WO2007013696A1 - ６’－アミジノ－２’－ナフチル４－グアニジノベンゾエート又はその塩を含んでなる抗腫瘍剤 - Google Patents

Abstract

本発明の目的は、既存の抗腫瘍剤の問題点である重篤な副作用や薬剤耐性誘導を起こさず、治療係数の高い新しいタイプの抗腫瘍剤を提供することである。特に現時点で有効な治療方法および化学療法剤が存在しない膵臓癌に有効であり、さらには癌転移及び癌浸潤を抑制することも可能である新しいタイプの薬剤及び治療方法を提供することである。本願発明の抗腫瘍剤、特に膵臓癌治療薬および癌転移抑制剤は、6'-アミジノ-2'-ナフチル4-グアニジノベンゾエート又はその塩、特にそのメシル酸塩であるメシル酸ナファモスタット(一般名。｢フサン｣、｢FUT｣、｢FUT175｣ともいう。)を有効成分として含有するものである。また、本発明の別の態様は、これらFUTと既存の抗癌剤・抗腫瘍剤、特に好ましくはゲムシタビン塩酸塩との併用である。

Description

明細書

6'-ァミジノ -2'-ナフチル 4-グァニジノベンゾエート又はその塩を含んで なる抗腫瘍剤 技術分野

本願発明は、 6'-アミジノ _2'-ナフチル 4-グァ -ジノベンゾエート又 はその塩、 特にそのメシル酸塩であるメシル酸ナファモスタツ ト （一般 名。 「フサン」、 「F U T J、 「F U T 1 7 5」 ともいう。 ； 以下 .「F U T」 という。） を有効成分として含有する抗腫瘍剤、 特に腠臓癌治療薬およ び癌転移若しくは癌浸潤の抑制剤、 及びこれら抗腫瘍剤又は抑制剤を投 与するこ.とを特徴とする腫.瘍及び癌の治療方法に関する。 また、 本発明 は、 これら F U Tと既存の抗癌剤 ·抗腫瘍剤とからなる医薬、 及ぴそれ ら医薬を投与することを特徴とする腫瘍及び癌の治療方法に関する。 背景技術

現在、 癌の治療法としては、 外科的療法、 放射線照射療法、 化学的 療法、 ホルモン療法、 免疫学的療法又はそれらの併用が行われている。 外科的療法、 放射線照射療法の進歩によってある種の疾患部位について は完全に近い治療が期待されるようになったが、 外科的に切除できる範 囲については 界がある。 手術後の再発や癌の転移の防止又は手術が不 可能な場合には化学療法が最も有効な治療手段となり うる。 又、 放射線 照射療法の補助的手段として、 あるいは症状の軽減の為にも化学療法は 行われる。

抗癌剤は作用の仕方や由来などにより、 「細胞障害性抗癌剤」 と 「分 子標的治療薬」 に分類される。 「細胞障害性抗癌剤」 はさらに、 代謝拮 抗剤、 アルキル化剤、 抗癌性抗生物質、 微小管阻害薬などに分類されて いる。 アルキル化剤や抗癌性抗生物質は、 ある一定の濃度に達すると作 用時間が短くても確実に効くが、 正常細胞に対する傷害も大きい。 そこ で、 薬をより効果的に癌病巣に到達させる研究がさかんに行われている。 また最近は、 癌に特異性の高い標的を探し出し、 その標的に効率よく作 用する薬 （分子標的治療薬） の開発も積極的に行われており、 すでに医 療の現場で使われはじめている。 またこのような化学療法剤に対しては、 癌細胞が薬剤耐性を獲得し、 薬効が持続しないという問題点もある。 よ り薬物有害反応が少なく、 効果の高い薬の開発が期待されている。

現在、 これら化学療法に用いられる薬剤としては、 ナイ トロジェン マスター ド Nォキシド、 シク ロホスフア ミ ド、 ト リエチレンチォホスホ ルアミ 'ド、 サルコリジン等のアルキル化剤、 5一フルォロゥラシル、 ゲ ムシタビン、 シタラビン、 メ ト ト レキサート等の代謝拮抗剤、 マイ トマ イシン C、 ァクチノマイシン D、 ブレオマイシン、 クロモマイシン A ₃、 ダウノマイシン、 ドキソルビシン等の抗癌性抗生物質、 ビノ レルビン、 パクリ.タキセル、 ドセタキセル等の微小管阻害薬、 その他、 塩酸イリノ テカン、 シスプラチン、 カルポプラチン、 エ トポシド、 ネダプラチン、 ミ トキサン トロン、 Lーァスパラギナーゼ、 プロカルバジン、 コルヒチ ン誘導体、 ピシバニール等が知られている。

既存の抗癌剤の作用機序は， 基本的にいずれも癌細胞に対して直接 殺癌細胞効果として働く ものばかりである. しかし、 近年、 催奇形性が 間題となって睡眠薬と しての治療薬から姿を消したサリ ドマイ ド (thalidomide)が、その催奇形性の原因追及から全く新しい,概念のもとに 抗腫瘍効果が浮かび上がつてきた。 特徴は薬効標的を癌細胞にするので なく血管新生を阻害することにある。 すなわち、 血管内皮細胞に对する 細胞分裂抑制作用により血管新生が抑制され、 細胞増殖に必要な酸素や 栄養供給を遮断し、 癌細胞の発達を防ぎ、 また転移を抑制するものであ る。 したがって、 殺細胞効果を有しないため抗癌剤特有の種々の重篤な 副作用も持ち合わせず、 また耐性も生じないため理想的な薬物と期待さ れている。血管新生は、成人では創傷治癒、性周期や癌細胞、 リゥマチ、 虚血など一部の病的状態を除いては通常起こらないように調節されて いる。その調節は正と負の調節因子によって行われ、プロテアーゼ活性、 血管内皮の活性、 線維芽細胞の活性、 免疫応答や CXCケモカイン調節な どが複雑に絡んでいる。

例えば、 血管新生を促進する matri x metal l oprot einase (MM P ) やそれを抑制する t i s sue i nh ib i tor of MMP ( T I M P )があり、 腫瘍細 胞では MM Pの発現量が増えることがわかっているため、 MM Pの発現 を抑制することができる MM P阻害剤は、 抗癌剤として有効であると考 えられる。 現在開発中の MMP 阻害剤としては、 Marimastat (British Biotech社、 米国、 非小細胞肺癌、 小細胞肺癌、 乳癌、 前立腺癌、 食道 癌に対して Phase III) 、 AG 3 3 4 0 (Agouron社、 米国、 非小細胞肺 癌、 ホルモン抵抗性前立腺癌に対し Phase.III、 神経芽細胞腫に対し Phase II) 、 C O L— 3 (Collagenex社、米国、各種固形癌に対し Phase 1) 、 N e o v a s t a t (Aeterna 社、 カナダ、 非小細胞肺癌などに対 し Phase III) 、 BMS - 2 7 5 2 9 1 (Bristol-Myers社、 米国、 Phase I)等がある。 MM Pの発現は核因子 （n u c l e a r f a c t o r ) κ Β (本明細書全体を通して、 N F— κ Β と略記する） によって制御さ れていることがわかっているため、 腫瘍細胞において発現が増強してい る ΜΜΡの発現を抑制する方法のひとつとしては、 N F— κ Βの活性化 を抑制することも有効であると考えられる。

ところで、 抗癌剤や癌の治療方法が大きく進歩したにも関わらず、 膝臓癌に関しては、 手術が可能な場合であっても術後生存期間は 12 ケ 月から 14 ヶ月と短く、 現在でも最も予後が悪い癌のひとつである。 十 分な有効性が示されている薬剤は現時点ではないため、 新しい作用メカ 二ズムを有する薬剤開発が切望されている。 このような状況の中、 最近 分子生物学的アプローチとして、 転写調節因子の一つとして知られてい る N F— κ Βの抑制剤を用いて化学療法剤に対する感受性を上げよう という試みも行われている。 従来の化学療法剤の問題点のひとつである 薬剤耐性は、 癌細胞の N F— κ Βが薬剤により活性化されることが原因 のひとつであると考えられている。 従って、' 既存の化学療法剤によって 活性化される N F— κ Βを抑制することによって、 薬剤耐性の獲得を防 ぎ、 化学療法剤に対する効果を持続させることも可能と考えられる。

N F— κ Βは、 免疫グロブリン （ I g ) κ 鎖遺伝子のェンハンサー に結合する B細胞特異的な核因子として同定され、 その後、 各種サイ ト 力インや受容体の遺伝子上流のプロモーター領域に結合することで、 こ れらの遺伝子の発現誘導に関与し、 免疫応答や炎症性疾患の病態形成に おいて重要な役割を果たしていることが明らかとなってきている。 N F — κ Bは、 p 5 0および p 6 5タンパク質に代表される R e 1 ファミ リ 一サブュニッ トの複合体で、 通常、 細胞質内では制御サブュニッ トであ る I ft Bタンパク質と結合して存在している。 しかし、 細胞に一定の刺 激が加えられる と I κ Β力 1 κ Β リ ン酸化酵素 （ I κ Β kinase complex： 以下 I K Kという） により リン酸化され、 N F— κ Βが複合 体から遊離され活性化される。 このように活性化された N F— κ Β力 S、 核内へ移行し、 ゲノム D N A上の特異塩基配列と結合することで遺伝子 の発現誘導に関与していることが知られている。 N F _ /c Bにより制御 される遺伝子には、 例えば、 I L— 1、 I L一 6、 I L一 8などの炎症 性サイ トカイン類や、 V C AM— 1や I C AM— 1などの接着因子があ る。 また、 N F— fc B自身のィンヒビターである I K B αの遺伝子発現 も制御し、 フィードバックをかけている。

