CN114369563B - 一种短双歧杆菌活性促进剂 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种短双歧杆菌活性促进剂，它包括低聚半乳糖、中性岩藻基人乳低聚糖和中性非岩藻基人乳低聚糖；所述短双歧杆菌活性促进剂中低聚半乳糖、中性岩藻基人乳低聚糖和中性非岩藻基人乳低聚糖的质量百分比为76.5:8.5:15至82.8:7.2:10。

Description

一种短双歧杆菌活性促进剂

技术领域

本发明属于食品技术领域，具体涉及一种短双歧杆菌活性促进剂。

背景技术

益生菌被定义为非致病性活微生物，当摄入足量时，可以在肠道中定植并促进微生物群的恢复，使宿主保持健康。分布于人体肠道的益生菌种类庞杂，主要包括乳酸杆菌、乳酸球菌、肠球菌、双歧杆菌菌属部分菌种及部分酵母菌等类型。大量研究指出，双歧杆菌与人一生的健康和疾病密切相关，在生命早期，人体肠道细菌中双歧杆菌约占60％～70％，双歧杆菌缺乏会导致新生儿患坏死性小肠结肠炎、过敏、肠易激综合征等疾病；在成年期早期，人体肠道细菌中双歧杆菌约占30％～40％，随着成年期年龄的增长，双歧杆菌水平逐渐下降，缺乏双歧杆菌可能导致肥胖、糖尿病等疾病；在老年期，人体肠道的双歧杆菌水平进一步下降，约占肠道细菌的0～5％，缺乏双歧杆菌可能导致癌症和老年性疾病，并且对健康个体及长寿人群的肠道微生物研究发现，双歧杆菌数量普遍较多。

低聚糖是由2～10个单糖通过糖苷键聚合而成的具有多种生理活性的碳水化合物。经研究证实具有诸多保健功效，如促进肠道健康、提高免疫力、降低血清胆固醇等。因此利用低聚糖对肠道益生菌的促进作用是改善人们的肠道健康与预防疾病的一条重要途径。目前国内市场上主要的功能性低聚糖有：低聚果糖(FOS)、异麦芽低聚糖(IMO)、低聚半乳糖(GOS)等。除了这些功能低聚糖，关于母乳低聚糖(HMOs)的研究也越来越多，HMOs是人乳中仅次于乳糖和脂肪的第三大营养物质，是母乳的独特成分，在婴幼儿生长发育中起到重要作用。其中最常见的HMOs包括2′-岩藻糖基乳糖(2′-FL)；3′-岩藻糖基乳糖(3′-FL)；3′-唾液酸乳糖(3′-SL)；6′-唾液酸乳糖(6′-SL)；乳糖-N-四糖(LNT)；乳糖-N-新四糖(LNnT)；二岩藻糖基乳糖(DFL)。但事实上，单一功能性低聚糖对益生菌的促进作用并不理想，因此研究合适配比的多种功能性低聚糖组合甚至功能性低聚糖与人乳低聚糖组合对益生菌的作用效果具有重要意义。

在多种低聚糖配比的研究中，研究对象大多是FOS和GOS等功能性低聚糖，对2'-FL，LNT等人乳低聚糖的研究较少，其中功能低聚糖与人乳低聚糖的组合配比研究更鲜有报道。

发明内容

本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种短双歧杆菌活性促进剂。

为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：

所述短双歧杆菌活性促进剂中包括低聚半乳糖(GOS)、中性岩藻基人乳低聚糖和中性非岩藻基人乳低聚糖，所述短双歧杆菌活性促进剂中低聚半乳糖、中性岩藻基人乳低聚糖和中性非岩藻基人乳低聚糖的质量百分比为76.5:8.5:15至82.8:7.2:10。

优选地，所述中性岩藻基人乳低聚糖为3’-岩藻糖基乳糖(3’-FL)、2’-岩藻糖基乳糖(2’-FL)和二岩藻糖基乳糖(DFL)中的至少一种。

优选地，所述中性非岩藻基人乳低聚糖为乳糖-N-四糖(LNT)和乳糖-N-新四糖(LNnT)中的至少一种。

优选地，所述短双歧杆菌活性促进剂中包括低聚半乳糖、2’-岩藻糖基乳糖和乳糖-N-四糖；所述短双歧杆菌活性促进剂中低聚半乳糖、2’-岩藻糖基乳糖和乳糖-N-四糖的质量百分比为76.5:8.5:15至82.8:7.2:10，优选为80.96:7.04:12。

下面对本发明作进一步说明：

本发明旨在发现婴儿肠道益生菌之一(短双歧杆菌)具有促进肠道吸收功能，母乳低聚糖能有效的促进婴儿肠道菌群发挥益生功能，进而对婴儿奶粉配方中三种低聚糖的配比进行研究。

