ES2865477T3 - Composiciones y métodos para la prevención y/o tratamiento de la deficiencia de vitamina B12 - Google Patents

Abstract

Una composición que comprendeEubacterium halliiy/oIntestinimonas butyriciproducensy un portador fisiológicamente aceptable para su uso en el tratamiento y/o la prevención dedeficiencia de vitamina B12en un sujeto.

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones y métodos para la prevención y/o tratamiento de la deficiencia de vitamina B12.

Campo del a invención

La presente invención se refiere a los campos de la producción de vitamina B12 y a la prevención y/o al tratamiento de la deficiencia de la vitaminaB12, microbiota intestinal, barrera de la mucosa intestinal y composiciones farmacéuticas, alimentarias o de piensos, o composiciones probióticas que incluyen a las bacterias Eubacterium hallii(E. hallii)y/o Intestinimonas butyriciproducens(I. butyriciproducens)que producen la pseudovitamina B12 y, opcionalmente, una o más bacterias que producen propionato y/o que degradan la mucina, tales como Akkermansia muciniphila(A. muciniphila). Se proporcionan asimismo métodos y usos de las bacterias E. halliiy/oI. butyriciproducensy composiciones que comprenden E. halliiy/o I. butyriproducens y, opcionalmente, bacterias que producen propionato y/o bacterias degradantes de mucina, tales como A. muciniphilapara: 1) prevenir y/o tratar la deficiencia de vitamina B12 en un sujeto 2) promover y/o aumentar la producción de la pseudovitamina B12 en el intestino de un sujeto y/o 3) para promover y/o aumentar la producción de propionato en el intestino de un sujeto.

Antecedentes de la invención

Los corrinoides son moléculas que contienen cobalto y funcionan como cofactores enzimáticos en una amplia variedad de organismos. Los corrinoides específicos se identifican por la estructura de sus ligandos axiales. El ligando axial inferior de un corrinoide puede ser un benzimidazol, una purina o un compuesto fenólico. El cofactor B12 que más comúnmente se encuentra en los animales y en muchas bacterias contiene 5,6-dimetilbencimidazol (DMB) como ligando axial. Este cofactor B12 particular se conoce comúnmente como vitamina B12.

Solo los procariotas tienen las enzimas necesarias para la síntesis de los corrinoides. Ni los hongos, ni las plantas, ni los animales (inclusive los seres humanos) son capaces de producir corrinoides tales como la vitamina B12. Los animales y los seres humanos dependen de alimentos naturalmente ricos en corrinoides como la vitamina B12 (por ejemplo, los huevos, el pescado, la carne de res y otros) o de productos fortificados con corrinoides tales como la vitamina B12 o los suplementos de vitamina B12 como fuentes devitamina B12. Asimismo, la microbiota intestinal puede proporcionar corrinoides tales como la vitamina B12 a animales y seres humanos. La vitamina B12 puede producirse en forma industrial solamente mediante una síntesis de fermentación bacteriana.

La vitamina B12, también conocida como cobalamina, es una vitamina soluble en agua que se sabe que desempeña un papel en la síntesis del DNA, la hematopoyesis óptima y el desarrollo adecuado del cerebro y las funciones neurológicas. La vitamina B12 normalmente participa en el metabolismo de cada célula del cuerpo humano, e influye especialmente en la síntesis y la regulación del ADN y también en el metabolismo de los ácidos grasos y el metabolismo de los aminoácidos.

Se conocen cofactores de B12 con ligandos axiales distintos de DMB, siendo el ejemplo más común la pseudovitamina B12, en la que la adenina unida a N7 reemplaza al DMB como ligando axial.

Se han descripto más de una docena de reacciones enzimáticas en bacterias humanas e intestinales que utilizan la vitamina B12 como cofactor. Mientras que en los seres humanos estas incluyen reacciones catalizadas por metilmalonil-CoA mutasa y metionina sintasa dependiente de B12, en las bacterias intestinales hay presente un conjunto adicional de enzimas dependientes de la vitamina B12 (Degnan et al 2014. Cell Metab. 20(5):769-778). No todas las bacterias intestinales producen vitamina B12. Por lo tanto, algunas bacterias intestinales dependen de las bacterias intestinales que sí producenvitamina B12 para que les suministren vitamina B12. Por lo tanto, la disponibilidad de vitamina B12 también tiene un efecto sobre las bacterias intestinales y contribuye a la estructura y función de las comunidades microbianas intestinales. Dado que la vitamina B12 puede ser limitante para los seres humanos, se deduce que también existen limitaciones a la vitamina B12 en el tracto intestinal. La vitamina B12 es necesaria para toda la gama de conversiones microbianas en el tracto intestinal.

Entre estas conversiones se encuentra la producción de propionato a través de la metilmaninil-CoA mutasa dependiente de la vitamina B12. El propionato y el butirato se encuentran entre los ácidos grasos de cadena corta (AGCC) producidos en el tracto intestinal por la fermentación de componentes de la dieta o del huésped. Estos AGCC tienen diferentes funciones en el cuerpo humano, en el que el butirato alimenta principalmente a los colonocitos, el butirato se metaboliza principalmente en el hígado (Guarner and Malagelada, 2003. The Lancet 361: 512-519). Además, los AGCC tienen efectos sobre la morfología y la función del colon tales como disminuir el pH, aumentar la proliferación celular y el volumen de la materia fecal y modificar la composición microbiana. Los AGCC también controlan el peso corporal y la sensibilidad a la insulina (Canfora et al., 2015. Nature Reviews Endocrinology 11:577-591). Más aun, se ha comprobado que las AGCC envían señales al huésped a través de receptores acoplados a las proteínas G (GPR41 y GPR43) que han demostrado que afectan al sistema inmunológico en ratones, entre otros, a través de células T reguladoras (Brown et al., 2003. J Biol Chem 278:11312-11319; Le Poul et al., 2003. J Biol Chem 278:25481-25489; Smith et al 2013. Science 341(6145):569-573). Finalmente, las AGCC también envían señales a los circuitos neuronales a través del receptor FFAR2 (Erny et al 2015. Nat Neurosci 18(7):965-977). El propionato es un sustrato de la gluconeogénesis hepática y tiene efectos inhibidores sobre la síntesis de lípidos y colesterol y efectos protectores sobre la inflamación y la carcinogénesis (Hosseini et al., 2011. Nutrition Reviews 69:245-258). Las intervenciones en la dieta en seres humanos han demostrado que el propionato también aumenta la saciedad y regula el apetito, lo que produce el mantenimiento del peso en adultos con sobrepeso (Chambers et al 2015. Gut 64(11): 1744-1754).

La cantidad recomendada diaria (recommended dayly ammount - RDA) devitamina B12 varía según la edad, el sexo y el estado de embarazo. Por ejemplo, la RDA devitamina B12 para los adultos es aproximadamente 2.4 microgramos por día, tanto para hombres como para mujeres. Sin embargo, la RDA de vitamina B12 no siempre se alcanza debido a la ingesta insuficiente de vitamina B12 en la dieta u otras condiciones que conducen a niveles bajos o insuficientes de B12. Por lo general, se observa una ingesta insuficiente o limitada de vitamina B12 en sujetos con patrones dietéticos específicos, como los vegetarianos y veganos, o como resultado de enfermedades o afecciones de la salud que incluyen anemia perniciosa, gastritis atrófica, inflamación crónica del páncreas, procedimientos quirúrgicos en los que se elimina parte del estómago y/o del intestino (incluyendo cirugías para perder peso), afecciones del intestino delgado (por ejemplo la enfermedad de Crohn, la enfermedad celíaca, el crecimiento bacteriano o de parásitos y similares), el consumo excesivo de alcohol, trastornos del sistema inmunológico, (por ejemplo, la enfermedad de Graves o lupus), el uso prolongado de fármacos para la reducción de la acidez, desnutrición, trastornos alimentarios (por ejemplo, bulimia o anorexia nerviosa), y otros. Otras enfermedades o trastornos que conducen a niveles bajos o insuficientes devitamina B12 incluyen HIV/SIDA, tratamientos con metformina para pacientes con diabetes de tipo 2, obesidad o índice de masa corporal (IMC), estado de pre-diabetes u obesidad acompañada de estado prediabético o resistencia a la insulina, trastornos genéticos como la deficiencia hereditaria de transcobalamina I y/o II, y muchos otros.

