TW200924744A - Compositions and methods for inhibiting the activation of dsRNA-dependent protein kinase and tumor growth inhibition - Google Patents

Compositions and methods for inhibiting the activation of dsRNA-dependent protein kinase and tumor growth inhibition Download PDF

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TW200924744A
TW200924744A TW097141111A TW97141111A TW200924744A TW 200924744 A TW200924744 A TW 200924744A TW 097141111 A TW097141111 A TW 097141111A TW 97141111 A TW97141111 A TW 97141111A TW 200924744 A TW200924744 A TW 200924744A
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TW
Taiwan
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pkr
composition
inhibitor
treatment
cancer
Prior art date
Application number
TW097141111A
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English (en)
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Michael John Tisdale
Helen Laura Eley
Steve Thomas Russell
Kevin Burke Miller
Original Assignee
Nestec Sa
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Description

200924744 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於用於預防及治療哺乳動物受檢者之病狀之 組合物及方法，其包括該治療之前或同時的雙股核糖核酸 依賴蛋白質激酶之至少一種抑制劑（pkh)，其中該治療 • 引起對雙股核糖核酸依賴蛋白質激酶活化的抑制。本發明
. 之組合物及方法另外包括至少一種進一步增強藉由PKR-I 達成之鱗酸化抑制的增效劑。 © 【先前技術】 • 惡病質通常與大量疾病病況相關，該等疾病病況包括與 危重疾病相關之急性發炎過程及慢性發炎疾病，諸如癌 症、膿毒病、充血性心臟衰竭、類風濕性關節炎、慢性阻 塞性肺部疾病及人類免疫缺乏病毒感染。其亦與其他已知 肌肉萎縮疾病及病症相關，該等疾病及病症例如骨骼肌減 少症（年齡相關之肌肉質量損失疾病）。惡病質造成患有癌 ❹ 症之全部患者中1 〇%-22%死亡，且造成初始創傷事件之後 數曰至數週由膿毒病誘導之器官功能障礙及營養不良而發 生之損傷死亡的約15%。 癌症患者（尤其胃腸道癌症患者）展現進行性骨骼肌萎縮 或惡病質’其又降低患者之生活品質及存活時間。患者之 癌症惡病質由厭食症、體重減輕、提前飽感、虛弱（有虛 弱之感覺而無力量之實際損失）、瘦體質損失及多個器官 功能障礙表徵。與癌症惡病質相關之痩體質損失不僅削弱 個體且使日常生活之活動困難，而且可削弱患者至使其無 135310.doc 200924744 力量經受化學及/或放射治療的程度。 惡病質係歸因於蛋白質合成降低（低合成代謝）及内生蛋 白質分解（分解代謝）增加與所得胺基酸氧化之組合 (O Keefe，S.J.D.等人，Cancer Res” 50:1226-1230，1990) 〇
蛋白質降解增加之機制歸因於泛素-蛋白酶體蛋白水解路 才工之表現増加。Khal，J.等人，int. j. Biochem. Cell. Biol., 37·2196-2206，2005。仍未知造成癌症惡病質中不能維持 蛋白質合成之機制。然而，直至最近才提出可解釋惡病質 中蛋白質合成降低及肌原纖維蛋白質降解增加的機制。該 機制涉及經由自體磷酸化達成之雙股RNA依賴蛋白質激酶 (PKR)之活化。藉由諸如PIF(蛋白水解誘導因子）及Ang Π(血管緊張素Π)之藥劑達成之PKR活化誘導真核起始因子 2a (eIF2a)之磷酸化，使得經由與鳥嘌呤_核苷酸交換因子 eIF2B競爭抑制轉譯起始，此阻礙eIF2由其GDp結合狀態 轉化為活性GTP結合形式。Russell，s τ等人，CeU
Signalling，19:1797-1806, 2007。 經由轉譯起始調節蛋白質合成
轉譯起始之調節包括⑴使起始子甲硫胺醯基-轉移RNA (met-tRNA)與4〇s核糖體亞單位結合；及⑴）使mRNA與43s 刚起始複合物結合。在第一步驟期間，met_tRNA與4〇s核 糖體亞單位以與真核起始因子2 (eIF2)及鳥苷三碌酸（GTp) 之三元複合物形式結合。該步驟之後，將GTp水解為鳥苷 二磷酸（GDP)，其中自三元複合物釋放eIF2。該^^必須 將GDP交換為GTP以進入另一輪起始。此經由另一真核起 135310.doc 200924744 始因子2(eIF2B)之作用進行，該eIF2B介導eIF2上之鳥嘴吟 核苷酸交換。eIF2B由eIF2在其α亞單位上之eIF2B鱗駿化 調節，該磷酸化將eIF2由受質轉化為eIF2B之競爭性抑制 劑。 在第二步驟中，mRNA與43s前起始複合物之結合需要― • 組總稱為eIF4F之蛋白質，其為由以下各物組成之多亞單 . 位複合物：eIF4A (RNA解旋酶）、eIF4B(其與eIF4A結合起 作用以展開mRNA之5'非轉譯區中之二級結構）、eIF4E(其 ❹ 與存在於mRNA之5’端處之m7GTP帽結合）及eIF4G(其充當 eIF4E、eIF4A& mRNA之骨架）。總之，eIF4F複合物用以 識別、打開及引導mRNA至43s前起始複合物。eIF4E對 eIF4F複合物形成之可用性似乎由轉譯抑制子eIF4E-結合蛋 白質1 (4E-BP1)調節。4E-BP1又與eIF4G競爭與eIF4E結合 且能夠將eIF4E隔離於無活性複合物中。4E-BP1之結合經 由藉由激酶雷帕黴素（rapamycin)之哺乳動物標乾（mT〇R> ^ 達成之磷酸化調節，其中增加之磷酸化使得4E-BP1對 eIF4E之親和力降低。 藉由PIF及Ang II達成之泛素-蛋白酶體路徑之誘導需要 • 活化轉錄因子核因子-κΒ (NF-κΒ)。Wyke，S.M.及Tisdale， . M.J.，Br. J. Cancer，92:71 1-721，2005。已展示 PKR 活化上 游激酶ΙκΒ激酶，此將導致抑制子蛋白ΙκΒ之降解^ ΙκΒ之 降解又將引起NF-κΒ釋放。所釋放之NF-κΒ將遷移至核 中，此將引起特定基因之轉錄活化（Zamanian-Daryoush， Μ,等人，Mol. Cell Biol·，20:1278-1290，2000)。含有突變 135310.doc 200924744 PKR之肌管不能響應於PIF或Ang II活化NF-κΒ且不能誘導 泛素-蛋白酶體路徑。該等結果表明藉由PKR誘導泛素-蛋 白酶體路徑需要NF-κΒ活性。 胺基酸 認為二十種胺基酸中之九種為人類所必需，因為體内不 能製備該等胺基酸。該九種胺基酸必須經由個體之膳食獲 . 得。缺乏該等胺基酸中之一或多者可引起負氮平衡，其中 所排泄之氮多於所攝取之氮，因為蛋白質降解快於其製 ® 備’此可能導致酶活性破壞及肌肉質量損失。 已知諸如胰島素、胰島素樣生長因子之合成因子及胺基 酸增加蛋白質合成且引起肌肉過度生長。支鏈胺基酸（尤 其白胺酸）可起始通常包括調節轉譯起始之mT〇R& eIF2的 信號轉導路徑。舉例而言，胺基酸缺乏將導致eIF2_a磷酸 化增加及蛋白質合成減少。 在患有惡病質之患者中，游離胺基酸之血漿含量普遍降 〇 低。通常發現諸如白胺酸、異白胺酸及纈胺酸之支鏈胺基 酸（BCAA)降低最多。BCAA包含肌肉蛋白f中之總胺基酸 之14_18〇/。，其充當蛋白質合成之基本組份及調節劑。在本 . 文中所提及之三種BCAA中，白胺酸為肌肉蛋白質合成之 . 最有效之刺激劑，而剩餘兩者不太有效。如由Anth〇ny, J.c.等人（J. Nutr” 130:139_145, 2〇〇〇)報導之刺激蛋白質合 成之機制係藉由經由4E-BP1 (eIF4E'结合蛋白1}之超碟酸 化活化轉譯起始中之mRNA結合步驟達成，4Ε_Βρι之超磷 酸化又使得eIF4E自&活性4E_Bpi eIF4E複合物釋放。所 135310.doc 200924744 釋放之eIF4E又與eIF4G聯合以形成活性eIF4F複合物。 eIF4F複合物之形成增加促進43 S前起始複合物遷移並募集 至mRNA，增強肽鏈起始。 儘管尚未透徹研究出BCAA對PKR活化之作用，但Eley 及其同事近年來報導諸如白胺酸及纈胺酸之BCAA顯著抑 制攜帶惡病質誘導腫瘤（MAC-16)之小鼠的體重減輕，其經 由增加蛋白質合成及減少降解而引起骨骼肌濕重顯著增 加。Eley，H.L.等人，Biochem J.，407(1):1 13-120，2007。 白胺酸對PKR磷酸化之該作用似乎歸因於PPI(蛋白質磷酸 酶I)之表現增加，已展示PPI與PKR之N末端調節區結合且 抑制自體磷酸化（Tan, S.L.等人，J. Biol· Chem.， 277:36109-36117，2002)。Eley及其同事之該研究為展示白 胺酸可削弱當曝露於PIF時攜帶MAC-16腫瘤之小鼠之骨骼 肌中及鼠肌管中PKR及eIF2a磷酸化之最先報導。活體外所 用白胺酸之濃度（2 mmol/1)與Anthony等人先前報導（J. Nutr.，130:2413-2419，2000)之每公斤體重投與1.35 g白胺 酸時大鼠血清中之濃度相同。 另一方面，Eley及其同事所報導的攜帶MAC-16腫瘤之 小鼠之體重減輕與由於4E-BPI低磷酸化所致之結合於 eIF4E之結合蛋白4E-BPI之eIF4E的量增加及活性eIF4G-eIF4E複合物進行性減少相關。此可歸因於mTOR(雷帕黴 素之哺乳動物標靶）之磷酸化減少，此可引起p70S6k (70 kDa核糖體S6激酶）之磷酸化減少。注意到eEF2(真核延長 因子2)增加5倍，此亦經由轉譯延長減少而降低蛋白質合 135310.doc 200924744 成。白胺酸之治療藉由以下來逆轉該作用：（1)增加mTOR 及p70s6k; (2)使4E-BPI超磷酸化；（3)減少與eIF4E結合之 4E-BPI之量；（4)使eIF4G-eIF4E複合物之形成增加；及（5) 減少eIF2a磷酸化及PKR活化以分別使蛋白質合成增加及所 增加蛋白質之降解削弱。 基於以上所述，PKR之抑制劑與諸如支鏈胺基酸之營養 補充劑之組合可一起用於治療及預防癌症惡病質或與惡病 質相關之其他疾病。 〇 其間，本發明之發明者近來在PCT公開案WO/2007/064618 中描述其研究，其係關於在治療哺乳動物之肌肉損失中投 與一或多種支鏈胺基酸（BCAA)、BCAA前軀物、BCAA代 謝物、富含BCAA之蛋白質、經處理以富含BCAA之蛋白 質或其任何組合。亦描述適於該投與之營養調配物。 預防及治療惡病質及厭食症仍為醫藥界之現存問題。用 以供應癌症或任何疾病攜帶宿主中肌肉質量損失的營養補 0 充維持仍然基本上無效。因此，仍需要改良臨床方法以用 營養與化學治療之組合應用增強化學治療或任何形式之細 胞毒性抗贅生性治療的功效。 