JPWO2007013696A1 - ６’−アミジノ−２’−ナフチル４−グアニジノベンゾエート又はその塩を含んでなる抗腫瘍剤 - Google Patents

Abstract

本発明の目的は、既存の抗腫瘍剤の問題点である重篤な副作用や薬剤耐性誘導を起こさず、治療係数の高い新しいタイプの抗腫瘍剤を提供することである。特に現時点で有効な治療方法および化学療法剤が存在しない膵臓癌に有効であり、さらには癌転移及び癌浸潤を抑制することも可能である新しいタイプの薬剤及び治療方法を提供することである。本願発明の抗腫瘍剤、特に膵臓癌治療薬および癌転移抑制剤は、６’−アミジノ−２’−ナフチル ４−グアニジノベンゾエート又はその塩、特にそのメシル酸塩であるメシル酸ナファモスタット（一般名。「フサン」、「ＦＵＴ」、「ＦＵＴ１７５」ともいう。）を有効成分として含有するものである。また、本発明の別の態様は、これらＦＵＴと既存の抗癌剤・抗腫瘍剤、特に好ましくはゲムシタビン塩酸塩との併用である。

Description

本願発明は、６’−アミジノ−２’−ナフチル ４−グアニジノベンゾエート又はその塩、特にそのメシル酸塩であるメシル酸ナファモスタット（一般名。「フサン」、「ＦＵＴ」、「ＦＵＴ１７５」ともいう。；以下「ＦＵＴ」という。）を有効成分として含有する抗腫瘍剤、特に膵臓癌治療薬および癌転移若しくは癌浸潤の抑制剤、及びこれら抗腫瘍剤又は抑制剤を投与することを特徴とする腫瘍及び癌の治療方法に関する。また、本発明は、これらＦＵＴと既存の抗癌剤・抗腫瘍剤とからなる医薬、及びそれら医薬を投与することを特徴とする腫瘍及び癌の治療方法に関する。

現在、癌の治療法としては、外科的療法、放射線照射療法、化学的療法、ホルモン療法、色疫学的療法又はそれらの併用が行われている。外科的療法、放射線照射療法の進歩によってある種の疾患部位については完全に近い治療が期待されるようになったが、外科的に切除できる範囲については限界がある。手術後の再発や癌の転移の防止又は手術が不可能な場合には化学療法が最も有効な治療手段となりうる。又、放射線照射療法の補助的手段として、あるいは症状の軽減の為にも化学療法は行われる。
抗癌剤は作用の仕方や由来などにより、「細胞障害性抗癌剤」と「分子標的治療薬」に分類される。「細胞障害性抗癌剤」はさらに、代謝拮抗剤、アルキル化剤、抗癌性抗生物質、微小管阻害薬などに分類されている。アルキル化剤や抗癌性抗生物質は、ある一定の濃度に達すると作用時間が短くても確実に効くが、正常細胞に対する傷害も大きい。そこで、薬をより効果的に癌病巣に到達させる研究がさかんに行われている。また最近は、癌に特異性の高い標的を探し出し、その標的に効率よく作用する薬（分子標的治療薬）の開発も積極的に行われており、すでに医療の現場で使われはじめている。またこのような化学療法剤に対しては、癌細胞が薬剤耐性を獲得し、薬効が持続しないという問題点もある。より薬物有害反応が少なく、効果の高い薬の開発が期待されている。
現在、これら化学療法に用いられる薬剤としては、ナイトロジェンマスタードＮオキシド、シクロホスファミド、トリエチレンチオホスホルアミド、サルコリジン等のアルキル化剤、５−フルオロウラシル、ゲムシタビン、シタラビン、メトトレキサート等の代謝拮抗剤、マイトマイシンＣ、アクチノマイシンＤ、ブレオマイシン、クロモマイシンＡ_３、ダウノマイシン、ドキソルビシン等の抗癌性抗生物質、ビノレルビン、パクリタキセル、ドセタキセル等の微小管阻害薬、その他、塩酸イリノテカン、シスプラチン、カルボプラチン、エトポシド、ネダプラチン、ミトキサントロン、Ｌ−アスパラギナーゼ、プロカルバジン、コルヒチン誘導体、ピシバニール等が知られている。
既存の抗癌剤の作用機序は，基本的にいずれも癌細胞に対して直接殺癌細胞効果として働くものばかりである．しかし、近年、催奇形性が間題となって睡眠薬としての治療薬から姿を消したサリドマイド（ｔｈａｌｉｄｏｍｉｄｅ）が、その催奇形性の原因迫及から全く新しい概念のもとに抗腫瘍効果が浮かび上がってきた。特徴は薬効標的を癌細胞にするのでなく血管新生を阻害することにある。すなわち、血管内皮細胞に対する細胞分裂抑制作用により血管新生が抑制され、細胞増殖に必要な酸素や栄養供給を遮断し、癌細胞の発達を防ぎ、また転移を抑制するものである。したがって、殺細胞効果を有しないため抗癌剤特有の種々の重篤な副作用も持ち合わせず、また耐性も生じないため理想的な薬物と期待されている。血管新生は、成人では創傷治癒、性周期や癌細胞、リウマチ、虚血など一部の病的状態を除いては通常起こらないように調節されている。その調節は正と負の調節因子によって行われ、プロテアーゼ活性、血管内皮の活性、線維芽細胞の活性、免疫応答やＣＸＣケモカイン調節などが複雑に絡んでいる。
例えば、血管新生を促進するｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ（ＭＭＰ）やそれを抑制するｔｉｓｓｕｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ＭＭＰ（ＴＩＭＰ）があり、腫瘍細胞ではＭＭＰの発現量が増えることがわかっているため、ＭＭＰの発現を抑制することができるＭＭＰ阻害剤は、抗癌剤として有効であると考えられる。現在開発中のＭＭＰ阻害剤としては、Ｍａｒｉｍａｓｔａｔ（ＢｒｉｔｉｓｈＢｉｏｔｅｃｈ社、米国、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、乳癌、前立腺癌、食道癌に対してＰｈａｓｅ ＩＩＩ）、ＡＧ３３４０（Ａｇｏｕｒｏｎ社、米国、非小細胞肺癌、ホルモン抵抗性前立腺癌に対しＰｈａｓｅ．ＩＩＩ、神経芽細胞腫に対しＰｈａｓｅ ＩＩ）、ＣＯＬ−３（Ｃｏｌｌａｇｅｎｅｘ社、米国、各種固形癌に対しＰｈａｓｅ Ｉ）、Ｎｅｏｖａｓｔａｔ（Ａｅｔｅｒｎａ社、カナダ、非小細胞肺癌などに対しＰｈａｓｅ ＩＩＩ）、ＢＭＳ−２７５２９１（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ社、米国、Ｐｈａｓｅ Ｉ）等がある。ＭＭＰの発現は核因子（ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ）κＢ（本明細書全体を通して、ＮＦ−κＢ と略記する）によって制御されていることがわかっているため、腫瘍細胞において発現が増強しているＭＭＰの発現を抑制する方法のひとつとしては、ＮＦ−κＢの活性化を抑制することも有効であると考えられる。