Un sujeto con niveles bajos o insuficientes de vitamina B12, ya sea debido a deficiencias en la dieta o por un estado de enfermedad como se mencionó antes, puede estar en riesgo de desarrollar una deficiencia de vitamina B12. Según el grado de gravedad, la duración de la privación o limitación de vitamina B12 y la etapa de la vida que se transcurra (niñez, edad adulta o vejez), la deficiencia de vitamina B12 puede conducir a un abanico de enfermedades, desde enfermedades asintomáticas, hasta a manifestaciones hematológicas, neurológicas y psiquiátricas graves y el posible riesgo de daño neurológico irreversible no obstante se siga un tratamiento. Un sujeto que padece deficiencia de vitamina B12 puede presentar uno o más síntomas, tales como diarrea o estreñimiento, fatiga, falta de energía, mareo al ponerse de pie, pérdida de apetito, piel pálida, problemas de concentración, dificultad para respirar, principalmente durante el ejercicio, lengua roja hinchada o encías sangrantes, confusión o cambio en el estado mental (por ejemplo, demencia), depresión, pérdida del equilibrio, entumecimiento y hormigueo en manos y pies, y otros.

La deficiencia de vitamina B12 generalmente se diagnostica en un sujeto midiendo los niveles de vitamina B12 en la sangre. Normalmente, los niveles de vitamina B12 en la sangre por debajo de 120-180 picomol/L (170-250 pg/mL) en adultos son indicativos de deficiencia de vitamina B12. Niveles elevados de ácido metilmalónico en sangre (valores >0.4 micromol/L) también pueden indicar deficiencia de vitamina B12.

Los tratamientos para remediar o aliviar las afecciones relacionadas con la deficiencia de vitamina B12en un sujetoincluyen la ingesta de suplementos de vitamina B12 o inyecciones devitamina B12 y/o cambios en la dieta (es decir, la introducción de alimentos ricos en vitamina B12). Una de las limitaciones de la suplementación con vitamina B12 es que la eficacia de dicho tratamiento puede ser limitada o insatisfactoria en sujetos con capacidad comprometida para absorber la vitamina B12 a través del tracto gastrointestinal, como ser los sujetos tratados con metformina u otros fármacos que causan malabsorción de vitamina B12 o niveles bajos de vitamina B12 en la sangre.

Por lo tanto, existe la necesidad de composiciones o métodos para prevenir, tratar o aliviar y/o mejorar la deficiencia de vitamina B12en un sujeto.

Resumen de la invención

La presente invenciónse refiere a una composición que comprendeEubacterium halliiy/oIntestinimonas butyriciproducensy un portador fisiológicamente aceptable para su uso en el tratamiento y/o la prevención dela deficiencia de vitamina B12en un sujeto.

En una realización, la deficiencia de vitamina B12en dicho sujeto deriva o es causada por tratamiento con metformina para enfermedades tales como diabetes de tipo 2, anemia perniciosa, gastritis atrófica, inflamación crónica del páncreas, procedimiento quirúrgico donde se extirpa parte del estómago y/o intestino delado, pérdida de peso quirúrgica (bariátrica),enfermedad inflamatoria del intestino, como la enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa y similares, enfermedad celíaca, crecimiento bacteriano, consumo excesivo de alcohol, enfermedad de Graves, lupus, uso prolongado de fármacos reductores del ácido, desnutrición, bulimia y anorexia nerviosa, HIV/SIDA, obesidad, índice de masa corporal alto, estado de prediabetes, resistencia a la insulina o una dieta vegetariana o vegana.

La composición para el uso que aquí se enseña puede además comprender una bacteria productora de propionato, como la Akkermansia muciniphila.

Puede ser una composición farmacéutica o un suplemento, por ejemplo, en forma seleccionada el grupo de cápsula, tableta o polvo.

Dichas E. halliiy/o I. butyriciproducensy, opcionalmente, dicha bacteria productora de propionato, pueden presentarse en forma liofilizada o microencapsulada.

Dichas E. halliiy/o I. butyriciproducenspueden presentarse en cantidades que van desde aproximadamente 104hasta aproximadamente 1015 células. Adicionalmente, dichas bacterias que producen propionato como la A. muciniphilapueden presentarse en una cantidad que va desde aproximadamente 104hasta aproximadamente 1015células.

La composición que se enseña en el presente puede además comprender a agente aglutinante de las mucosas. La composición que se enseña en el presente puede además comprenderiones de cobalto, por ejemplo, en forma de sal de cobalto como cloruro de cobalto, sulfato de cobalto, acetato de cobalto o nitrato de cobalto. La invención también se refiere al uso de una composición que comprendeE. halliiy/oI. butyriciproducens y un portador fisiológicamente aceptable para aumentar la producción de pseudovitamina B12 en el intestino de un sujeto y/o para aumentar la producción de propionato en el intestino de un sujeto.

Es posible que el sujeto sufra de deficiencia de vitamina B12 y dicha deficienciaen dicho sujeto puede derivar o estar causada por un tratamiento de metformina para diabetes de tipo 2 anemia perniciosa, gastritis atrófica, inflamación crónica del páncreas, procedimiento quirúrgico en el que se extrae parte del estómago y/o del intestino delgado, cirugía de pérdida de peso, enfermedad inflamatoria intestinal, tales como enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa y similares, enfermedad celíaca, crecimiento bacteriano, consumo excesivo de alcohol, enfermedad de Graves, lupus, uso prolongado de medicamentos reductores de ácido, desnutrición, bulimia , y anorexia nerviosa, VIH / SIDA, obesidad, índice de masa corporal alto, estado de prediabetes, resistencia a la insulina o una dieta vegetariana o vegana.

La invención está además dirigida a E. hallii y/o I. butyriciproducenspara su uso en el tratamiento y/o la prevención de la deficiencia de vitamina B12enun sujeto. El sujeto puede sufrir dedeficiencia de vitamina B12. La deficiencia de vitamina B12en dicho sujeto puede derivar o ser causada por un tratamiento con metformina para enfermedades tales como diabetes de tipo 2, anemia perniciosa, gastritis atrófica, inflamación crónica del páncreas, procedimiento quirúrgico en el que se extrae parte del estómago y/o del intestino delgado, cirugía de pérdida de peso, enfermedad inflamatoria intestinal, tal comoenfermedad de Crohn, colitis ulcerosa y similares, enfermedad celíaca, crecimiento bacteriano, consumo excesivo de alcohol, enfermedad de Graves, lupus, uso prolongado de medicamentos reductores de ácido, desnutrición, bulimia, y anorexia nerviosa, VIH / SIDA, obesidad, índice de masa corporal alto, estado de prediabetes, resistencia a la insulina o una dieta vegetariana o vegana.

Asimismo, la invención proporciona E. halliiy/o butyriciproducenspara aumentar la producción de pseudovitamina B12 en el intestino de un sujeto, y/opara aumentarla producción de propionato en el intestino de un sujeto. El sujeto puede sufrir dedeficiencia de vitamina B12. La deficiencia de vitamina B12en dicho sujeto puede derivar o ser causada por un tratamiento con metformina para diabetes de tipo 2, anemia perniciosa, gastritis atrófica, inflamación crónica del páncreas, procedimiento quirúrgico en el que se extrae parte del estómago y/o del intestino delgado, cirugía de pérdida de peso, enfermedad inflamatoria intestinal, tales como enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa y similares, enfermedad celíaca, crecimiento bacteriano, consumo excesivo de alcohol, enfermedad de Graves, lupus, uso prolongado de medicamentos reductores de ácido, desnutrición, bulimia , y anorexia nerviosa, VIH / SIDA, obesidad, índice de masa corporal alto, estado de prediabetes, resistencia a la insulina o una dieta vegetariana o vegana.

Definiciones

El término 'sintrófico' o 'sintrofia' como se usa en este documento, se refiereal fenómeno de que una especie vive de los productos de otra especie. En esta asociación, el crecimiento de uno de los miembros mejora o depende de los nutrientes, los factores o los sustratos proporcionados por el otro miembro. Este término para referirse a la interdependencia nutricional a menudo se usa en microbiología para describir esta relación simbiótica entre algunas especies bacterianas.