【發明内容】 本發明係關於治療哺乳動物中之病狀之組合物及方法， 其包括該治療之前或同時的雙股核糖核酸依賴蛋白質激酶 之至少一種抑制劑（PKR-I)，其中該治療引起對雙股核糖 核酸依賴蛋白質激酶活化的抑制。此外，本發明之組合物 及方法另外包括至少一種增效劑，其中至少一種增效劑增 135310.doc 200924744 強哺乳動物中藉由PKR-Ι達成之填酸化抑制。此外，本發 明係關於增強化療劑在治療或改良使用化療劑之癌症病 狀、自身免疫或其他病症中之功效的組合物及方法，其中 至少一種PKR-I係與至少一種營養化合物一起使用或不與 至少一種營養化合物一起使用。 在本發明之一特徵中，病狀可包括（但不限於）癌症；發 炎疾病；膿毒病；充血性心臟衰竭；類風濕性病症，包括 (但不限於）強直性脊柱炎；肌肉纖維疼痛；風濕性器官病 (亦即心臟、肺、腎臟及血管炎）；狼瘡，包括全身性紅斑 性狼瘡症；顳動脈炎及風濕性多肌痛；修格蘭氏症候群 (Sj0rgren’s syndrome);類風濕性關節炎；慢性阻塞性肺部 疾病；神經退化性疾病；自體免疫疾病；人類免疫缺乏病 毒感染；免疫相關病狀，包括（但不限於）過敏性病狀、氣 喘病狀及與移植或輸血相關之病狀；糖尿病；牛皮癖症； 皮膚病；細胞老化；庫欣病（Cushing Disease);風濕熱及 ❹ H症》 在本發明之另一特徵中，增效劑以及PKR I中之至少一 者增強改良或降低患病哺乳動物之上述病狀中之—者的嚴 . 重性。 在本發明之另一特徵中，PKRJ可為天然的或合成的且 可經腸或非經腸單獨投與或與至少一種增效劑組合投與。 非經腸投藥之途徑為皮下、靜脈内、肌肉内或局部。對於 腸内投與而言，其可經由鼻内、口内、鼻胃管、口胃管戋 經由胃口、空腸口或迴腸口。 135310.doc -12- 200924744 在本發明之另一特徵中，組合物為營養組合物。増效劑 可為PKR之抑制劑、pKR_I之類似物、PKR之破酸化抑制 劑、化療劑、血管生成劑、血管擴張劑、兒茶素-黃烷 醇、生物活性蛋白質、支鏈胺基酸、必需胺基酸、胺基 酸、胺基酸類似物、核苷酸、維生素、麩醯胺酸、唾液酸 募醣、L-茶胺酸、益菌助生質、益生菌、合益素、必需脂 肪酸、PUFA、MUFA及抗氧化劑。增效劑可為至少一種L_ ❹ 麵醯胺酸促效劑，例如L·茶胺酸。核苷酸可為RNA，例如 腺嘌呤、鳥嘌呤、尿嘧啶或胞嘧啶。化療劑之實例為5_氟 尿嘧啶或吉西他濱（gemcitabine) ^胺基酸之實例可為正白 胺酸、精胺酸、L-瓜胺酸、L-茶胺酸或麩酿胺酸。生物活 性劑可為 TGF-βΙ、TGF-P2、TGF-P3、TGF-P4或 TGF-P5。 PKR-I可充當哺乳動物之細胞生長或細胞複製之抑制 劑。治療可以放射治療或化學治療之形式。 本發明之組合物可另外包括蛋白質磷酸酶_1α(ρρι_Α)之 〇 至少一種改質劑，其中ΡΡ1-Α使PKR之磷酸化形式去磷酸 化。此外，至少一種改質劑為支鏈胺基酸，亦即白胺酸、 異白胺酸或纈胺酸。 ^ 本發明亦包括治療哺乳動物之病狀之方法，其包括向該 哺乳動物投與如上所述之組合物，其中該治療引起對經治 療哺乳動物中dsRNA依賴蛋白質激酶之活化的抑制。 本發明之其他特徵及優勢將在以下實施方式中顯而易 見。然而，應瞭解儘管實施方式表明本發明之實施例，但 其僅以說明性方式而非限制性方式給出。熟習此項技術者 135310.doc •13- 200924744 由該實施方式將顯而易見在本發明範疇内之各種變化及修 改。 【實施方式】 本發明之該等及其他特徵將更易於由本發明之各種態樣 之以下描述結合描述本發明之各種實施例之隨附圖式加以 理解。 本發明係關於在存在或不存在營養化合物之情況下使用 雙股RNA蛋白質激酶抑制劑（PKR-Ι)增強化療劑在治療癌 〇 症中之功效的方法。 藉由使用PKR之抑制劑，完全削弱蛋白質合成降低且防 止eIF2tx磷酸化誘導（亦參見圖丨）。pkr抑制劑亦削弱由pIF 與Ang II誘導之蛋白質合成降低且防止惡病質鼠模型與惡 病質人類模型中蛋白酶體表現及活性增加》所提出之闞明 肌肉惡病質中經由PKR自體磷酸化達成之蛋白質合成降低 及蛋白質降解增加之機制如圖1中所概括。Eley，H.L.及 ❹ Tisdale，M.J.，J. Biol.，282:7087-7097, 2007 ; Eley，H.L.及 Tisdale, M.J·，Br. J. Cancer，96:1216-1222，2007 ;及 Eley， H.L.等人，Br. J. Cancer，98(2):443-449, 2008。基於該等 發現，PKR之抑制劑可用於治療性預防癌症患者以及其他 惡病質相關疾病中之肌肉萎縮。 舉例而言，如由本發明者所觀察，患有體重減輕之人類 癌症患者之肌肉中磷酸化形式之PKR與磷酸化形式2eIF2a 之含量均大大提向（不考慮其量）。注意到pKR鱗酸化與 eIF2a麟酸化之間的線性關係，此產生以下提示：pKR鱗酸 135310.doc 14- 200924744 化致使eIF2a磷酸化。然而，肌凝蛋白含量隨體重減輕量 增加而減少。肌凝蛋白表現與eIF2a磷酸化程度之間存在 類似線性關係。該等發現表明PKR磷酸化可為癌症患者中 肌肉萎縮之重要起始子。Eley，H.L.等人，Br. j Cancer 98 (2):443-449, 2008 〇 ’ 在不將本發明侷限於任何特定機制的情況下，本發明之 ' 發明者已發現，與單獨使用化療劑（例如5-氟尿嘧啶或吉西 他濱）相比，與化療劑組合投與PKR-I更有效地降低腫瘤細 胞之生長。因此，投與PKR-Ι在其增強化學治療之能力中 可為直接或間接的。5-氟尿嘧啶或吉西他濱均為通常用於 治療贅生性生長（結腸癌）之化療化合物。在不受理論約束 的情況下，咸信PKR-Ι在以極特定濃度引入時降低癌細胞 之生長（在200 nM下作用最大，在較低及較大濃度下作用 減小）。此外，抑制PKR進一步減少曝露於化療藥物之癌細 胞的增殖。與單獨使用任一化合物所觀察到之抑制相比， 〇 細胞抑制似乎為協同作用（參見圖8)。咸信投與結構上與 PKR I化合物無關之特定營養化合物亦降低癌細胞生長且 預防癌症惡病質。然而，該等營養化合物經由不同於由 Jammi等人，Biochem· Biophys. Res. c〇mmun，3〇8:5〇_57, 2003先前描述之PKR-I化合物之機制發揮作用。 如本文中所使用之術語"增效劑"或"增強"涉及化合物或 藥劑，其在與另一藥劑及/或營養化合物組合使用時產生 兩種藥劑/化合物之大於各自單獨使用之作用總和的協同 作用。根據本發明，增效劑可包括（但不限於）pKR之抑制 135310.doc 200924744 劑、PKR-Ι之類似物、PKR之破酸化抑制劑、營養補充劑 或化合物、化療劑、丘管生成劑、血管擴張劑、兒茶素黃 燒醇、生物活性蛋白質、支鏈胺基酸、必需胺基酸、胺基 酸或胺基酸類似物、核苷酸或RNA、維生素、麩醯胺酸、 唾液酸募醣、L-茶胺酸、益菌助生質、益生菌或合益素、 必需脂肪酸、PUFA及/或MUFA及抗氧化劑。 如本文中所使用之術語"治療"係指預防性治療與治療性 或疾病改善性治療，包括治療具有感染疾病之風險或疑似 已感染疾病的患者以及患病或已診斷為患有疾病或醫學病 狀之患者。該等術語亦指維持及/或促進並未患有疾病但 "Tab對產生不健康病狀（諸如氮失調或肌肉損失）敏感之個 體之健康。因此，”有效量"為治療個體之疾病或醫學病狀 之量，或更一般地，向個體提供營養、生理學或醫學效益 之量。此外，雖然術語”個體，，及"患者"在本文中通常用於 才曰人類，但本發明並不限於人類。因此，術語"個體"及"患 φ 者係指可受益於該治療之任何動物。 惡病質 ‘惡病質或萎縮為具有嚴重營養不良及負氮平衡之病狀， 其由以下病狀表徵：貧血症（血紅蛋白下降）、厭食症（缺乏 * 食慾或嚴重食慾不振）、體重減輕及肌肉萎縮。惡病質中 生理學、代謝及行為變化與患者虛弱、疲乏、胃腸不適、 睡眠/覺醒奈亂、疼痛、倦怠、氣促、昏睡、抑费、不適 及擔憂對家庭及朋友難於負擔之抱怨相關。惡病質見於若 干疾病，該等疾病包括（但不限於）AIDS ;癌症；親骨折 135310.doc 200924744 後，慢性心臟衰竭；慢性肺病，諸如慢性阻塞性肺病及慢 性阻塞性肺部疾病；肝硬化；腎衰竭；自體免疫疾病，諸 如類風濕性關節炎及全身性狼瘡；膿毒病；結核病；囊腫 性纖維化；克羅恩氏症（Crohn，s disease)及重症感染。除該 等慢性感染及惡性病狀之外，亦已在大範圍創傷損傷之後 的患者中及患有生長停滯症候群（failure thrive syndrome)之老人中鑑別到惡病質。 兩種主要組份促進癌症惡病質：（1)食慾不振，及（2)對 應激之代謝反應’其造成以比單獨由營養攝取缺乏所預期 之速率大之速率優先損失肌肉。因此，在患有癌症之患者 中改善肌肉質量損失速率之營養補充劑將具有重要臨床效 果。 癌症惡病質並非簡單為腫瘤之局部作用。通常存在蛋白 質、脂肪及碳水化合物代謝之改變。舉例而言，碳水化合 物代謝異常包括總葡萄糖轉換速率增加、肝臟葡糖新生增 加、葡萄糖耐受不良及葡萄糖含量增加。通常觀察到脂肪 分解增加、游離脂肪酸及甘油轉換增加、高脂質血症及脂 蛋白脂酶活性降低。與癌症惡病質相關之鱧重減輕不僅由 體脂肪儲存減少引起且由總蛋白質質量減少以及大量骨絡 肌萎縮引起。蛋白質轉換增加及胺基酸氧化調節不良亦可 具有重要性。已揭示響應於癌症所產生之宿主衍生因子的 存在為惡病質之病因劑（causative agent)，例如腫瘤壞死因 子-α (TNF-α)或惡液質素、介白素-1 (IL-1)、IL-6、γ·干擾 素（γ-IFN)及前列腺素（PG ;例如PGE2) » 135310.doc -17- 200924744 體重減輕在患有肺癌及胃腸道癌之患者中常見，造成體 脂肪與肌肉蛋白質大量損失，但非肌肉蛋白質仍未受影 響。雖然體脂肪損失在能量儲備方面具有重要性，但骨骼 肌蛋白質損失導致不能活動，且最終損壞呼吸肌功能，導 致因墜積性肺炎而死。儘管惡病質時常伴隨有厭食症，但 僅營養補充不能維持穩定體重，且所增加之任何重量係歸 因於脂肪組織及水增加而非瘦體質增加。 雙股（ds)RNA依賴蛋白質激酶（PKR) 如本文中所使用之術語"PKR"係指具有以下蛋白質之功 能且或者稱為以下蛋白質的蛋白質：”雙股RNA依賴蛋白 質激酶"、”雙股 RNA依賴 eIF-2a激酶”、"DAI”（Jimenez-Garcia 等人，J. Cell Sci. 106:11-12, 1993)、”dSI，，、 ”p68(人類）或 p65(鼠）激酶"（Lee 等人，J· Interferon Cytokine Res. 16:1073-1078，1996)或 dsRNA-PK。亦參見 Clemens 等人，J. Interferon Res. 13 :241，1993。PKR為已 知具有激酶活性之唯一鑑別之dsRNA-結合蛋白質。PKR為 絲胺酸/蘇胺酸激酶，其之酶活化需要dsRNA結合及隨後之 自體鱗酸化（Galabru，J.及 Hovanessian，A·，J. Biol. Chem. 262:15538-15544，1987 ; Meurs，E.等人，Cell, 62:379-390, 1990)。PKR之最佳經表徵活體内受質為真核起始因子-2之 α亞單位（eIF-2a)，其在磷酸化之後最終引起對細胞及病毒 蛋白質合成之抑制（Hershey, J. W. B.，Ann. Rev· Biochem. 60:717-755，1991)。已表明PKR之該特殊功能為引起調節 IFN-a及IFN-β之抗病毒及抗增殖活性之機制中之一者。 135310.doc -18 - 200924744 PKR之另一生物學功能為其作為信號轉導物之公認作用。 Kumar等人證實PKR可使ΙκΒα磷酸化，引起核因子-κΒ (NF-κΒ)釋放及活化（Kumar，Α.等人，Proc. Natl. Acad. Sci· USA 91, 6288-6292，1994)。在IFN-b啟動子中提供經最隹 表徵之NF-κΒ位點，此可提供PKR介導IFN_b轉錄之dsRNA 活化的機制（Visvanathan，K. V.及 Goodbourne，S·，EMB〇 J” 8, 1129-1138, 1989)» PKR之活化包括兩個分子與雙股RNA串聯結合，且隨後 ® 在一分子内事件中彼此磷酸化。（Wu等人，1997，】.81〇1·