ところで、抗癌剤や癌の治療方法が大きく進歩したにも関わらず、膵臓癌に関しては、手術が可能な場合であっても術後生存期間は１２ヶ月から１４ヶ月と短く、現在でも最も予後が悪い癌のひとつである。十分な有効性が示されている薬剤は現時点ではないため、新しい作用メカニズムを有する薬剤開発が切望されている。このような状況の中、最近分子生物学的アプローチとして、転写調節因子の一つとして知られているＮＦ−κＢの抑制剤を用いて化学療法剤に対する感受性を上げようという試みも行われている。従来の化学療法剤の問題点のひとつである薬剤耐性は、癌細胞のＮＦ−κＢが薬剤により活性化されることが原因のひとつであると考えられている。従って、既存の化学療法剤によって活性化されるＮＦ−κＢを抑制することによって、薬剤耐性の獲得を防ぎ、化学療法剤に対する効果を持続させることも可能と考えられる。
ＮＦ−κＢは、免疫グロブリン（Ｉｇ）κ鎖遺伝子のエンハンサーに結合するＢ細胞特異的な核因子として同定され、その後、各種サイトカインや受容体の遺伝子上流のプロモーター領域に結合することで、これらの遺伝子の発現誘導に関与し、免疫応答や炎症性疾患の病態形成において重要な役割を果たしていることが明らかとなってきている。ＮＦ−κＢは、ｐ５０およびｐ６５タンパク質に代表されるＲｅｌファミリーサブユニットの複合体で、通常、細胞質内では制御サブユニットであるＩκＢタンパク質と結合して存在している。しかし、細胞に一定の刺激が加えられるとＩκＢがＩκＢリン酸化酵素（ＩκＢ ｋｉｎａｓｅｃｏｍｐｌｅｘ：以下ＩＫＫという）によりリン酸化され、ＮＦ−κＢが複合体から遊離され活性化される。このように活性化されたＮＦ−κＢが、核内へ移行し、ゲノムＤＮＡ上の特異塩基配列と結合することで遺伝子の発現誘導に関与していることが知られている。ＮＦ−κＢにより制御される遺伝子には、例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８などの炎症性サイトカイン類や、ＶＣＡＭ−１やＩＣＡＭ−１などの接着因子がある。また、ＮＦ−κＢ自身のインヒビターであるＩκＢαの遺伝子発現も制御し、フィードバックをかけている。
ＮＦ−κＢに起因する疾患としては、例えば虚血性疾患、炎症性疾患、自己免疫疾患、癌の転移・浸潤、悪液質等が挙げられる。虚血性疾患としては虚血性臓器疾患（例えば心筋梗塞、急性心不全、慢性心不全等の虚血性心疾患、脳梗塞等の虚血性脳疾患および肺梗塞等の虚血性肺疾患等）、臓器移植・臓器手術後の予後の悪化（例えば心移植、心臓手術、腎移植、腎臓手術、肝移植、肝臓手術、骨髄移植、皮膚移植、角膜移植、肺移植等の予後の悪化）、再潅流障害、ＰＴＣＡ後の再狭窄等が知られている。炎症性疾患としては腎炎、肝炎、関節炎等の種々の炎症、急性腎不全、慢性腎不全、動脈硬化等が挙げられる。また、自己免疫疾患としてはリウマチ、多発性硬化症、橋本甲状腺炎等が挙げられる。（例えば、特許文献１参照）。
ＮＦ−κＢは炎症反応以外に、細胞の増殖・生存においても重要な役割を果たしており、ＮＦ−κＢの制御機構が崩壊すると、多くの炎症性疾患や癌を引き起こすと言われている。例えば、本願発明者らは、多くのヒト膵臓癌組織やヒト膵臓癌細胞株においては、ＮＦ−κＢのサブユニットであるｐ６５分子が持続的に活性化していること、ＮＦ−κＢを不活性化することによって、膵臓癌細胞の肝転移や腫瘍形成を抑制することができるということも報告されている。
ＮＦ−κＢを抑制することによって様々な疾患を治療しようとする試みも行われている。ＮＦ−κＢの阻害剤としては、プロテアソーム阻害剤、ＩＫＫ阻害剤、サリドマイドのような免疫調整剤などが知られている。また、例えば非ステロイド系薬物であるアスピリンやサリチル酸ナトリウムが高濃度でＮＦ−κＢの活性化阻害作用を有していること（例えば、非特許文献１参照）、プリン系化合物であるキサンチン誘導体がＮＦ−κＢの活性化阻害作用を有していること（例えば、特許文献２参照）、および、ステロイド系薬物であるデキサメタゾンがＩκＢの産生を誘導してＮＦ−κＢの活性化阻害作用を有していることが報告されている（例えば、非特許文献２参照）。これらのうちいくつかについては臨床試験が行われている段階である。
ところで、本発明の６’−アミジノ−２’−ナフチル ４−グアニジノベンゾエート又はその薬理学上許容される塩、特にメシル酸ナファモスタット（ＦＵＴ）を有効成分として含有する薬剤は、すでに膵炎の急性症状（急性膵炎、慢性膵炎の急性増悪、術後の急性膵炎、膵管造影後の急性膵炎、外傷性膵炎）の改善、汎発性血管内血液凝固症（ＤＩＣ）の改善、出血性病変または出血傾向を有する患者の血液体外循環時の灌流血液の凝固防止（血液透析及びプラスマフェレーシス）に有効であるとして、本邦において承認されている薬剤であり、その安全性も既に確認されている。
また、ＦＵＴは肥満細胞が脱顆粒を起こす際に放出する蛋白分解酵素であるトリプターゼ阻害活性を有し、全身アナフィラキシー疾患、アスピリン過敏性喘息、喘息、間質性肺疾患、間質性膀胱炎、過敏性腸症候群、アレルギー性疾患、アトピー性疾患、皮膚水疱症、知覚過敏症、疼痛、掻痒症、歯肉炎、浮腫、乾癬、肺繊維症、関節炎、歯周病、血液凝固障害、腎間質線維化、Ｘ線造影剤の副作用としての血管透過性亢進または肺浮腫、及び花粉症からなる群から選ばれる疾患の治療または予防に有効であることも知られている。
さらに本出願人は、ＦＵＴが、炎症局所に集積する免疫担当細胞におけるＮＦ−κＢの活性化を抑制することにより、炎症反応を抑える効果があり、免疫調節剤とて有効であるということ見出している。
以上のように、現在使用されている抗癌剤には、上述したような様々な問題点がある。即ち、癌細胞内のＮＦ−κＢの活性化による薬剤耐性の獲得、正常細胞に対する強い毒性、重篤な副作用等である。従って、薬剤耐性を誘導せず、副作用のない新しいタイプの抗癌剤の開発が望まれている。また、特に膵臓癌については現時点で有効な治療方法や抗癌剤がなく、現在最も予後の悪い癌であるといわれており、有効や薬剤の開発が切望されている。
特開２００３−１２８５５９号公報 特開平９−２２７５６１号公報 Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６５，９５６（１９９４） Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７０，２８３（１９９５）