El término'Akkermansia muciniphila’ o 'A. muciniphila’como se usa en este documento, se refierea las bacterias anaeróbicas degradantes de la mucina identificadas por primera vez por Derrien (Derrien et al, International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2004, 54: 1469-1476). Las células son ovaladas, sin movilidad y con la tinción de Gram se tiñen gramnegativas. A. muciniphilatambién se conocen como Akkermansia spp.o bacterias similares a las Akkermansia. Pertenece al grupo de las Chlamydiae/Verrucomicrobia; filo-Verrucomicrobia. Si la taxonomía cambiara, la persona versada en la materia sabría como adaptar los cambios en la taxonomía para deducir las cepas que podrían usarse en la presente invención. Además, el genoma completo deA. muciniphila han sido determinado por van Passel et al, PLoS One 6, 2011: el6876. En general, se acepta que las cepas con una similitud de genoma de aproximadamente el 70% pueden considerarse como de la misma especie.

El término 'bacterias mucolíticas' o 'especies de bacterias asociadas a la mucosa intestinal' o 'bacterias que degradan la mucosidad' como se usa en este documento, se refiere bacterias que se asocian o se encuentran en las proximidades de las barreras de la mucosa intestinal. Las 'especies bacterianas asociadas a las mucosas intestinales' además se caracterizan por que son capaces de degradar la mucosidad. Ejemplos no limitantes de 'especies bacterianas asociadas a las mucosas intestinales' incluyen a lasA. muciniphila(ATTC BAA-835), Faecalibacterium prausnitzii(A2-165), Lactobacillus rhamnosus(ATCC 53103) yBifidobacterium breve (DSM-20213).

El término 'corrinoides' como se usa en este documento, se refiere auna clase de compuestos químicamente relacionados que contienen el elemento bioquímicamente raro cobalto colocado en el centro de unanillo tetrapirrol plano llamado “anillo Corrin”. La biosíntesis de la estructura básica de la vitaminase logra solo mediante bacterias y arqueas (que generalmente producen la forma hidroxocobalamina), pero en el cuerpo humano puede lograrse la conversión entre diferentes formas de vitaminas.

El término 'vitamina B12' o 'vitamersB12' generalmentese refiere a una clase de compuestos químicamente relacionados, todos los cuales muestran actividad biológica. La vitamina B12 a menudo se denomina 'cobalamina'. El término 'cobalamina' como se lo usa en este documento, generalmente se refiere a todas las formas de la vitamina B12. Específicamente, las cobalaminas consisten en un grupo de compuestos de vitamer que contienen cobalto e incluyen cianocobalamina, hidroxocobalamina (esta forma no ocurre en la naturaleza y se produce a partir de la hidroxocobalamina bacteriana), y finalmente, las dos formas de cofactor de B12 que ocurren naturalmente en el cuerpo humano, que incluyen 5'-deoxiadenosilcobalaminay metilcobalamina.

El término 'pseudovitamina B12' como se usa en este documento, se refiere aCoa-[a-(7-adenl)]-Copcianocobamida. Esta molécula se diferencia de la cobalamina en el ligando a, donde tiene adenina en lugar de 5,6-dimetilbencimidazol unida en un enlace a-glicosídico al C-1 de la ribosa.

El término 'deficiencia de vitamina B12', también conocida como 'hipocobalaminemia', como se usa en este documento, se refiereniveles insuficientes o bajos en sangre de vitamina B12, por ejemplo, niveles devitamina B12 por debajo de 120-180 picomol/L (170-250 pg/mL) en adultos. La deficiencia de vitamina B12en un sujetonormalmente deriva o se produce como resultado del tratamiento con metformina para diabetes tipo 2, anemia perniciosa, gastritis atrófica, inflamación crónica del páncreas, procedimientos quirúrgicos de extirpación de parte del estómago y/o del intestino delgado, cirugía para perder peso, enfermedad de Crohn, enfermedad celíaca, crecimiento bacteriano, consumo excesivo de alcohol, enfermedad de Graves, lupus, uso prolongado de medicamentos reductores de ácido, desnutrición, bulimia, y anorexia nerviosa, VIH/SIDA, obesidad, índice de masa corporal alto, estado de prediabetes, resistencia a la insulina o una dieta vegetariana o veganay otras enfermedades.

Un sujeto que sufre de deficiencia de vitamina B12 puede mostrar uno o más síntomas tales como diarrea o estreñimiento, fatiga, falta de energía, mareo al ponerse de pie, pérdida de apetito, piel pálida, problemas para concentrarse, dificultad para respirar (principalmente durante el ejercicio), lengua roja e hinchada o encías sangrantes, niveles bajos de glóbulos rojos, función cardíaca reducida, daño nervioso, confusión o cambio en el estado mental (p. ej., demencia), irritabilidad, depresión, psicosis, pérdida del equilibrio, función muscular deficiente, entumecimiento y hormigueo en manos y pies, arruga el sabor, disminución de la fertilidad y otros. En los niños pequeños, los síntomas incluyen crecimiento deficiente, desarrollo deficiente y dificultades con el movimiento. Sin tratamiento temprano, algunos de los cambios pueden ser permanentes.

El término 'metformina' como se usa en este documento, se refiere aun medicamento para el tratamiento de la diabetes de tipo 2. El uso de metformina se ha asociado con una mayor incidencia de la deficiencia de vitamina B12y niveles reducidos de vitamina B12 en suero en sujetos con diabetes de tipo 2 tratados con dicho fármaco. Se cree que la metformina afecta el sistema de absorción gastrointestinal y, por lo tanto, produce la mala absorción de la vitamina B12 en el sujeto tratado con dicho fármaco.

El término 'barrera de la mucosa intestinal' como se enseña aquí, se refiere a la barrera de la mucosa natural que actúa como una barrera selectiva que permite la absorción de nutrientes, electrolitos y agua y previene la exposición a macromoléculas perjudiciales, microorganismos, antígenos, dietéticos y microbianos (por ejemplo, alimentos alergénicos). La barrera de la mucosa intestinal se compone esencialmente de una capa de mucosa y una capa subyacente de células epiteliales (denominadas en el presente documento “células epiteliales intestinales”). Las células epiteliales intestinales están estrechamente unidas entre sí por medio de las llamadas “uniones estrechas”, que son básicamente “uniones físicas” entre las membranas de dos células epiteliales intestinales. El mantenimiento de la barrera de la mucosa intestinal, en particular, el mantenimiento de la integridad física de la capa de células epiteliales intestinales (es decir, mantener firmes las uniones entre las células) es crucial para la protección del huésped contra la migración de microorganismos patógenos, antígenos y otros agentes indeseables del intestino al torrente sanguíneo.

La barrera de la mucosa intestinalestá también colonizada por aproximadamente 1012 -1014microorganismos comensales, principalmente bacterias anaeróbicas o microaerófilas, la mayor parte de las cuales viven en simbiosis con su huésped. Estas bacteriasson beneficiosas para su huésped de muchas maneras. Proporcionan protección contra las bacterias patógenas y cumplen una función nutricional en su huésped al sintetizar la vitamina K y algunos de los componentes del complejo de la vitamina B. Además, la barrera de la mucosa intestinalha desarrollado un complejo “sistema de inmunidad de la mucosa intestinal” para distinguir entre bacterias comensales (es decir, bacterias beneficiosas) y bacterias patógenas y otros agentes perjudiciales. El sistema inmunológico de la mucosa intestinal es parte integral dela barrera de la mucosa intestinal, y comprende and tejidos linfoides y células inmunitarias especializadas (es decir, linfocitos y células plasmáticas) que se encuentran dispersas ampliamente por toda la barrera de la mucosa intestinal. Uno de los microorganismos que naturalmente coloniza la mucosa en los sujetos saludables es la A. muciniphila que degrada la mucina y que ha demostrado aumentar la función de barrera intestinal (Everard et al., PNAS 110 (2013) 9066-71; Reunanen et al., Appl Environ Microbiol March 202015).