Chem 272:1291-1296)。PKR牽涉於依賴於細胞凋亡作為活 體内控制機制之過程中，該等過程包括抗病毒活性、細胞 生長調節及腫瘤形成（Donze 等人，EMBOJ.，14:3828-3834，1995 ; Lee 等人，Virology，199:49卜496，1994 ; Jagus 等人，Int. J. Biochem. Cell. Biol. 1989，第 9卷： 1576-86)。 _ PKR抑制劑（PKR-I)
Q PKR與多種細胞過程有關，該等細胞過程包括信號轉 導、分化及細胞凋亡》根據本發明，PKR之抑制劑（PKR-I) 可用於治療與異常細胞反應相關之病症，例如神經退化性 病症（例如亨廷頓氏症（Huntington disease)、阿茲海默氏症 (Alzheimer’s disease)及帕金森氏症（Parkinson’s disease))。 可適用於本發明之組合物、套組及方法的PKR抑制劑包括 以下文獻中所述之彼等者：Shimazawa等人，Neurosci. Lett., 409:192-195, 2006 ； Peel, J. Neuropathol. Exp. 135310.doc 19- 200924744
Neurol” 63:97-105，2004 ; Bando等人，Neurochem. Int·， 46:11-18，2005 ; Peel等人，Hum. Mol. Genet.，10:1531-1538，2001 及 Chang 等人，j. Neurochem. 83:1215-1225, 2002 〇 PKR-I之類似物亦可包括（但不限於）2-胺基嘌呤（2-AP)、 9-(4-溴-3,5-二甲基·吡啶·2·基）_6_氯-9H-嘌呤-2-基胺、9-(4-溴-3,5-二曱基-吡啶-2-基甲基）-6-氣-9Η-嘌呤-2-基胺磷 酸鹽、9-(4-溴-3,5-二曱基-吡啶-2-基甲基）-6-氣-911-嘌呤-2-基胺氫氣酸鹽、6·溴-9-(4-溴-3，5-二甲基-吡啶-2-基曱 基）-9H-嘌呤-2·基胺、6-溴-9-(4-溴-3,5-二甲基-1-氧基-吡 啶-2-基甲基）-9H_嘌呤-2-基胺、2-(2-胺基-6-氣-嘌呤-9-基 甲基）-3,5-二曱基-吡啶-4-醇、9-(4-烯丙基氧基-3,5-二曱 基-吡啶-2-基甲基）-6-氣-9H-嘌呤-2-基胺、6-氯-9-[4-(2-乙 氧基-乙氧基）-3,5-二曱基·吡啶-2-基甲基]-9H-嘌呤-2-基 胺、6-氯-9-(4-環丙基甲氧基-3,5-二甲基·吼啶-2-基曱基）-9H-嘌呤-2-基胺、6-氣-9-(4-異丁氧基-3,5-二甲基-吡啶-2-基甲基）-9H-嘌呤-2-基胺、6-氣-9-(4-氣-3,5-二曱基-吡啶-2-基曱基）-9H-嘌呤-2-基胺、6-氣-9-(3,5-二甲基-吡啶-2-基 甲基）-9H-嘌呤-2-基胺及6-溴-9-(4-甲氧基-3,5-二甲基-吡 啶-2-基甲基）-9H_嘌呤_2-基胺磷酸鹽。PKR抑制劑類似物 描述於 Jammi 等人，Biochem. Biophys. Res. Commun.， 3 08:50-57, 2003 (Calbiochem 目錄號第 527450號）中。 術語"PKR表現"係指編碼PKR之核酸序列之轉錄及轉 譯，其產物包括前軀物RNA、mRNA、多肽、轉譯後加工 135310.doc -20- 200924744 之多肽及其衍生物，且包括來自諸如鼠或猴酶之其他物質 之PKR。以實例之方式，PKR表現之檢定包括自體磷酸化 檢定（Der 及 Lau，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:8841-8845, 1995)、eIF2a峨酸化檢定（Zamanian-Daryoush，M.等人， Oncogenes，18:3 15-326，1999)、藉由 PKR 免疫沈澱及活體 外激酶檢定進行之激酶檢定（Zamanian-Daryoush，M.等 人，Mol. Cell. Biol.，20:1278-1290, 2000)。用於PKR表現 及/或產生之例示性檢定包括諸如西方墨點法之蛋白質檢 定，及用於PKR mRNA之檢定，諸如反轉錄酶聚合酶鏈反 應（RT-PCR)檢定、北方墨點分析、點潰墨法分析或使用經 適當標記之探針基於編碼PKR之核酸序列進行之原位雜交 分析》 如上所述，PKR為一種使體内或細胞内蛋白質分解所涉 及之一系列其他細胞蛋白質磷酸化之蛋白質。該等靶向降 解之蛋白質不限於橫紋肌蛋白質，且包括結構性或調節性 之細胞蛋白質（例如酶及信號蛋白質、肌動蛋白絲等）。因 此，已展示抑制PKR蛋白質改變控制細胞蛋白質降解之機 制。預期PKR抑制干擾正常蛋白質代謝且限制新蛋白質之 降解與合成。 源於投與本發明之PKR-Ι之用途及益處如下文所討論： 在癌症治療應用中：由於已展示PKR抑制劑（PKR-Ι)抑制 與泛素介導之蛋白酶體路徑相關之蛋白質降解，故咸信 PKR-Ι減少腫瘤細胞之複製且因此減緩腫瘤生長，如由本 文所提供之實例所證實》使用PKR-Ι亦可促進腫瘤細胞數 135310.doc 200924744 心腫瘤抑制之機制尚未完全闌明 細胞複製循環之蛋白質以及…队 匕括干擾控制 内蛋白質。 質以及維持細胞完整性所必需之細胞 如先前所報導’ ΡΚΙΜ可用於抑料絡肌之蛋白質降 解’骨絡肌之蛋白質降解通常在癌症惡病質中上調。癌症 惡病質通常致使瘦肌肉組織極快速損失，因此增加患者死 亡之風險。
與全身投與對比，咸信將PKR_w部注射於腫瘤中保持 正常骨路肌代謝（其包括蛋白質分解），同時經由限制細胞 内蛋白質代谢而限制腫瘤細胞生長。 在自體免疫疾病中：過度發炎反應通常造成調節發炎反 應之過量蛋白質產生。由於過度發炎反應與肌肉損失及自 知傷較慢恢復直接相關，故需要調節發炎反應。因此，咸 信益處來源於投與PKR — 〗以限制產生發炎調節蛋白質（例如 急性期蛋白質（CRP)、介白素（IL_6、IL_i等））之細胞的過 量產生。 以平衡及受控方式進行自身免疫為潛在贅生性細胞之免 疫監視所必需。儘管自身免疫具有一些副作用，但其仍為 重要及自然過程。因此，預期防止製造蛋白細胞激素中所 涉及之免疫細胞之過量產生限制免疫反應且預防自體免疫 疾病。 舉例而言，在全身性紅斑性狼瘡症（SLE)中，PKR在經 活化SLE T細胞中過度表現，此與eIF2a峨酸化增加有關。 PKR之高度表現及隨後之eiF2a磷酸化可能（至少部分）產生 135310.doc •22- 200924744 SLE患者T細胞中對有絲分裂原之受損之轉譯及增殖反 應。Grolleau，Α.等人，j. Clin. Invest, 106 (12):1561-1568, 2000 〇 在過敏症中：對各種抗原或效應子之過敏反應藉由蛋白 免疫球蛋白E(IgE)介導，該lgE由B細胞在與抗原（例如花 粉）接觸時產生。因此，咸信使用PKR-I藉由經由限制B細 胞來減少IgE產生而有利於個人。此類似於由不同類型之 稱為奥瑪利珠單抗（Omalizumab，Xolair®-Novartis)之化合 物所提供之功能。與蛋白質分解抑制劑相比，奥瑪利珠單 抗為一種以減少過敏性超敏反應為目的而用於過敏相關哮 喘治療之單株抗體。 在慢性阻塞性肺部疾病（COPD)中：由於與COPD相關之 病狀（包括"慢性支氣管炎"）通常與氣管之黏液產生杯狀細 胞的增生及過度生長相關，咸信使用PKR-I減少與COPD相 關之症狀。黏液分泌減少有助於氣管阻塞，因此有利於以 PKR-I治療之個人。此外，COPD與發炎相關，繼而使組織 產生傷痕及重塑，使氣管變窄。 在局部施用中：咸信PKR-I有利於多種皮廣病狀，包括 (但可不限於）異位性皮膚炎、濕疹及牛皮癣。在異位性皮 膚炎中，存在免疫系統之過量反應產生發炎、刺痛及腫痛 之皮膚，此可由投與PKR-I控制。 在免疫營養中：使用免疫營養（諸如第二代Impact®)以 調節發炎及減少感染常見於進行癌症手術之患者中。預期 藉由PKR-I進一步控制細胞激素產生減少發炎細胞激素之 135310.doc -23- 200924744 過度表現。 在化學治療中：新近研究已表明，自牛奶中分離之特定 生物活性肽在細胞週期停滯在G〇期（細胞衰老）時具有細胞 保護特性。咸信PKR-I改變控制細胞週期之蛋白質之降 解。因此，咸信在活性化學及放射療法期間限制細胞複製 保護健康細胞。 • 在糖尿病中：對於I型糖尿病而言，如在自身免疫中， 如上所述》在II型糖尿病甲，胰腺之β細胞在完全胰島素依 ❹ 賴、成人發作糖尿病之最後階段之前分泌過量胰島素。因 此，咸信PKR-I可用於局部投與以預防胰島素分泌過多。 在庫欣病中：庫欣氏病係由腦垂體中腫瘤之存在引起， 該腫瘤促進過量皮質醇分泌。因此，咸信局部及/或全身 投與PKR-I將預防腫瘤生長且可能減少皮質醇之合成。在
皮質醇促進瘦趙質損失之其他慢性應激反應中亦可見其他 益處Q ❹ 在器官移植中：使用PKR-1減少對外來抗原呈遞作出反 應由此促成器官排斥之免疫蛋白質之表現。 在風濕熱及風濕性器官疾病中：風濕熱及風濕性器官疾 病為一種發炎疾病，其可發展為未經治療或在治療中之由 • 感染A族鏈球菌（汾〜Piococcws)引起之鏈球菌感染的罕見併 發症。未知風濕熱及風濕性器官疾病之確切病因，但醫學 研究已集中於對由特定類型之鏈球菌產生之抗原的異常免 疫系統反應。來自該感染之抗原反應致使錯誤地侵襲器 S、肌肉及關節之抗體產生。無治療風濕熱及風濕性器官 135310.doc •24- 200924744 疾病之方法，而該病狀之醫學治療包括用以治療鏈球菌感 染及預防未來感染之抗生素處方及緩解疾病症狀之其他藥 物。因此，暫時減少抗體產生以提供抗生素療法之時間將 藉由經由PKR-Ι達成之蛋白質合成抑制來實現。 在早老症中：早老症（希臘語，，，老齡"）特指哈-吉早老症 症候群（HUtchinson_Gilford ProgeHa syndr〇me)或通常指其 他加速老化之疾病。早老症為一種極其罕見之疾病，其中 ❹ —些老化態樣通常被加速’纟中少數患病兒童存活超過13 貞。其為遺傳病狀，但會偶然發生且並不在家庭中遺傳。 無已知治療早老症之方法，但已有若干發現。已提出以生 長激素（Sadeghi-Nejad，A.等人，j. Pediatr. End〇crin〇1