現在、化学的療法剤として使用されている抗腫瘍剤は、腫瘍細胞のＤＮＡ、ＲＮＡ合成を選択的に阻害したり、細胞分裂を阻害する事によって悪性腫瘍の増殖を抑えるものであって、正常細胞、特に細胞分裂の速い組織、例えば骨髄組織や生殖腺組織までも障害してしまう為に、重篤な副作用を発現することがしばしばあり、心毒性、悪心、嘔吐、下痢、血球減少、発熱、脱毛、肝障害等の副作用を伴う例が多い。この為、腫瘍を根絶するのに十分な量の薬剤を投与できず、既存の化学療法剤は十分な効果を示すに到っていないのが現状である。更には、化学療法を施行中に腫瘍細胞が薬剤耐性を獲得してしまう問題もあり、薬剤耐性を克服するに足る活性を有し、かつ低毒性で治療係数の高い新薬の開発が望まれている。さらには癌転移を抑制することができる新しいタイプの薬剤及び治療方法の開発が切望されている。また、特に膵臓癌については、現時点で有効な治療方法および化学療法剤が存在しないため、最も予後の悪い癌であり、有効な治療方法および新薬の開発が切望されている。

本発明者は、このような問題点を解決すべく鋭意研究を進めた結果、膵炎治療剤、汎発性血管内血液凝固症（ＤＩＣ）治療剤、血液体外循環時の灌流血液の凝固防止剤としてその有用性と安全性がすでに確認されているＦＵＴが抗腫瘍作用を有する薬剤として極めて有効であることを具体的に見出し、本発明を完成した。
より詳しくは、本発明者は、本発明の６’−アミジノ−２’−ナフチル ４−グアニジノベンゾエート又はその薬理学上許容される塩、特にメシル酸ナファモスタット（ＦＵＴ）を有効成分として含有する薬剤は、腫瘍細胞に対して作用し、その生存率を下げるとともに、腫瘍細胞のアポトーシスを誘導する効果を有するものであることを見出し、さらに詳細な研究により、腫瘍細胞におけるＩＫＫの抑制により、ＩκＢ−αのリン酸化を抑制し、さらにはＮＦ−κＢの活性化を抑制するというメカニズムにより腫瘍細胞の増殖を阻止する新しいタイプの薬剤であることも見出した。また、ＦＵＴが現在有効な治療薬が切望されている膵臓癌に対して顕著な効果を示し、その生体における効果をヒト膵臓がん細胞を移植した動物実験によって確認することにも成功し、本発明を完成した。
また、本発明の別の態様は、上記のごときＦＵＴが既存の抗癌剤と併用することにより更に優れた効果を発揮し、しかも体重減少等の副作用を全く示さないことを見出して、本発明を完成し得たものである。即ち、既存の抗癌剤は薬剤耐性を誘導するという問題点を有しているが、ＦＵＴは薬剤耐性の原因である細胞内のＮＦ−κＢの活性化を抑制する作用があるため、両者を併用することにより、既存の抗癌剤の効果をさらに増強することが可能となった。
他剤特にゲムシタビンとのＦＵＴの併用による腫瘍抑制効果及び副作用の抑制効果は、全く予想し得ない驚くべきことであった。我々は、その併用効果を動物実験においても確認した。特に膵臓癌に対して顕著な抑制効果と副作用抑制効果を示した。特に、ゲムシタビン等の抗腫瘍剤とＦＵＴとの併用が、体重減少等の重篤な副作用を顕著に低減できることは予想し得ない、驚くべき現象であった。
癌細胞表面でその発現が増強しているＭＭＰは、癌組織の腫脹や癌細胞の転移、浸潤に関与している分子であるが、ＦＵＴはこの分子の発現を抑制する効果を有することが明らかとなり、抗腫瘍効果のみならず、癌転移抑制剤としても極めて有効であることが明らかとなった。特に、ゲムシタビン等の他の抗腫瘍剤との併用は、その薬理効果のみならず、体重減少等の副作用の抑制の観点からも、大いに実用化が期待されるものである。
即ち本願発明は、メシル酸ナファモスタットを有効成分とする抗腫瘍剤に関するものであり、以下に示す通りである。
（１）下記式で表される６’−アミジノ−２’−ナフチル ４−グアニジノベンゾエート又はその薬理学上許容される塩を有効成分として含有してなる抗腫瘍剤又は癌転移若しくは癌浸潤の抑制剤。
（２）塩がメシル酸塩である上記１に記載の抗腫瘍剤又は癌転移若しくは癌浸潤の抑制剤。
（３）抗腫瘍剤又は癌転移若しくは癌浸潤の抑制剤が、それぞれ、膵臓癌治療剤、膵臓癌転移若しくは膵臓癌浸潤の抑制剤である上記１又は２に記載の薬剤。
（４）６’−アミジノ−２’−ナフチル ４−グアニジノベンゾエート又はその薬理学上許容される塩を有効成分として含有してなるＮＦ−κＢ抑制剤。
（５）塩がメシル酸塩である上記４に記載のＮＦ−κＢ抑制剤。
（６）６’−アミジノ−２’−ナフチル ４−グアニジノベンゾエート又はその薬理学上許容される塩を有効成分として含有してなるＩＫＫ（ＩκＢリン酸化酵素）抑制剤。
（７）塩がメシル酸塩である上記６に記載のＩＫＫ（ＩκＢリン酸化酵素）抑制剤。
（８）上記１乃至７のいずれか１項に記載の薬剤と、他の抗腫瘍剤を組み合わせてなる医薬。
（９）他の抗腫瘍剤がアルキル化剤、抗代謝薬、抗生物質、植物アルカロイド、白金錯体誘導体およびホルモンからなる群から選ばれる１以上の抗腫瘍剤である上記８に記載の医薬。
（１０）他の抗腫瘍剤がゲムシタビン塩酸塩、ナイトロゲン・マスタード・Ｎ−オキサイド、サイクロホスファミド、メルファラン、カルボクオン、ブスルファン、ニマスチン塩酸塩、ラニマスチン、ダカルバジン、フルオロウラシル、テガフル、サイタラビン、アンサイタビン塩酸塩、ブロキシウリジン、ドキシフルウリジン、メルカプトプリン、チオイノシン、メトトレキセート、マイトマイシン、ブレオマイシン、ダウノルビシン塩酸塩、ドキソルビシン塩酸塩、ピラルビシン塩酸塩、アクラルビシン塩酸塩、ネオカルジノスタチン、アクチノマイシンＤ、ヴィンクリスチン硫酸塩、ヴィンデシン硫酸塩、ヴィンブラスチン硫酸塩、エトポサイド、タモキシフェンクエン酸塩、プロカルバジン塩酸塩、マイトブロニトール、マイトキサントン塩酸塩、カルボプラチンおよびシスプラチンからなる群から選ばれる１以上の抗腫瘍剤である上記８または９に記載の医薬。
（１１）癌患者又は腫瘍患者に対して、請求項１に記載の抗腫瘍剤又は癌転移若しくは癌浸潤の抑制剤を投与することを特徴とする癌又は腫瘍の治療又は予防方法。
（１２）癌患者又は腫瘍患者に対して、請求項１に記載の抗腫瘍剤又は癌転移若しくは癌浸潤の抑制剤と他の抗腫瘍剤を同時に投与するか、または時期をずらして投与することを特徴とする上記（１１）に記載の癌又は腫瘍の治療又は予防方法。

一般的に、制癌剤は極めて強い副作用を有しているのが普通であって、患者の苦痛は大きな問題となっている。一方、本発明の６’−アミジノ−２’−ナフチル ４−グアニジノベンゾエート又はその薬理学上許容される塩、特にメシル酸ナファモスタット（ＦＵＴ）を有効成分として含有する薬剤は、すでに膵炎の急性症状（急性膵炎、慢性膵炎の急性増悪、術後の急性膵炎、膵管造影後の急性膵炎、外傷性膵炎）の改善、汎発性血管内血液凝固症（ＤＩＣ）の改善、出血性病変または出血傾向を有する患者の血液体外循環時の灌流血液の凝固防止（血液透析及びプラスマフェレーシス）に有効であるとして、本邦において承認されている薬剤であり、その安全性も既に確認されている。
したがって、安全性が確認されているＦＵＴを有効成分とする制癌剤が実現し、しかも未だその治療法が確立されていない膵臓癌への適用が実現するならば、患者は制癌剤の副作用の苦痛から解放され、その効果は絶大なるものである。
さらには、直接の抗腫瘍作用を有しているだけでなく、癌が増大していく過程のひとつである癌浸潤や、癌転移を抑制する効果も有していることは、外科的手術後の転移抑制剤としての効果をもたらすものと期待される。
また、既存の抗癌剤や抗腫瘍剤によって引き起こされる薬剤耐性を抑制する効果も有しているため、既存の抗癌剤や抗腫瘍剤との併用により、さらに高い抗癌・抗腫瘍効果を発揮し得るものである。加えて、ＦＵＴが既存の抗癌・抗腫瘍剤に対して優れた併用効果を有することから、結果的に抗癌・抗腫瘍剤の投与量を低減することが可能となり、患者に苦しみをもたらした多くの副作用を低減することが可能となった。さらに注目すべきことは、これらの併用効果が、本発明者らによって動物実験によっても確認されたことである。本発明者らは、特にヒト膵臓癌細胞を移植した動物において顕著な抑制効果を示すこと、体重減少等の副作用が全くないことを見出しており、これら実験事実は、有効な治療薬が切望されている膵臓癌に対して大きな期待をもたらすものであるばかりか、臨床への適用可能性が極めて高いことを意味するものである。