El término 'probióticos' o 'productos probióticos' como se usa en este documento, se refiere a microorganismos tales como bacterias intestinales, que, cuando son administradas o ingeridas en cantidades efectivas, confieren beneficios para la salud del huésped (por ej., seres humanos o mamíferos). Preferiblemente, los probióticos deberían estar vivos o ser viables cuando son administrados a un sujeto, a fin de permitir que los probióticos colonicen el intestino grueso del huésped. Sin embargo, en determinadas condiciones, los probióticos también pueden estar muertos al momento de ser administrados, siempre que las sustancias producidas por los probióticos sigan aun ejerciendo efectos probióticos beneficiosos sobre el huésped. La mayoría de los probióticos o productos probióticos se componen de bacterias del ácido láctico como las Lactobacillio las Bifidobacteria.Los expertos en la materia conocen bien el campo de los probióticos y saben cómo seleccionar bacterias de ácido láctico dotadas de actividad probiótica.

El término 'prebióticos' o los 'productos prebióticos' como se usan en este documento se refiere generalmente a compuestos que promueven el crecimiento y/o la actividad de microorganismos GI que contribuyen al bienestar de su huésped. Los prebióticos o productos prebióticos consisten principalmente de fibras fermentables o carbohidratos no digeribles. La fermentación de estas fibras por parte de los probióticos promueve la producción de productos finales beneficiosos, tales como los AGCC, en particular, los butiratos. El experto en la materia conoce bien el campo de los prebióticosy sabe cómo seleccionar los ingredientes dotados de actividad prebiótica.

El término 'simbióticos o 'productos simbióticos' como se usa en este documento en general se refiere a las composiciones y/o suplementos nutricionales que combinan probióticos con uno o más compuestos que promueven el crecimiento y/o la actividad de microorganismos GI, tales como los prebióticos, en un solo producto. Los simbióticos influyen beneficiosamente en el huésped mejorando la supervivencia y la colonización de los probióticos en el tracto, estimulando selectivamente el crecimiento y/o activando el metabolismo de los probióticos, mejorando de esa manera el bienestar del huésped. El experto en la materia conoce bien los simbióticos y sabe cómo seleccionar los ingredientes que pueden combinarse en un simbiótico.

El término 'especies de bacterias intestinales beneficiosas,' como se usa en este documento, se refiere auna especie de bacteria que habita (es decir, que es innata) en el intestino de los mamíferos (por ejemplo, en los seres humanos) y que ejerce efecto(s) beneficioso(s) tales como la protección contra especies bacterianas patógenas, la producción del ácido butírico y/o butirato y derivados, etc., en la salud GI, metabólica y otros aspectos de la salud de los mamíferos en los que reside.

Los ejemplos no limitantes de especies bacterianas intestinales beneficiosas incluyen bacterias del ácido láctico del géneroLactobacillusyBifidobacterium.Otros ejemplos no limitantes de especies bacterianas intestinales beneficiosas incluyen especies bacterianas productoras de butirato, que usan acetil-CoA para producir ácido butírico y/o butirato y sus derivados, como las cepas bacterianas descritas enlas patentes US2014/0242654, WO 2014/150094 o WO2013032328 A1.

El término“cantidad efectiva”o “cantidad eficaz”, como se usa en este documento, se refiere auna cantidad necesaria para lograr un efecto según se enseña en el presente. Por ejemplo, una cantidad efectiva de lacepa bacteriana intestinal o una cepa derivada de la misma como se enseña en el presente documento, es decir E. halliiy/ol. butyriciproducens, y, opcionalmente A. muciniphilaes una cantidad que es efectiva para tratar, prevenir y aliviar la deficiencia de vitamina B12en un sujeto. La cantidad efectiva puede ser fácilmente determinada sin experimentación indebida por parte del experto en la materia. Por ejemplo, el experto en la materia puede determinar si la cantidad deE. hallii y/oI. butyriciproducens,y, opcionalmente, A. muciniphilaes efectivo para tratar, prevenir y/o aliviar la deficiencia de vitamina B12en un sujetomidiendo los niveles devitamina B12 en la sangre y determinar si los niveles en sangre de vitamina B12 han regresado a los niveles normales (aproximadamente 137-546 picomol/L como se analizó en Doets et al. et al. 2013. Ann Nutr Metab 62:311-322).

El término 'portador fisiológicamente aceptable', o 'portador alimentario aceptable', o 'portador nutricionalmente aceptable', o 'portador farmacéuticamente aceptable' como se usa en este documento, se refiere aun material portador fisiológicamente, alimentariamente, nutricionalmente o farmacéuticamente aceptable, tal como un material diluyente, excipiente, disolvente o encapsulante, líquido o sólido, implicado en proporcionar una forma de administración del polipéptido o la célula huésped de la invención.Cada portador debe ser “aceptable” en el sentido de ser compatible con los otros ingredientes de la composición y no dañino para el sujeto, es decir, que sean aptos para el consumo o nutricionalmente aceptables. El término 'apto para el consumo” o “nutricionalmente aceptable” se refiere a ingredientes o sustancias que generalmente son consideradas seguras para el consumo de los seres humanos y otros mamíferos.Ejemplos no limitativosde materiales que pueden servir como portadores fisiológicamente aceptables o nutricionalmente incluyen: (1) azúcares, como lactosa, glucosa y sacarosa; (2) almidones, tales como almidón de maíz y almidón de patata; (3) celulosa y sus derivados, tales como carboximetilcelulosa de sodio, etilcelulosa y acetato de celulosa; (4) tragacanto en polvo; (5) malta; (6) gelatina; (7) talco; (8) excipientes, tales como manteca de cacao y ceras para supositorios; (9) aceites, como aceite de cacahuete, aceite de semilla de algodón, aceite de flor de zafiro, aceite de sésamo, aceite de oliva, aceite de maíz y aceite de soja; (10) glicoles, tales como propilenglicol; (11) polioles, tales como glicerina, sorbitol, manitol y polietilenglicol; (12) ésteres, tales como oleato de etilo y laurato de etilo; (13) agar; (14) agentes tamponadores, tales como hidróxido de magnesio e hidróxido de aluminio; (15) ácido algínico; (16) agua libre de pirógenos; (17) solución salina isotónica; (18) la solución de Ringer; (19) alcohol etílico; (20) soluciones tampón de fosfato; (21) otras sustancias compatibles no tóxicas empleadas en formulaciones farmacéuticas y similares. Además, los términos 'nutricionalmente aceptable' y 'farmacéuticamente aceptable' como se usa en el presente se refieren a aquellas composiciones o combinaciones de agentes, materiales o composiciones y/o sus formas de dosificación, que están dentro del rango de alcance del juicio médico sensato, para ser usados en contacto con tejidos de seres humanos y animales sin producir toxicidad, irritación, respuesta alérgica excesiva u otros problemas o complicaciones, proporcionales a una relación riesgo/beneficio razonable.

El término 'apto para el consumo' o 'nutricionalmente aceptable' se refiere a ingredientes o sustancias que generalmente son consideradas seguras para el consumo humano (y de otros mamíferos).

El término 'aproximadamente', como se lo usa aquí, indica un rango de tolerancia normal en la técnica, por ejemplo, dentro de 2 desviaciones estándar de la media. El término 'aproximadamente' puede entenderse como que abarca valores que se desvían como máximo 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05%, o 0.01% del valor indicado.

Los términos 'comprende' o 'que comprende' y sus conjugaciones, como se lo usa en el presente documento, se refieren a una situación en la que estos términos se usan en su sentido no limitativo y expresan que ítems que siguen a la palabra están incluidos, pero que ítems que no están específicamente mencionados no están excluidos. También abarcan las expresiones más limitativas “consiste esencialmente en” y “consta de”.

La referencia a un elemento mediante el artículo “un” o “una” no excluye la posibilidad de la presencia de más de un elemento, a menos que el contexto claramente requiera que haya uno y solo uno de dichos elementos. El artículo indefinido “un” o “una” por lo tanto, generalmente significa “al menos uno”.