Metab.’ 20 (5):633-637, 2007)及法呢基轉移酶抑制劑 (Meta, M.等人，Trends M〇I Med，12 (1〇):48〇 487, 2〇〇6) 治療。2003年，M. Erikss〇n等人報導早老症可為一種新生 之顯性性狀且在新懷孕胎兒中或雙親中之一者之配子中的 〇 細胞分裂期間產生。其係由染色體1上之LMNA(核纖層蛋 白（LaminM)基因中之突變引起。在早老症中，將核纖層 蛋白A則體裂解為核纖層蛋白a所需之酶（蛋白酶）的識別位 點犬變。不能產生核纖層蛋白A且在核臈上積累核纖層蛋 白A前體，引起特徵性核出泡（[抓％ H等人，44〇 (7080):32-34, 2006)。此引起早老症之過早老化症狀。將 早老症患者細胞與來自LMNA年輕及老齡人類受檢者之皮 膚、，、田胞對比之研究在早老症及老齡細胞中發現類似缺陷， 包括某些核内蛋白質下調、DNA損傷及組蛋白脫甲基化增 135310.doc •25· 200924744 加’使得異染色體減少。使用PKR抑制劑以減少蛋白質表 現’該等蛋白質諸如核纖層功能障礙中所涉及之經報導引 起早老症之蛋白質（例如核纖層蛋白A前體）。 除非另有說明，否則如本文中所使用之術語，，胺基酸"係 指以下胺基酸中之至少一者：必需胺基酸，例如異白胺 酸、白胺酸、離胺酸、曱硫胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、色 胺酸、綠胺酸或組胺酸；條件必需胺基酸，例如酪胺酸、 ❹ 半胱胺酸、精胺酸或麩醯胺酸；或非必需胺基酸，例如甘 胺酸、丙胺酸、脯胺酸、絲胺酸、麩胺酸、天冬胺酸、天 冬酿胺酸、牛磺酸或肉鹼。 除非另有說明，否則如本文中所使用之"必需胺基酸" (EAA)係指以下胺基酸中之一者的至少一來源：異白胺 酸、白胺酸、離胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、色 胺酸、纈胺酸及組胺酸。 此外’認為胺基酸精胺酸、半胱胺酸、甘胺酸、麵醯胺 ❹ 酸及酪胺酸為條件必需胺基酸，意謂其通常無需在膳食 中’但必須向不合成足夠量之特定群體外源供應。 如本文中所使用之"支鏈胺基酸"係指以下胺基酸中之至 . 少一者，例如白胺酸、異白胺酸或纈胺酸。 • L•茶胺酸或7_乙基胺基-L麩胺酸（亦稱為SuntheanineTM) 為一種獨特胺基酸’其僅在茶葉（例如紅茶、烏龍茶及綠 茶（中國茶（Cawe/"a 之浸液））中見到。茶胺酸與麩 醯胺酸相關且可穿過血腦屏障。由於茶胺酸可進入大腦， 故其具有精神活化特性。已展示茶胺酸減少心理及實體應 135310.doc -26- 200924744 激且在與咖啡鹼組合攝取時可產生鬆弛感覺且改良認知及 隋緒。如所展示，L-茶胺酸促進α-腦電波（一種鬆弛指數） 之產生。其亦可提高對微生物感染及可能甚至腫瘤的天然 抵抗力。50 mg至200 mg之劑量可提供鬆弛作用。未表明 L-茶胺酸使免疫系統功能增強的劑量；然而，在初步研究 中志願者一曰消耗約6〇〇 mL茶。 . 如本文中所使用之"益菌助生質"為不易消化之食品成 份，其在向宿主或受檢者之消化道提供時相對於病原性細 ® 菌物種選擇性刺激一種或有限數目之有益細菌物種的生長 及/或活性^益菌助生質包括酵母、酵母培養物、真菌培 養物及已知膳食纖維’諸如多醣及寡醣，諸如果募醣 (FOS)及瓜耳膠，尤其部分水解瓜耳膠（pHGG)及果膠。"益 生菌為有效細菌物種，其在引入宿主或受檢者之消化道 時有效定植且產生有益作用。較佳地，.益生菌包括乳酸桿 菌及雙歧桿菌（如力⑷中之一或多 φ 者。術浯"合益素"係指益菌助生質與益生菌之混合物，其 藉由改良活微生物膳食補充劑在宿主或受檢者之胃腸道中 之存活及植入而有利地影響宿主。 - "必需脂肪酸"或”EFA,，可指身體可用之任何脂肪酸且可 • 分類為可在自然界中見到或合成產生之飽和、多不飽和或 單不飽和脂肪酸。EFA可包括（但不限於）膽固醇、前列腺 素、卵磷脂、膽鹼、肌醇、共軛次亞麻油酸、肉豆蔻酸、 軟脂酸、硬脂酸、油酸' 次亞麻油酸、十二碳五烯酸、 二十二碳五烯酸、二十二碳六烯酸、次亞麻油酸、γ_次亞 135310.doc -27· 200924744 麻油酸、ω-3脂肪酸、ω-6脂肪酸、ω-9脂肪酸、多不飽和 脂肪酸、長鍵多不飽和脂肪酸、花生四烯酸、單不飽和脂 肪酸、脂肪酸之前軀物及脂肪酸之衍生物。根據本發明用 於預防或治療惡病質或厭食症之有效組合物可包括具有 EFA中之至少一者之混合物的組合。 上文所提之營養物之每日傳遞可視個體或受檢者之體 重、性別、年齡及/或醫學病狀而變化。 營養干預 使用靶向營養物以在活性放射治療及/或化學治療期間 增加細胞毒性或與本發明之PKR-I組合使用靶向營養物以 達成最佳效果如下： 在細胞毒性方面：咸信自由基誘導營養物增加對病態及 腫瘤細胞之損傷。實例包括以下各物： a.鐵、亞硝酸鹽/硝酸鹽 b·少量維生素E、C、B複合物及硒及其他抗氧化劑 c.増加之植酸鹽（二價螯合劑）、l-茶胺酸以阻斷楚醯胺 酸吸收。 在細胞保護方面’咸信以下營養物在化學治療期間防止 正常細胞遭受免疫侵襲及細胞損壞及損傷： a. 抗氧化劑：麩醢胺酸、半胱胺酸、維生素a、維生素 C、維生素E及硒 b. 用於合成代謝之離胺酸—正白胺酸（BcaA類似物） c. 用於合成代謝之核苷酸（或循環中之核苷酸片段） d. 大量多不飽和脂肪酸（PUFA)/單不飽和脂肪酸（mufa) 135310.doc -28 - 200924744 以增加膜流動性及防止反應性氧化劑損傷 e，唾液酸寡醣以改良腸細胞健康及減少病原生物體及化 合物之滲入。 諸如益生菌、益菌助生質及合益素之產品之用途在文獻 中充分記載。舉例而言，已知益生菌（a)降低與抗生素、輪 狀病毒感染、化學治療相關之腹瀉的頻率及持續時間，且 • 將旅行者腹瀉降低至較低程度；（b)刺激細胞及體液免疫； 及減少結腸中之不利代謝物，諸如銨及前致癌酶。益生 菌在癌症預防中具有可能之作用。參見Schrezenmeir，】等 人，Am. J· Clin. Nutr.，73(增刊）：361S_364S，2〇〇1。如本 文中所使用之術語"益生菌"係指足夠數量之存活所定義微 生物的製劑或含有足夠數量之存活所定義微生物的產品， 其在宿主之腔室中改變微生物群（藉由植入或定植），且藉 此在該宿主中發揮有益作用。術語"益菌助生質"係指不易 消化之食品成份，其藉由選擇性刺激結腸中一種或有限數 〇 目之細菌的生長及/或活性而有利地影響宿主。舉例而 言，雙歧桿菌將藉由攝取諸如果募糖、菊糖、轉半乳糖苦 化寡糖及大丑寡糖之物質而促進。當產品含有益生菌及益 菌助生質時使用術語"合益素、因為術語"合益素"暗指協 .目作用，故其用於益菌助生質化合物選擇性有利於益生菌 化合物之產品。在嚴格意義上，其為含有寡果糖及益生菌 雙歧桿菌之產品。參見Schrezenmeir，J等人，2〇〇1前述。 在存在或不存在營養化合物之情況下使用激酶抑制劑增 強化療劑在癌腫瘤治療中之功效。其他益處包括營養調節 135310,doc •29· 200924744 調節肌肉損失、尤其癌症惡病質之代謝路徑。 就投與PKR-Ι而言’與化療劑（例如5_氟尿嘧啶或吉西他 濱）組合與僅使用任一者相比，雙股RNA蛋白激酶磷酸化 更有效地引起細胞（MAC16實體腫瘤）生長減少。 此外，投與PKR抑制劑可用於減少前發炎性細胞激素核 因子-κ-Β (NF-κΒ)之活性形式。認為NF-κΒ與某些腫瘤細 胞對化學治療藥物（例如吉西他濱（Arlt，A.等人，
Oncogene，22 (21):3243-3251，2003)及 5-FU (Uetsuka，H.等 人，Exp Cell Res.，289 (1):27-35, 2003))之抗性相關。因 此，投與PKR-抑制劑在其增強化學治療之能力方面可為直 接或間接的。其中兩者均為通常用於治療贅生性生長（例 如結腸癌）之化合物。 本發明之發明者已展示PKR抑制劑在以極特定濃度（在 200 nM下作用最大，在較低及較大濃度下作用減小）引入 時降低癌細胞生長。此外，抑制PKr進一步減少曝露於化 學治療藥物之癌細胞增殖。與單獨使用任一化合物所觀察 到之抑制相比，細胞抑制似乎為協同作用（參見圖8)。咸信 投與結構上與PKR-抑制劑化合物無關之特定營養化合物亦 降低癌細胞生長且預防癌症惡病質。然而，營養化合物經 由不同於前述PKR抑制劑化合物之機制（Jammi等人，2〇〇3) 發揮作用。 營養減緩化學治療之免疫抑制： 已知一些化療劑引起免疫抑制’兩個實例包括5_氟尿嘧 咬及吉西他濱。 135310.doc -30- 200924744 5-氟尿嘧咬（5-FU)為作為一些類型之癌症（包括腸癌、乳 癌、胃癌及食道癌）之治療提供之通用化學治療藥物。與 使用5-FU相關之併發症為對感染之抵抗力降低。5_FU可降 低骨趟之白血球產量，使患者更傾向於受感染。 吉西他濱為作為非小細胞肺癌、胰腺癌、膀胱癌及乳癌 之治療提供之化學治療藥物。吉西他濱亦可降低骨趙之白 ▲•球產量，增加患者對感染之敏感性。免疫功能之顯著降 低通常開始於治療給藥之後7日，且對感染之抗性通常在 化學治療之後10-14日之間最低。血細胞通常將穩步增 加，且在預定之下一化學治療過程之前恢復到正常水準。 咸信麩醯胺酸藉由維持免疫功能而向接受化學治療之患 者提供益處。先前已表明營養與化學治療之相互作用。抗 氧化劑藉由在細胞内提前分解藥物而降低化學治療之功 效，此有益於健康細胞但在腫瘤細胞中不適宜。胺基酸麵 醯胺酸可促進化療藥物分解，因為其為細胞間抗氧化劑谷 胱甘狀（GSH)之組份（Rouse, K.等人，Annals Surge., 221 (4):420-426, 1995)。因此，已表明以胺基酸L_茶胺酸阻斷 細胞吸收麩醯胺酸為一種增強阿黴素（d〇x〇rubicin)情況下 之化學治療之方法（Sugiyama，T·及Adzuki，Y.，Biochip. Biophys. Act，1653 (2):47-59, 2003)。然而，並非所有研究 均支持該針對麩醯胺酸之主張（Rubi〇，ΐ.τ.等人，Ann Surg.，227 (5):772-778, 1998)。雖然 GSH 可能促使化療化 合物降解以試圖保護細胞’但麵醯胺酸亦為適當免疫細胞 功能之重要組份。儘管證據建議降低麵醯胺酸，但免疫功 135310.doc 200924744 能之作用將損害患者健康及恢復。 免疫營養：化療功效之虛高（ostentation)(以PKR抑制劑 達成）可能增加患者感染之風險。感染及感染風險可降低 腫瘤學家投與成功治療所需之侵襲性劑量之化學治療的意 願。此外，亦可損害患者耐受有效治療方案以及自治療相 關之共病或手術創傷恢復/癒合之能力。具有包括消炎脂 肪酸（例如十二碳五烯酸及二十二碳六烯酸）、胺基酸^精 ❹ 胺酸及其前軀物、L-瓜胺酸及核糖核酸之成份的營養補充 可經由T細胞活化、成熟及減少發炎而促進免疫健康。 生物活性牛奶衍生蛋白質：生物活性牛奶衍生蛋白質提 供生物活性肽（例如轉化生長因子_β (同功異型物1·3))之來 源’其減緩或暫時停滯健康細胞中之細胞週期分裂。該等 生物/舌性蛋白質需要經由加工（諸如酸化）活化，且因此標 準牛奶並不合適。咸信投與該等來自牛奶之生物活性蛋白 質保護與該蛋白質接觸之細胞，諸如經口、經食道及經胃 〇 腸上皮投與。該等生物活性肽藉由降低迅速分裂細胞對因 化療劑（在存在或不存在PKR抑制劑的情況下）之損傷的敏 感性而發揮作用。 核苷酸（例如核糖核酸）：咸信該等化合物（例如腺嗓呤、 ' 鳥嗓吟、胞嘧啶）為接受化學治療之癌症患者提供免疫系 統維持，尤其在該化學治療方案與諸如PKR抑制劑之增效 劑組合提供的情況下。核苷酸維持骨髓形成及其包括紅血 球與T細胞（免疫細胞）之產物成熟。此外，正對核苷酸促 進藥物吸收之潛力進行研究，因此，咸信核苷酸之營養補 135310.doc 32- 200924744 充由於增加腫瘤細胞之化療劑吸收及維持免疫功能而有 益。 血管生成及血管擴張營養物：促進血管生成及血流量之 營養物亦增加化療劑至代謝活性組織之傳遞。在癌症患者 中不推薦營養投與胺基酸L-精胺酸及/或L-瓜胺酸以及兒茶 素黃烷醇化合物（認為其為癌症之化學預防劑），因為其可 月&促使血管生成’即快速生長之侵襲性腫瘤之特性。然 而，增加血液傳遞至（尤其）腫瘤亦將增加細胞毒性化療劑 ® 之吸收。 在存在或不存在特定營養物的情況下投與PKR抑制劑對癌 症惡病質之削弱作用 癌症惡病質、心臟惡病質及包括骨骼肌減少症、 HIV/AIDS等之可能的其他病狀十之肌肉蛋白質損失由亞 單位聯合及/或上調之蛋白體產生控制。該過程之步驟中 之一者包括真核起始因子2_a (eIF2a)之活化。eif2a之經由 〇 磷酸化的活化促使蛋白體蛋白質降解。投與PKR抑制劑減 v eIF2a刀子之活化（磷酸化），由此減少蛋白體之活化且減 少肌肉蛋白質分解。 已展不經由在存在或不存在其他營養物的情況下投與 - PKR抑制劑增加化學治療之效能且抑制癌症惡病質之過程 增加化學治療藥物對腫瘤細胞之作用。本發明之益處在於 其可減少引發臨床相關作用所必需之時間長度或劑量數。 先前已進行研究以評估抑制PKR之化合物，但先前尚未證 實PKR之抑制具有癌症治療益處。其他益處亦可由投與 135310.doc -33- 200924744 PKR抑制劑及包括胺基酸、脂肪酸、核酸之特定營養化合 物獲得以進一步增強化學治療且削弱治療相關毒性。 PKR抑制劑阻斷癌症惡病質中所涉及之pKR磷酸化及腫 瘤對治療之H結果證實該等化合物在癌症治療中之激 發潛力。此外’使用作用於獨立蛋白質(ρρι)或直接作用於 PKR以減少PK㈣酸化之特定營養物亦表明其具有作為癌 症治療中之共治療劑之潛力。