図１は、ＦＵＴ処理によるＮＦ−κＢおよびＩκＢαの変化を示す図である（実施例１，２）。
図１−ａ、ｃは、ヒト膵臓癌細胞株ＭＤＡＰａｎｃ−２８を各濃度のＦＵＴで処理した後の活性化ＮＦ−κＢをゲルシフトアッセイにより検出した結果を示す図である。
図１−ｂ、ｄはヒトＭＤＡＰａｎｃ−２８を各濃度のＦＵＴで処理した後の細胞質画分のＩκＢをウェスタンブロットにより検出した結果を示す図である。
図２は、ＦＵＴ処理によるＩＫＫ活性、リン酸化ＩκＢα量の変化、およびアポトーシスの誘導を示す図である（実施例２，３，４）。
図２−ａは、ＦＵＴ処理前後のＭＤＡＰａｎｃ−２８細胞質画分中のＩＫＫ１、ＩＫＫ２発現をウェスタンブロットにより検出した結果と、それぞれの細胞質画分の酵素活性（リン酸化されたＩκＢα量）を検出した結果を示す図である。
図２−ｂはＦＵＴ処理のＭＤＡＰａｎｃ−２８細胞質中のリン酸化ＩκＢα量を経時的に検出した結果を示す図である。
図２−ｃはＭＤＡＰａｎｃ−２８を各濃度のＦＵＴで処理した後のＤＮＡを抽出し、分断化が起こっているか否かを検出したものを示す図である。
図３は、ＦＵＴ処理によるＴＮＦＲＩ発現量増強を示す図である（実施例５）。
図３−ａ及び図３−ｂは、ＭＤＡＰａｎｃ−２８細胞をＦＵＴで処理した後のＴＮＦＲＩのｍＲＮＡ発現および蛋白発現の変化を示した図である。
図４は、ＦＵＴ処理によるＴＮＦＲＩ発現上昇のメカニズムを検討した結果を示す図である（実施例６）。
図４−ａは、異なるサイズのＴＮＦＲＩプロモーターを含むベクターを作成し、それぞれを組み込んだ細胞を用いてレポータージーンアッセイを行った結果を示した図である。−３８４と−２１１ｂｐの間にＴＮＦＲＩの発現を誘導する転写因子の結合部位が存在することが明らかとなった。
図４−ｂは、さらにＴＮＦＲＩの発現を誘導する転写因子の結合部位を特定するために、２種類のプライマーを用いてＰＣＲを行い、ゲルシフトアッセイを行った結果を示した図であり、−３４５と−２８６ｂｐの間に転写因子の結合部位が存在することが明らかとなった。
図４−ｃは、ＰＥＡ３のｃＤＮＡをトランスフェクションした細胞ではＴＮＦＲＩプロモーターの活性化が起こったが、コントロールの細胞では活性化が起こらなかったことを示した図である。
図５は、ＴＮＦＲＩプロモーター領域へのＰＥＡ３の結合を検討した結果を示す図である（実施例６）。
図５−ａは、ＴＮＦＲＩプロモーター領域にＰＥＡ３が結合することを確認するために、ＰＥＡ３プローブと、それに一部変異を入れたプローブを用いた、阻害実験の結果を示す図である。
図５−ｂは、ヒト膵臓癌細胞株ＭＤＡＰａｎｃ−２８対するＦＵＴ処理によるＰＥＡ３の発現の経時的上昇を示した図である。
図６は、ＦＵＴによるカスパーゼ８の活性化を示す図である（実施例７）。
図６−ａは、ヒト膵臓癌細胞株ＭＤＡＰａｎｃ−２８を各濃度のＦＵＴで２４時間処理した後、細胞質画分を調整し、ウェスタンブロットを行い、抗カスパーゼ８抗体で検出した結果を示す。
図６−ｂ，ｃ，ｄは、ＦＵＴの処理濃度を一定とし（８０μｇ／ｍｌ）、処理時間を０〜２４時間の間で細かく取り、カスパーゼ８、ｐ−ＦＡＤＤ、Ｂｉｄ、ｊＢｉｄの発現の経時的変化をウェスタンブロットにより検出した結果を示す図である。
図７は、ＦＵＴとＴＮＦ−αの併用効果を示す図である（実施例８，９）；ヒト膵臓癌細胞株ＭＤＡＰａｎｃ−２８について以下の処理をした後、細胞質画分を調整しウェスタンブロットによりリン酸化ＦＡＤＤ、カスパーゼ８、ＮＦ−κＢ、ＩκＢαの発現を調べた結果を示している。
図７−ａは、細胞をＦＵＴ（８０μｇ／ｍｌ）で前処理した後、ＴＮＦ−α（５ｎｇ／ｍｌ）で２４時間刺激した場合である。
図７−ｂは、ＴＮＦ−αにより活性化されたＮＦ−κＢが、ＦＵＴ処理により抑制されることを示す図である。
図７−ｃは、ＩκＢαの発現についての図である。
図８は、ＦＵＴとＴＮＦ−αの併用効果を示す図である（実施例９）。ヒト膵臓癌細胞株ＭＤＡＰａｎｃ−２８をＴＮＦ−αで２４時間処理した後、各濃度のＦＵＴを添加しさらに２４時間培養した。
図８−ａは、このようにして培養された細胞についてＭＴＴアッセイを行い、細胞生存率を算定した結果を示す図である。
図８−ｂは、ＤＮＡを抽出し、ＤＮＡフラグメンテーションアッセイを行った結果を示す図である。
図９は、ＦＵＴによるカスパーゼ８の活性化のメカニズムを検討した結果を示す図である（実施例１０）。ＴＮＦＲＩの発現をｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）により抑制した細胞を調整し、ＦＵＴ処理をした後、ＦＡＤＤのリン酸化及びカスパーゼ８の活性化を検討した結果を示している。
図１０は、ＦＵＴ処理による、抗腫瘍剤ゲムシタビン誘導活性化ＮＦ−κＢの抑制について示す図である（実施例１１）。ヒト膵臓癌細胞株ＭＤＡＰａｎｃ−２８をゲムシタビンで１２時間処理した後、ゲルシフトアッセイを行い、ＮＦ−κＢの活性化の有無を検討した結果を示す。
図１０−ａは、さらにゲムシタビンとＦＵＴの併用効果を検討した結果を示す図である。
図１０−ｂは、ヒト膵臓癌細胞株ＭＤＡＰａｎｃ−２８をＦＵＴ、ＰＳ１１４５又はＰＳ３４１で３時間前処理後、ゲムシタビン処理を３時間行い、ゲルシフトアッセイを行った結果を示す図である（実施例１１）。
図１１は、ヒト膵臓癌細胞株ＭＤＡＰａｎｃ−２８の生細胞率に対するＦＵＴ処理の影響を検討した結果を示す図である（実施例１２）。ＦＵＴ、ＰＳ１１４５又はＰＳ３４１それぞれの薬剤単独での、ヒト膵臓癌細胞株ＭＤＡＰａｎｃ−２８の生存率に対する影響を検討した。ヒト膵臓癌細胞株ＭＤＡＰａｎｃ−２８をそれぞれの薬剤で２４時間及び４８時間処理した後、ＭＴＴアッセイを行った結果示す図である。
図１２は、ヒト膵臓癌細胞株ＭＤＡＰａｎｃ−２８のアポトーシスに対するゲムシタビンとＮＦ−κＢ抑制剤との併用効果を検討した結果を示す図である（実施例１３）。ヒト膵臓癌細胞株ＭＤＡＰａｎｃ−２８をＦＵＴ、ＰＳ１１４５又はＰＳ３４１で３時間前処理後、ゲムシタビンで４８時間処理した細胞について、アポトーシスを起こしている細胞の割合を算定した。アポトーシスを起こしているか否かの確認は、ＦＡＣＳｃａｎを用いて測定した。
図１３は、正常細胞に対する ＦＵＴ処理の影響を示す図である（実施例１４）。ＦＵＴ処理のマウス繊維細胞に対する影響を検討した結果を示す。
図１４は、ＦＵＴ処理によるＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９の発現抑制を示す図である（実施例１５）。ヒト膵臓癌細胞株ＭＤＡＰａｎｃ−２８を、ＦＵＴ ０μｇ／ｍｌまたは８０μｇ／ｍｌで処理した後、細胞質画分についてウェスタンブロットを行い、ＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９の発現を検討した結果を示す。
図１５は、ＦＵＴ処理のヒト膵臓癌細胞株ＭＤＡＰａｎｃ−２８に対する浸潤抑制効果を検討した結果を示す図である（実施例１６）。ＦＵＴ ８０μｇ／ｍｌで２４時間処理した細胞、無処理の細胞を、それぞれマトリゲルをコーティングしたチャンバーに１ウェルあたり２００００個播種し、３７℃で２２時間、ＦＵＴ ８０μｇ／ｍｌ存在下または非存在下でインキュベートした。ライトギムザ染色を行い、浸潤した細胞数を顕微鏡下で計数した結果を示す。
図１５−ａは、処置なし（対照）、図１５−ｂは、ＦＵＴ１７５（８０μｇ／ｍｌ）２２時間処理、図１５−ｃは、ＦＵＴ１７５（８０μｇ／ｍｌ）２４時間予備処理、図１５−ｄは、ＦＵＴ１７５（８０μｇ／ｍｌ）２４時間予備処理、２２時間処理したものである。
図１６は、ヒト膵がん細胞株Ｐａｎｃ−１を皮下に５×１０６個移植し、移植後６週間後に腫瘤径が平均化するように３群に分け、Ｃｏｎｔｒｏｌ群：処置なし（ｎ＝４）、ＧＥＭ群（ゲムシタビン投与群）：ゲムシタビン（１００ｍｇ／ｋｇ，週１回，ｉ．ｐ．）（ｎ＝４）、ＦＵＴ ｇｒｏｕｐ：ＦＵＴ−１７５（３０ｍｇ／ｋｇ，週３回，ｉ．ｐ．）＋ゲムシタビン（１００ｍｇ／ｋｇ，週１回，ｉ．ｐ．）（ｎ＝４）、の処置を６週間行い、腫瘍サイズの測定を行った結果を示す図である（実施例１７）。
図１７は、上記図１６の処置を行った後に、マウスの体重測定を行った結果を示す図である（実施例１７）。
図１８は、上記図１６の処置を行った後に、摘出腫瘤の重量を測定した結果を示す図である（実施例１７）。
図１９は、上記図１６の処置を行った後のマウスを写真撮影したものである。