N F— κ Β に起因する疾患としては、 例えば虚血性疾患、 炎症性 疾患、 自己免疫疾患、 癌の転移 ·浸潤、 悪液質等が挙げられる。 虚血性 疾患としては虚血性臓器疾患 （例えば心筋梗塞、 急性心不全、 慢性心不 全等の虚血性心疾患、 脳梗塞等の虚血性脳疾患および肺梗塞等の虚血性 肺疾患等）、 臓器移植 ·臓器手術後の予後の悪化 （例えば心移植、 心臓 手術、 腎移植、 腎臓手術、 肝移植、 肝臓手術、 骨髄移植、 皮膚移植、 角 膜移植、 肺移植等の予後の悪化）、 再灌流障害、 P T C A後の再狭窄等 が知られている。 炎症性疾患としては腎炎、 肝炎、 関節炎等の種々の炎 症、 急性腎不全、 慢性腎不全、 動脈硬化等が挙げられる。 また、 自己免 疫疾患としてはリゥマチ、多発性硬化症、橋本甲状腺炎等が挙げられる。

(例えば、 特許文献 1参照）。

N F— / c Β.は炎症反応以外に、 細胞の増殖 ·生存においても重要な 役割を枭たしており、 N F— fc Βの制御機構が崩壊すると、 多くの炎症 性疾患や癌を引き起こすと言われている。 例えば、 本願発明者らは、 多 くのヒ ト塍臓癌組織ゃヒ ト膝臓癌細胞株においては、' N F— κ Bのサブ ユニットである p 6 5分子が持続的に活性化していること、 N F— / c B を不活性化することによって、 眸臓癌細胞の肝転移や腫瘍形成を抑制す ることができるということも報告されている。

N F— κ Bを抑制することによって様々な疾患を治療しようとする 試みも行われている。 N F— κ Bの阻害剤としては、 プロテアソーム阻 害剤、 I KK阻害剤、 サリ ドマイ ドのような免疫調整剤などが知られて いる。 また、 例えば非ステロイ ド系薬物であるアスピリンやサリチル酸 ナトリゥムが高濃度で N F— κ B の活性化阻害作用を有していること (例えば、 非特許文献 1参照）、 プリン系化合物であるキサンチン誘導 体が N F— /c B の活性化阻害作用を有していること （例えば、 特許文 献 2参照）、 および、 ステロイ ド系薬物であるデキサメタゾンが I κ B の産生を誘導して N F - κ B の活性化阻害作用を有していることが報 告されている （例えば、 非特許文献 2参照）。 これらのうちいくつかに ついては臨床試験が行われている段階である。'

ところで、 本発明の 6'-ァミジノ -2'-ナフチル 4-グァニジノベンゾェ 一ト又はその薬理学上許容される塩、 特にメシル酸ナファモスタッ ト ( F U T )を有効成分として含有する薬剤は、すでに滕炎の急性症状（急 性膝炎、慢性滕炎の急性増悪、術後の急性膝炎、膝管造影後の急性膝炎、 外傷性膝炎） の改善、 汎発性血管内血液凝固症 （DIC) の改善、 出血 性病変または出血傾向を有する患者の血液体外循環時の灌流血液の凝 固防止 （血液透析及ぴプラスマフヱレーシス） に有効であるとして、 本 邦において承認されている薬剤であり、 その安全性も既に確認されてい る。

また、 F U Tは肥満細胞が脱顆粒を起こす際に放出する蛋白分.解酵 素である トリプターゼ阻害活性を有し、 全身アナフィラキシー疾患、 ァ スピリン過敏性喘息、 喘息、 間質性肺疾患、 間質性膀胱炎、 過敏性腸症 候群、. アレルギー性疾患、 ア トピー性疾患、 皮膚水疱症、 知覚過敏症、 疼痛、 搔痒症、 歯肉炎、 浮腫、 乾癬、 肺繊維症、 関節炎、 歯周病、 血液 凝固障害、 腎間質線維化、 X線造影剤の副作用としての血管透過性亢進 または肺浮腫、 及び花粉症からなる群から選ばれる疾患の治療または予 防に有効であることも知られている。

さらに本出願人は、 F U Tが、 炎症局所に集積する免疫担当細胞に おける N F— κ Βの活性化を抑制することにより、 炎症反応を抑える効 果があり、.免疫調節剤とて有効であるということ見出している。

以上のように、現在使用されている抗癌剤には、上述したような様々 な問題点がある。 即ち、 癌細胞内の N F— κ Βの活性化による薬剤耐性 の獲得、 正常細胞に対する強い毒性、 重篤な副作用等である。 従って、 薬剤耐性を誘導せず、 副作用のない新しいタイプの抗癌剤の開発が望ま れている。 また、 特に塍臓癌については現時点で有効な治療方法ゃ抗癌 剤がなく、 現在最も予後の悪い癌であるといわれており、 有効や薬剤の 開発が切望されている。 [特許文献 1 ] 特開 2 0 0 3— 1 2 8 5 5 9号公報

[特許文献 2]'特開平 9 - 2 2 7 5 6 1号公報

[非特許文献 1 ] S c i e n c e , 2 6 5 , 9 5 6 ( 1 9 94)

[非特許文献 2 ] S c i e n c e , 2 7 0 , 2 8 3 ( 1 9 9 5) 発明の開示

発明が解決しようとする課題

現在、 化学的療法剤として使用されている抗腫瘍剤は、 腫瘍細胞の DNA、 RN A合成を選択的に阻害したり、 細胞分裂を阻害する事によ つて悪性腫瘍の増殖を抑えるものであって、 正常細胞、 特に細胞分裂の 速い組織、 例えば骨髄組織や生殖腺組織までも障害してしまう為に、 重 篤な副作用を発現することがしばしばあり、心毒性、悪心、嘔吐、下痢、 血球減少、 発熱、 脱毛、 肝障害等の副作用を伴う例が多い。 この為、 腫 瘍を根絶するのに十分な量の薬剤を投与できず、 既存の化学療法剤は十 分な効果を示すに到っていないのが現状である。 更には、 化学療法を施 行中に腫瘍細胞が薬剤耐性を獲得してしまう問題もあり、 薬剤耐性.を克 服するに足る活性を有し、 かつ低毒性で治療係数の高い新薬の開発が望 まれている。 さらには癌転移を抑制することができる新しいタイプの薬 剤及ぴ治療方法 開発 切望されている。また、特に獰臓癌については、 現時点で有効な治療方法および化学療法剤が存在しないため、 最も予後 の悪い癌であり、 有効な治療方法および新薬の開発が切望されている。 課題を解決するための手段

本発明者は、このような問題点を解決すべく鋭意研究を進めた結果、 膝炎治療剤、 汎発性血管内血液凝固症 （DIC) 治療剤、 血液体外循環時 の灌流血液の凝固防止剤としてその有用性と安全性がすでに確認され ている FUTが抗腫瘍作用を有する薬剤として極めて有効であること を具体的に見出し、 本発明を完成した。

より詳しくは、 本発明者は、 本発明の 6'·アミジノ -2'·ナフチル 4-グ ァニジノベンゾエート又はその薬理学上許容される塩、 特にメシル酸ナ ファモスタツ ト （FUT) を有効成分として含有する薬剤は、 腫瘍細胞 に対して作用し、 その生存率を下げるとともに、 腫瘍細胞のアポトーシ スを誘導する効果を有するものであることを見出し、 さらに詳細な研究 により、 腫瘍細胞における I K Kの抑制により、 I κ B— αのリン酸化 を抑制し、 さらには N F— κ Βの活性化を抑制するというメカニズムに より腫瘍細胞の増殖を阻止する新しいタイプの薬剤であることも見出 した。 また、 F U Tが現在有効な治療薬が切望されている膝臓癌に対し て顕著な効果を示し、 その生体における効果をヒ ト滕臓がん細胞を移植. した動物実験によって確認することにも成功し、 本発明を完成した。

また、 本発明の別の態様は、 上記のごとき F U Tが既存の抗癌剤と 併用することにより更に優れた効果を発揮し、 しかも体重減少等の副作 用を全く示さないことを見出して、 本発明を完成し得たものである。 即 ち、 既存の抗癌剤は薬剤耐性を誘導するという問題点を有しているが、 F U Τは薬剤耐性の原因である細胞内の N F - / Βの活性化を抑制す る作用があるため、 両者を併用することにより、. 既存の抗癌剤の効果を さらに増強することが可能となった。

• 他剤特にゲムシタビンとの F U Tの併用による腫瘍抑制効果及び副 - 作用の抑制効果は、 全く予想し'得ない驚くべきことであった。 我々は、 その併用効果を動物実験においても確認した。 特に膝臓癌に対して顕著 な抑制効果と副作用抑制効果を示した。 特に、 ゲムシタビン等の抗腫瘍 剤と F U Τと 併用が、 体重減少等の重篤な副作用を顕著に低減できる ことは予想し得ない、 '驚くべき現象であった。