營養物（胺基酸、多盼類）與 醫藥級化合物相比之益處為：不同的作用機制、價格、安 全性及可經由替代性零售渠道得到。 如本文中所使用，術語"活性劑"、"活性成份"、"活性化 合物"或在一些情況下"化合物”之含義應理解為等同的。 從而術語"PKR之生物活性"及”生物學活性pKR"係指與 PKR或PKR之片段 '衍生物或類似物相關之任何生物活 性’諸如酶活性’尤其包括自體磷酸化活性及激酶活性， 包括受質（諸如真核轉料始因子2 (eIF_2)及轉錄因子諸如 NF_kB)之磷酸化。 "離體”意謂在獲得細胞或分離到細胞株之生物體的體 外。離體應用可包含使用完整細胞，或使用無細胞系統 (亦即活體外），諸如溶胞物。 "活體内"意謂在獲得細胞或分離到細胞株之生物體的體 内。 "人類細胞”意謂自任何發育階段之人類分離之細胞。 "患者"或"受檢者”意謂任何動物。 動物包括(但不限於)禽類及哺乳動物，纟中哺乳動物包 135310.doc -34 - 200924744 諸二不限於)齧齒動物(鼠)；水生哺乳動物丨家養動物， 、狼兔及貓科動物；農場動物，諸如綿羊（羊 類）、豬（豬類）、母牛（牛類）、山羊（羊類（hi㈣ne))及馬（馬 人類。若使用術語動物或哺乳動物或其複數形 式，則預期其亦適於能夠產生由本段上下文所展現或意欲 展現之作用的任何動物。可使用本發明之方法、組合物及 套組/σ療之其他動物包括渐踢蛇、魚及鳥。 ^ "哺乳動物”意欲包括（但不限於））蓄齒動物（鼠广水生哺 乳動物；家養動物，諸如犬、狼、兔及描科動物；農場動 物，諸如綿羊（羊類）、豬（豬類）、母牛（牛類）、山羊（羊類） 及馬（馬類）；及人類。若使用術語哺乳動物，則預期其亦 適於能夠產生由哺乳動物所展現或意欲展現之作用的其他 動物。 如本文中所使用之術語”殘基"或”胺基酸殘基"或"胺基酸，, 係指併入蛋白質、多肽或肽（總稱為”肽”）中之胺基酸。該 》 胺基酸可為天然存在之胺基酸且除非另作限制，否則可涵 蓋可以類似於天然存在之胺基酸之方式發揮作用之天然胺 基酸的已知類似物。 術語"癌症”係指各種類型之惡性贅瘤，其中之大多數可 侵襲周圍組織且可轉移至不同位點（PDR Medical Dictionary， 第一版（1995))。 術語"贅瘤"及"腫瘤"係指一種異常組織，其藉由細胞增 殖快於正常組織生長且在移除起始增殖之刺激之後繼續生 長（PDR Medical Dictionary，第一版（1995))。該異常組織 135310.doc • 35- 200924744 =部分或完全缺乏與正常組織之結構組織及功能協調， “、常紐織可為良性的（亦即良性遽瘤）或惡性的（亦即$、性 腫瘤）。 〜 化療與異常細胞增殖相關之病症"意欲包括預防受 . ★者中贅瘤之生長或減少受檢者中原有贅瘤之生長。該抑 制亦可為抑制贅瘤自一位點轉移至另一位點。在一態樣 中，贅瘤對一或多種本文所述之轉譯起始抑制劑敏感。意 ❹ 欲由本發明涵蓋之贅瘤類型之實例包括（但不限於）與以下 ;疒相關之贅瘤：乳癌、皮膚癌、骨癌(包括骨髓及造血 組織癌）、前列腺癌、印巢癌、子宮癌、子宮頸癌、肝 癌、肺癌、腦癌、喉癌、膽囊癌、胰腺癌、直腸癌、副甲 狀腺癌、甲狀腺癌、腎上腺癌、免疫系統癌症、神經組織 癌頭頌癌、結腸癌、胃癌、支氣管癌及/或腎癌。 如本文中所使用之"測試樣品"係指由所關注之受檢者獲 得之生物樣品。舉例而言，測試樣品可為生物流體樣品 〇 (彳丨如血清、唾液、尿）、組織樣品（例如生檢組織）或細胞 樣品（例如面頰刮擦物）。如本文中所使用之"正常樣品" 或”標準樣品"係指由健康（亦即非惡性）生物流體樣品、組 織樣品或細胞樣品獲得之生物樣品。如本文中所使用之術 • 語"生物樣品"意欲包括由受檢者分離之組織、細胞及生物 流體以及存在於受檢者内之組織、細胞及流體。生物樣品 可具有任何生物組織或流體或細胞。典型生物樣品包括 (但不限於）唾液、淋巴、血液、血細胞（例如白細胞）、脂 肪細胞、子宮頸細胞、面頰細胞、咽喉細胞、乳房細胞、 135310.doc •36· 200924744 肌肉細胞、皮膚細胞、肝細胞、脊椎細胞、骨髓細胞、組 織（例如肌肉組織、子宮頸組織、皮膚組織、脊椎組織、 肝臟組織及其類似組織）微小針刺生檢樣品、尿、腦脊髓 液、腹膜液及胸膜液或其細胞。生物樣品亦可包括組織之 部分，諸如針對組織學目的而獲得之冰凍切片。生物樣品 可由哺乳動物獲得，該哺乳動物包括（但不限於）馬、母 牛、綿羊、猪、山羊、兔、脉鼠、大鼠、小鼠、沙鼠、非 人類靈長類及人類。生物樣品亦可包括來自微生物之細胞 (例如細菌細胞、病毒細胞、酵母細胞及其類似細胞）及其 部分。 MAC16腫瘤源自於經化學誘導、可移植之結腸腺癌之經 建立系列（MAC) ’且由特定細胞株產生，該細胞株於1989 年3月8日以臨時登錄號8903016現存放於Public Health Laboratory Service Centre for Applied Microbiology and Research, Porton Down, Salisbury, Wiltshire, United
Kingdom 的 European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC)中。 MAC 16腫瘤是為適度地經良好分化的腺癌瘤，其已在小 鼠經連續繼代多年。咸已發現其似乎可代表人類患者中誘 導惡病質之腫瘤提供較令人滿意之實驗模型，尤其目前通 常發現其在較小腫瘤負荷（小於1 %體重）下及在不減少食品 或水之攝取的情況下，可產生相當大之體重減輕。 醫藥組合物 本文所述之本發明化合物或藥劑為（例如）藉由抑制eIF2a 135310.doc •37· 200924744 或PKR磷酸化而影響eIF2a或PKR磷酸化或增強影響eIF2a 或PKR磷酸化之化合物或藥劑的化合物或藥劑。本發明化 合物或藥劑可併入適於投藥之醫藥組合物中。 ❹ ❹ 包括PKR-Ι之至少一種抑制劑、pKRd之至少一種磷酸化 抑制劑及/或PKR-Ι之增效劑的本發明化合物可經腸或非經 腸投與。非經腸投藥可選自由以下各方式投藥組成之群： 皮下、靜脈内、肌肉内及局部投藥。可參與之投藥可為錠 劑、液體、凝膠劑、藥囊、散劑、口含劑、薄臈、膠狀物 及膠囊形式》此外，可投與之投藥方法之途徑可選自由以 下途徑組成之群··鼻内、内部（interior丨y)、鼻胃管、口胃 管胃口、空腸口及迴腸口。 本發明化合物通常可包含上述化合物及醫藥學上可接受 之載劑。如本文所使用之術語"醫藥學上可接受之載劑"意 欲包括任何及所有與醫藥投藥相容之溶劑、分散介質、包 抗細菌及抗真菌劑、等張及吸收延遲劑及其類似 物。該等介質及藥劑用於醫藥學活性物質之用途為此項技 術中所熟知。除非任何習知介質或藥劑與活性劑不相容， 函蓋其在組合物中之用途。補充營養劑亦可併入 明之組合物中。 本發明醫藥組合物係經調配以與其所欲之投藥途徑相 容。舉例而> < β ’用於非經腸、皮内或皮下施用之溶液或懸 浮液可包枯、 乂下組份：無菌稀釋劑’諸如注射用水、生理 食鹽水溶液、 不揮發性油、聚己二醇、甘油、丙二醇戎盆 他合成溶劑；醇次其 ⑴，抗菌劑，諸如苯曱醇或對羥基苯曱酸甲醋； 13531〇.(j〇c -38· 200924744 抗氧化劑，諸如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑，諸如乙 二胺四乙酸；緩衝劑’諸如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽； 及調㈣力之試劑，諸如氣化鈉或右旋糖。可以酸：鹼 (諸如氫氣酸或氫氧化納）調節阳值。可將非經腸製劑封裝 • 於由玻璃或塑膠製成的安瓶、拋棄式注射器或多次劑量小 瓶中。 • 冑於可注射用途之醫藥組合物包㈣g水溶液（在水溶 〇 ’社情況下)或分散液及用於實時製備無菌可注射溶液或分 散液之無菌散劑。就靜脈内投藥而言，合適載劑包括生理 鹽水、抑菌水、Cremoph〇r EL™ (BASF，Parsippany N j)或 碟酸鹽緩衝鹽水(PBS)。在所有情況下，組合物必須無菌 且應為在-定程度上易於注射之流體。其在製備及儲存條 件下必須穩定，且必須防止微生物（諸如細菌及真菌）之污 染作用而保存。載劑可為含有下列各物之溶劑或分散介 質：（例如）水、乙醇、多元醇（例如甘油、丙二醇及液體聚 Φ 乙二醇及其類似物）及其合適混合物。可例如藉由使用諸 如印磷脂之包衣，藉由保持所需粒度(在分散液的情況 )及藉由使用界面活性劑來保持適當流動性。預防微 •生物之作用可藉由多種抗菌劑及抗真菌劑（例如對羥基苯 甲酸自曰、氣丁醇、苯酚、抗壞血酸、硫柳汞及其類似物） 來達成。在許多情況下，較佳地在組合物中包括等張劑， 例如糖、多元醇（諸如甘露糖醇、山梨糖醇、氣化鈉p可 藉由在組合物中包括延緩吸收之藥劑（例如單硬脂酸鋁及 明膠）來引起可注射組合物之吸收延長。 135310.doc -39- 200924744 可藉由將於適當溶财之所需量的活性化合物與以上所 列舉之成份中之—者或組合合併，視需要繼而進行過據滅 菌來製備無菌可注射溶液。_般而言，藉由將活性劑併入 含有基本分散介質及以上所列舉之所需其他成份的1菌媒 劑中來製備分散液。在用於製備㈣可注射溶液之無菌散 劑的情況下，較佳製備方法為真空乾燥及冷魏燥其產 生活性成份加上來自其先前無菌過濾之溶液的任何其他所 需成份的散劑。 ❹
口服組合物通常包含惰性稀釋劑或可食用載劑。其可封 裝於明膠膝囊中或壓製成錢劑。出於口服治療投藥之目 的，活性劑可與賦形劑合併且以錠劑、片劑或膠囊之形式 使用。口服組合物亦可使料體_來製備以制作漱口 劑’其中流體載劑中之藥劑係經口施用且漱口且吐出或吞 下。可包括醫藥學上相容之結合劑及/或佐劑物質作為组 合物之-部分》鍵劑、丸劑、勝囊、片劑及其類似物可含 有以下成份中之任-者或具有類似性質之藥劑：黏合劑， 諸如微晶纖維素、黃f膠或明膠；賦形劑，諸如殿粉或乳 糖；崩解劑，諸如海藻酸、澱粉羥基乙酸鈉或玉米澱粉； 潤滑劑，諸如硬脂酸鎂或氫化植物油（Ster〇tes);滑動劑， 諸如膠體二氧化矽；甜味劑’諸如蔗糖或糖精；或調味 劑，諸如胡椒薄荷、水楊酸甲酯或橙味劑。 在一實施例中，本發明之化合物係以保護藥劑免於由 内快速消除之載劑製備，諸如包括植人物及微膠囊化傳遞 系統之控制釋放調配物。可使用生物可降解、生物相容性 1353 丨 0.doc .40· 200924744 聚合物，諸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、膠原 蛋白、聚原酸酯及聚乳酸。製備該等調配物之方法對於熟 習此項技術者顯而易見。該等物質亦可由Alza c〇rp〇rati〇n