本明細書において、「メシル酸ナファモスタット（ＦＵＴ）」とは、上記したとおり、下記式で表される６−アミジノ−２−ナフチル ｐ−グアニジノベンゾエート ジメタンスルホネート（６−Ａｍｉｄｉｎｏ−２−ｎａｐｈｔｈｙｌｐ−ｇｕａｎｉｄｉｎｏｂｅｎｚｏａｔｅ ｄｉｍｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）を意味する。
メシル酸ナファモスタット（ＦＵＴ）は、すでに本邦において承認されており、その効能効果は、
１）膵炎の急性症状（急性膵炎、慢性膵炎の急性増悪、術後の急性膵炎、膵管造影後の急性膵炎、外傷性膵炎）の改善：
２）汎発性血管内血液凝固症（ＤＩＣ）：
３）出血性病変または出血傾向を有する患者の血液体外循環時の灌流血液の凝固防止（血液透析及びプラスマフェレーシス）：である。
本願発明に係るメシル酸ナファモスタット（ＦＵＴ）の投与量は、投与対象、投与ルート、対象疾患、症状などによっても異なるが、例えば患者に経口投与する場合、１日あたり、２．８ｍｇ／ｋｇ乃至９．６ｍｇ／ｋｇで投与するのが望ましい。非経口投与の場合、その投与形態（例えば注射剤、外用剤、坐剤等）によっても異なるが一日投与量は、１．４ｍｇ／ｋｇ乃至４．８ｍｇ／ｋｇが望ましい。
本願発明の薬剤は、経口投与のための固体組成物、液体組成物及びその他の組成物、あるいは非経口投与のための注射剤、外用剤、坐剤、経皮吸収性製剤、吸入剤等の形態を取ることができ、その使用形態については特に限定されるものではない。経口投与のための固体組成物には、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤等が含まれる。カプセル剤には、ハードカプセル及びソフトカプセルが含まれる。好ましくは、非経口投与のための注射剤である。
このような固体組成物においては、ＦＵＴからなる活性物質が、少なくともひとつの不活性な希釈剤、例えばラクトース、マンニトール、マンニット、グルコース、ヒドロキシプロピルセルロース、微結晶セルロース、デンプン、ポリビニルピロリドン、メタケイ酸アルミン酸マグネシウムと混合される。組成物は、常法に従って、不活性な希釈剤以外の添加剤、例えばステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、繊維素グリコール酸カルシウムのような崩壊剤、グルタミン酸またはアスパラギン酸のような溶解補助剤を含有していてもよい。錠剤または丸剤は必要により白糖、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレートなどの胃溶性あるいは腸溶性物質のフィルムで被覆していてもよいし、また２以上の層で被覆していてもよい。さらにゼラチンのような吸収されうる物質のカプセルも包含される。
経口投与のための液体組成物は、薬剤的に許容される乳濁剤、溶液剤、シロップ剤、エリキシル剤等を含む。このような液体組成物においては、ＦＵＴからなる活性物質が、一般的に用いられる不活性な希釈剤（例えば精製水、エタノール）中に溶解される。これら液体組成物は、不活性な希釈剤以外に湿潤剤、懸濁化剤のような補助剤、甘味剤、風味剤、防腐剤を含有していてもよい。
経口投与のためのその他の組成物としては、ＦＵＴからなる活性物質を含み、それ自体公知の方法により処方されるスプレー剤が含まれる。この組成物は不活性な希釈剤以外に亜硫酸水素ナトリウムのような安定剤と等張性を与えるような安定化剤、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウムあるいはクエン酸のような等張剤を含有していてもよい。
本願発明による非経口投与のための液剤、例えば注射剤としては、無菌の水性または非水性の溶液剤、懸濁剤、乳濁剤を包含する。水性の溶液剤、懸濁剤としては、例えば注射用蒸留水及び生理食塩水が含まれる。非水溶性の溶液剤、懸濁剤としては、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、エタノールのようなアルコール類、ポリソルベート８０（登録商標）等がある。このような組成物は、さらに防腐剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤、溶解補助剤（例えば、グルタミン酸、アスパラギン酸）のような補助剤を含んでいてもよい。これらはバクテリア保留フィルターを通すろ過、殺菌剤の配合または照射によって無菌化される。これらはまた無菌の固体組成物を製造し、使用前に無菌化または無菌の注射用蒸留水または他の溶媒に溶解して使用することもできる。
非経口投与のためのその他の組成物としては、メシル酸ナファモスタット（ＦＵＴ）を有効成分として含み、常法により処方される注腸剤、外溶液剤、軟膏、塗布剤、坐剤等が含まれる。
吸入剤、エアゾール剤として使用するには、活性成分を溶液、懸濁液または微小粉体の形で、気体または液体噴射剤と共に、且つ所望により湿潤剤または分散剤のような通常の補助剤と共にエアゾール容器内に充填する。本願発明化合物は、ネブライザーまたはアトマイザーのような非加圧型の剤形にしてもよい。
併用に用いる既存の抗癌剤・抗腫瘍剤は、特に限定されるものではないが、例えば、ゲムシタビン塩酸塩、ナイトロゲン・マスタード・Ｎ−オキサイド、サイクロホスファミド、メルファラン、カルボクオン、ブスルファン、ニマスチン塩酸塩、ラニマスチン、ダカルバジン、フルオロウラシル、テガフル、サイタラビン、アンサイタビン塩酸塩、ブロキシウリジン、ドキシフルウリジン、メルカプトプリン、チオイノシン、メトトレキセート、マイトマイシン、ブレオマイシン、ダウノルビシン塩酸塩、ドキソルビシン塩酸塩、ピラルビシン塩酸塩、アクラルビシン塩酸塩、ネオカルジノスタチン、アクチノマイシンＤ、ヴィンクリスチン硫酸塩、ヴィンデシン硫酸塩、ヴィンブラスチン硫酸塩、エトポサイド、タモキシフェンクエン酸塩、プロカルバジン塩酸塩、マイトブロニトール、マイトキサントン塩酸塩、カルボプラチンおよびシスプラチンからなる群から選ばれる１以上の抗腫瘍剤を挙げることができる。特に好ましくはゲムシタビン塩酸塩である。
併用に用いるこれら既存の抗癌剤・抗腫瘍剤の好ましい投与量は、それぞれの薬剤に対してＦＤＡや厚生労働省が規定乃至は推奨するところの投与量である。しかし、上記のとおりＦＵＴとの併用によりその効果が増大されることから、上記規定の投与量より少ない投与量で十分な効果を発揮することが可能である。したがって、これら既存の抗癌剤・抗腫瘍剤のより好ましい投与量は、ＦＤＡや厚生労働省が規定乃至は推奨するところの投与量の０．３倍乃至１倍である。
また、これら既存の抗癌剤・抗腫瘍剤の投与方法は、ＦＤＡや厚生労働省が規定乃至は推奨するところの方法に従えばよい。また、これら既存の抗癌剤・抗腫瘍剤とＦＵＴとの投与タイミングについては、これら薬剤を患者に同時に投与してもよいし、或いは既存薬の投与に先立ってＦＵＴを投与しても、或いは逆に既存薬の投与した後にＦＵＴを投与してもよい。
以下、本願発明を実施例により詳しく説明するが、これは例示的なものであり、本願発明はこれに限定されるものではない。

ＦＵＴ１７５によるＮＦ−κＢの抑制；
ヒト膵臓癌細胞株ＭＤＡＰａｎｃ−２８に各濃度のＦＵＴを添加し、ＮＦ−κＢ活性化に及ぼす影響を調べた。ＭＤＡＰａｎｃ−２８は常にＮＦ−κＢが活性化している細胞株である。各濃度のＦＵＴで処理後の細胞の核抽出物についてκＢプローブを用いたゲルシフトアッセイを行い、活性化し核移行しているＮＦ−κＢを検出した。具体的には、１０μｇの核抽出物をバインディングバッファー（７５ｍＭ ＮａＣｌ，１５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，１．５ｍＭ ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ，２５％ ｇｌｙｃｅｒｏｌ，２０ｍｇ／ｍｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）中で、３０分間、４℃の条件下、１μｇのｐｏｌｙ（ｄＩ−ｄＣ）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）と反応させた。^３２Ｐ標識したオリゴヌクレオチドプローブ（配列番号１〜４）を室温で２０分反応させた後、電気泳動を行った（４％ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ，０．２５ｘＴＢＥ；２２．５ｍＭ Ｔｒｉｓ，２２．５ｍＭｂｏｒａｔｅ，５００ｕＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０）。ゲルは８０℃で１時間乾燥させた後、−８０℃にてＫｏｄａｋ ｆｉｌｍ（Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ Ｃｏ．，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，Ｎ．Ｙ．）に露光させ、検出した。陽性コントロールとしては、Ｏｃｔ−１を用いた。
結果を図１−ａ、ｃに示した。ＦＵＴの濃度依存的にＮＦ−κＢの活性化が抑制された。またＦＵＴ添加後２４時間目までは経時的にＮＦ−κＢの活性化が抑制され、４８時間目には定常状態に戻っていた。

ＦＵＴによるリン酸化ＩκＢαの減少；
ヒト膵臓癌細胞株ＭＤＡＰａｎｃ−２８に各濃度のＦＵＴを添加し、ＩκＢαに及ぼす影響を調べた。各濃度のＦＵＴで処理後の細胞の細胞質抽出液を常法に従って抽出し、ウェスタンブロットにより、各蛋白を検出した。具体的には、１レーンあたり５０μｇの蛋白を添加し、電気泳動を行った。ＰＶＤＦ膜（Ｏｓｍｏｎｉｃｓ）に転写し、５％ｎｏｎｆａｔ ｍｉｌｋ含有ＰＢＳ中で、室温、２時間のブロッキングを行った。次に０．１％ｎｏｎｆａｔ ｍｉｌｋ含有ＰＢＳで希釈した１次抗体（抗ＩκＢα抗体）を４℃で一晩反応させた。ＰＶＤＦ膜をＰＢＳで洗浄し、０．１％ｎｏｎｆａｔ ｍｉｌｋ含有ＰＢＳで希釈した２次抗体液を室温、２時間反応させた。蛋白の検出はＬｕｍｉ−Ｌｉｇｈ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅで行った。
結果を図１−ｂ、ｄ及び図２−ｂに示した。図１−ｂでは、ＦＵＴの濃度依存的に細胞質中のＩκＢαが増加しているのがわかる。これは、細胞質中で不活性型のＮＦ−κＢに結合した状態のＩκＢαがＦＵＴの濃度依存的に増加していることを示している。図１−ｄはＦＵＴ添加後２４時間目まではＮＦ−κＢの不活性化に伴い細胞質中のＩκＢα量が増加するが、４８時間後には定常状態に戻っていることを示している。この結果は実施例１に示したＮＦ−κＢの活性化と相関しているものである。図２−ｂの実験では、１次抗体として、リン酸化したＩκＢαのみを認識できる抗体を用いている。ＦＵＴの添加により細胞質中のリン酸化したＩκＢαが経時的に減少しており、ＮＦ−κＢの活性化が抑制されていることを示すものである。