Los términos“aumentar” y “mayor nivel de” y los términos“disminuir” y “nivel menor de” se refieren a la capacidad de aumentar o disminuir significativamente o estar a un nivel significativamente mayor o menor. En general, un nivel aumenta o disminuye cuando es al menos 5%, tal como 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50% o mayor o menor, respectivamente, que el nivel correspondiente en un ítem de control o referencia. Alternativamente, un nivel de una muestra puede aumentar o disminuir cuando ha crecido o decrecido significativamente desde el punto de vista estadístico en comparación con un nivel de un control o referencia. Descripción detallada de la invención

Estos inventores sorpresivamente descubrieron que una composición que comprendeE. halliiy/o I. butyriciproducensy un portador aceptable podrían usarse para tratar, prevenir o aliviar la deficiencia de vitamina B12en un sujetoal que se le administra una cantidad efectiva de dicha composición. Estos inventores descubrieron que E. hallii yl. butyriciproducenstienen la capacidad de producir pseudovitamina B12.

Sin atenerse a ninguna teoría, se cree que E. halliiyl. butyriciproducensproducen y secretan la pseudovitamina B12 in situ,es decir, en el intestino de un sujeto. La pseudovitamina B12 puede entonces ser inmediatamente absorbida por los enterocitos del huésped, en donde pueden ser directamente usados como un cofactor para las enzimas dependientes de la vitamina B12, o en donde pueden convertirse en formas diferentes de vitamina B12 para ser usadas como un cofactor en las enzimas dependientes de la vitamina B12.

Se ha demostrado que la pseudovitamina B12 puede actuar como un cofactor para las tres enzimas dependientes de vitamina B12 MetH, EutBC y PduCDE en Salmonella enterica(Anderson et al. 2008. J Bacteriol 190(4): 1160-1171). Se ha sugerido que la pseudovitamina B12 es el corrinoide natural producido por laSalmonella enterica(Taga and Walker. 2008. J Bacteriol 190(4): 1157-1159). Se ha demostrado que la pseudovitamina B12 es el corrinoide dominante producido por Clostridium cohlearium, Lactobacillus reuteri, Nostoc commune, Aphanizomenon flos-aquae,yAphanothece sacrum. Además, se ha demostrado que la pseudovitamina B12 producida por Lactobacillus reuteri,también una bacteria intestinal abundante en ratones, puede aliviardeficiencia de vitamina B12en estos animales (Santos et al 2007. FEBS Letters 581:4865-4870; Molina et al 2009. J Appl Microbiol 106:467-473).

En un primer aspecto,la presente invenciónse refiere a una composición que comprendeE. halliiy/oIbutyriciproducensy un portador fisiológicamente aceptable para su uso en el tratamiento y/o la prevención dedeficiencia de vitamina B12en un sujeto.

Elportador fisiológicamente aceptablepuede ser cualquier portador inerte. Ejemplos no limitativosde portadores fisiológica o farmacéuticamente aceptables adecuados incluyen cualquiera de los portadores, tampones, diluyentes y excipientes fisiológicos o farmacéuticos bien conocidos. Podrá apreciarse que la elección de un portador fisiológico adecuado dependerá del modo de administración deseado de la composición, según se enseña en el presente documento (por ejemplo, la vía oral) y la forma deseada de la composición (por ejemplo, en bebidas, yogur, polvo, cápsulas y similares). El experto en la materia conoce cómo seleccionar un portador fisiológicamente aceptable que sea adecuado o compatible con las composiciones para ser usadas según las enseñanzas del presente documento.

En una realización, la deficiencia de vitamina B12en dicho sujetoderiva o es causada al menos parcialmente por el tratamiento con metformina de diabetes tipo 2, anemia perniciosa, gastritis atrófica, inflamación crónica del páncreas, procedimientos quirúrgicos de remoción de parte del estómago y/odel intestino delgado, cirugía (bariátrica) para la pérdida de peso, enfermedades inflamatorias del intestinotales como enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa y similares, enfermedad celíaca, crecimiento bacteriano, consumo excesivo de alcohol, enfermedad de Graves, lupus, uso prolongado de medicamentos reductores de ácido, desnutrición, bulimia , y anorexia nerviosa, VIH / SIDA, obesidad, índice de masa corporal alto, estado de prediabetes, resistencia a la insulina o una dieta vegetariana o vegana.

En una realización, la composición para ser usada según se enseña en el presente documentopuede además comprenderbacterias productoras de propionato y/o degradantes de mucina, tales como, sin limitación,A. muciniphilao Lactobacillus reuteri.Se comprobó queE. halliiyA. muciniphilatienen un efecto beneficioso entre sí. Sin desear atenerse a la teoría, se cree que A. muciniphilaproporciona un sustrato adecuado para E. hallii,mientras que E. halliile aporta a A. muciniphilauna fuente de vitamina B12 para aumentar su crecimiento y el cambio de su perfil de metabolitos hacia la producción de propionato. Se espera que el mismo efecto beneficioso pueda lograrse entre E. halliiy cualquier otra bacteria productora de propionato, o entre I. butyriciproducens y cualquier bacteria productora de propionato, incluyendo aA. muciniphila.Pueden administrarse bacterias productoras de propionato y/o degradantes de mucinaen forma simultánea o secuencialmente a E. halliiy/oI. butyriciproducens.

En una realización, la composición para ser usada según se enseña en el presente documentocomprende además un compuesto de cobalto, por ejemplo, en forma de sal de cobalto, tal como un cloruro de cobalto, sulfato de cobalto, nitrato de cobalto, acetato de cobalto y similares. La presencia de cobalto suplementario puede asegurar la producción de anillo corrinoide suficiente como precursor para la pseudovitamina B12 producida por E. halliiy/oI. butyriciproducens.Alternativamente, dicho compuesto de cobalto puede administrarse a un sujeto que sufre o está en riesgo de sufrir de deficiencia de vitamina B12y enfermedades y condiciones asociadas como se enseña en el presente documento, en combinación con la composición que se enseña en el presente documento, en cuyo caso el compuesto de cobalto puede ser administrado al sujeto simultánea o secuencialmente.

En una realización, la composición para ser usada según se enseña en el presente documentopueden ser en forma de líquido, es decir, una suspensión estabilizada de£. halliiy/ol. butyriciproducens,y, opcionalmente, A. muciniphilasegún se enseña en este documento, o en forma sólida, por ejemplo, un polvo de células huéspedes liofilizadassegún se enseña en este documento. En el caso que E. halliiy/ol. butyriciproducens,y, opcionalmente, A. muciniphilaesténliofilizadas, se puede emplear un crioprotector tal como lactosa, trehalosa o glucógeno. Para la administración por vía oral, pueden administrarse E. halliiy/oI. butyriciproducens, y, opcionalmente, A. muciniphilaen formas de dosificación sólida, tales como cápsulas, tabletas y polvos, o en formas de dosificación líquida, tales como elíxires, jarabes y suspensiones. E. halliiy/oI. butyriciproducens, y, opcionalmente,A. muciniphilapueden encapsularse en cápsulas tales como cápsulas de gelatina, junto con ingredientes inactivos y vehículos en polvo, tales como p. glucosa, lactosa, sacarosa, manitol, almidón, celulosa o derivados de celulosa, estearato de magnesio, ácido esteárico, sacarina de sodio, talco, carbonato de magnesio y similares.

Preferiblemente, dichas E. halliiy/oI. butyriciproducensestán presentes en la composición que aquí se enseñaen forma sólida, liofilizada o seca, por ejemplo, en forma de polvo o granulada. Dichas E. halliiy/oI. butyriciproducenspuede, por ejemplo, estar presente enla composición que aquí se enseñaen forma microencapsulada. El experto en la materia es capaz de liofilizar o microencapsular E. halliiy/oI. butyriciproducensen base a técnicas bien conocida . Dado que E. halliiy/oI. butyriciproducensson bacterias anaeróbicas obligadas, durante la liofilización o la microencapsulación, pueden aplicarse condiciones libres de oxígeno para preservar la viabilidad de E. halliiy/oI. butyriciproducens.

La microencapsulación es bien conocida en la técnica de la preservación de las bacterias probióticas (por ejemplo, como ha sido analizado por Serna-Cock y Vallejo-Castillo, 2013. Afr J of Microbiol Res, 7(40): 4743­ 4753). Por ejemplo, en la presente invención, puede emplearse cualquiera de las técnicas de preservación y los sistemas de preservación descriptos por Serna-Cock y Vallejo-Castillo.

Los métodos de liofilización incluyen, sin limitación, congelación lenta y gradual a -40 ° C antes del secado, la congelación rápida colocándola a -80 ° C antes del secado, o la congelación ultrarrápida mediante goteo de células con crioprotector en nitrógeno líquido antes del secado.