❹ 及Nova PharmaCeuticals，Inc.商業上獲得。脂質體懸浮液 (包括以病毒抗原之單株抗體靶向受感染細胞之脂質體）亦 可用作醫藥學上可接受之載劑。其可根據熟習此項技術者 已知之方法（例如美國專利第4,522,811號中所描述者，該 專利之全文係以引用的方式併入本文中）來製備。 營養組合物 化學治療及放射治療不僅有效破壞癌細胞，而且其由於 引起非癌細胞過早死亡而對該等細胞亦有害。此外，本發 明之化合物不僅可藉由抑制PKR磷酸化來抑制腫瘤細胞生 長，而且亦可增強化療劑在癌症患者中之功效。如上所討 論’本發明之化合物包括至少—種單獨或與至少—種增效 劑組合之PK1U。除經調配以用於f藥目的之外，該等化合 物可如上所討論經營養調配以達成所需目的。 本發明之營養組合物可為膳食方式之形式，例如補充 劑’或為營養調配物之形式，例如醫學食品或飲料產品， 例如為完全齡、腾食之-部分之形式，作為食品添加劑 或供溶解用之散劑。散劑可與液體(例如水)或其他液體(諸 如牛奶或果汁）組合。 視情ί兄’營養調配物不僅包括太双ηα 匕栝本發明之化合物，且可完 全為營養的，亦即可包括礦物皙 啊卿員、維生素、微量元素及脂 肪及/或脂肪酸來源’以使其可用获垃破 又丹』用作營養之唯一來源提供 135310.doc •41 · 200924744 f本上所有所需每曰量之維生素、礦物質、碳水化合物、 月曰肪及/或脂肪酸、蛋白質及其類似物。 ，因本發明之營養組合物可以營養平衡之完全膳食之 f式提供’例如適合於經口或經管進食，例如藉助於鼻胃 管、鼻十二指腸管、食管、胃管或空腸管，或周邊或總非 經腸營養進食。較佳地’本發明之組合物係用於經口投 藥。 本發明之營養組合物可用於促進肌肉蛋白質合成或控制 腫瘤誘導之體重減輕，諸如惡病質，例如癌症惡病質。其 亦可用作患有自體免疫錢或使用化療劑之其他病症之患 者的營養補充劑。 在本發明之一特徵中，營養組合物可另外包括（但不限 於）生物活性蛋白質、支鏈胺基酸、必需胺基酸、胺基酸 或胺基酸類似物、核苷酸或RNA、維生素、麵醯胺酸、唾 液酸募醣、L-茶胺酸、益菌助生質、益生菌或合益素、必 需脂肪酸、PUFA及/或MUFA、食用油及抗氧化劑。 食用油可用於製備本發明之營養組合物。食用油包括 (但不限於）菜籽油（canola)、中鏈甘油三酯（MCT)、魚油、 大豆油、大豆卵磷脂油、玉米油、紅花油、向日葵油、高 油酸向日葵油、高油酸紅花油、橄欖油、玻璃苣油、黑加 侖油（black currant oil)、月見草油及亞麻籽油。 本發明之營養組合物可另外包括可溶性纖維，例如違 脂；海藻酸鹽；卡魯冰（carubin);果膠及其衍生物，例如 來自水果及蔬菜之果膠’且更佳來自柑橘果及蘋果之果 135310.doc -42- 200924744 膠；β-葡聚糖，諸如燕麥卜葡聚糖；角又菜谬，· 入及ί角叉菜膠；富窠錨毬皦•共k ’例如K、 虽塞蘭4膠’ I)糖；阿拉伯 纖維素及其衍生物；硬葡聚糖；車 心糖， τ〜早諸如車前 殼；黏質及膠。根據本發明，膠及黏 =籽 榀衫l丄 只软住為植物滲出 物。詳a之，如本文+所使用之術語，，膠"係指通常 之蔬菜膠且更特定言之係指魔芋膠、= —1山膠、瓜爾 ❹
爾丑膠)、刺槐豆膠、樹莢豆膠、黃蓍樹膠、阿拉伯膠 刺梧桐樹膠、印度膠、料職其他相關蘋婆膠、紫花首 着、三葉草、㈣巴、羅望子粉。根據本發明可使用天匕然 及經改質（例如經水解）之可溶性纖維。根據本發明，較佳 可使用瓜爾膠，例如經水解之瓜爾膝。 上文所提之可選營養物之每日傳遞可視個體之體重 別、年齡及/或醫學病狀而變化。 本發明之營養組合物可包括一或多種脂肪酸，例如多不 飽和脂肪酸、益菌助生質或益生菌或益菌助生質與益生菌 之組合（合益素）；及生物活性化合物或提取物。 營養組合物可提供美國RDA針對維生素及礦物質（例如 鈣、鎂、鐵、辞、磷、維生素D、維生素κ)每日劑量之至 少100%，例如1〇〇%。其亦可含有抗氧化劑，包括（但不限 於）麩醯胺酸、半胱胺酸、維生素A、維生素C、維生素Ε 及碼其可尤其含有大量維生素Ε，其可用於組合物中以 促進肌肉蛋白質合成或控制腫瘤誘導之體重減輕，諸如惡 病質’例如癌症惡病質。 本發明之營養組合物可以醫學食品或飲料產品形式提 135310.doc -43· 200924744 供，例如以口服營養形式，例如作為保健飲料、現製飲 料、視情況軟飲料（包括汁液、奶昔、優格飲料、基於沙 冰（smoothie)或大豆之飲料）、以塊狀形式或分散於任何類 型之食品中，諸如培烤產品、穀物塊（cereal bar)、奶片 (dairy bar)、快餐食品、湯、早餐縠類、穆茲利（muesli)、 糖果、藥片、小甜點、餅乾、脆餅（諸如脆米餅）及奶產 β 品0 較佳地，本發明之組合物可以營養調配物形式投與，例 ® 如作為膳食之一部分，例如以保健飲料（例如即用飲料）之 形式。 固體口服劑型係以本身已知之方式製備，例如藉助於習 知混合、造粒、成型、溶解或冷凍乾燥製程製備。 本文中提及或引用之文章、專利及專利申請案及所有其 他文獻及電子可利用資訊之内容之全文係如同各個別公開 案經特別且個別地指明以引用的方式併入一般而以引用的 〇 方式併入本文中。申請者保留將任何該等文章、專利、專 利申請案或其他文獻之任何及所有物質及資訊實體併入本 申請案中之權利。 纟文所㈣性描述之本發明可在不存在本文所未明確揭 示之任何要素、限制下合適地實踐。因此’例如術語"包 含"、"包括"、，，含有"等應視為可擴大地且非限制性的。此 外，本文中所用之術語及表述已用作描述且非限制性之術 語，且並不意欲在該等術語及表述使用中排除所展示及所 描述特徵之任何等效物或其部/分，但應認識到在所主張之 135310.doc 200924744 本發明的範_内可進行各種修改。因此，應瞭解儘管已利 用較佳實施例及可選特徵特別地揭示了本發明，但熟習此 項技術者可採用本文所揭示之所體現之本發明之修改及變 化，且認為此等修改及變化在本發明之範疇内。 本文已廣泛且一般性描述本發明。屬於通用揭示内容之 較窄類型及亞組群中之每一者亦形成本發明之一部分。其 &括具有限制條件或負面限制自該等類中移除任何標的的 纟發明之通用描述，而無論所去除之物質是否在本文中特 ❹ 別地敍述。 此外，在本發明之特徵或態樣按照馬庫西 組加以描述之情況下，熟習此項技術者應認識到本發明由 此亦按照馬庫西群組之成員的個別成員或亞群加以描述。 實例 在下列實例中進一步對本發明進行界定。應瞭解雖然該 等實例表明較佳實施例，但其僅以說明之方式給出。自以 ❿ 上讶論及該等實例，熟習此項技術者可確定本發明之較佳 特徵，且在不背離本發明之精神及範疇的情況下，可對本 發明進行各種改變及修改以使其適合各種用途及條件。 ' 材料： ' 胎牛血清（FCS)及RpMI 164〇組織培養基係購自
Invitrogen (Paisley，Scotland)。L-[2,6-3H]苯丙胺酸（spec, act” S.OOTBqmmol·1)、Hybond A硝基纖維素膜及增強之化 學發光（ECL)產生套組係來自 Amersham Biosciences (Bucks， UK)。磷酸化PKR及總PKR之兔單株抗體係購得New 135310.doc -45· 200924744
England Biolabs (Herts, UK)。鱗酸化 eIF2a之兔多株抗血 清係來自Abeam (Cambridge, UK)且總eIF2a之兔多株抗血 清係來自Santa Cruz Biotechnology (CA)。過氧化酶·共輛 山羊抗兔抗體係購自Dako Ltd (Cambridge, UK)。PKR抑制 劑及 Phospho Safe™提取劑係來自 Merck Euro lab Ltd (Leics, UK)。EMSA(電泳遷移率檢定）凝膠遷移檢定套組係來自 Panomics (CA，USA)。吉西他濱（Gemzar®)係由 Eli Lilly 及 Co (Basingstoke, UK)饋贈。5-氟脲嘧咬係購自Sigma Aldridge (Dorset, UK) 〇 腫瘤維持 由 Cowen 等人（J. Natl_ Cancer Inst,，64:675-681，1980)首 次描述之MAC 16為攜帶已確定系列（MAC)之化學誘導可移 植結腸腺癌瘤的純NMRI小鼠株。MAC16腫瘤為中等良好 分化型腺癌瘤，其已在小鼠中多年連續繼代。其為在人類 患者中誘導惡病質之腫瘤提供較令人滿意之實驗模型，尤 其目前通常發現其在較小腫瘤負荷（小於1%體重）下且不減 少食物或水攝取的情況下產生相當大之體重減輕（Bibby， M.C.等人，J. Natl. Cancer Inst.，78:539-546，1987)。 使MAC16腫瘤及MAC13腫瘤在含有10% FCS之RPMI 1640培養基中在37°C下，在於空氣中之5% C02氣氛中活體 外繁殖。為進行細胞生長檢定，將細胞以每孔0.5xlO5個細 胞（MAC13)或每孔ΙχΙΟ5個細胞（MAC16)接種於24孔多孔培 養皿中且使其積累24 h，隨後添加藥物。三曰後在細胞處 於指數生長時測定細胞數目。 135310.doc -46 - 200924744 如 Bibby 等人，j. Natl. Cancer Inst” 78 (3):539-546, 1987中所述，藉由將片段皮下（se )移植於側腹中使 MAC16腫瘤及MAC13腫瘤在NMRI小鼠中活體内繼代。為 維持惡病質，用於繼代之MAC16腫瘤係選自具有確定之體 重減輕之供體動物’且在平均體重減輕為5 %時起始治 療。將動物隨機分成六組以接受每日藉由皮下注射投與之 溶劑（DMSO(二甲亞砜）：PBS(填酸鹽緩衝鹽水）；1:2〇)或1 mg/kg及5 mg/kg之PKR抑制劑。在動物體重減輕達至2〇〇/0 時’將其藉由頸部錯位處死。所有動物實驗遵循經British Home Office批准之嚴格方案，且所遵循之倫理準則滿足 UKCCR準則要求之標準（Workman，P.等人 ’ Br, j. Cancer， 77:1-10, 1998)。 蛋白質合成之量測 如 Eley，H.L.及 Tisdale，M.J.，J. Biol. Chem·，282 (10):7087-7097，2007中所述，藉由將L-[2,6-3H]苯丙胺酸 併入蛋白質中經4小時來測定MAC16及MAC13細胞中之蛋 白質合成。藉由移除組織培養基終止反應，且以冰冷之無 菌PBS洗滌三次。移除PBS且添加冰冷之0.2 Μ高氣酸，繼 而在4°C下培育20 , min。移除高氣酸之後，添加〇 j Μ NaOH，且繼而在4°C下培育30 min。藉由在37°c下再培育 20 mi η進行反應’且添加0·2 Μ高氣酸。將混合物再置於 冰上20 min。在4°C下以700 g離心5 min之後，將含蛋白質 之顆粒溶解於〇·3 M NaOH中，且測定反射活性。使用標準 比色蛋白質檢定（sigma)分析蛋白質含量。 135310.doc -47- 200924744 西方墨點分析 將腫瘤樣品（約10 mg)在500 μΐ卩11〇8?11〇3狂『6顶提取劑中 勻相化且在4°C下以15,000 g離心15 min。將胞質蛋白質部 分（10 pg)在10%十二烷基硫酸鈉/聚丙烯酿胺凝膠 (SDS/PAGE ;對於eIF2a為6%)上解析。將經解析之蛋白質 轉移於0.45 μιη硝基纖維素膜上，將其在4°C下以5%於Tris 緩衝鹽水（pH值7.5)中之Marvel阻斷隔夜。隨後將膜在0.5% Tween緩衝鹽水或TBS-Tween中洗滌15分鐘，隨後添加一 次抗體。除以1:500之稀釋度使用之磷酸化eIF2a之外，該 等一次抗體係以1:1000之稀釋度使用。將一次抗體自膜洗 脫15 min，其中每5 min使用0.1% TBS-Tween更換緩衝 液。以1:1000稀釋度使用二次抗體，且將其在45 min之後 洗脫。藉由ECL顯影，且使薄膜顯影3-6 min。藉由密度計 掃描墨點以定量差值。 電泳遷移率檢定（EMSA) 根據 Andrews 及 Faller 之方法（Nucleic Acids Res.，19 (9):2499, 1991)藉由低滲透壓溶解繼而高鹽提取核*Dna_ 結合蛋白質自腫瘤樣品分離。使用panomics EMSA”凝膠 遷移"套組根據製造商之說明進行EMSA。 統計分析 對於至少三個重複實驗’以平均值±SEM呈現結果。藉 由單因子變異數分析（ANOVA)繼而Tukey-Kramer多次對比 檢驗測定各組之間的平均差值。認為户值小於〇 〇5為顯著 的。 135310.doc -48 - 200924744 結果 在癌症患者中，體重減輕不僅僅為較短存活時間之獨立 預測者，其亦減少對治療之反應以及預測治療毒性（Ross， P_J.等人，Br. J. Cancer，90 (1〇):1905-1911，2004)。體重減 輕係歸因於由細胞激素及腫瘤因子（諸如蛋白水解_誘導因 子（PIF)及脂質動員因子（LMF))所誘導的骨骼肌及脂肪組織 之進行性萎縮（Tisdale，M.J.，Curr. Opin. Clin. Nutr. Metab. Care，5 (4):401·4〇5, 2002)。該等因子不僅可影響宿主組織 ® 中之代謝，且可影響原發腫瘤及癌轉移。因此，LMF誘導 解耦聯蛋白質（UCP)2在腫瘤中之表現，認為此與自由基解 毒有關且其保護腫瘤細胞免受產生自由基損傷之細胞毒性 藥物的影響（Sanders，P.M.及 Tisdale, M.J.，Br. J. Cancer, 90 (6):1274-1278, 2004)。