ＦＵＴによるＩＫＫ活性の変化；
ヒト膵臓癌細胞株ＭＤＡＰａｎｃ−２８をＦＵＴで処理した後、氷冷したＰＢＳで洗浄し、８００μｇの細胞質画分を調製した。グルタチオンセファローズビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を添加し、４℃で３時間転倒混和し、非特異的吸着画分を取り除いた。上清に抗ＩＫＫ１／２抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）４μｇを添加し、４℃で一晩反応させた後、グルタチオンセファローズビーズを添加し４℃で３時間混和した。免疫複合体が結合したビーズをＰＢＳで２回洗浄したものを、免疫沈降と酵素活性測定に用いた。
酵素活性測定においては、上記のビーズをキナーゼバッファー（１５０ｍＭ ＮａＣｌ，２５ｍＭ ｂｅｔａ−ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ，１０ｍＭ ＭｇＣｌ２含有２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ）で洗浄し、酵素反応を行った。５ｕＣｉの^３２Ｐ標識γ−ＡＴＰと、基質であるＧＳＴ−ＩκＢαを１μｇ含むキナーゼバッファー中で３７℃、３０分反応させた。ＳＤＳサンプルバッファーで反応を停止し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、オートラジオグラフィーにより検出した。
その結果を図２−ａに示した。ＦＵＴ処理により、ＩＫＫ１およびＩＫＫ２の発現量に変化は生じないが、ＩＫＫ１，ＩＫＫ２の酵素活性が低下し、リン酸化し得るＩκＢα量が減少しているのがわかる。

ＦＵＴによる膵臓癌細胞のアポトーシス誘導；
ヒト膵臓癌細胞株ＭＤＡＰａｎｃ−２８をＦＵＴで処理した後、ＤＮＡ抽出バッファー（０．１ｍＭ ＥＤＴＡ，０．５％ＳＤＳ，２０μｇ／ｍｌ ＲＮａｓｅ含有１０ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ８．０）中、３７℃、１時間インキュベートした。１０００Ｕ／ｍｌのプロテイナーゼＫを添加し、５０℃で５時間インキュベートした。ＤＮＡをフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールで抽出後、水溶性画分を回収し、イソプロパノール及び酢酸アンモニウムを添加し、沈殿を回収した。沈殿を７０％エタノールで洗浄し、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡバッファーに溶解させた。２％アガロースゲルを用いて電気泳動を行い、エチジウムブロマイドにてＤＮＡのバンドを確認した。
その結果を図２−ｃに示した。４０μｇ／ｍｌ以上のＦＵＴで処理したＭＤＡＰａｎｃ−２８細胞では、ＤＮＡの断片化が生じており、ＦＵＴによってアポトーシスが誘導されたことを示している。

ＦＵＴによるＴＮＦ受容体ｔｙｐｅＩ（以下ＴＮＦＲＩという）の発現の上昇；
ＦＵＴによって誘導される癌細胞のアポトーシスが、どのような作用メカニズムによって起こるのかを明らかにするために、ＦＵＴ処理によるヒト膵臓癌細胞株ＭＤＡＰａｎｃ−２８におけるＴＮＦＲＩの発現の変化を確認した。
ハイブリダイゼーションに用いるためのｃＤＮＡプローブを以下の方法で作成した。ＦＵＴで処理したヒト膵臓癌細胞株ＭＤＡＰａｎｃ−２８よりＴＲＩＺＯＬ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を用いてＲＮＡを抽出した。１５μｇのＲＮＡを１％変性ホルムアルデヒドアガロースゲルを用いて電気泳動し、ナイロン膜に転写した。ＴＮＦＲＩのｍＲＮＡの検出に用いるｃＤＮＡプローブを作成するために、ＲＴ−ＰＣＲを行った。このとき、配列番号５および６に示したプライマーを用いた。得られたｃＤＮＡをｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクターに導入した。得られたｃＤＮＡの塩基配列は、Ｇｅｎｅ Ｂａｎｋの配列と一致した。作成したｃＤＮＡプローブを、ランダムラベリングキット（Ｒｏｃｈｅ）を用いてα−^３２ＰｄＣＴＰで標識し、ハイブリダイゼーションに使用した。
ＴＮＦＲＩのｍＲＮＡ発現は上記プローブを用いて定法に従い、ノーザンブロット法により確認した。図３−ａに示したように、ＦＵＴの濃度依存的にＴＮＦＲＩのｍＲＮＡ発現は増加した。また、細胞表面上のＴＮＦＲＩの発現はウェスタンブロット法により検出した。具体的方法は実施例２に示したものと同様である。検出には、Ｍｏｕｓｅ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉ−ＴＮＦＲ１（Ｈ−５；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いた。その結果、図３−ｂに示したようにＦＵＴ処理により細胞表面上のＴＮＦＲＩの発現は増加した。
実施例１の結果と合わせると、活性型ＮＦ−κＢとＴＮＦＲＩは、その発現をお互いにフィードバック制御していることがわかる。

ＦＵＴによる転写因子ＰＥＡ３の活性化；
ＮＦ−κＢとＴＮＦＲＩのフィードバック制御に関与している転写因子が何であるかを明らかにするために、異なるサイズのＴＮＦＲＩプロモーターを含むベクターを作成し、レポータージーンアッセイを行った。その結果、−３８４と−２１１ｂｐの間にＴＮＦＲＩの発現を誘導する転写因子の結合部位が存在することが明らかとなった。
さらにＴＮＦＲＩの発現を誘導する転写因子の結合部位を特定するために、２種類のプライマーの組み合わせ（配列番号７及び８、配列番号８及び９）を用いてＰＣＲを行い、−３８４と−２８６ｂｐの配列の前半部分の配列、後半部分の配列をそれぞれ認識する２種類のプローブを作成した。これらのプローブを用いて、実施例１と同様の方法でゲルシフトアッセイを行った。その結果、−３４５と−２８５ｂｐの間に転写因子の結合部位が存在することが明らかとなった。検索ソフトＩＦＴＩ−ＭＩＲＡＧＥを用いて解析したところ、この配列に結合する転写因子はＰＥＡ３であることが判明した（図４）。
ヒト膵臓癌細胞株ＭＤＡＰａｎｃ−２８に、ＴＮＦＲＩプロモーター領域にルシフェラーゼ遺伝子を結合した配列を導入したベクターと、ＰＥＡ３のｃＤＮＡをトランスフェクションし、レポータージーンアッセイを行った。ＰＥＡ３のｃＤＮＡをトランスフェクションした細胞ではＴＮＦＲＩプロモーターの活性化が起こったが、ＰＥＡ３のｃＤＮＡをトランスフェクションしていないコントロールの細胞では活性化が起こらなかった。
ＴＮＦＲＩプロモーター領域にＰＥＡ３が結合することを確認するために、ＰＥＡ３プローブと、それに一部変異を入れたプローブを用いて、阻害実験を行った。常にＮＦ−κＢが不活性型になっている細胞（ＭＤＡＰａｎｃ−２８／ＩκＢα）においては、ＴＮＦＲＩの高い発現が見られ、標識したＰＥＡ３プローブがＴＮＦＲＩプロモーター領域に結合する。それに対して上記の２種類の非標識のプローブを導入して阻害活性を比較したところ、非標識のＰＥＡ３プローブを入れた方では標識ＰＥＡ３プローブの結合阻害が起きたが、非標識の変異プローブを入れた方では全く起きなかった（図５−ａ）。また、ヒト膵臓癌細胞株ＭＤＡＰａｎｃ−２８対するＦＵＴ処理によってＰＥＡ３の発現が経時的に高くなることも示された（図５−ｂ）。

ＦＵＴによるカスパーゼ８の活性化；
ＦＵＴ処理によるＴＮＦＲＩの発現レベルの上昇に伴って、アポトーシスシグナルカスケードが動くか否かを、カスパーゼ８の活性化を指標に検討した。ヒト膵臓癌細胞株ＭＤＡＰａｎｃ−２８を各濃度のＦＵＴで２４時間処理した後、細胞質画分を調整し、ウェスタンブロットを行い、抗カスパーゼ８抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で検出した（図６−ａ）。ＦＵＴの処理濃度を一定とし（８０μｇ／ｍｌ）、処理時間を０〜２４時間の間で細かく取り、カスパーゼ８、ｐ−ＦＡＤＤ、Ｂｉｄ、ｊＢｉｄの発現の経時的変化をウェスタンブロットにより調べた（図６−ｂ，６−ｃ，６−ｄ）。抗ＦＡＤＤ抗体はＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、抗Ｂｉｄ抗体はＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社のものを用いた。
ＦＵＴ処理の濃度依存的にカスパーゼ８の活性化が起こることから、ＦＵＴはＮＦ−κＢの活性化抑制と、ＴＮＦＲ１の発現誘導に加えて、アポトーシスシグナルカスケードの始動についても重要な役割を果たしていることが明らかとなった。さらに、図６−ｂ、ｃに示したように、ＦＵＴ処理により経時的にＦＡＤＤのリン酸化が促進し、その後カスパーゼ８の活性化が促進することから、ＴＮＦが誘導するアポトーシス経路において、ＦＡＤＤがカスパーゼ８の活性化によるアポトーシスシグナルカスケードの始動に関与していることも明らかとなった。ＪＮＫを介した経路において必須であるＢｉｄの分解産物ＪＢｉｄの発現もまた同様に経時的に増加していた（図６−ｄ）。以上のことから、ＦＵＴによるカスパーゼ８の活性化には、ＦＡＤＤ及びＪＮＫを介した２つの独立した経路が関与していることが明らかとなった。