A menudo se emplean crioprotectores para proteger las composiciones probióticas durante la liofilización y para mejorar su vida útil. Sin limitación, puede usarse un crioprotector seleccionado del grupo que incluye sacarosa, maltosa, maltodextrina, trehalosa, manitol, sorbitol, inulina, glicerol, DMSO, etilenglicol, propilenglicol, 2-metil-2,4-pentanodiol, polietilenglicol, polivinilpirrolidona, alcohol polivinílico, poliglicerol, leche desnatada se puede emplear polvo, proteína de leche, proteína de suero, leche UHT, betaína, adonitol, sacarosa, glucosa, lactosa o cualquier combinación de los mismos.

Se pueden añadir además prebióticostales como almidón y salvado de trigo antes de la liofilización para mejorar la eficacia de la composición de E. halliiy/oI. butyriciproducensenseñada en el presente documento. El agregado de antioxidantes como la riboflavina, el fosfato de riboflavina o una sal fisiológicamente aceptable del mismo, glutatión, ascorbato, glutatión y cisteína a la mezcla de liofilización puede mejorar aún más la viabilidad de la composición de E. halliiy/oI. butyriciproducensque aquí se enseña durante el almacenamiento, si fuera necesario. En una realización, la composición para ser usada según se enseña en el presente documentopuede ser un alimento o una composición de complemento alimenticio. Tal alimento o composición de complemento alimenticio puede incluir un producto lácteo, más preferiblemente un producto lácteo fermentado, preferiblemente un yogur o una bebida de yogur.

En una realización, la composición para ser usada según se enseña en el presente documentopuede ser una composición farmacéutica, por ejemplo, en una forma seleccionada del grupo de cápsula, comprimido y polvo. En una realización, E. halliiy/oI. butyriciproducenspueden estar presente en la composición según se enseña en este documentoen una cantidad que varía entre aproximadamente 104hasta aproximadamente 1015 células, preferentemente unidades formadoras de colonias (UFC). Por ejemplo, una cantidad eficaz de la célula huésped puede ser una cantidadde aproximadamente 105células o UFC a aproximadamente 1014células o UFC, preferiblemente aproximadamente 106células o UFC a aproximadamente 1013células o UFC, preferiblemente aproximadamente 107células o UFC a aproximadamente 1012células o UFC, more preferiblemente aproximadamente 108células o UFC a aproximadamente 1012células o UFC.

En una realización, A. muciniphila,si está presente, puede estar presente en la composición según se enseña en este documentoen una cantidad que varía desde aproximadamente 104hasta aproximadamente 1015células, preferiblemente unidades formadoras de colonias (UFC). Por ejemplo, una cantidad eficaz de la célula huésped puede ser una cantidad de aproximadamente 105células o UFC a aproximadamente 1014células o UFC, preferiblemente aproximadamente 106células o UFC a aproximadamente 1013células o UFC, preferiblemente aproximadamente 107células o UFC a aproximadamente 1012células o UFC, more preferiblemente aproximadamente 108células o UFC a aproximadamente 1012células o UFC.

En una realización, la composición para ser usada según se enseña en el presente documentopuede además comprenderunagente aglutinante a las mucosas.

El término 'agente aglutinante a las mucosas' o 'polipéptido de unión a la mucosa' como se usa en este documento, se refiere aun agente o un polipéptido que es capaz de adherirse a las superficies de la mucosa intestinal dela barrera de la mucosa intestinalde un mamífero (por ejemplo, un ser humano). Una variedad de los polipéptidos de unión a la mucosaya ha sido descripta en la técnica. Ejemplos no limitativosdepolipéptidos de unión a la mucosa incluyensubunidades de unión a la membrana de la toxina bacteriana que incluyen la subunidad B de la toxina de la cólera, la subunidad B de la enterotoxina termolábil de E. coli, las subunidades S2, S3, S4 y/o S5de la toxina Bordetella pertussis, el fragmento B de la toxina de la difteria y las subunidades de unión a membrana de la toxina Shiga o toxinas similares a Shiga. Otrospolipéptidos de unión a las mucosas adecuados incluyen proteínas de fimbrias bacterianas como las fimbrias de E. coliK88, K99, 987P, F41, FAIL, CFAIII ICES1, CS2 y/o CS3, CFAIIV ICS4, CS5 y/o CS6), fimbrias P o similares. Otrosejemplos no limitativosde fimbrias incluyen hemaglutinina filamentosa de Bordetella pertussis, pilus corregulador de la toxina de Vibrio cholerae (TCP), hemaglutinina sensible a la manosas (MSHA), hemaglutinina sensible a la fucosa (PSHA), y similares. Otros agentes de unión a las mucosas incluyen proteínas de unión viral que incluyen hemaglutininas del virus influenza y sendai y lectinas animales o moléculas similares a la lectinas incluyendo moléculas de inmunoglobulina o fragmentos de las mismas, lectinas calcio-dependientes (de tipo C), selectinas, colectinas o hemaglutinina helix pomatis, las lectinas vegetales con subunidades de unión a mucosa incluyen concanavalina A, aglutinina de germen de trigo, fitohemaglutinina, abrina, ricina y similares.

En una realización, las composiciones según se enseña en este documentopueden comprender uno o más ingredientes, que son adecuados para promover la supervivencia y/o la viabilidad y/o mantener la integridad deE. halliiy/ol. butyriciproducensy, opcionalmente,A. muciniphiladurante el almacenamiento y/o durante la exposición a la bilis, y/o durante el pasaje a través del tracto GI de un mamífero (por ej., un ser humano). Ejemplos no limitativos de dichos ingredientes incluyen un recubrimiento entérico y agentes de liberación controlada que permiten el paso a través del estómago. El experto en la materia sabe cómo seleccionar ingredientes adecuados para asegurar que el componente activo (es decir,E. halliiy/oI. butyriciproducens,y opcionalmenteA. muciniphila) llegue al destino deseado, en donde ejercerá su acción.

En una realización, las composiciones para ser utilizadas según se enseña en este documentopueden además comprenderingredientes seleccionados del grupo que consiste en prebióticos, probióticos, carbohidratos, polipéptidos, lípidos, vitaminas, minerales, agentes medicinales, agentes conservantes, antibióticos o cualquier combinación de los mismos.

En una realización, las composiciones para ser utilizadas según se enseña en este documentopueden además comprenderuno o más ingredientes, que mejoran aún más el valor nutricional y/o el valor terapéutico delas composiciones según se enseña en este documento. Por ejemplo, puede ser conveniente añadir uno o más ingredientes (por ej.,ingredientes nutricionales, ingredientes de uso veterinario o medicinal, etc.) seleccionados entre proteínas, aminoácidos, enzimas, sales minerales, vitaminas (por ej.,tiamina HCI, riboflavina, piridoxina HCI, niacina, inositol, cloruro de colina, pantotenato de calcio, biotina, ácido fólico, ácido ascórbico, vitamina B12, ácido p-aminobenzoico, vitamina A acetato, vitamina K, vitamina D, vitamina E, y similares), azúcares y carbohidratos complejos (por ej.,monosacáridos, disacáridos y polisacáridos solubles e insolubles en agua), compuestos medicinales (por ej.,antibióticos), antioxidantes, oligoelementos (por ej.,compuestos de cobalto, cobre, manganeso, hierro, zinc, estaño, níquel, cromo, molibdeno, yodo, cloro, silicio, vanadio, selenio, calcio, magnesio, sodio, potasio y similares). El experto en la materia está familiarizado con métodos e ingredientes que son adecuados para mejorar el valor nutricional, y/oterapéutico y/o medicinal de las composiciones según se enseña en este documento.

En otro aspecto, la presente invenciónse refiere a E. halliiy/oI. butyriciproducenspara su uso en el tratamiento y/o la prevención de la deficiencia de vitamina B12en un sujeto.

En una realización, E. halliiy/oI. butyriciproducenspara los usos según se enseña en este documentopuede ser particularmente indicado para un sujeto que sufre de deficiencia de vitamina B12, en donde la deficiencia de vitamina B12en dicho sujetoes causada por las condiciones mencionadas antes.