PIF核心肽皮西丁（dermicidin)在乳 癌細胞中之表現促進細胞生長及存活且降低血清依賴性 (Porter，D.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，100:10931- _ 10936，2003)。已展示PIF經由藉由包括藉由自體磷酸化活 化dsRNA依賴蛋白質激酶PKR之機制活化轉錄因子核因子-κΒ (NF-κΒ)促進肌肉萎縮（Eley及Tisdale, 2007)。在攜帶惡 病質誘導之MAC 16腫瘤之小鼠中使用PKR之低分子量抑制 劑的新近研究（Eley等人，2007)展示PKR之低分子量抑制 劑不僅削弱肌肉萎縮，而且抑制腫瘤生長。此係令人驚訝 地’因為如誘導惡病質之人類腫瘤一般，MAC 16腫瘤具有 南化學抗性（Double，J.A.及 Bibby，M.C.，J. Natl. Cancer Inst·’ 81 (13):988-994, 1989)。其為表明抑制PKR誘導腫瘤 135310.doc -49- 200924744 生長抑制之第一報導且該作用之機制的研究可提供對治療 化學抗性腫瘤之理解。 PKR與腫瘤生長之間的一種可能之聯繫包括NF-κΒ之活 化。NF-κΒ之活化已與腫瘤細胞存活及增殖以及侵襲及血 管生成（腫瘤轉移之關鍵事件）相關聯（Karin，M.，Nature 441 (7092):431-436, 2006)。已報導NF-κΒ在大量腫瘤類型 中原構性活化，該等腫瘤類型包括結腸直腸癌（Kojima，M. 等人，Anticancer Res.，24(2B):675-681，2004)、胰腺癌 (Wang，W.等人，Clin· Cancer Res.，5:119-127，1999)及肝 細胞癌（Tai，D.I·等人，Cancer，89:2274-2281，2000)。引起 NF-κΒ原構性活化之因素包括腫瘤壞死因子a(TNF-a)、介 白素-1 (IL-1)、pH 及缺氧（Baldwin，A.S.，J. Clin. Invest.， 107 (3):241-243, 2001) »藉由惡病質誘導之腫瘤產生之PIF 有可能亦可導致NF-κΒ之原構性活化，如其在惡病質動物 之骨骼肌中所進行般（Wyke，S.M.等人，Br. J. Cancer，91 (9):1742-1750, 2004)。藉由白藜蘆醇抑制骨骼肌中NF-κΒ 活化亦抑制攜帶MAC16腫瘤之小鼠中之腫瘤生長，儘管並 未研究其機制。NF-κΒ可經由調節卡斯蛋白酶活性而活化 抑制細胞凋亡之基因轉錄（Karin，M.等人，Nat· Immunol.， 3(3):221-227, 2002)。藉由NF-κΒ抑制細胞凋亡使腫瘤對化 學治療及輻射具有抗性（Bharti，A.C.及Aggarwal，B.B.， Ann. NY Acad..Sci.，973:392-395, 2002)，且可說明惡病質 生成腫瘤如此耐受治療之原因。 本研究對比PKR抑制劑對MAC 16腫瘤生長之有效性與其 135310.doc -50- 200924744 對組織學上類似於MAC16腫瘤但不誘導惡病質之MAC13 Μ 瘤生長之有效性（Beck, S.A.及 Tisdale，M.J.，Cancer Res.， 47:5919-5923, 1987)，且研究腫瘤生長抑制之機制。 先前研究（Eley，H.L.及 Tisdale，M.J” J. Biol.，282:7087-7097，2007)展示低分子量PKR抑制劑（8-[1-(1Η-咪唑-4-基）(Z)亞甲基])-6,8-二氫-噻唑[5,4-e]吲哚-7-酮）削弱惡病 質誘導之MAC16腫瘤在小鼠中之生長。圖2中所呈現之結 果展示其亦抑制MAC 16腫瘤活體外生長，其中在200 nM下 具有最大作用，而其即使在高達1000 nM之濃度下亦對 MAC13腫瘤生長無作用。兩種腫瘤均為小鼠中由持久投與 1，2-二曱基肼所誘導之大腸腺癌瘤（Cowen，D.M.等人，J. Natl. Cancer Inst.，64 (3):675-681，1980)，但MAC16誘導 惡病質（Bibby，M.C·等人，J Natl Cancer Inst” 78 (3):539- 546，1987)，而MAC13不誘導。圖2中之結果展示磷酸化 卩101(圖3八)及填酸化61?2〇1(圖38)在]^八(：16腫瘤中之高水準 表現，但二者在MAC 13腫瘤中並不高水準表現。然而， PKR與eIF2a在兩種腫瘤類型中之總含量類似。以PKR抑制 劑治療攜帶^八(：16腫瘤之小鼠引起？〖11(圖4八）與61?2〇1(圖 4B)麟酸化增加完全削弱，而對PKR與eIF2a之總含量無作 用。以PKR抑制劑處理MAC16細胞，在200 nM之濃度下產 生細胞生長之最大抑制，而更高濃度產生不太有效之抑制 (圖2)。為檢驗該作用是否與抑制PKR之自體磷酸化相關， 在MAC16細胞與MAC13細胞中測定抑制劑對磷酸化PKR與 總PKR之作用（圖5)。在小鼠MAC 16細胞中之實體腫瘤展示 135310.doc -51- 200924744 高水準之磷酸化PKR，而MAC 13展示極低水準之磷酸化 PKR。PKR抑制劑抑制MAC16細胞中PKR之自體磷酸化， 其中在200 nM與300 nM之間作用最大，而在更高濃度下其 不太有效（圖5A)。PKR抑制劑對MAC13細胞中低水準之 PKR自體磷酸化無作用（圖5B)。在任一細胞株中，抑制劑 對細胞中之總PKR均無作用。由於已展示PKR活化誘導骨 骼肌中20S蛋白酶體之表現（Eley，H.L.及Tisdale, M.J.，J. Biol.，282:7087-7097，2007)，故測定抑制劑之作用。 MAC16細胞（圖5C)與MAC13細胞（圖5D)均表現20S蛋白酶 體，但MAC 16細胞中之表現高於MAC 13細胞中之表現。 此外，PKR抑制劑削弱20S蛋白酶體在MAC 16細胞中之表 現（圖5C)，但不削弱20S蛋白酶體在MAC13細胞中之表現 (圖5D)。此外，20S蛋白酶體之表現（圖5C)及PKR之表現 (圖5 A)與PKR抑制劑之不同濃度之間存在線性相關（相關係 數0.95 7)(圖5E)，表明20S蛋白酶體之表現亦可由PKR在 MAC 16細胞中之表現控制。 與MAC 13腫瘤相比，MAC 16腫瘤中之蛋白質合成經顯 著抑制（圖6)，此可歸因於eIF2a之磷酸化增加。此表明， PKR之磷酸化對於MAC16腫瘤之存活可具重要性。PKR之 功能中之一者為其能夠活化NF-κΒ (Zamanian-Daryoush, M. 等人，Mol· Cell Biol·，20:1278-1290，2000)。圖 7A 中之數 據展示NF-κΒ在MAC16腫瘤中高水準原構性活化，但NF-κΒ在MAC 13腫瘤中並不高水準原構性活化。以PKR抑制劑 治療攜帶MAC 16腫瘤之小鼠削弱NF-κΒ在腫瘤中之原構性 135310.doc •52- 200924744 活化，表明NF-κΒ之原構性活化源於PKR活化。 已展示NF-κΒ活化在胰腺癌對吉西他濱（Arh，A.等人， Oncogene, 22 (21):3243-3251，2003)及胃癌對5-氟脲嘧啶 (5-FU)(Uetsuka, H.等人，Exp Cell Res.，289 (1):27-35, 2003) 之化學抗性中發揮重要作用。為測定藉由PKR抑制劑達成 之NF-κΒ下調是否會增加MAC16細胞對吉西他濱及5FU之 敏感性，測定該等藥劑單獨或與PKR抑制劑（在100 nM或 200 nM下）組合對細胞生長之作用（圖8)。在1 μΜ與10 μΜ 之間的濃度下，5FU單獨對MAC16細胞之生長產生顯著抑 制，且該作用藉由兩種濃度下之PKR抑制劑顯著增強。同 樣，吉西他濱誘導之MAC 16細胞生長抑制亦藉由兩個濃度 下之PKR抑制劑增強。該等結果表明PKR抑制劑可證實適 用於人類腫瘤對細胞毒性藥劑之化學敏化。 討論 早期研究表明PKR充當腫瘤抑制者’因為以催化無活性 突變形式之PKR轉染3T3細胞引起細胞轉化（Koromilas, A.E.等人，Science，257:1685-1689，1992)，而上調 Ml 骨髓 白血病細胞中之野生型PKR活性引起轉化表型逆轉或細胞 凋亡（Raveh，T.等人，J. Biol. Chem.，271 (41):25479-25484，1996)。然而，新近研究（Kim, S.Η.等人，Oncogene， 19(27):3086-3094, 2000 ; Yang, Y.L.等人，EMBO J·， 14(24):6095-6106, 1995)對該假設提出懷疑。因此，PKR缺 失轉殖基因小鼠正常且不展示腫瘤發病率增加（Yang等 人，1995)。此外，PKR之自體磷酸化及eIF2a之磷酸化在 135310.doc -53- 200924744 乳癌細胞株之溶胞物中比在未轉化上皮細胞株之溶胞物中 高 40到倍（Kim，S.H.等人，Oncogene，19 (27):3086-3094, 2000)，且與處於培養中之未轉染黑素細胞中相比，在黑 色素瘤細胞中亦較高（Kim, S.H.等人，Oncogene, 21 (57):8741-8748, 2002)。此外，正常黏膜轉化為腺瘤及結 腸癌瘤均具有增加之PKR表現（Kim等人，2002)。未轉化 細胞株中之PKR活性較低部分歸因於PKR蛋白質含量較 低，且部分歸因於存在P58(PKR之一種已知細胞抑制 劑）（Kim, S.H.等人，2000)。 當前研究展示自體磷酸化之PKR在來自患有惡病質之小 鼠的腫瘤中之表現上調。經活化之PKR與NF-κΒ之核結合 增加相關，NF-κΒ之核結合藉由抑制PKR活化而削弱《該 等腫瘤中NF-κΒ之活化將與展示惡病質為前發炎性病況之 臨床資料有關（McMillan, D.C.等人，Nutr. Cancer, 31 (2):101-105，1998)。在鼠腫瘤對（MAC16/MAC13)中，以低 分子量PKR抑制劑治療抑制展示磷酸化PKR上調之MAC 16 的增殖速率，但對不展示PKR活化之MAC13腫瘤無效。該 結果表明展示經活化PKR之惡病質誘導腫瘤可對PKR抑制 劑之抗腫瘤作用更敏感。令人驚訝之觀察結果在於PKR抑 制劑在200 nM之濃度下抑制PKR最有效，而增加之濃度具 有減少之抑制作用。在鼠肌管中在PIF存在下發現類似觀 察結果（Eley及Tisdale, 2007)。PKR抑制劑係針對PKR中之 ATP結合位點，且在無細胞轉譯檢定中使用針對另一 ATP 結合位點之抑制劑（2-胺基嘌呤）發現類似觀察結果（Jammi 135310.doc • 54- 200924744 等人，Biochem. Biophys. Res. Commun.，308:50-57，2003)。 該作用係歸因於轉譯機構之其他組份之非特異性抑制。然 而，有可能較高濃度之該抑制劑與PKR結合引起構形變 化，該構形變化誘導如使用ATP得到般之自體磷酸化 (Lemaire，P.A.等人，J. Mol. Biol·，345 (1):81-90, 2005)。 先前研究（Zamanian-Daryoush等人，2000)已展示PKR可 活化NF-κΒ。PKR經由其催化域與上游激酶IKK實體相互 作用，此使ΙκΒ中之關鍵絲胺酸殘基磷酸化，引起其降 解，釋放游離NF-κΒ，隨後NF-κΒ能夠遷移至核中DNA上 之其特異性結合位點。IKK藉由PKR達成之活化似乎經由 蛋白質-蛋白質相互作用而發生，其刺激ΙΚΚβ自體磷酸 化，而非藉由直接填酸化達成（Bonnet, M.C.等人，Mol. Cell· Biol.，20 (13):4532-4542, 2000)。然而，亦已展示 elF2在α亞單位上磷酸化活化NF-κΒ (Jiang，J.Y·等人，Mol· Cell. Biol·, 23 (16):5651-5663, 2003)。此表明另一機制， 藉此抑制PKR可用以下調NF-κΒ活化。藉由PKR抑制劑抑 制NF-κΒ之原構性活化可能至少部分地引起對腫瘤生長速 率之抑制。