癌細胞表面でその発現が増強している ΜΜ Ρは、 癌組織の腫脹や癌細 胞の転移、 浸潤に関与している分子であるが、 F U Tはこの分子の発現 を抑制する効果を有することが明らかとなり、 抗腫瘍効果のみならず、 癌転移抑制剤としても極めて有効であることが明らかとなった。 特に、 ゲムシ.タビン等の他の抗腫瘍剤との併用は、 その薬理効果のみならず、 体重減少等の副作用の抑制の観点からも、 大いに実用化が期待されるも のである。. 即ち 願発明は、 メシル酸ナファモスタツトを有効成分とする抗腫 瘍剤に関するものであり、 以下に示す通りである。

( 1 ) 下記式で表される 6'-アミジノ - 2'-ナフチル 4-グァニジノベンゾェ 一ト又はその薬理学上許容される塩を有効成分と して含有してな る抗腫瘍剤又は癌転移若しくは癌浸潤の抑制剤。

(2) 塩がメシル酸塩である上記 1に記載の抗腫瘍剤又は癌転移若しく は癌浸潤の抑制剤。

(3 ) 抗腫瘍剤又は癌転移若しくは癌浸潤の抑制剤が、 それぞれ、 腠臓 癌治療剤、 .瞵臓癌転移若しくは瞵臓癌浸潤の抑制剤である上記 1又 は 2に記載の薬剤。

(4 ) 6，-ァミジノ -2，-ナフチル 4-グァニジノベンゾエート又はその薬理 学上許容される塩を有効成分として含有してなる NF- /cB抑制剤。 (5) 塩がメシル酸塩である上記 4に記載の NF- κΒ抑制剤。

( 6 ) 6'-ァミジノ -2'-ナフチル 4-グァニジノベンゾエート又はその薬理 学上許容される塩を有効成分として含有してなる IKK(I/cB リン酸 化酵素）抑制剤。

( 7 ) 塩がメシル酸塩である上記 6に記載の IKK(I cB リン酸化酵素）抑 制剤。

(8) 上記 1乃至 7のいずれか 1項に記載の薬剤と、 他の抗腫瘍剤を組 み合わせてなる医薬。

(9) 他の抗腫瘍剤がアルキル化剤、 抗代謝薬、 抗生物質、 植物アル力 ロイ ド、 白金錯体誘導体おょぴホルモンからなる群から選ばれる 1 以上の抗腫瘍剤である上記 8に記載の医薬。

( 1 0) 他の抗腫瘍剤がゲムシタビン塩酸塩、 ナイ トロゲン .マスター ド.' N—ォキサイ ド、 サイクロ.ホスフアミ ド、 メルファラン、 カル ボクォン、 ブスルファン、 二マスチン塩酸塩、 ラニマスチン、 ダカ ルパジン、 フルォロウラシル、 テガフノレ、 サイタラビン、 アンサイ タビン塩酸塩、 プロキシゥリ ジン、 ドキシフルゥリ ジン、 メルカプ トプリン、 チォイノシン、 メ ト トレキセート、 マイ トマイシン、 ブ レオマイシン、 ダウノルビシン塩酸塩、 ドキソルビシン塩酸塩、 ピ ラルビシン塩酸塩、ァクラルビシン塩酸塩、ネオカルジノスタチン、 ァクチノマイシン D、 ヴインクリスチン硫酸塩、 ヴインデシン硫酸 塩、 ヴインブラスチン硫酸塩、 エトポサイ ド、 タモキシフェンタエ ン酸塩、 プロカルバジン塩酸塩、 マイ トブロニトール、 マイ トキサ ントン塩酸塩、 カルポプラチンおよびシスブラチンからなる群から 選ばれる 1以上の抗腫瘍剤である上記 8または 9に記載の医薬。

( 1 1 ) 癌患者又は腫瘍患者に対して、請求項 1に記載の抗腫瘍剤又は 癌転移若しくは癌浸潤の抑制剤を投与することを特徴とする癌又は 腫瘍の治療又は予防方法。

( 1 2 ) 癌患者又は腫瘍患者に対して、 請求項 1に記載の抗腫瘍剤又は 癌転移若しくは癌浸潤の抑制剤と他の抗腫瘍剤を同時に投与する力 、 または時期をずらして投与することを特徴とする上記 （ 1 1 ) に記 載の癌又は腫瘍の治療又は予防方法。 発明の効果

一般的に、 制癌剤は極めて強い副作用を有しているのが普通であつ て、 患者の苦痛は大きな問題となっている。 一方、 本発明の 6'-アミジノ -2，-ナフチル 4-グァニジノベンゾエート又はその薬理学上許容される塩、 特にメシル酸ナファモスタツト '（F U T ) を有効成分として含有する薬 剤は、 すでに膝炎の急性症状 （急性滕炎、 慢性滕炎の急性増悪、 術後の 急性膝炎、 鸱管造影後の急性膝炎、 外傷性膝炎） の改善、 汎発性血管 内血液凝固症 （DIC) の改善、 出血性病変または出血傾向を有する患者 の血液体外循環時の灌^血液の凝固防止 （血液透析及びプラスマフエレ 一シス）に有効であるとして、本邦において承認されている薬剤であり、 その安全性も既に確認されている。

したがって、 安全性が確認されている F U Tを有効成分とする制癌 剤が実現し、 しかも未.だその治療法が確立されていない滕臓癌への適用 が実現するならば、 患者は制癌剤の副作用の苦痛から解放され、 その劾 果は絶大なるものである。

さらには、 直接の抗腫瘍作用を有しているだけでなく、 癌が増大し ていく過程のひとつである癌浸漓や、 癌転移を抑制する効果も有してい ることは、 外科的手術後の転移抑制剤としての効果をもたらすものと期 待される。

また、 既存の抗癌剤ゃ抗腫瘍剤によって引き起こされる薬剤耐性を 抑制する効果も有しているため、 既存の抗癌剤ゃ抗腫瘍剤との併用によ り、 さらに高い抗癌 ·抗腫瘍効果を発揮し得るものである。 加えて、 F U Tが既存の抗癌 ·抗腫瘍剤に対して優れた併用効果を有することから、 結果的に抗癌 ·抗腫瘍剤の投与量を低減することが可能となり、 患者に 苦しみをもたらした多くの副作用を低減することが可能となった。 さら に注目すべきことは、 これらの併用効果が、 本発明者らによって動物実 験によっても確認されたことである。 本発明者らは、 特にヒ ト膝臓癌細 胞を移植した動物において顕著な抑制効果を示すこと、 体重減少等の副' 作用が全くないことを見出しており、' これら実験事実は、 有効な治療薬 が切望されている瞵臓癌に対して大きな期待をもたらすものであるば かりか、 臨床への適用可能性が極めて高いことを意味するものである。 図面の簡単な説明

図 1は、 FUT処理による NF— κ Βおよび I κ Βひの変化を示す図 である （実施例 1， 2)。

図 1一 a、 cは、 ヒ ト腾臓癌細胞株 MD AP a n c— 2 8を各濃度 の F U Tで処理した後の活性化 N F— κ Bをゲルシフ トアツセィによ り検出した結果を示す図である。

図 1一 b、 dはヒ ト MD AP a n c - 28を各濃度の FUTで.処理 した後の細胞質画分の I κ Βをウェスタンブロッ トにより検出した結 果を示す図である。

図 2は、 FUT処 aによる I KK活性、 リン酸化 I _Κ Β ひ量の変化、 およびアポトーシスの誘導を示す図である （実施例 2, 3， 4)。

図 2— a は、 F UT処理前後の MD A P a n c - 28細胞質画分中 の I KK 1、 I KK 2発現をウェスタンプロットにより検出した結果と、 それぞれの細胞質画分の酵素活性 （リン酸化された I /c B a量） を検出 した結果を示す図である。

図 2— bは F U T処理の MD A P a n c - 2 8細胞質中のリン酸 ィ匕 I κ Bひ量を経時的に検出した結果を示す図である。

図 2— cは MD A P a n c - 2 8を各濃度の F U Tで処理した後 の DNAを抽出し、 分断化が起こっているか否かを検出したものを示す 図である。

図 3は、 FUT処理による TNF R I発現量増強を示す図である

(実施例 5)。

図 3— a及び図 3— bは、 MD A P a n c— 28細胞を F UTで処 理した後の TNF R Iの mR N A発現おょぴ蛋白発現の変化を示した 図である。

図 4は、 FUT処理にょるTNFR I発現上昇のメカニズムを検討 した結果を示す図である （実施例 6)。

図 4一 aは、 異なるサイズの TN F R Iプロモーターを含むべクタ 一を作成し、 それぞれを組み込んだ細胞を用いてレポータージーンアツ セィを行った結果を示した図である。 ·一 384と一 2 1 1 b pの間に T N F R Iの発現を誘導する転写因子の結合部位が存在することが明ら かとなつた。

図 4一 bは、 さらに TN F R Iの発現を,誘導する転写因子の結合部 位を特定するために、 2種類のプライマーを用いて P C Rを行い、 ゲル シフトアツセィを行った結果を示した図であり、 一 34 5と一 28 6 b pの間に転写因子の結合部位が存在することが明らかとなった。

図 4一 cは、 P EA 3の c DNAをトランスフエクシヨンした細胞 では T N F R Iプロモーターの活性化が起こったが、 コントロールの細 胞では活性化が起こらなかったととを示した図である。

図 5は、 TNFR Iプロモーター領域への P E A 3の結合を検討し た結果を示す図である （実施例 6)。

図 5— aは、 T N F R Iプロモーター領域に P E A 3が結合するこ とを確認するために、 P EA 3プローブと、 それに一部変異を入れたプ ローブを用いた、 阻害実験の結果を示す図である。

図 5— bは、 ヒ ト滕臓癌細胞株 MDAPanc-28 対する FUT処理に よる P E A 3の発現の経時的上昇を示した図である。

図 6は、 FUTによるカスパーゼ 8の活性化を示す図である （実施 例 7)。 .