ＦＵＴとＴＮＦ−αの相乗効果１；
ヒト膵臓癌細胞株ＭＤＡＰａｎｃ−２８について以下の処理をした後、細胞質画分を調整しウェスタンブロットによりリン酸化ＦＡＤＤ、カスパーゼ８、ＮＦ−κＢ、ＩκＢαの発現を調べた。まず、細胞をＦＵＴ（８０μｇ／ｍｌ）で前処理した後、ＴＮＦ−α（５ｎｇ／ｍｌ）で２４時間刺激場合には、図７−ａに示すようにＦＡＤＤのリン酸化及びカスパーゼ８の活性化は、ＦＵＴ処理単独に比べ、ＴＮＦ−α処理によって増強した。また、ＴＮＦ−αにより活性化されたＮＦ−κＢが、ＦＵＴ処理により抑制されることも明らかとなった（図７−ｂ）。ＩκＢαの発現も同様であった（図７−ｃ）。

ＦＵＴとＴＮＦ−αの相乗効果２；
癌細胞のアポトーシスに対するＦＵＴとＴＮＦ−αの併用効果を調べた。ヒト膵臓癌細胞株ＭＤＡＰａｎｃ−２８をＴＮＦ−αで２４時間処理した後、各濃度のＦＵＴを添加しさらに２４時間培養した。これらの細胞について定法に従ってＭＴＴアッセイを行い、細胞生存率を算定した。またＤＮＡを抽出し、ＤＮＡフラグメンテーションアッセイを行った。
ＭＴＴアッセイについて具体的には、細胞２０００個を９６穴マイクロタイタープレートに１００μｌの培地中播種し、上記処理を行った後、プレート遠心し、５ｍｇ／ｍｌ ＭＴＴ（Ｓｉｇｍａ）ＰＢＳ溶液に置き換え３７℃、４時間インキュベートした。上清を除去し、ＤＭＳＯを１００μｌ添加し、細胞を溶解した。５７０ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダーを用いて測定した。８穴について同条件で実験を行った。独立した実験を合計２回行い、それらの平均値を算定した。ＤＮＡフラグメンテーションアッセイについては、実施例４と同様の方法で行った。
結果を図８に示した。コントロールと比較して、ＦＵＴ処理により細胞の生存率が顕著に低下した。さらにＴＮＦ−αを併用することにより、生存率は低下傾向にあった（図８−ａ）。また、ＤＮＡフラグメンテーションについては、ＴＮＦ−α ５ｎｇ／ｍｌのみの処理では起こらないのに対し、ＦＵＴを併用することにより起こるようになった（図８−ｂ）。以上のことから、ＦＵＴとＴＮＦ−αの併用により、癌細胞のアポトーシスを相乗的に起こすことができることが明らかとなった。

ＦＵＴによるカスパーゼ８の活性化のメカニズム；
ＦＵＴ処理によってＴＮＦＲＩの発現が上昇することが、カスパーゼ８の活性化に必要であるか否かを確認するために、ＴＮＦＲＩの発現をｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）により抑制した細胞を調整した。
図９に示すように、ＴＮＦＲＩの発現が抑制された細胞については、ＦＵＴを処理しても、ＦＡＤＤのリン酸化及びカスパーゼ８の活性化も起こらなかった。従って、ＦＵＴによるカスパーゼ８の活性化はＴＮＦＲＩ依存的であることが明らかとなった。

ＦＵＴ処理による、抗腫瘍剤ゲムシタビン誘導の活性化ＮＦ−κＢの抑制；
化学療法剤の中には、細胞内のＮＦ−κＢの活性化を誘導し、その結果薬剤耐性を引き起こすものがあり、問題になっている。そこで、本発明者らはまず、ゲムシタビンがヒト膵臓癌細胞株ＭＤＡＰａｎｃ−２８に作用してＮＦ−κＢの活性化を誘導するか否かを確認した。ヒト膵臓癌細胞株ＭＤＡＰａｎｃ−２８をゲムシタビンで１２時間処理した後、常法に従ってゲルシフトアッセイを行い、ＮＦ−κＢの活性化の有無を検討した。具体的には、実施例１に記載した方法と同様の方法により行った。その結果、図１０−ａに示すように、ゲムシタビン処理によりＮＦ−κＢの活性化が誘導されることが確認できた。
次に、ゲムシタビンとＦＵＴの併用効果を検討した。同時に、他のＮＦ−κＢ阻害剤であるＰＳ１１４５およびＰＳ３４１との比較も行った。ヒト膵臓癌細胞株ＭＤＡＰａｎｃ−２８をＦＵＴ、ＰＳ１１４５又はＰＳ３４１で３時間前処理を行った。その後ゲムシタビン処理を３時間行った後に、ゲルシフトアッセイを行いＮＦ−κＢの活性化に対する影響を検討した。その結果、図１０−ｂに示すように、ＦＵＴはゲムシタビンによって誘導されるＮＦ−κＢの活性化を抑制する作用を有することが明らかとなった。他の２種類の薬剤についても同様の傾向を示したが、ＦＵＴによる抑制効果が最も顕著であった。

ヒト膵臓癌細胞株ＭＤＡＰａｎｃ−２８の生細胞率に対するＦＵＴ処理の影響；
ＦＵＴ、ＰＳ１１４５又はＰＳ３４１はＮＦ−κＢの活性化抑制効果を示したが、これらの薬剤は異なった作用メカニズムを有する異なったタイプの薬剤であるので、それぞれの薬剤単独での、ヒト膵臓癌細胞株ＭＤＡＰａｎｃ−２８の生存率に対する影響を検討した。ヒト膵臓癌細胞株ＭＤＡＰａｎｃ−２８をそれぞれの薬剤で２４時間及び４８時間処理した後、ＭＴＴアッセイを行った。ＭＴＴアッセイは実施例９に記載した方法で行った。その結果、図１１−ａに示すようにＦＵＴの濃度依存的にヒト膵臓癌細胞株ＭＤＡＰａｎｃ−２８の細胞増殖が抑制され、４８時間目では２４時間目と比較して生細胞率のわずかな増加が見られた。それに対してＰＳ１１４５は、４８時間処理においては、濃度依存的な増殖抑制効果を示したが、２４時間処理においては、有意な抑制効果は示さなかった。また、ＰＳ３４１には、２４時間処理、４８時間処理とも有意な増殖抑制効果は見られなかった（図１１−ｂ、１１−ｃ）。以上より、ＦＵＴ及びＰＳ１１４５は、ヒト膵臓癌細胞株ＭＤＡＰａｎｃ−２８に対する増殖抑制効果を有していたが、その抑制効果はＦＵＴの方が早い時間に起こることが明らかとなった。

ヒト膵臓癌細胞株ＭＤＡＰａｎｃ−２８のアポトーシスに対するゲムシタビンとＮＦ−κＢ抑制剤との併用効果の検討；
ＦＵＴ、ＰＳ１１４５およびＰＳ３４１は、ゲムシタビン誘導のＮＦ−κＢの活性化を抑制する作用を有することが明らかとなったが、ヒト膵臓癌細胞株ＭＤＡＰａｎｃ−２８のアポトーシス誘導に関してはどのような効果を有するかについて検討した。ＦＵＴ、ＰＳ１１４５又はＰＳ３４１で３時間前処理後、ゲムシタビンで４８時間処理した細胞について、アポトーシスを起こしている細胞の割合を算定した。アポトーシスを起こしているか否かの確認は、フローサイトメトリーにより行った。薬剤処理後の細胞を回収し、７０％エタノールで−２０℃の条件下で２４時間固定した。細胞をＰＢＳで洗浄し、５０μｇ／ｍｌプロピウムイオダイド、０．１％トライトンＸ−１００、０．１％クエン酸ナトリウム、１μｇ／ｍｌ Ｄｎａｓｅ ｆｒｅｅ ＲＮａｓｅ含有ＰＢＳに懸濁した。室温で３０分インキュベートした後、ＤＮＡ量をＦＡＣＳｃａｎを用いて測定した。その結果、図１２に示すように、ゲムシタビン単独でもアポトーシスを誘導したが、ＦＵＴ、ＰＳ１１４５またはＰＳ３４１とゲムシタビンを併用することにより、その効果がさらに増大した。