Métodos y usos

En otro aspecto, la presente invenciónse refiere al uso deuna composición que comprende E. halliiy/ol. butyriciproducensy unportador fisiológicamente aceptablepara aumentar la producción de pseudovitamina B12 en el intestino de un sujeto.

En una realización, la composición que comprendeE. halliiy/ol. butyriciproducensy un portador fisiológicamente aceptablepuede ser usadaen un métodopara aumentar la producción de pseudovitamina B12 en el intestino de un sujeto, dicho método comprendeel paso de administrar una cantidad eficaz de dicha composición a dicho sujeto.

En una realización, el sujeto puede ser un sujeto que sufre de deficiencia de vitamina B12, en el que la deficiencia de vitamina B12en dicho sujetoes causada por las condiciones antes mencionadas.

En otro aspecto, la presente invenciónse refiere al uso deuna composición que comprende E. halliiy/ol. butyriciproducensy un portador fisiológicamente aceptablepara aumentar la producción depropionatoen el intestino de un sujeto.

En una realización, la composición que comprendeE. halliiy/ol. butyriciproducensy un portador fisiológicamente aceptablepuede ser usadaen un métodopara aumentar la producción de propionatoen el intestino de un sujeto, dicho método comprendeel paso de administrar una cantidad eficaz de dicha composición a dicho sujeto.

En otro aspecto, la presente invenciónse refiere al uso deE. halliiy/ol. butyriciproducenspara aumentar la producción de pseudovitamina B12 en el intestino de un sujeto.

En una realización, E. halliiy/ol. butyriciproducenspuede ser usadaen un método para aumentar la producción de pseudovitamina B12 en el intestino de un sujeto, dicho método comprendeel paso de administrar una cantidad eficaz de dicha composición a dicho sujeto.

En una realización, E. halliiy/ol. butyriciproducenspuede ser usadaen un método para aumentar la producción de pseudovitamina B12 en el intestino de un sujetopuede ser particularmente indicada para un sujeto que sufre de deficiencia de vitamina B12, cuando la deficiencia de vitamina B12 deriva o es causada por cualquiera de las condiciones antes mencionadas.

En otro aspecto, la presente invenciónse refiere al uso deE. halliiy/ol. butyriciproducenspara aumentar la producción depropionatoen el intestino de un sujeto.

En una realización, E. halliiy/ol. butyriciproducenspuede ser usadaen un método para aumentar la producción depropionatoen el intestino de un sujeto, dicho método comprendeel paso de administrar una cantidad eficaz de dicha composición a dicho sujeto.

En otro aspecto aún, la presente invenciónse refiere a un método in vitropara producirpseudovitamina B12, dicho método comprendelos pasos de cultivar bacterias de las especies E. halliiy/ol. butyriciproducens en condiciones que permitan la producción de la pseudovitamina B12, y aislar la pseudovitamina B12 producida.

El experto en la materia conoce bien los métodos para aislar la pseudovitamina B12 producida.

La presente invenciónes además ilustrada, pero no limitada, por los siguientes ejemplos.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 muestra una medición demetabolitos de A. muciniphila en medio mucoso con y sin el añadido de vitaminas o devitamina B12.

Ejemplos

Ejemplo 1

Condiciones para el cultivo bacteriano

Akkermansia muciniphila

Se cultivó Akkermansia muciniphilaMucT (ATTC BAA-835) según se ha descripto antes (Derrien et al., 2004; Duncan et al., 2002). Las incubaciones se realizaron en botellas de suero selladas con tapones de caucho butílico a 37°C en condiciones anaeróbicas proporcionadas por una fase gaseosa de 182 kPa (1.5 atm) N2/CO2(proporción de 80/20). El crecimiento se midió mediante espectrofotómetro como densidad óptica a 600 nm (OD600).

E. hallii

Se cultivó anaeróbicamente Eubacterium hallii L2-7 a 37 °C en YCFA con algunos ajustes. La utilización de azúcar de mucina se realizó en medio mínimo con o sin el añadido de acetato 10 mM. En caso de que los experimentos se realizaran con azúcares simples derivados de mucina (manosa, fucosa, galactosa, N-acetilgalactosamina o N-aceitilglucosamina), estos se utilizaron en una concentración de 25 mM. Se observó el crecimiento durante 24 horas y se tomaron muestras regularmente para realizar análisis OD600 y HPLC.

Experimentos de co-cultivo

Se realizaron experimentos de co-cultivo en un medio mínimo suplementado con mucosidad (Derrien et al., 2004). Se establecieron las condiciones óptimas de co-cultivo como sigue. Se añadióA muciniphilaa un medio de mucina, seguido de 8 horas de incubación, para alcanzar concentraciones medibles de acetato y liberar azúcares. A continuación, se añadieron célulasde E. halliia las incubaciones que contenían A. muciniphila. Todas las célulashabían sido lavadas dos veces con PBS antes del añadido al co-cultivo para evitar el desbordamiento de productos del pre-cultivo. Durante el co-cultivo, se añadió 0.15% de mucina al medio cada 48 horas para mantener suficiente disponibilidad del sustrato para A. muciniphila.

Análisis de los productos de fermentación producidos por el co-cultivo bacteriano

Para el análisis de los productos de fermentación obtenidos del co-cultivo antes descripto se utilizó cromatografía líquida de alta resolución (High-performance liquid chromatography- HPLC) . Para el análisis del producto de fermentación se centrifugó 1 ml del cultivo bacteriano y el sobrenadante se almacenó a -20°C hasta realizar el análisis por HPLC. Se midieron la conversión del sustrato y la formación del producto con sistema de cromatografía líquida de alto rendimiento ((HPLC) Thermo Scientific Spectra equipado con una columna Varian Metacarb 67H 300 X6.5 mm mantenida a 45°C y funcionando con 0.005 mM de ácido sulfúrico como eluyente. El eluyente tenía un flujo de 0.8 ml/min se detectaron metabolitos mediante la determinación del índice de refracción.

Análisis de la Vitamina B12

Se usó espectrometría de masas por cromatografía líquida de ultra alta resolución (UHPLC-MS) para el análisis de vitamina B12. Brevemente, se mezclaron células de E. hallii (0,2 g) con 10 ml de tampón de extracción (hidróxido de sodio 8,3 mM y ácido acético 20,7 mM, pH 4,5) que contenía 100 pl de NaCN al 1%. La vitamina se extrajo en su forma ciano, sometiendo la mezcla a un baño de agua hirviendo durante 30 min. Después de enfriar, el extracto se recuperó por centrifugación (6900 g durante 10 min; Hermle, Wehingen, Alemania) y finalmente se purificó mediante cromatografía en columna de inmunoafinidad (Easy-Extract; R-Biopharma, Glasgow, Escocia). Se analizó el contenido de vitaminas del extracto reconstituido usando una columna HSS T3 C18 (2.1 x 100 mm; 1.8 pm) en un sistema de Waters Acquity UPLC (Milford, MA, EE. UU.) equipado con un detector de matriz de fotodiodos (PDA; 210-600 nm) e interconectado a un espectrómetro de masas de tiempo de vuelo cuadripolo de alta resolución (QTOF; Synapt G2- Si, aguas). El eluyente fue un flujo en gradiente (0,32 ml / min) de agua (disolvente A) y acetonitrilo (disolvente B), ambos acidificados con ácido fórmico al 0,1%: 0-0,5 min (95: 5); 5-5 min (60:40); 5-6 min (60:40) y 6-10 min (95: 5). La columna 22 se mantuvo a 30 ° C y la detección de UV se registró a 361 nm. El análisis de EM se realizó en modo de iones positivos con ionización por electropulverización, utilizando un rango de barrido establecido para m / z de 50-1500. Los iones parentales correspondientes al pico de vitamina se fragmentaron más (MS / MS) y luego se analizaron.