図 6— aは、ヒ ト腌臓癌細胞株 MDAPanc-28を各濃度の FUTで 24 時間処理した後、 細胞質画分を調整し、 ウェスタンプロッ トを行い、 抗 カスパーゼ 8抗体で検出した結果を示す。

図 6— b,c,dは、 F UTの処理濃度を一定とし （80 g/ml)、 処理時 間を 0〜24時間の間で細かく取り、 カスパーゼ 8、 p-FADD、 Bid, jBid の発現の経時的変化をウェスタンブロッ トにより検出した結果を示す 図である。

図 7は、 F UTと TNF— αの併用効果を示す図である （実施例 8， 9) ； ヒ ト膝臓癌細胞株 MDAPanc-28について以下の処理をした後、 細 胞質画分を調整しウェスタンプロッ トにより リン酸化 FADD、 カスパー ゼ 8、 N F— κ Β、 1 κ B aの発現を調べた結果を示している。

図 7— aは、 細胞を F U T (80 μ g/ml) で前処理した後、 T N F— a ( 5ng/ml) で 24時間刺激した場合である。

図 7— bは、 T N F—ひにより活性化された N F— κ Bが、 F UT 処理により抑制されることを示す図である。

図 7— cは、 I κ B ひの発現についての図である。

図 8は、 F U Tと T N F—ひの併用効果を示す図である（実施例 9)。 ヒ ト膝臓癌細胞株 MDAPanc- 28を T N F— αで 24時間処理した後、 各濃 度の F U Τを添加しさらに 24時間培養した。

図 8 — a は、 このようにして培養された細胞について MT Tアツセ ィを行い、 細胞生存率を算定した結果を示す図である。

図 8 — bは、 D NAを抽出し、 D NAフラグメンテーショ ンアツセ ィを行った結果を示す図である。

図 9は、 F U Tによるカスパーゼ 8の活性化のメカニズムを検討し た結果を示す図である （実施例 1 0 )。 T N F R Iの発現を siRNA(sjiiall interfering RNA)により抑制した細胞を調整し、 F U T処理をした後、 FADD のリン酸化及びカスパーゼ 8の活性化を検討した結果を示してい る。

図 1 0は、 F U T処理による、 抗腫瘍剤ゲムシタビン誘導活性化 N

F— κ Bの抑制について示す図である （実施例 1 1 )。 ヒ ト膝臓癌細胞 株 MDAPanc- 28をゲムシタビンで 12時間処理した後、 ゲルシフ トアツセ ィを行い、 N F— κ Bの活性化の有無を検討した結果を示す。

図 1 0— aは、 さらにゲムシタ.ビンと FUTの併用 ¾果を検討した結 果を示す図である。

図 1 0.— bは、 ヒ ト膝臓癌細胞株 MDAPanc - 28 を F U T、 P S 1 1 4 5又は P S 3 4 1で 3時間前処理後、ゲムシタビン処理を 3時間行い、 ゲルシフトアツセィを行った結果を示す図である （実施例 1 1)。 '

図 1 1は、 ヒ ト膝臓癌細胞株 MDAPanc- 28 の生細胞率に対する F U T処理の影響を検討した結果を示す図である （実施例 1 2 )。 F U T、 P S 1 1 4 5又は P S 3 4 1それぞれの薬剤単独での、 ヒ ト膝臓癌細胞 株 MDAPanc- 28 の生存率に対する影響を検討した。 ヒ ト膝臓癌細胞株 MDAPanc- 28をそれぞれの薬剤で 24時間及び 48時間処理した後、 MT T ァッセィを行った結果示す図である。

図 1 2は、 ヒ ト膝臓癌細胞株 MDAPanc - 28.のアポトーシスに対する ゲムシタビンと N F— κ B抑制剤との併用効果を検討した結果を示す 図である （実施例 1 3)。 ヒ ト鸱臓癌細胞株 MDAPanc- 28を F U T、 P S 1 1 4 5又は P S 3 4 1で 3時間前処理後、 ゲムシタビンで 48時間処 · '理した細胞について、 アポトーシスを起こしている細胞の割合を算定し た。 アポト一シスを起こしているか否かの確認は、 FACScan を用いて測 定した。

図 1 3は、 正常細胞に対する F U T処理の影響を示す図である (実施例 1 4)。 F U T処理のマウス繊維細胞に対する影響を検討した 結果を示す。

図 1.4は、 F U T処理による MMP— 2、 MMP— 9の発現抑制を 示す図である （実施例 1 5 ) 。 ヒ ト瞵臓癌細胞株 MDAPanc - 28 を、 F U T 0 / g/mlまたは 8 0 ji g/mlで処理した後、細胞質画分についてゥ: スタンブロッ トを行い、 MMP— 2および MMP— 9の発現を検討した 結果を示す。

図 1' 5は、 F UT処理のヒ ト膝臓癌糸 包株 MDAPanc- 28 に対する浸 潤抑制効果を検討した結果を示す図である （実施例 1 6)。 F U T 80 μ g/mlで 24時間処理した細胞、 無処 3の細胞を、 それぞれマトリゲル をコーティングしたチャンパ一に 1 ゥエルあたり 2 0 0 0 0個播種し、 3 7 °Cで 2 2時間、 F U T 8 0 g/ml存在下または非存在下でインキ ュペートした。 ライ トギムザ染色を行い、 浸潤した細胞数を顕微鏡下で 計数した結果を示す。

図.1 5— aは、 処置なし （対照)、 図 1 5— bは、 F'U T 1 7 5 ( 8 0 μ g /m 1 ) 2 2時間処理、 図 1 5 — cは、 F UT 1 7 5 ( 8 0 μ g /m 1 ) 2. 4時間予備処理、 図 1 5 _ dは、 F UT 1 7 5 ( 8 0 μ g / m l ) 2 4時間予備処理、 2 2日 間処理したものである。

図 1 6は、 ヒ ト膝がん細胞株 Pane- 1を皮下に 5X106個移植し、 移 植後 6週間後に腫瘤径が平均化するように 3群に分け、 Control 群： 処 置なし（n=4)、 GEM 群（ゲムシタビン投与群） ： ゲムシタビン（100mg/kg， 週 1回， i. p. ) (n=4)、 FUT group: FUT- 175 (30m_g/kg， 週 3回， i. p. ) + ゲムシタビン（lOOmg/kg, 週 1回， i.p. ) (n=4)、 の処置を 6 週間行い、 腫瘍サイズの測定を行った結果を示す図である （実施例 1 7)。 図 1 7は、 上記図 1 6の処置を行った後に、 マウスの体重測定を行 つた結果を示す図である （実施例 1 7 )。

図 1 8は、 上記図 1 6の処置を行った後に、 摘出腫瘤の重量を測定 した結果を示す図である （実施例 1 7 )。

図 1 9は、 上記図 1 6の処置を行った後のマウスを写真撮影したも のである。 発明を実施するための最良の形態

本.明細書において、 「メシル酸ナファモスタツト（F U T )」 とは、 上 記したとおり、 下記式で表される 6 —アミジノー 2 —ナフチル p—グ ァニジノベンゾエート ジメタンスノレホネート (6-Amidino-2-naphthyl p-guani mobenzoate dimethanesulfonate を, g、味する。

2CH ,S0₃H

メシル酸ナファモスタツト （FUT) は、 すでに本邦において承認、さ れており、 その.効能効果は、

1 ) 腌炎の急性症状 '（急性腠炎、 慢性膝炎の急性増悪、 術後の急性腠 炎、 膝管造影後の急性膝炎、 外傷性膝炎） の改善：

2 ) 汎発性血管内血液凝固症 （DIC) ：

3 ) 出血性病変または出血傾向を有する患者の血液体外循環時の灌流 血液の凝固防止 （血液透析及ぴプラスマフエレ一シス） ： である。

本願発明に係るメシル酸ナファモスタツト （FUT) 'の投与量は、 投 与対象、 投与ルート、 対象疾患、 症状などによっても異なるが、 例えば 患者に経口投与する場合、 1 日あたり、 2.8mg/kg乃至 9.6mg/kgで投与 するのが望ましい。 非経口投与の場合、 その投与形態 （例えば注射剤、 外用剤、 坐剤等） によっても異なるが一日投与量は、 1.4mg/kg 乃至 4.8mg/kgが望ましい。

