起到了关键作用(Uetsuka等，2003)。这表明PKR抑制剂可以用于增强肿瘤对化疗药物的敏感性。在目前的研究中，显示PKR抑制剂能够敏化MAC16细胞对5-FU和吉西他滨的细胞毒性作用，这建议了此类药物的另一种有效治疗作用。
PKR的活化可以解释某些肿瘤的低增生率，这使得它们对化疗和放疗不敏感。除了NF-κB的活化外，PKR也能够诱导eIF2α的磷酸化，它能够通过竞争性抑制鸟嘌呤核苷酸交换因子(eIF2B)而抑制转译启动，它能够将eIF2.GDP转化为eIF2.GTP(Rowlands，A.G.等，J.Biol.Chem.，263(12)：5526-5533，1988)。然而在人类乳癌细胞中，蛋白的合成不受高eIF2α磷酸化抑制，可能是因为它们含有较高水平的eIF2B(Kim等，2000)。
该研究的结果显示，在PKR抑制剂存在下，PKR的磷酸化水平和20S蛋白酶体α-亚基之间具有直接的联系。这可以提供另一种肿瘤生长抑制机制。26S蛋白酶体(由两种19S调节亚基与20sα-亚基组合形成)能够降解与细胞周期调控有关的蛋白，例如p27和p21(Blagosklonny，M.V.等，Biochem.Biophys.Res.Commun.，227(2)：564-569，1996)。采用二肽硼酸类似物PS-341(Velcade)对26S蛋白酶体的靶向抑制显示其能够阻断增生并诱导人胰腺癌细胞和异种移植物的细胞凋亡(Shah，S.A.等，J.Cell Biochem.，82(1)：110-122，2001)。PS-341也显示能够使得人胰腺癌细胞对吉西他滨敏感(Bold，R.J.等，J.Surge.Res.，100(1)：11-17，2001)。所以，通过PKR自磷酸化抑制剂抑制蛋白酶体的表达可能与肿瘤生长的减弱和对标准化疗药物的敏感性增加有关。
本文中使用的术语“约”应当通常理解为是指在一定数字范围内的数量。另外，本文中的所有的数字范围应当理解为包括在此范围内的每一个整数。
应当理解，本发明不受本文中所述具体实施方案的限定。因此，本领域技术人员根据本文所述公开或者常规实验易于进行的所有修改都应当包含在权利要求所定义的本发明的精神和范围内。

Claims (41)

1.至少一种双链RNA依赖性蛋白激酶(PKR)抑制剂的组合物和通过所述组合物可以增强的治疗。
2.权利要求1的组合物，其中所述至少一种双链RNA依赖性蛋白激酶(PKR)抑制剂为磷酸化抑制剂。
3.至少一种增强双链RNA依赖性蛋白激酶(PKR)抑制剂的化合物的组合物和通过所述组合物可以增强的治疗。
4.权利要求3的组合物，其中所述增强双链RNA依赖性蛋白激酶(PKR)抑制剂的化合物为增强双链RNA依赖性蛋白激酶(PKR)磷酸化抑制剂的化合物。
5.权利要求1和3的组合物，其中所述增强为所述治疗的增强。
6.权利要求1和3的组合物，其中所述增强为减轻所述治疗的至少一种副作用的发生和/或严重程度。
7.权利要求1和3的组合物，其中所述抑制剂通过肠道或胃肠外途径给药。
8.权利要求1和3的组合物，其中所述抑制剂为营养性组合物。
9.权利要求1和3的组合物，其中所述抑制剂为细胞生长抑制剂。
10.权利要求1和3的组合物，其中所述抑制剂为细胞复制抑制剂。
11.权利要求1和3的组合物，该组合物还包括至少一种蛋白磷酸酶1α(PP1a)调节剂。
12.权利要求11的组合物，其中所述PP1a将磷酸化的PKR去磷酸化。
13.权利要求11的组合物，其中所述PP1a为支链氨基酸。
14.权利要求11的组合物，其中所述PP1a为亮氨酸。
15.权利要求11的组合物，其中所述PP1a为至少一种营养性化合物。
16.权利要求1和3的组合物，该组合物还包括一种增强治疗向代谢活性组织传递的成分。
17.权利要求16的组合物，其中所述成分为精氨酸和瓜氨酸中的至少一种。
18.权利要求1和3的组合物，该组合物包括细胞复制抑制剂的组合物。
19.权利要求18的组合物，其中营养性组合物含有转化生长因子-β(TGF-[β])。
20.权利要求1和3的组合物，其中所述治疗为化疗。
21.权利要求1和3的组合物，其中所述治疗为放疗。
22.权利要求1、2、3或4任一项中所要求保护的组合物的用途。
23.权利要求22的用途，其中所述治疗用于恶性肿瘤。
24.权利要求22的用途，其中所述治疗用于自身免疫性疾病。
25.权利要求22的用途，其中所述增强为所述治疗的增强。
26.权利要求22的用途，其中所述增强为减轻所述治疗的至少一种副作用的发生和/或严重程度。
27.权利要求22的用途，其中所述抑制剂为营养性组合物。
28.权利要求22的用途，该用途还包括至少一种蛋白磷酸酶1α(PP1a)的调节剂。
29.权利要求28的用途，其中所述PP1a为支链氨基酸。
30.权利要求1的用途，该用途还包括一种增强治疗向代谢活性组织传递的成分。
31.权利要求30的用途，其中所述成分为精氨酸和瓜氨酸中的至少一种。
32.权利要求22的用途，该用途还包括细胞复制抑制剂的使用。
33.权利要求32的用途，其中所述细胞复制抑制剂包括转化生长因子-β(TGF-[β])。
34.权利要求22的用途，其中所述治疗为化疗。
35.权利要求22的用途，其中所述治疗为放疗。
36.权利要求1、2、3或4任一项中所要求保护的组合物的生产方法。
37.用于治疗疾病的组合物和用于所述疾病的治疗方法，该组合物包括至少一种双链RNA依赖性蛋白激酶磷酸化抑制剂(PKR-I)。
38.权利要求37的组合物，该组合物还包括至少一种增效剂，所述至少一种增效剂还能够增强所述PKR-I在所述哺乳动物中的磷酸化的抑制。
39.权利要求37的组合物，其中所述疾病选自：癌症、癌症恶病质、厌食症、炎性疾病、败血症、充血性心衰、类风湿性关节炎、慢性阻塞性肺病、神经退行性疾病、自身免疫性疾病、人类免疫缺陷性病毒感染、糖尿病、皮肤病、细胞老化、库欣病、风湿热和早衰。
40.权利要求37的组合物，其中所述增强为所述疾病严重程度的改善或减轻。
41.权利要求37的组合物，其中所述至少一种增效剂选自：PKR抑制剂、PKR-I类似物、PKR磷酸化抑制剂、化疗药物、血管生成药物、血管舒张药物、儿茶素-黄烷醇、生物活性蛋白、支链氨基酸、必需氨基酸、氨基酸、氨基酸类似物、核苷酸、维生素、谷氨酰胺、唾液酸低聚糖、L-茶氨酸、益生素、益生菌、合生元、必需脂肪酸、PUFA、MUFA和抗氧化剂。
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PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Open date: 20101020