PKR介導由許多不同刺激經由磷酸化eIF2a及活 化 NF-κΒ誘導之細胞〉周亡（Gil, J.及 Esteban, M·，Apoptosis. 5 (2):107-114, 2000)。然而，PKR亦活化亦由NF-κΒ介導之 延遲細胞凋亡之存活路徑（ϋοηζέ，Ο.等人，EMBO J·， 23:5 64-571，2004)。因此，如NF-κΒ般，PKR可促進腫瘤細 胞存活或死亡。除促進生長之外，NF-κΒ藉由增加前血管 生成因子（諸如血管内皮生長因子）表現而增強腫瘤之血管 135310.doc -55- 200924744 生成潛力（Xiong，H.Q.等人，11^.】.〇&1^61'，108(2):181-188, 2004)，且NF-κΒ調節基因產物促進癌細胞之遷移及侵 襲（Yebra，M.等人，Mol. Biol. Cell, 6:841-850，1995)。儘 管NF-κΒ與控制超過150種標靶基因有關，但經由抑制PKR 自體磷酸化抑制其活化並不在小鼠中產生毒性，表明其為 治療癌症之新穎治療方案。新近研究（Kunnumakkara，A.B. 等人，Cancer Res.，67 (8):3853-6861, 2007)已展示薑黃素 (一種NF-κΒ活化抑制劑）抑制活體外人類胰腺癌細胞株之 生長且增強活體内吉西他濱之抗腫瘤活性。已展示NF-kB 促進胰腺癌中之吉西他濱抗性（Arlt等人，2003)及人類胃 癌細胞株中對5-FU及吉西他濱之化學抗性（Uetsuka等人， 2003)中發揮關鍵作用。此表明PKR之抑制劑可用於使化學 抗性腫瘤對化療劑敏化。在當前研究中，已展示PKR抑制 劑使MAC 16細胞對5-FU與吉西他濱之細胞毒性作用敏化， 表明該等藥劑之另一潛在治療作用。 PKR之活化可解釋一些腫瘤之低速率增殖，此使得該等 腫瘤對化學治療及輻射不敏感。除NF-κΒ活化之外，PKR 亦誘導eIF2ct之磷酸化，此藉由競爭性抑制將eIF2.GDP轉 化為eIF2.GTP之鳥嘌呤核苷酸交換因子eIF2B而抑制轉譯 起始（Rowlands, A.G.等人，1.61〇1.(1!116111.，263 (12):5526-5533，1988)。然而，在人類乳癌細胞中，蛋白質合成並未 受高eIF2a磷酸化抑制，此可能由於其含有較高含量之 eIF2B (Kim等人，2000)。 本研究之結果展示在PKR抑制劑存在下PKR之磷酸化水 135310.doc -56- 200924744 準與20S蛋白酶體α亞單位之表現之間的直接關係。此可提 供腫瘤生長抑制之另一機制。藉由使兩個19S調節亞單位 與20S α亞單位組合形成之26S蛋白酶體降解細胞週期控制 中所涉及之蛋白質，諸如Ρ27及p21 (Blagosklonny，M.V.等 人 ’ Biochem· Biophys. Res. Commun.，227 (2):564-569, 1996)。已展示以二肽_酸類似物PS_341(萬珂，Veicade) 靶向抑制26S蛋白酶體在人類胰腺癌細胞及異種移植中阻 斷增殖且誘導細胞凋亡（Shah, S.A.等人，J. Cell Biochem.， 82 (1):110-122, 2001)。亦已展示pS_341使人類胰腺癌細胞 對吉西他濱敏化（Bold, R.J.等人，j. Surge. Res·，100 (1):11-17，2001)。因此’由pKR自體磷酸化之抑制劑達成 之腫瘤中蛋白酶體表現的抑制可引起腫瘤生長削弱及對標 準化療劑之敏感性增加。 如本文中所使用之術語"約"通常應理解為指數值範圍中 之兩個數值。此外，本文中之所有數值範圍應理解為包括 該範圍内之各全部整數。 應瞭解本發明並不限於本文中所說明及所描述之確切構 型。因此，認為所有易於由一般熟習此項技術者自本文所 述之揭示内谷或藉由常規實驗由此獲得之合適修改係在由 隨附申請專利範圍所界定之本發明之精神及範轉内。 【圖式簡單說明】 圖1為展示經由PKR活化導致骨骼肌中蛋白質合成降低 及蛋白質降解增加之路徑之圖。 圖2展示增加濃度之PKR抑制劑對活體外MAC丨6腫瘤（♦) 135310.doc -57· 200924744 及MAC 13 ( )腫瘤生長之作用。將實驗重複三次。與對照 之差值表示為c，ρ<〇.〇〇1。 圖3A至圖3B呈現西方墨點法，其展示MAC16腫瘤（色帶 1至3)及MAC13腫瘤（色帶4至6)中PKR之磷酸化形式及總體 形式（3A)及eIF2ct之磷酸化形式及總體形式（3B)的表現。密 度測定分析展示磷酸化形式（pH)與總體形式（t〇t)之比率， • 且呈現三個獨立西方墨點之平均值。與MAC 16腫瘤之差值 展示為b ’ p<0.〇l ;或c，ρ<〇·〇〇ι。 ® 圖4Α至圖4Β展示藉由皮下注射每曰投與以溶劑 (DMSO:PBS，1:20)對照（色帶1至3)或濃度為ι(色帶4至6) 或5(色帶7至9) mgkg·1之PKR抑制劑治療攜帶MAC16腫瘤 之小鼠（Eley等人’ 2007)對PKR磷酸化（4A)及eIF2a磷酸化 (4B)的作用。各組中小鼠數目n=6。密度測定分析展示难 酸化形式（pH)與總體形式（tot)之比率，且呈現三個獨立西 方墨點之平均值。與對照之差值展示為c，p<0 001。 ❹ 圖5A至圖5E呈現各濃度PKR抑制劑對MAC 16細胞（5A及 5C)及MAC13細胞（5B及5D)中PKR自體磷酸化（5A及5B)及 20S蛋白酶a亞單位表現（5(：及5〇)之作用。密度測定分析展 示携酸化形式（pH)與總體形式（t〇t)之比率，且呈現三個獨 立西方墨點之平均值。與對照之差值展示為a，p<〇.〇5 ; b ’ ρ<0·01 ;或c，p<〇.〇01。（5E)以密度測定法在以（5(：)中 所不之各濃度PKR抑制劑治療之MAC16細胞中所量測的 20S蛋白酶α亞單位之表現與（5A)中所示之磷酸化ρκιι之水 準之間的關係。相關係數為0 957。 135310.doc •58- 200924744 圖6展示如方法部分中所述MAC13細胞及MAC16細胞中 經4 h之活體外蛋白質合成。與MAC 16腫瘤之差值展示為 c，p<0.001。 圖7A至圖7B展示如由EMSA所測定的NF-κΒ在得自以5 mgkg_1之PKR抑制劑治療4日或溶劑對照治療之小鼠的 MAC16腫瘤中在MAC16腫瘤及MAC13腫瘤（7A)及（7B)中之 核積累。密度測定分析呈現三個獨立墨點之平均值。在 (7A)中與MAC16腫瘤之差值展示為b，p<0.01，而在（7B) 中與溶劑對照之差值展示為c，p<0.00 1。 圖 8 呈現 5FU以 0 μΜ ( )、1 μΜ (口）、2.5 μΜ ( 0)、5 μΜ (目）及10 μΜ (ϋ)單獨或與100 ηΜ及200 ηΜ之PKR抑制 劑（PKR)組合對活體外MAC16細胞生長之作用，及吉西他 濱以 0 μΜ (_ )、3.8 μΜ (口）、9.5 μΜ ( S)、19 μΜ (目）及 3 8 μΜ (函）單獨或與PKR抑制劑組合對MAC16細胞生長之作 用。亦展示單獨100 nM及200 nM之PKR抑制劑之作用。與 對照之差值展示為b，p<0.01 ;或c，p<0.001，而在PKR抑 制劑存在下之差值展示為e，ρ<0·01 ;或f，p<0.001。 135310.doc -59-

Claims (1)

  1. 200924744 十、申請專利範圍： 1·種組合物，其具有至少一種雙股核糖核酸依賴蛋白質 激酶（PKR)之抑制劑’其可增強治療。 2.如吻求項之丨之組合物’其中雙股核糖核酸依賴蛋白質 激酶（PKR)之該至少一種抑制劑為磷酸化抑制劑。 3·種組合物，其具有至少一種增強雙股核糖核酸依賴蛋 白質激酶（PKR)之抑制劑的化合物，其可增強治療。
    Ο 4. 如凊求項之3之組合物，其中該增強雙股核糖核酸依賴 蛋白質激酶（PKR)之抑制劑的化合物係為增強雙股核糖 核酸依賴蛋白質激酶（PKR)之磷酸化抑制劑之化合物。 5. 如請求項1或3之組合物，纟中該增強為該治療之強化。 6. 如請求項之⑻之組合物，其中該增強係降低該治療至 少一種副作用之發生及/或嚴重性。 7. 如請求項之組合物，其中該抑制劑係經腸或非經腸 投與。 8·如請求項丨或3之組合物，其中該抑制劑為營養組合物。 9. 如請求項！或3之組合物’其中該抑制劑為細胞生長抑制 劑。 10. 如請求们或3之組合物’其中該抑制劑為細胞複製抑制 劑。 至少一種蛋白質磷 11·如請求項1或3之組合物，其另外包含 酸酶la(PPla)改質劑。 其中該PPla使經磷酸化PKR去磷 12 ·如請求項11之組合物 酸化。 I35310.doc 200924744 13 14 15 16. • 17. ❹18· 19. 20. 21. 22. ❹ 23. 24. 25. 26. 27. 28. 如請求項11之組合物，其中該PP la為支鏈胺基酸。 .如請求項11之組合物，其中該ppla為白胺酸。 如請求項11之組合物，其中該PPla為至少一種營養化合 物。 如請求項1或3之組合物’其另外包含可增強將治療傳送 至代謝活性組織之藥劑。 如請求項16之組合物，其中該藥劑為精胺酸及瓜胺酸中 之至少一者。 如凊求項1或3之組合物’其另外包含細胞複製抑制劑之 組合物。 如請求項18之組合物，其中營養組合物包含轉化生長因 子-P(TGF-P) 〇 如請求項1或3之組合物，其中該治療為化學治療。 如請求項1或3之組合物，其中該治療為放射治療。 如請求項1之組合物’其另外包含可增強將治療傳送至 代謝活性組織之藥劑。 -種如請求項i、2、3及4中任一項之組合物之用途其 係用於製造增強治療之藥劑。 如請求項23之用途，其中該治療係用於惡性病症。 如請求項23之用途’其中該治療係用於自體免疫疾病。 如請求項23之用途’其中該增強為該治療之增強。 如請求項23之用途，其中該增強為降低該治療至 副作用之發生及/或嚴重性。 種 如請求項23之用途，其中該抑制劑為營養組合物。 135310.doc 200924744 29.如凊求項23之用途，其中該組合物另外包含至少一種蛋 白質磷酸酶1 α(ρρ 1 a)改質劑。 3〇.如請求項29之用途，其中該PPla為支鏈胺基酸。 31. 如清求項23之用途’其中該組合物另外包含可增強將治 療傳送至代謝活性組織之藥劑。 32. 如清求項31之用途，其中該藥劑為精胺酸及瓜胺酸中之 • 至少一者。 ❹ 33 ·如°月求項23之用途，其另外包含使用細胞複製抑制劑。 34. 如請求項33之用途，其中該細胞複製抑制劑包含轉化生 長因子-P(TGF-p)。 35. 如請求項23之用途，其中該治療係化學治療。 36·如請求項23之用途，其中該治療係放射治療。 37. —種用於治療病狀之組合物，其包含至少一種雙股核糖 核酸依賴蛋白質激酶磷酸化之抑制劑（PKH)，其可增強 治療。 φ 38.如請求項37之組合物，其另外包含至少一種增效劑’該 至少一種增效劑進一步增強該哺乳動物中藉由該 之鱗酸化抑制作用。 39.如請求項37之組合物，其中該病狀係選自由以下各病狀 ' 組成之群：癌症、癌症惡病質、厭食症、發炎疾病、膿 毒病、充血性心臟衰竭、類風濕性關節炎、慢性阻塞性 肺部疾病、神經退化性疾病、自體免疫疾病、人類免疫 缺乏病毒感染、糖尿病、皮膚病、細胞老化、庫欣病 (Cushing Disease)、風濕熱及早老症。 135310.doc 200924744 40. 如請求項37之組合物’其申該雙股核糖核酸依賴蛋白質 激酶磷酸化抑制劑（PKR-I)可增強該治療，使得該病狀之 嚴重性改善或降低。 41. 如請求項38之組合物，其中該至少一種增效劑係選自由 以下各物組成之群：PKR之抑制劑、pkr_i之類似物、 PKR之磷酸化抑制劑、化療劑、应管生成劑、血管擴張 劑、兒茶素-黃烷醇、生物活性蛋白質、支鏈胺基酸、必 需胺基酸、胺基酸、胺基酸類似物、核苷酸、維生素、 麩醯胺酸、唾液酸募醣、L-茶胺酸、益菌助生質、益生 菌、合益素、必需脂肪酸、PUFA、MUFA及抗氧化劑。 135310.doc
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