本願発明の薬剤は、 経口投与のための固体組成物、 液体組成物及び その他の組成物、 あるいは非経口投与のための注射剤、 外用剤、 坐剤、 経皮吸収性製剤、 吸入剤等の形態を取ることができ、 その使用形態につ いては特に限定されるものではない。 経口投与のための固体組成物には、 錠剤、丸剤、 カプセル剤、散剤、顆粒剤等が含まれる。 カプセル剤には、 ハードカプセル及びソフ トカプセルが含まれる。 好ましくは、 非経口投 与のための注射剤である。

このよ な固体組成物においては、 FUTからなる活性物質が、 少な く ともひとつの不活性な希釈剤、 例えばラタ トース、 マンニトール、 マ ンニッ ト、 グルコース、 ヒ ドロキシプロピルセルロース、 微結晶セル口 ース、 デンプン、 ポリ ビニルピロ リ ドン、 メタケイ酸アルミン酸マグネ シゥムと混合ざれる。 組成物は、 常法に従って、 不活性な希釈剤以外の 添加剤、 例えばステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、 辑維素グリ コール酸カルシウムのような崩壊剤、 グルタ ミン酸またはァスパラギン 酸のような溶解補助剤を含有していてもよい。 錠剤または丸剤は必要に よ り 白糖、 ゼラチン、 ヒ ドロキシプロピルセルロース、 ヒ ドロキシプロ ピルメチルセルロースフタ レー トなどの胃溶性あるいは腸溶性物質の フィルムで被覆していてもよいし、 また 2以上の層で被覆していてもよ レ、。 さらにゼラチンのような吸収されうる物質のカプセルも包含される。

経口投与のための液体組成物は、 薬剤的に許容される乳濁剤、 溶液 剤、 シロップ剤、 エリキシル剤等を含む。 このような液体組成物におい ては、 FUTからなる活性物質が、一般的に用いられる不活性な希釈斉 IJ (例 えば精製水、 エタノール） 中に溶解される。 これら液体組成物は、 不活 性な希釈剤以外に湿潤剤、 懸濁化剤のような補助剤、 甘味剤、 風味剤、 防腐剤を含有していてもよい。

経口投与のためのその他の組成物としては、 F U Tからなる活性物 質を含み、 それ自体公知の方法により処方されるスプレー剤が含まれる。 この組成物は不活性な希釈剤以外に亜硫酸水素ナトリ ウムのよ うな安 定剤と等張性を与えるような安定化剤、 塩化ナトリウム、 クェン酸ナト リゥムあるいはクェン酸のような等張剤を含有していてもよい。

本願発明による非経口投与のための液剤、 例えば注射剤としては、 無菌の水性または非水性の溶液剤、 懸濁剤、 乳濁剤を包含する。 水性の 溶液剤、 懸濁剤としては、 例えば注射用蒸留水及び生理食塩水が含まれ る。非水溶性の溶液剤、懸濁剤としては、例えばプロピレンダリコール、 ポリエチレングリコーノレ、 ォリーブ油のような植物油、 エタノールのよ うなアルコール類、 ポリソルベート 8 0 (登録商標） 等がある。 このよ うな組成物は、 さらに防腐剤、 湿潤剤、 乳化剤、 分散剤、 安定化剤、 溶 解補助剤 （例えば、 グルタミン酸、 ァスパラギン酸） のような補助剤を 含んでいてもよい。 これらはパクテリア保留フ.ィルターを通すろ過、 殺 菌剤の配合または照射によって無菌化される。 これらはまた無菌の固体 組成物を製造し、 使用前に無菌化または無菌の注射用蒸留水または他の 溶媒に溶解して使用することもできる。

非経口投与のためのその他の組成物としては、 メシル酸ナファモス タツ ト （FUT) を有効成分として含み、 常法により処方される注腸剤、 外溶液剤、 軟膏、 塗布剤、 坐剤等が含まれる。

吸入剤、 エアゾール剤として使用するには、 活性成分を溶液、 懸濁 液または微小粉体の形で、 気体または液体噴射剤と共に、 且つ所望によ り湿潤剤または分散剤のような通常の補助剤と共にエアゾール容器内 に充填する。 本願発明化合物は、 ネブライザ一またはアトマイザ一のよ うな非加圧型の剤形にしてもよい。

併用に用いる既存の抗癌剤 ·抗腫瘍剤は、 特に限定されるものでは ないが、 例えば、 ゲムシタビン塩酸塩、 ナイ トロゲン 'マスタード · N ーォキサイ ド、 サイクロホスフアミ ド、 メノレファラン、 カルボクォン、 プスルファン、 二マスチン塩酸塩、 ラニマスチン、 ダカルバジン、 フル ォロウラシル、 .テガフル、 ザイタラビン、 アンサイタビン塩酸塩、 プロ キシゥリジン、 ドキシフルゥリジン、メルカプ 1、プリン、チオイノシン、 メ ト トレキセート、 マイ トマイシン、 ブレ才マイシン、 ダウノノレビシン 塩酸塩、 ドキソルビシン塩酸塩、 ピラルビシン塩酸^、 ァクラルビシン 塩酸塩、 ネオカルジノスタチン、 ァクチノマイシン D、 ヴインクリスチ ン硫酸塩、 ヴインデシン硫酸塩、 ヴインブラスチン硫酸塩、 エトポサイ ド、 タモキシフェンクェン酸塩、 プロカルバジン塩酸塩、 マイ トブロニ トール、 マイ トキサントン塩酸塩、 カルポプラチンおよびシスプラチン からなる群から選ばれる 1以上の抗腫瘍剤を挙げることができる。 特に 好ましくはゲムシタビン塩酸塩である。

併用に用いるこれら既存の抗癌剤 ·抗腫瘍剤の好ましい投与量は、 それぞれの薬剤に対して F D Aや厚生労働省が規定乃至は推奨すると ころの投与量である。 しかし、 上記のとおり F U Tとの併用によりその 効果が増大されることから、 上記規定の投与量より少ない投与量で十分 な効果を発揮することが可能である。 したがって、 これら既存の抗癌 剤 ·抗腫瘍剤のより好ましい投与量は、 F D Aや厚生労働省が規定乃至 は推奨するところの投与量の 0 . 3倍乃至 1倍である。

また、 これら既存の抗癌剤 ·抗腫瘍剤の投与方法は、 F D Aや厚生 労働省が規定乃至は推奨するところの方法に従えばよい。 また、 これら 既存の抗癌剤 ·抗腫瘍剤と F U Tとの投与タイミングについては、 これ ら薬剤を患者に同時に投与してもよいし、 或いは既存薬の投与に先立つ て F U Tを投与しても、 或いは逆に既存薬の投与した後に F U Tを投与 してもよい。

以下、 本願発明を実施例により詳しく説明するが、 これは例示的な ものであり、 本願発明はこれに限定されるものではない。 実施例 1

F U T 1 .7 5による N F— κ Βの抑制 ；

ヒ ト膝臓癌細胞株 MDAPanc-28 に各濃度の FUTを添加し、 N F .— • κ B活性化に及ぼす影響を調べた。 MDAPanc-28は常に N F— κ Βが活 性化している細胞株である。 各濃度の FUT で処理後の細胞の核抽出物 について κ Βプロ一プを用いたゲルシフトァッセィを行い、 活性化し核 移行している N F— fc Βを検出した。 具体的には、 の核抽出物を バインディングバッファー （75mM NaCl, 15mM Tris-HCl, pH 7.5, 1.5mM dithiothreitol, 25 % glycerol, 20mg/ml bovine serum albumin) 中で、 30分間、 4°Cの条件下、 1 gの oly(dI-dC)(Pharmacia, Picataway, N.J.)と反応させた。 ³²P標識したオリゴヌクレオチ プローブ （配列番 号 1〜 4 ) を室温で 20 分反応させた後、 電気泳動を行った ( 4%polyacrylamide gel, 0.25xTBE; 22.5mM Tris, 22.5mMborate , 500uM. EDTA, pH8.0)。 ゲルは 80°Cで 1時間乾燥させた後、 _80°Cにて Kodak film(Eastman Kodak Co., Rochester, N.Y.)に露光させ、 検出し た。 陽性 ントロールとしては、 Oct- 1を用いた。

結果を図 1一 a、 cに示した。 FUTの濃度依存的に N F— κ Bの活 性化が抑制された。また FUT添加後 24時間目までは経時的に N F - κ Bの活性化が抑制され、 48時間目には定常状態に戻っていた。 実施例 2

FUTによるリン酸化 I κ B ひの減少；

ヒ ト塍臓癌細胞株 MDAPa.nc-28 に各濃度の FUTを添加し、 I κ Β αに及ぼす影響を調べた。 各濃度の FUT で処理後の細胞の細胞質抽出 液を常法に従って抽出し、 ウェスタンプロッ トにより、 各蛋白を検出し た。 具体的には、 1 レーンあたり 50 i gの蛋白を添加し、 電気泳動を行 つた。 P V D F膜 （Osmonics). に転写し、 5% nonfat milk含有 P B S 中で、 室温、 2時間のブロッキングを行った。 次に 0. 1% nonfat milk含 有 P B Sで希釈した 1次抗体 （抗 Ι κ Β ひ抗体） を 4°Cで一晩反応させ た。 P V D F膜を P B Sで洗浄し、 0. 1% nonfat milk含有 P B Sで希釈 した 2次抗体液を室温、 2 時間反応させた。 蛋白の検出は Lumi-Light estern Blotting Substrateで f了つた。