Resultados

Sintrofía dependiente de la Vitamina B12 entre E. hallii y A. muciniphila

En el co-cultivo de A. muciniphilaconE. hallii, la proporción entre succinato y propionato había cambiado en comparación con los monocultivos de A. muciniphila.Se sabe que la producción de propionatomediante metilmalonil-CoA sintasa depende del cofactor de vitamina B12. Por lo tanto, se probó el efecto de las vitaminas y la vitamina B12 en monocultivos de A. muciniphila.El añadido de una mezcla de vitaminas o solamente vitamina B12 en efecto, cambió el perfil de succinato a propionatodeA. muciniphilade la misma manera que lo hizo la presencia de E. halliien el co-cultivo (Figura 1). El análisis detallado por espectroscopía de masas mostró que E. halliies capaz de sintetizar un vitamer B12 en monocultivos. La estructura del vitamer parecía ser pseudovitamina B12 ya que el ligando inferior contenía adenina en lugar de 5,6-dimetilbencimidazol (DMB). Nose observó el efecto del añadido de DMB en la estructura del vitamer B12 producido (no se muestran esos datos). Tomada en conjunto, esto es una evidencia de una alimentación cruzada metabólica bidireccional entre A. muciniphilayE. hallii,en dondeA. muciniphila proporciona azúcares para apoyar el crecimiento de E. hallii, que a su vez proporciona A. muciniphiianiveles suficientes de vitamina B12 análogos a los usados como un cofactor para la conversión de succinato a propionatomediante metilmalonil- CoA sintasa. Tanto la vitamina B12 como la pseudovitamina B12 pueden ser usadas como cofactor por A. municiphiiay activar la metilmalonil-CoA sintasa. Por lo tanto, esta relación sintrófica parece co-evolucionar dentro del tracto intestinal, ya que el vitamer B12 producido por E. haiiiies en forma de pseudovitamina B12.

En el caso de E. haiiii,se observó una interacción metabólica y de un cofactor sintrófico, ya que produjo pseudovitamina B12 que influyó en el flujo de carbono dentro de A. muciniphiia,dando como resultadola producción de propionato. Se sabe a partir de estudios en seres humanos que el propionato administrado al colon tiene varios efectos beneficiosos, incluida la reducción del apetito (Chamberset al., 2015, supra).

El hecho de haber encontrado un perfil metabólico modificado para A. muciniphiiaen presencia de E. haiiiida testimonio de una interacción sintrófica mutualista. Los socios sintrópicos producen conjuntamente una mayor proporción de propionato a succinato, lo que es beneficioso para el metabolismo de la célula huésped. Además, se produce un cofactor B12, que puede ser usado por el huésped para prevenir y/o tratar la deficiencia de vitamina B12.

Muchos trastornos gastrointestinales han sido asociados al daño de la mucosa y a una menor función de la barrera del intestino grueso. El hecho de que las bacterias del intestino puedan tener un impacto en ambos factores, ya sea directamente o mediante la estimulación inmunológica y metabólica específica, enfatiza aún más la importancia de tener las bacterias adecuadas en el lugar correcto. La pérdida de la integridad de la mucosa y del mucobioma asociado podría ser un indicador de estados patológicos y su desarrollo.A. muciniphiia ha sido positivamente asociadaa un fenotipo magro y a una regulación genética metabólica beneficiosa en tipos de células de seres humanos (Everard et al., 2013; Lu- kovac et al., 2015). Su presencia puede ser esencial para una red adherente a la mucosa de microorganismos beneficiosos que juntos provocan estos efectos en el huésped. En efecto, los estudios de pérdida de peso generalmente informan sobre una mayor abundancia de Verrucomicrobios (especialmente A. muciniphiia) como así también varias otras especies microbianas (Liouet al., 2013; Remelyet al., 2015; Wardet al., 2014). Tomados en conjunto, estos resultados además indican la posible importancia de las redes microbianas asociadas a las mucosas y su alimentación metabólica cruzada para la regulación de los parámetros relacionados con la salud del huésped y la prevención de enfermedades.

Ejemplo 2

Producción de Vitamina B12 mediante Intestinimonas butyriciproducens

Se cultivó Intestinimonas butyriciproducensAF211 como se ha descripto, en un medio de glucosa-acetato (Bui et al. Nature Comm 2015, 6: 10062). Un análisis más detallado por espectroscopia de masas mostró que I. butyriciproducensAF 211 es capaz de sintetizar un vitaminer B12 en monocultivos. La estructura del vitaminer era la misma que la producida por E.haiiiiy fue identificada como pseudovitamina B12 ya que el ligando inferior contenía adenina en lugar de 5,6-dimetilbencimidazol (DMBI). No se observó ningún efecto de adición de DMB en la estructura del vitaminer B12 producido (no se muestran datos).

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Una composición que comprendeEubacterium halliiyloIntestinimonas butyriciproducensy un portador fisiológicamente aceptable para su uso en el tratamiento ylo la prevención dedeficiencia de vitamina B12en un sujeto.

2. Composición para su uso según la reivindicación 1, en la que la deficiencia de vitamina B12 en dicho sujeto deriva del tratamiento con metformina para diabetes de tipo 2, anemia perniciosa, gastritis atrófica, inflamación crónica del páncreas, procedimiento quirúrgico en la que se ha extirpado parte del estómago ylo del intestino delgado, cirugía (bariátrica) para perder peso, enfermedad de intestino inflamable, tal como la enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, enfermedad celíaca, crecimiento bacteriano, consumo excesivo de alcohol, enfermedad de Graves, lupus, uso prolongado de reductores de ácido, desnutrición bulimia, y anorexia nerviosa, HIVISIDA, obesidad, índice de masa corporal alto, estado de prediabetes, resistencia a la insulina o dieta vegetariana o vegana.

3. Composición para su uso de acuerdo concualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, que además comprendeuna bacteria productora de propionato, tal comoAkkermansia muciniphila.

4. Composición para su uso de acuerdo concualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, que es una composición farmacéutica o de suplemento en una forma seleccionada del grupo de cápsula, tableta o polvo.

5. Composición para su uso de acuerdo concualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicha I.

butyriciproducensyloE. halliiy, opcionalmente,dicha bacteria que produce propionato, está presente en forma liofilizada o microencapsulada.

6. Composición para su uso de acuerdo cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que I.

butyriciproducensyloE. halliiestá presente en una cantidad que varía desde aproximadamente 104hasta aproximadamente 1015células.

7. Composición para su uso de acuerdo concualquiera de las reivindicaciones 3-6, en la que dicha bacteria que produce propionato, tal comoA. muciniphila, está presenteen una cantidad que varía desde aproximadamente 104hasta aproximadamente 1015células.

8. Composición para su uso de acuerdo cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que además comprende a agente aglutinante a las mucosas.

9. Composición para su uso de acuerdo concualquiera de las reivindicaciones precedentes, que además comprendeiones de cobalto, por ejemplo, en forma de sal de cobalto,tal como cloruro de cobalto, sulfato de cobalto, acetato de cobalto o nitrato de cobalto.

10. Composición para su uso de acuerdo conla reivindicación 1 o 2, en la que el uso es además para aumentar la producción de pseudovitamina B12 en el intestino de un sujeto.

11. Composición para su uso de acuerdo conla reivindicación 1 o 2, en la que el uso es además para aumentar la producción de propionatoen el intestino de un sujeto.

12. I butyriciproducensyloE. halliipara su uso en el tratamiento ylo la prevención de la deficiencia de vitamina B12en un sujeto.

13. I butyriciproducensyloE. halliipara uso de acuerdo con las reivindicación 12, en donde la deficiencia de vitamina B12 en dicho sujeto deriva del tratamiento con metformina para diabetes de tipo 2, anemia perniciosa, gastritis atrófica, inflamación crónica del páncreas, procedimiento quirúrgico en el que se extirpa parte del estómago ylo del intestino delgado, cirugía de pérdida de peso, enfermedad inflamatoria intestinal, como enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, enfermedad celíaca, crecimiento bacteriano, consumo excesivo de alcohol, enfermedad de Graves, lupus, uso prolongado de fármacos para reducir el ácido, desnutrición, bulimia, y anorexia nerviosa, VIHlSlDA, obesidad, índice de masa corporal alto, estado de prediabetes, resistencia a la insulina o una dieta vegetariana o vegana.

14. I butyriciproducensyloE. halliipara uso de acuerdo con la reivindicación 12 o 13, en donde el uso además es para aumentar la producción de pseudovitamina B12 en el intestino de un sujeto.

15. I butyriciproducensyloE. halliipara uso de acuerdo con la reivindicación 12 o 13, en donde el uso es además para aumentar la producción de propionatoen el intestino de un sujeto.