JP7219801B2 - ビタミンb12欠乏症を予防および/または治療するための組成物および方法 - Google Patents
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Description
本明細書で使用する場合、「共生(syntrophic)」または「栄養共生(syntrophy)」という用語は、ある種が別の種の産物に寄生して生きている現象を指す。この会合では、一方のパートナーの成長は、改善されるか、または他方のパートナーによって提供される栄養素、成長因子もしくは基質に依存する。栄養学的相互依存についてのこの用語は、微生物学において、ある細菌種間のこの共生関係を記述するためにしばしば使用される。
さらなる態様において、本発明は、対象の腸におけるシュードビタミンB12の産生を増加させるための、E.ハリイおよび/またはI.ブチリシプロデュセンスと、生理学的に許容される担体とを含む組成物の使用に関する。
細菌増殖条件
アッカーマンシア・ムシニフィラ
アッカーマンシア・ムシニフィラ MucT(ATTC BAA-835)を、以前に記載されたように増殖させた(Derrienら、2004;Duncanら、2002)。182kPa(1.5気圧)N2/CO2(80/20比率)の気相によって提供される嫌気性条件下で、37℃にてブチルゴム栓で密封した血清ボトル中でインキュベーションを行った。増殖は分光光度計により600nmにおける光学濃度(OD600)として測定した。
ユウバクテリウム・ハリイ L2-7を、いくらか調整したYCFA中で37℃にて嫌気的に増殖させた。ムチン糖の利用は、10mM酢酸塩を添加したまたは添加していない最小培地中で行った。ムチン由来の単糖(マンノース、フコース、ガラクトース、N-アセチルガラクトサミン、またはN-アセチルグルコサミン)を用いて実験を行った場合、これらは25mMの濃度で使用した。増殖を24時間追跡し、OD600およびHPLC分析のために定期的に試料を採取した。
共培養実験は、粘液を補充した最小培地中で行った(Derrienら、2004)。最適な共培養条件を以下のように確立した。A.ムシニフィラをムチン培地に添加し、次いで測定可能な濃度の酢酸塩および遊離糖を得るために8時間インキュベートした。その後、E.ハリイの細胞をA.ムシニフィラ含有インキュベーションに添加した。全ての細胞をPBSで2回洗浄し、その後、前培養からの産物のオーバーフローを防ぐために共培養物に添加した。共培養の間、0.15%ムチンを48時間毎に培地に添加し、A.ムシニフィラに対する十分な基質利用性を維持した。
高速液体クロマトグラフィー(HPLC)を、上記の共培養からの発酵産物の分析のために使用した。発酵産物分析のために、細菌培養物1mLを遠心分離し、上清をHPLC分析まで-20℃で保存した。基質変換および産物形成は、45℃に維持され、0.005mM硫酸を溶離液として流した、Varian Metacarb 67H 300×6.5mmカラムを備えたThermo Scientific Spectra system高速液体クロマトグラフィー(HPLC)システムを用いて測定した。溶離液の流量は0.8ml/minであり、屈折率を測定することにより代謝産物を検出した。
超高速液体クロマトグラフィー質量分析(UHPLC-MS)をビタミンB12分析のために使用した。簡単に説明すると、E.ハリイ細胞(0.2g)を、100μLの1%NaCNを含有する10mLの抽出緩衝液(8.3mM水酸化ナトリウムおよび20.7mM酢酸、pH4.5)と混合した。混合物を沸騰水浴に30分間曝すことによってビタミンをそのシアノ形態で抽出した。冷却後、抽出物を遠心分離(6900gで10分間;Hermle、Wehingen、ドイツ)により回収し、最後にイムノアフィニティーカラムクロマトグラフィー(Easy-Extract;R-Biopharma、Glasgow、スコットランド)により精製した。再構成した抽出物を、フォトダイオードアレイ検出器(PDA;210-600nm)を備え、高分解能四重極飛行時間型質量分析計(QTOF;Synapt G2-Si、Waters)にインターフェースで接続したWaters Acquity UPLCシステム(Milford、MA、USA)においてHSS T3 C18カラム(2.1×100mm;1.8μm)を使用してビタミン含有量について分析した。溶離液は、水(溶媒A)およびアセトニトリル(溶媒B)の勾配流(0.32ml/分)であり、両方とも0.1%ギ酸で酸性化した:0~0.5分(95:5);0.5~5分(60:40);5~6分(60:40)および6~10分(95:5)。カラム22を30℃に維持し、UV検出を361nmで記録した。MS分析は、50~1500のm/zに設定した走査範囲を使用してエレクトロスプレーイオン化で陽イオンモードにおいて行った。ビタミンピークに対応する親イオンをさらに断片化し(MS/MS)、分析した。
ビタミンB12はE.ハリイとA.ムシニフィラとの間の栄養共生に依存した
A.ムシニフィラとE.ハリイとの共培養において、コハク酸塩のプロピオン酸塩に対する割合は、A.ムシニフィラの単一培養と比較して変化していた。メチルマロニル-CoAシンターゼによるプロピオン酸塩の産生は、補因子ビタミンB12に依存することが知られている。したがって、ビタミンおよびビタミンB12の効果をA.ムシニフィラの単一培養で試験した。ビタミン混合物またはビタミンB12のみの添加は、実際に、共培養で行ったE.ハリイの存在と同様にA.ムシニフィラのコハク酸塩をプロピオン酸塩プロファイルに変化させた(図1)。質量分析による詳細な分析から、E.ハリイは単一培養でB12ビタマーを合成できることが示された。ビタマーの構造は、5,6-ジメチルベンズイミダゾール(DMB)の代わりにアデニンを含む低い配位子としてシュードビタミンB12であるように見える。産生したB12ビタマーの構造に対するDMB添加の効果は観察されなかった(データは示していない)。まとめると、このことは、A.ムシニフィラとE.ハリイとの間の双方向性代謝栄養共生の証拠であり、A.ムシニフィラはE.ハリイの増殖支援のために糖を提供し、見返りとしてE.ハリイは、メチルマロニル-CoAシンターゼを介してコハク酸塩をプロピオン酸塩に変換するための補因子として使用される十分なレベルのビタミンB12類似体をA.ムシニフィラに提供する。ビタミンB12およびシュードビタミンB12はいずれも、A.ムシニフィラによって補因子として使用され、メチルマロニル-CoAシンターゼを活性化し得る。したがって、この栄養共生関係は、E.ハリイによって産生されるB12ビタマーがシュードビタミンB12型であることから、腸管内で共進化しているようである。