結果を図 l — b、 d及び図 2— bに示した。 図 1 — bでは、 F U T の濃度依存的に細胞質中の I κ B αが増加しているのがわかる。 これは、 細胞質中.で不活性型の N F - κ Βに結合した状態の I κ Β _αが F U Τ の濃度依存的に増加していることを示している。 図 1一 dは F U T添加 後 24 時間目までは N F— κ Bの不活性化に伴い細胞質中の I κ Β α量 が増加するが、 48時間後には定常状態に戻っていることを示している。 この結果は実施例 1に示した N F— κ Βの活性化ど相関しているもの である。 図 2— bの実験では、 1 次抗体として、 リン酸化した I κ B _α のみを認識できる抗体を用いている。 F U Tの添加により細胞質中のリ ン酸化した I κ Β αが経時的に減少しており、 N F— κ Βの活性化が抑 制されていることを示すものである。 実施例 3

F U Τによる ΙΚΚ活性の変化 ；

ヒ ト膝臓癌細胞株 MDAPanc-28 を F U Tで処理した後、 氷冷した PBS で洗浄し、 800 gの細胞質画分を調製した。 グルタチオンセファ ローズビーズ （Amersham Pharmacia Biotech) を添加し、 4°Cで 3時 間転倒混和し、 非特異的吸着画分を取り除いた。 上清に抗 IKK1/2抗体 ( Santa Cruz Biotechnology) 4 μ gを添加し、 4°Cで一晚反応させた後、 ダルタチオンセファローズビーズを添加し 4°Cで 3時間混和した。 免疫 複合体が結合したビーズを P B Sで 2回洗浄したものを、 免疫沈降と酵 素活性測定に用いた。

酵素活性測定においては、 上記のビーズをキナーゼバッファー ( 150mM NaCl, 25πιΜ beta- glvcerop osphate , lOmM MgCl2 含有 25mM HEPES) で洗浄し、 酵素反応を行った。 5uCi の 32p標識 _γ— AT Ρと、 基質である G S T— I κ Β αを 1 /i g含むキナーゼバッファ 一中で 37°C、 30分反応させた。 S D Sサンプルバッファーで反応を停 止し、 S D S— P AG Eを行い、 オートラジオグラフィ一により検出し た。

その結果を図 2—aに示した。 F UT処理により、IKK1および IKK2 の発現量に変化は生じないが、 ΙΚΚ1， ΙΚΚ2の酵素活性が低下し、 リ ン 酸化し得る I κ. Β ひ量が減少しているのがわかる。 実施例 4'

F UTによる膝臓癌細胞のアポトーシス誘導；

ヒ ド膝臓癌細胞株 MDAPanc-28 を F UTで処理した後、 DNA抽 出バッファー （O.lmM EDTA, 0.5% SDS, 20 β g/ml RNase含有 lOmM Tris,pH 8.0) 中、 37°C、 1時間インキュベートした。 lOOOU/mlのプロ ティナーゼ Kを添加し、 50°Cで 5時間インキュベートした。 DNAをフ ェノール /ク口口ホルム/イソァミルアルコールで抽出後、 水溶性画分を 回収し、 ィソプロパノール及び酢酸アンモニゥムを添加し、 沈殿を回収 した。 沈殿を 70%ェタノールで洗浄し、 Tris-EDTAバッファーに溶解さ せた。 2 %ァガロースゲルを用いて電気泳動を行い、 ェチジゥ.ムブロマ イ ドにて DN Aのバンドを確認した。

その結果を図 2— cに示した。 40 μ g/ml 以上の FUT で処理した MDAPanc-28細胞では、 DNAの断片化が生じており、 FUTによってァ ポトーシスが誘導されたことを示している。 実施例 5

F UTによる TN F受容体 type I (以下 TN F R I という） の発現の上 ；

FUTによって誘導される癌細胞のアポトーシスが、 どのような作 用メカニズムによって起こるのかを明らかにするために、 F UT処理に よるヒ ト膝臓癌細胞株 MDAPanc-28 における TN F R Iの発現の変化 を確認した。

ハイブリダイゼーシヨンに用いるための c DNAプローブを以下の 方法で作成した。 F UTで処理したヒ ト滕臓癌細胞株 MDAPanc-28 よ り TRIZOL Reagent (Life Technologies, Inc.)を用いて R N Aを抽出し た。 1 の RNAを 1% 変' |·生ホルムアルデヒ ドアガロースゲルを用 いて電気泳動し、 ナイ ロン膜に転写した。 TN F R I の mRN Αの検出 に用いる c DN Aプローブを作成するために、 RT_ P CRを行った。 このとき、 配列番号 5および 6に示したプライマーを用いた。 得られた ' c DNAを p CR 2. 1— TOP Oベクターに導入した。 得られた c D N Aの塩基配列は、 G e n e B a n kの配列と一致した。 作成した c DNAプローブを、 ランダムラベリングキッ ト (R o c h e) を用いて 一³.² P d CT Pで標識し、 ハイプリダイゼーシヨ ンに使用 Lた。

TNF R Iの; mRN A発現は上記プローブを用いて定法に従い、 ノ 一ザンブロッ ト法により確認した。 図 3— a に示したように、 FUTの 濃度依存的に TN F R I の mRN A発現は増加した。 また、 細胞表面上 の TNFR I の発現はウェスタンプロット法により検出した。 具体的方 ：法は実施例 2に示したものと同様である。検出には、 Mouse monoclonal anti-TNFRl(H-5; Santa Cruz iBiotechnology)を用いた。 その結果、 図 3 - bに示したように FUT処理により細胞表面上の TNF R I .の発 現は増加した。

実施例 1の.結果と合わせると、 活性型 N F— κ Bと TNF R Iは、 その発現をお互いにフィ一ドバック制御していることがわかる。 実施例 6

FUTによる転写因子 P EA 3の活性化；

N F— κ Bと T N F R I のフィードバック制御に関与している転 写因子が何であるかを明らかにするために、 異なるサイズの TN F R I プロモーターを含むベクターを作成し、 レポータージーンアツセィを行 つた。 その結果、 一 3 84と一 2 1 l b pの間に TNFR Iの発現を誘 導する転写因子の結合部位が存在することが明らかとなった。

さらに TNF R I の発現を誘導する転写因子の結合部位を特定す るために、 2種類のプライマーの組み合わせ （配列番号 7及び 8、 配列 番号 8及ぴ 9) を用いて P CRを行い、 一 3 84と一 2 8 6 b pの配歹 IJ の前半部分の配列、 後半部分の配列をそれぞれ認識する 2種類のプロ一 ブを作成した。 これらのプローブを用いて、 実施例 1 と同様の方法でゲ ルシフトアツセィを行った。 その結果、 ー 3 4 5とー 2 8 5 の間に 転写因子の結合部位が存在することが明らかとなった。 検索ソフ ト I F T I一 M I RAGEを用いて解析したところ、 この配列に結合する転写 因子は P E A 3であることが判明した （図 4)。

ヒ ト滕臓癌細胞株 MDAPanc-28 に、 TNFR Iプロモーター領域 にルシフェラーゼ遺伝子を結合した配列を導入したベクターと、 Ρ ΕΑ · 3の c DNAを トランスフエクシヨ ンし、 レポータージーンアツセィを 行った。 P EA 3の c DNAをトランスフェクションした細胞では T N F R Iプロモ^ ·ターの活性化が起こったが、 P EA 3の c DNAをトラ ンスフエクショ ンしていないコン ト口ールの細胞では活性化が起こら なかった。

T N F R Iプロモーター領域に P E A 3が結合することを確認す るために、 P E A 3プローブと、 それに一部変異を入れたプローブを用 いて、 阻害実験を行った。 常に NF— Bが不活性型になっている細胞 (MDAPanc-28/Ι B α ) においては、 TNF R Iの高い発現が見られ、 標識した P E A 3プローブが TNF R Iプロモーター領域に結合する。 それに対して上記の 2種類の非標識のプローブを導入して阻害活性を 比較したところ、 非標識の P E A 3プローブを入れた方では標識 P E A 3プローブの結合阻害が起きたが、 非標識の変異プローブを入れた方で 'は全く起きなかった （囪 5— a)。 また、，ヒ ト腠臓癌細胞株 MDAPanc-28 対する F U T処理によって P E A 3の発現が経時的に高くなることも 示された （図 5— b)。 実施例 7

F UTによるカスパーゼ 8の活性化；

FUT処理による TNFR Iの発現レベルの上昇に伴って、 アポト 一シスシグナルカスケ一ドが動くか否かを、 カスパーゼ 8の活性化を指 標に検討した。 ヒ ト膝臓癌細胞 MDAPanc-28を各濃度の FUTで 24 時間処理した後、 細胞質画分を調整し、 ウェスタンプロッ トを行い、 抗 カスパーゼ 8抗体（Santa Cruz Biotechnology)で検出した（図 6— a)。 FUTの処理濃度を一定とし （80jU g/ml) 、 処理時間を 0〜24時間の間 で細かく取り、 カスパーゼ 8、 p-FADD、 Bid, jBid の発現の経時的変 化をウェスタンブロットにより調べた（図 6 -b, 6 -c, 6一 d)。抗 FADD 抗体 ίま Santa Cruz Biotechnology社、 抗 Bid抗体ま BD Pharmingen 社のものを用いた。