正常細胞に対する ＦＵＴ処理の影響；
抗腫瘍剤としての有効であると判断されるためには、正常細胞に対して影響がないということが重要である。そこで、次にＦＵＴ処理の正常細胞に対する影響を検討した。正常細胞としては、マウス繊維細胞を用いた。その結果、８０μｇ／ｍｌの濃度のＦＵＴで処理しても、細胞の生存率には影響が見られなかった（図１３）。それに対して、他のＮＦ−κＢ阻害剤であるＰＳ１１４５およびＰＳ３４１は、細胞にアポトーシスを誘導する濃度で用いると、正常細胞の生細胞率を顕著に減少させることが明らかとなった。

ＦＵＴ処理によるＭＭＰ−２， ＭＭＰ−９の発現抑制；
ヒト膵臓癌細胞株ＭＤＡＰａｎｃ−２８を、ＦＵＴ ０μｇ／ｍｌまたは８０μｇ／ｍｌで処理した後、細胞質画分を調製した。得られた細胞質蛋白についてウェスタンブロットを行い、ＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９の発現を検討した。具体的な実験方法は実施例２に示した通りである。検出にはウサギポリクローナル抗ＭＭＰ−２抗体、ヤギポリクローナル抗ＭＭＰ−９抗体、マウス抗Ｂ−アクチン抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．）を用いた。その結果、図１４に示すように、ＦＵＴの濃度依存的にＭＭＰ−２，ＭＭＰ−９の発現が抑制された。

ＦＵＴ処理による膵臓癌細胞株の浸潤抑制；
ＦＵＴ処理によるヒト膵臓癌細胞株ＭＤＡＰａｎｃ−２８の浸潤抑制効果を検討するために、マトリゲル浸潤アッセイを行った。ＦＵＴ ８０μｇ／ｍｌで２４時間処理した細胞、無処理の細胞を、それぞれマトリゲルをコーティングしたチャンバーに１ウェルあたり２００００個播種した。３７℃で２２時間、ＦＵＴ ８０μｇ／ｍｌ存在下または非存在下でインキュベートした。常法に従ってライトギムザ染色を行い、浸潤した細胞数を顕微鏡下で計数した。その結果を図１５に示した。ＦＵＴで前処理した細胞群において、顕著な浸潤抑制効果が見られた。

ＦＵＴ１７５およびゲムシタビンのｉｎ ｖｉｖｏ投与効果；
雄性のヌードマウス（８週）にたいしてヒト膵がん細胞株Ｐａｎｃ−１を皮下に５×１０６個移植し、移植後６週間後に腫瘤径が平均化するように３群に分けて、それぞれの群に以下の処置を行った。Ｃｏｎｔｒｏｌ群：処置なし（ｎ＝４）、ＧＥＭ群（ゲムシタビン投与群）：ゲムシタビン（１００ｍｇ／ｋｇ，週１回，ｉ．ｐ．）（ｎ＝４）、ＦＵＴ ｇｒｏｕｐ：ＦＵＴ−１７５（３０ｍｇ／ｋｇ，週３回，ｉ．ｐ．）＋ゲムシタビン（１００ｍｇ／ｋｇ，週１回，ｉ．ｐ．）（ｎ＝４）、以上の処置を６週間行い、腫瘍サイズの測定、体重の測定、摘出腫瘤重量の測定、写真撮影を行った。
腫瘍サイズの測定結果を図１６に示した。Ｃｏｎｔｒｏｌ群に対して、ゲムシタビン単独投与群では、腫瘍サイズが約５０％に、ＦＵＴの併用群では約２５％にまで退縮した。この事実は、誰しも予想し得ない驚くべき成果であった。投与後のマウスの体重を図１７に示した。ゲムシタビン単独投与群では、体重減少が観察されたが、驚くべきことにＦＵＴとの併用群では、全く体重減少が見られず、コントロール群と同等であった。また、摘出腫瘤重量は、図１８に示すように、Ｃｏｎｔｒｏｌ群に対して、ゲムシタビン単独投与群で約５０％に、ＦＵＴとの併用群では約６％にまで退縮していた。図１９には、処置後のマウスの様子を写真撮影したものを示した。ＦＵＴとの併用群で、腫瘍が著しく退縮しているのがわかる。
上記試験結果から明らかなとおり、ゲムシタビンとＦＵＴの併用は、優れた抗腫瘍効果をもたらすだけでなく、体重減少等の重篤な副作用が全く観察されなかった。これは腫瘍患者にとって大いなる福音であり、早期の実用化が期待される。

本願発明の抗腫瘍剤は、腫瘍細胞におけるＩＫＫの抑制により、ＩκＢ−αのリン酸化を抑制し、さらにはＮＦ−κＢの活性化を抑制するというメカニズムにより腫瘍細胞の増殖を阻止する新しいタイプの薬剤である。現時点で有効な治療方法および化学療法剤が存在しない膵臓癌に特に有効であり、さらには癌転移を抑制する効果も有している。更には既存の抗腫瘍剤によって引き起こされる薬剤耐性を抑制する効果も有しているため、本発明の抗腫瘍剤単独のみならず、既存の抗腫瘍剤との併用により、さらに高い抗腫瘍効果を発揮するものである。最も注目すべきは、これらの顕著な抗腫瘍効果が、動物実験においても確認できている点である。すでに承認済みの薬剤なのでその安全性も確認されているため、副作用の恐れもなく、安全な抗腫瘍剤としてその実用化が期待される。特に、ゲムシタビン塩酸塩に対してＦＵＴを併用した場合には、体重減少等の副作用が観察されず、腫瘍治療に対する効果のみならず、その安全性が大いに記載される。
［配列表］

Claims (12)

1. 下記式で表される６’−アミジノ−２’−ナフチル ４−グアニジノベンゾエート又はその薬理学上許容される塩を有効成分として含有してなる抗腫瘍剤又は癌転移若しくは癌浸潤の抑制剤。
   
2. 塩がメシル酸塩である請求項１に記載の抗腫瘍剤又は癌転移若しくは癌浸潤の抑制剤。
3. 抗腫瘍剤又は癌転移若しくは癌浸潤の抑制剤が、それぞれ、膵臓癌治療剤、膵臓癌転移若しくは膵臓癌浸潤の抑制剤である請求項１又は２に記載の薬剤。
4. ６’−アミジノ−２’−ナフチル ４−グアニジノベンゾエート又はその薬理学上許容される塩を有効成分として含有してなるＮＦ−κＢ抑制剤。
5. 塩がメシル酸塩である請求項４に記載のＮＦ−κＢ抑制剤。
6. ６’−アミジノ−２’−ナフチル ４−グアニジノベンゾエート又はその薬理学上許容される塩を有効成分として含有してなるＩＫＫ（ＩκＢリン酸化酵素）抑制剤。
7. 塩がメシル酸塩である請求項６に記載のＩＫＫ（ＩκＢリン酸化酵素）抑制剤。
8. 請求項１乃至７のいずれか１項に記載の薬剤と、他の抗腫瘍剤を組み合わせてなる医薬。
9. 他の抗腫瘍剤がアルキル化剤、抗代謝薬、抗生物質、植物アルカロイド、白金錯体誘導体およびホルモンからなる群から選ばれる１以上の抗腫瘍剤である請求項８に記載の医薬。
10. 他の抗腫瘍剤がゲムシタビン塩酸塩、ナイトロゲン・マスタード・Ｎ−オキサイド、シクロホスファミド、メルファラン、カルボクオン、ブスルファン、ニマスチン塩酸塩、ラニマスチン、ダカルバジン、フルオロウラシル、テガフル、サイタラビン、アンサイタビン塩酸塩、ブロキシウリジン、ドキシフルウリジン、メルカプトプリン、チオイノシン、メトトレキサート、マイトマイシン、ブレオマイシン、ダウノルビシン塩酸塩、ドキソルビシン塩酸塩、ピラルビシン塩酸塩、アクラルビシン塩酸塩、ネオカルジノスタチン、アクチノマイシンＤ、ヴィンクリスチン硫酸塩、ヴィンデシン硫酸塩、ヴィンブラスチン硫酸塩、エトポサイド、タモキシフェンクエン酸塩、プロカルバジン塩酸塩、マイトブロニトール、マイトキサントン塩酸塩、カルボプラチンおよびシスプラチンからなる群から選ばれる１以上の抗腫瘍剤である請求項８または９に記載の医薬。
11. 癌患者又は腫瘍患者に対して、請求項１に記載の抗腫瘍剤又は癌転移若しくは癌浸潤の抑制剤を投与することを特徴とする癌又は腫瘍の治療又は予防方法。
12. 癌患者又は腫瘍患者に対して、請求項１に記載の抗腫瘍剤又は癌転移若しくは癌浸潤の抑制剤と他の抗腫瘍剤を同時に投与するか、または時期をずらして投与することを特徴とする請求項１１に記載の癌又は腫瘍の治療又は予防方法。