インテスティニモナス・ブチリシプロデュセンスによるビタミンB12の産生
インテスティニモナス・ブチリシプロデュセンス AF211を、グルコース-酢酸塩培地で記載されるように増殖させた(Buiら、Nature Comm 2015、6:10062)。質量分析によるさらなる詳細な分析は、I.ブチリシプロデュセンス AF211が単一培養においてB12ビタマーを合成できることを示した。ビタマーの構造はE.ハリイによって産生されたものと同じであり、5,6-ジメチルベンズイミダゾール(DMBI)の代わりにアデニンを含有する低い配位子としてシュードビタミンB12と同定された。産生したB12ビタマーの構造に対するDMB添加の影響は観察されなかった(データは示していない)。
Claims (17)
- インテスティニモナス・ブチリシプロデュセンス(Intestinimonas butyriciproducens)と、生理学的に許容される担体とを含む、対象におけるビタミンB12欠乏症の治療および/または予防に使用するための組成物。
- 前記対象におけるビタミンB12欠乏症が、2型糖尿病のためのメトホルミン治療、悪性貧血、萎縮性胃炎、膵臓の慢性炎症、胃および/または小腸の一部が除去される外科的処置、体重減少(肥満)手術、クローン病、潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患、セリアック病、細菌増殖、大量飲酒、グレーヴス病、ループス、胃酸抑制薬の長期使用、栄養不良、過食症、および食欲不振、HIV/AIDS、肥満、高肥満度指数、前糖尿病状態、インスリン耐性、または菜食もしくは完全菜食に由来する、請求項1に記載の組成物。
- プロピオン酸塩産生細菌をさらに含む、請求項1または2のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
- カプセル、錠剤、および粉末の群から選択される形態の医薬組成物またはサプリメント組成物である、請求項1または2のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
- 前記I.ブチリシプロデュセンス(I.butyriciproducens)および任意選択で前記プロピオン酸塩産生細菌が、凍結乾燥またはマイクロカプセル化形態で存在する、請求項1~4のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
- I.ブチリシプロデュセンスが約10 4 ~約10 15 細胞の範囲の量で存在する、請求項1~5のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
- 前記プロピオン酸塩産生細菌が約10 4 ~約10 15 細胞の範囲の量で存在する、請求項3~6のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
- 粘膜結合剤をさらに含む、請求項1~7のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
- コバルトイオンを、例えば、塩化コバルト、硫酸コバルト、酢酸コバルト、または硝酸コバルトなどのコバルト塩の形態でさらに含む、請求項1~8のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
- I.ブチリシプロデュセンスと、生理学的に許容される担体とを含む、対象の腸におけるシュードビタミンB12の産生を増加させるための組成物。
- 前記対象がビタミンB12欠乏症に罹患している、請求項10に記載の組成物。
- 前記対象におけるビタミンB12欠乏症が、2型糖尿病のためのメトホルミン治療、悪性貧血、萎縮性胃炎、膵臓の慢性炎症、胃および/または小腸の一部が除去される外科的処置、体重減少手術、クローン病、潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患、セリアック病、細菌増殖、大量飲酒、グレーヴス病、ループス、胃酸抑制薬の長期使用、栄養不良、過食症、および食欲不振、HIV/AIDS、肥満、高肥満度指数、前糖尿病状態、インスリン耐性、または菜食もしくは完全菜食に由来する、請求項11に記載の組成物。
- 対象におけるビタミンB12欠乏症の治療および/または予防に使用するための組成物を製造するための、I.ブチリシプロデュセンスの使用。
- 前記対象におけるビタミンB12欠乏症が、2型糖尿病のためのメトホルミン治療、悪性貧血、萎縮性胃炎、膵臓の慢性炎症、胃および/または小腸の一部が除去される外科的処置、体重減少手術、クローン病、潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患、セリアック病、細菌増殖、大量飲酒、グレーヴス病、ループス、胃酸抑制薬の長期使用、栄養不良、過食症、および食欲不振、HIV/AIDS、肥満、高肥満度指数、前糖尿病状態、インスリン耐性、または菜食もしくは完全菜食に由来する、請求項13に記載の使用。
- 対象の腸におけるシュードビタミンB12の産生を増加させるための組成物を製造するための、I.ブチリシプロデュセンスの使用。
- 前記対象がビタミンB12欠乏症に罹患している、請求項15に記載の使用。
- 前記対象におけるビタミンB12欠乏症が、2型糖尿病のためのメトホルミン治療、悪性貧血、萎縮性胃炎、膵臓の慢性炎症、胃および/または小腸の一部が除去される外科的処置、体重減少手術、クローン病、潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患、セリアック病、細菌増殖、大量飲酒、グレーヴス病、ループス、胃酸抑制薬の長期使用、栄養不良、過食症、および食欲不振、HIV/AIDS、肥満、高肥満度指数、前糖尿病状態、インスリン耐性または菜食もしくは完全菜食に由来する、請求項16に記載の使用。
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