F U T処理の濃度依存的にカスパーゼ 8の活性化が起こることか ら、 F UTは N F— κ Bの活性化抑制と、 T N F R 1の発現誘導に加え て、 アポトーシスシグナルカスケードの始動についても重要な役割を果たしていることが明らかとなった。 さらに、 図 6— b、 cに示したよう に、 FUT処理により経時的に FADDのリン酸化が促進し、 その後カス パーゼ 8の活性化が促進することから、' TN Fが誘導するアポトーシス 経路において、 FADDがカスパーゼ 8の活性化によるアポトーシスシグ ナルカスケードの始動に関与していることも明らかとなった。 J NKを 介した経路において必須である Bidの分解産物 JBidの発現もまた同様 に経時的.に増加していた （図 6— d) 。 以上のことから、 FUTによる カスパーゼ 8の活性化には、 F ADD及び J NKを介した 2つの独立し た経路が関与していることが明らかとなった。 実施例 8

F UTと TN F— αの相乗効果 1 ；

ヒ ト膝臓癌細胞株 MDAPanc-28 について以下の処理をした後、 細 胞質画分を調整しウェスタンプロットにより リン酸化 FADD カスパー ゼ 8、 NF— κ Β、 I κ Βひ の発現を調べた。 まず、 細胞を FUT (80 β g/ml) で前処理した後'、 TNF— ひ (5ng/ml) で 24時間刺激場合に は、 図 7— aに示すように FADDのリン酸化及びカスパーゼ 8の活性化 は、 FUT処理単独に比べ、 TNF— α処理によって増強した。 また、 T N F .— aにより活性化された NF— κ Βが、 FUT処理により抑制さ れることも明らかとなった （図 7— b ) 。 I κ B αの発現も同様であつ た （図 7— c) 。 実施例 9

F UTと T N F— αの相乗効果 2 ；

癌細胞のアポトーシスに対する FUTと TNF— ひの併用効果を 調べた。 ヒ ト瞵臓癌細胞株 MDAPanc-28を TN F— αで 24時間処理し た後、 各濃度の FUTを添加しさらに 24時間培養した。 これらの細胞 について定法に従つて MTTアツセィを行い、 細胞生存率を算定した。 また DNAを抽出し、 DNAフラグメンテーションアツセィを行った。

MT Tアツセィについて具体的には、細胞 2000個を 96穴マイク口 タイタープレートに 100 jul の培地中播種し、 上記処理を行った後、 プ レート遠心し、 5mg/mlMTT(Sigma) PBS溶液に置き換え 37。 ( 、 4時間' インキュベートした。 上清を除去し、' DMS Oを 100 1 添加し、 細胞 を溶解した。 570nmの吸光度をマイク口プレートリ一ダーを用いて測定 した。 8穴について同条件で実験を行った。 独立した実験を合計 2回行 レ、、 それらの平均値を算定した。 DNAフラグメンテーションアツセィ については、 実施例 4と同様の方法で行った。

結果を図 8に示した。 コントロールと比較して、 FUT処理により 細胞の生存率が顕著に低下した。 さらに TN F— ひを併用することによ り、 生存率は低下傾向にあった （図 8— a) 。 また、 DNAフラグメン テーションについては、 T N F—ひ 5ng/mlのみの処理では起こらない のに対し、 FUTを併用することにより起こるようになった（図 8— b)。 以上のことから、 FUTと TNF—ひの併用により、 癌細胞のアポ.トー シスを相乗的に起こすことができることが明らかとなった。 実施例 1 0

F UTによるカスパーゼ 8の活性化のメカニズム ；

FUT処理によって TNFR Iの発現が上昇することが、 カスパー ゼ 8の活性化に必要であるか否かを確認するために、 TN F R Iの発現 を siRNA(small interfering UNA)により抑制した細胞を調整した。

図 9に示すように、 TNFR I·の発現が抑制された細胞については、 FUTを処理しても、 FADDのリン酸化及びカスパーゼ 8の活性化も起 こらなかった。 従って、 F UTによるカスパーゼ 8の活性化は TN F R I依存的であることが明らかとなった。 実施例 1 1

FUT処理による、 抗腫瘍剤ゲムシタビン誘導の活性化 NF— κ Bの抑 制 ；

化学療法剤の中には、 細胞内の N F— / Bの活性化を誘導し、 その 結果薬剤耐性を引き起こすものがあり、 問題になっている。 そこで、 本 発明者らはまず、 ゲムシタビンがヒ ト滕臓癌細胞株 MDAPanc - 28 に作用 して N F— / c Bの活性化を誘導するか否かを確認した。 ヒ ト膝臓癌細胞 株 MDAPanc-28をゲムシタビンで 12時間処理した後、 常法に従ってゲル シフ トアツセィを行い、 N F— Bの活性化の有無を検討した。 具体的 には、 実施例 1に記載した方法と同様の方法により行った。 その結果、 図 1 0— a に示すように、 ゲムシタビン処理により N F— / c Bの活性化 が誘導されることが確認できた。

次に、 ゲムシタビンと FUTの併用効果を検討した。 同時に、 他の N F— κ Β阻害剤である P S 1 1 4 5および P S 3 4 1 との比較も行つ た。 ヒ ト膝臓癌細胞株 MDAPanc_28 を F UT、 P S 1 1 4 5又は P S 3 4 1で 3時間前処理を行った。 その後ゲムシタビン処理を 3時間行った 後に、 ゲルシフトアツセィを行い N F— κ Bの活性化に対する影響を検 討した。 その結果、 図 1 0— b に示すように、 F UTはゲムシタビンに よって誘導される N F - κ Βの活性化を抑制する作用を有することが 明らかとなった。 他の 2種類の薬剤についても同様の傾向を示したが、 F U Tによる抑制効果が最も顕著であった。

• .実施例 1 2

ヒ ト膝臓癌細胞株 MDAPanc - 28の生細胞率に対する F UT処理の影響； .

F U T、 P S 1 1 4 5又は P S 3 4 1は N F— κ Βの活性化抑制効 果を示したが、 これらの薬剤は異なった作用メカエス'ムを有する異なつ たタイプの薬剤であるので、 それぞれの薬剤単独での、 ヒ ド滕臓癌細胞 .株 MDAPanc-28 .の生存率に対する影響を検討した。 ヒ ト腠臓癌細胞株 MDAPanc-28をそれぞれの薬剤で 24時間及び 48時間処理した後、 MT T アツセィを行った。 MT Tアツセィは実施例 9に記載した方法で行った。 その結果、.図 1 1 一 a に示すように F U Tの濃度依存的にヒ ト鸱臓癌細 胞株 MDAPanc- 28の細胞増殖が抑制され、 48時間目では 24時間目と比較 して生細胞率のわずかな増加が見られた。 それに対して P S 1 1 4 5は、 48 時間処理においては、 濃度依存的な増殖抑制効果を示したが、 24 時 間処理においては、 有意な抑制効果は示さなかった。 また、 P S 3 4 1 には、 24 時間処理、 48 時間処理とも有意な増殖抑制効果は見られなか つた （図 1 1 一 b、 1 1 -c) 。 以上より、 F U T及ぴ P S 1 1 4 5は、 ヒ ト腾臓癌細胞株 MDAPanc - 28 に対する増殖抑制効果を有していたが、 その抑制効果は F UTの方が早い時間に起こることが明らかとなつた。 実施例 1 3

ヒ ト膝臓癌細胞株 MDAPanc - 28 のアポトーシスに対するゲムシタビンと NF - κ B抑制剤との併用効果の検討；

F UT、 P S 1 1 4 5および P S 3 4 1は、 ゲムシタビン誘導の N F - fc Bの活性化を抑制する作用を有することが明らかとなったが、 ヒ ト滕臓癌細胞株 MDAPanc- 28 のアポトーシス誘導に関してはどのような 効果を有するかについて検討した。 F UT、 P S 1 1 4 5又は P S 3 4 1で 3時間前処理後、 ゲムシタビンで 48時間処理した細胞について、 アポトー.シスを起こしている細胞の割合を算定した。 アポトーシスを起 こしているか否かの確認は、 フローサイ トメ トリーにより行った。 薬剤 処理後の細胞を回収し、 7 0 %エタノールで- 20°Cの条件下で 24時間固 定した。 細胞を P B Sで洗浄し、 50jWg/ml プロピウムィオダイ ド、 0. 1 % トライ トン X— 1 0 0、 0. 1 %クェン酸ナトリ ウム、 1 g/ml Dnase free RNase含有 P B Sに懸濁した。 室温で 30分ィンキュベート した後、 DNA.量を FACScanを用いて測定した。 その結果、 図 1 2に示 すように、 ゲムシタビン単独でもアポ.トーシスを誘導したが、 F UT、 P S 1 1 4 5または P S 3 4 1 とゲムシタビンを併用することにより、 その効果がさらに増大した。' 実施例 1 4

正常細胞に対する F UT処理の影響；

抗腫瘍剤としての有効であると判断されるためには、 正常細胞に対 して影響がないということが重要である。 そこで、 次に FUT処理の正 常細胞に対する影響を検討した。 正常細胞としては、 マウス繊維細胞を 用いた。 その結果、 80〃g/mlの濃度の FU丁で処理しても、 細胞の生存 率には影響が見られなかった （図 1 3 ) 。 それに対して、 他の N F— / c B阻害剤である P S 1 1 4 5および P S 3 4 1は、 細胞にアポトーシス を誘導する濃度で用いると、 正常細胞の生細胞率を顕著に減少させるこ とが明らかとなった。 実施例 1 5

F UT処理による MMP— 2， MMP— 9の発現抑制 ；

ヒ ト滕臓癌細胞株 MDAPanc- 28 を、 FUT 0 g/ml または 8 0 β g/mlで処理した後、 細胞質画分を調製した。 得られた細胞質蛋白につい てウェスタンブロッ トを行い、 MMP— 2および MM P— 9の発現を検 · 討した。 具体的な実験方法は実施例 2に示した通りである。 検出にはゥ サギポリクロ一ナル抗 MM P— 2抗体、 ャギポリクロ一ナル抗 MM P— 9抗体、 マウス抗 B—ァクチン抗体 (Santa Cruz Biotechnology, Inc. ) を用いた。 その結果、 図 1 4に示すように、 FUTの濃度依存的に MM P— 2， MMP— 9の発現が抑制された。 実施例 1.6

FUT処理による滕臓癌細胞株の浸潤抑制 ；

FUT処理によるヒ ト瞵臓癌細胞株 MDAPanc- 28 の浸潤抑制効果を . 検討するために、 マトリゲル浸潤アツセィを行った。 FUT 80 g/ml で 24 時間処理した細胞、 無処理の細胞を、 それぞれマトリゲルをコー ティングしたチャンパ一に 1 ゥエルあたり 2 0 0 0 0個播種した。 3 7°Cで 2 2時間、 FUT 80 ;Ug/ml存在下または非存在下でインキュ ペートした。 常法に従ってライ トギムザ染色を行い、 浸潤した細胞数を 顕微鏡下で計数した。 その結果を図 1 5に示した。 FUTで前処理した 細胞群において、 顕著な浸潤抑制効果が見られた。 実施例 1 7

F U T 1 7 5およぴゲムシタビンの. in vivo投与効果；

雄性のヌードマウス （8週） にたいしてヒ ト膝がん細胞株 Pane - 1を 皮下に 5X.106個移植し、移植後 6週間後に腫瘤径が平均化するように 3 群に分けて、 それぞれの群に以下の処置を行った。 Control 群： 処置な し （n=4)、 GEM 群 （ゲムシタビン投与群） ： ゲムシタビン（100mg/kg， 週 1回， i.p.) (n=4)、 FUT group: FUT-175 (30rag/kg, 週 3回， Lp.)+ゲ ムシタビン（100mg/k_g, 週 1回， i.p. ) (n=4)、以上の処置を 6週間行い、 腫瘍サイズの測定、 体重の測定、 摘出腫瘤重量の測定、 写真撮影を行つ た。

腫瘍サイズの測定結果を図 1 6に示した。 Control 群に対して、 ゲ ムシタビン単独投与群では、 腫瘍サイズが約 5 0 %に、 FUT の併用群で は約 2 5 %にまで退縮した。 この事実は、 誰しも予想し得ない驚くべき 成果であった。 投与後のマウスの体重を図 1 7に示した。 ゲムシタビン 単独投与群では、 体重減少が観察されたが、 驚くべきことに F U Tとの 併用群では、全く体重減少が見られず、 コントロール群と同等であった。 また、 摘出腫瘤重量は、 図 1 8に示すように、 Con trol 群に対して、 ゲ ムシタビン単独投与群で約 5 0 %に、 F U Tとの併用群では約 6 %にま で退縮していた。 図 1 9には、 処置後のマウスの様子を写真撮影したも のを示した。 F U Tとの併用群で、 腫瘍が著しく退縮している、のがわか る。

上記試験結果から明らかなとおり、 ゲムシタビンと F U Tの併用は、 優れた抗腫瘍効果をもたらすだけでなく、 体重減少等の重篤な副作用が 全く観察されなかった。 これは腫瘍患者にとって大いなる福音であり、 早期の実用化が期待される。 産業上の利用可能性

本願発明の抗腫瘍剤は、 腫瘍細胞における I K Kの抑制により、 I κ B— αのリン酸化を抑制し、 さらには N F— κ Βの活性化を抑制する というメカニズムによ'り腫瘍細胞の増殖を阻止する新しいタイプの薬 剤である。 現時点で有効な治療方法および化学療法剤が存在しない滕臓 癌に特に有効であり、 さらには癌転移を抑制する効果も有,している。 更 には既存の抗腫瘍剤によって引き起こされる薬剤.耐性を抑制する効果 も有しているため、 本発明の抗腫瘍剤単独のみならず、 既存の抗腫瘍剤 との併用により、 さらに高い抗腫瘍効果を発揮する.ものである。 最も注 目すべきは、 これらの顕著な抗腫瘍効果が、 動物実験においても確認で きている点である。 すでに承認済みの薬剤なのでその安全性も確認され ているため、 副作用の恐れもなく、 安全な抗腫瘍剤としてその実用化が 期待される。 特に、 ゲムシタビン塩酸塩に対して F U Tを併用した場合に は、 体重減少等の副作用が観察されず、 腫瘍治療に対する効果のみなら ず、 その安全性が大いに記載される。

Claims

請求の範囲

. 下記式で表される 6，-ァミジノ -2'·ナフチル 4-グァニジノベンゾエー ト又はその薬理学上許容される塩を有効成分として含有してなる抗 腫瘍剤又は癌転移若しくは癌浸潤の抑制剤。

2 . 塩がメシル酸塩である請求項 1に記載の抗腫瘍剤又は癌転移若しく は癌浸潤の抑制剤。

3 . 抗腫瘍剤又は癌転移若しくは癌浸潤の抑制剤が、 それぞれ、 腌臓癌 治療剤、 瞵臓癌転移若しくは腠臓癌浸潤の抑制剤である請求項 1又は

2に記載.の薬剤。

4 . 6'-ァミジノ -2'-ナフチル 4-グァニジノベンゾエート又はその薬理学 上許容される塩を有効成分として含有してなる NF - κ Β抑制剤。

5 . 塩がメシル酸塩である請求項 4に記載の NF - _Κ Β抑制剤。

6 . 6'-アミジノ -2，-ナフチル 4-グァ -ジノベンゾエート又はその薬理学 ^上許容される塩を有効成分として含有してなる ΙΚΚ (Ι _Κ Β リン酸化酵 素）抑制剤。

7 . 塩がメシル酸塩である請求項 6に記載の ΙΚΚ (Ι κ Βリン酸化酵素）抑 制剤。

8 . 請求項 1乃至 7のいずれか 1項に記載の薬剤と、 他の抗腫瘍剤を組 み合わ.せてなる医薬。

9 . 他の抗腫瘍剤がアルキル化剤、 抗代謝薬、 抗生物質、 植物アルカロ ィ ド、 白金錯体誘導体おょぴホルモンからなる群から選ばれる 1以上 の抗腫瘍剤である請求項 8に記載の医薬。

1 0 .他の抗腫瘍剤がゲムシタビン塩酸塩、ナイ トロゲン'マスタード · Ν—ォキサイ ド、 シクロホスフアミ ド、 メノレファラン、 カルボクォン、 ブスノレファン、 二マスチン塩酸塩、 ラニマスチン、 ダカノレパジン、 フ ルォロウラシル、 テガフル、 サイタラビン、 アンサイタビン塩酸塩、 プロキシゥリジン、 ドキシフルゥリジン、 メルカプトプリン、 チオイ ノシン、 メ ト トレキサート、 マイ トマイシン、 ブレオマイシン、 ダウ ノルビシン塩酸塩、 ドキソルビシン塩酸塩、 ピラルビシン塩酸塩、 ァ クラルビシン塩酸塩、 ネオカルジノスタチン、 ァクチノマイシン D、 ヴイ ンク リ スチン硫酸塩、 ヴイ ンデシン硫酸塩、 ヴイ ンブラスチン硫 酸塩、 エトポサイ ド、 タモキ.シフェンクェン酸塩、 プロカルバジン塩 酸塩、 マイ トブロニトール、 マイ トキサントン塩酸塩、 カルボプラチ '

らなる群から選ばれる 1以上の抗腫瘍剤であ る請求項 8または 9に記載の医薬。

1 . 癌患者又は腫瘍患者に対して、 請求項 1に記載の抗腫瘍剤又は癌 転移若しくは癌浸潤の抑制剤を投与することを特徴とする癌又は腫瘍 の治療又は予防方法。

2 . 癌患者又は腫瘍患者に対して、 請求項 1に記載の抗腫瘍剤又は癌 転移若しくは癌浸潤の抑制剤と他の抗腫瘍剤を同時に投与するか、 ま たは時期をずらして投与することを特徴とする請求項 1 1に記載の癌 又は腫瘍の治療又は予防方法。