本发明研究过程包括如下内容：

1.真空冷冻干燥菌种的恢复培养

(1)安瓿开封：用75％酒精脱脂棉对安瓿外表面进行消毒后，用火焰加热其顶端，滴少量无菌水至加热的安瓿顶端使之破裂，用锉刀或镊子敲下已经破裂的安瓿顶端。

(2)恢复培养

用无菌吸管吸取约0.3毫升短双歧杆菌生长培养基，滴入安瓿内，轻轻振荡，使冻干菌体溶解呈悬浮状。吸取全部菌悬液，移植于培养基试管中，置于-80℃冰箱保存。

2.菌种的活化

从-80℃取出短双歧杆菌菌种划线于固体培养基平板上，37℃过夜厌氧培养，挑取单菌落接种于液体培养基中得到一级种子液备用。

3.探究添加单一糖类物质对短双歧杆菌的增殖促进作用

以1％葡萄糖(Glu)、1％低聚半乳糖(GOS)、1％2′-岩藻糖基乳糖(2'-FL)、1％乳糖-N-四糖(LNT)为培养基中糖源，然后以1％接种量将短双歧杆菌一级种子液分别接种含不同糖源的培养基中。37℃厌氧培养，每隔6h取菌液测定OD₆₀₀(如图1)。

4.确定GOS与2'-FL的最佳配比

(1)以培养基中低聚糖添加量为1％GOS作为对照组，在总添加量仍为1％下，设置GOS:2'-FL＝9:1、8:2、7:3不同配比作为实验组，每组三平行重复。37℃静置厌氧培养，每隔6h取发酵液测定发酵液OD₆₀₀(如图2)。

(2)GOS与2'-FL的比例优化：在GOS:2'-FL＝9：1基础上进行比例优化实验，设置GOS:2'-FL＝98：2、95：5、92：8、90：10四种配比进行实验。每组三平行重复。37℃厌氧培养，每隔6h取发酵液测定发酵液OD₆₀₀(如图3)。

(3)确定GOS与2'-FL的最佳配比：以1％GOS作为对照，GOS:2'-FL＝92：8、90：10两种配比为实验组进行实验。每组三平行重复。37℃静置厌氧培养，培养至第48h取发酵液测定发酵液OD600(如图4)并进行平板涂布检验活菌数(如图5)、发酵液pH值的测定(如图6)、短链脂肪酸(SCFAs)含量测定(如图7)、还原糖含量的测定(如图8)、胞外多糖(EPS)含量的测定(如图9)。

5.确定GOS、2'-FL、LNT的最佳配比

(1)由4.(3)得出的实验结果，视GOS:2'-FL＝92：8为一整体，即GOS与2'-FL的比例确定为92:8，用A表示。保持培养基中总糖添加量为1％条件不变，往培养基中添加LNT，设置培养基中A与LNT的不同配比为实验组，添加量为1％A、1％LNT为对照组。每组三平行重复。37℃厌氧培养，每隔6h取发酵液测定发酵液OD₆₀₀(如图10)，探究A与LNT的不同配比对短双歧杆菌的增殖促进作用。

(2)在5.(1)实验结果的基础上设置更小梯度的A与LNT的配比为实验组，添加量为1％A为对照组。每组三平行重复。37℃厌氧培养，每隔6h取发酵液测定发酵液OD600(如图11)。培养至第72h测定菌液中短链脂肪酸含量(如图12)。

母乳低聚糖3-FL(3-岩藻糖基乳糖)是母乳中含量最丰富的HMO之一，其与2'-FL都属于中性岩藻基人乳低聚糖，具有相似的功能。乳糖-N-新四糖(LNnT)与乳糖-N-四糖(LNT)都属于中性非岩藻基人乳低聚糖，具有相似的功能。即，母乳低聚糖2-FL和3-FL，LNT和LNnT都对于免疫起到调节作用，减少有害菌的生长，促进有益菌(尤其是长双歧杆菌、两双歧杆菌)的生长。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明公开了三种低聚糖(GOS、2'-FL、LNT)对益生菌短双歧杆菌促进效果最明显的具体配比。在已有研究中，大部分是针对低聚果糖和低聚半乳糖最佳配比的研究，或是研究单种或两种低聚糖对益生菌的促进效果，对多种低聚糖的相关研究比较少，本发明通过实验研究了不同配比下的三种低聚糖对肠道微生物及肠道益生功能的影响，具体分析不同种类不同配比下的低聚糖对益生菌的OD₆₀₀，培养液的pH，胞外多糖含量，还原糖含量，短链脂肪酸等数据，得到三种低聚糖对双歧杆菌促进效果最好的具体配比，制成活性促进剂，同时也可为婴儿配方奶粉中低聚益生元的配比与添加以及消费者的选择提供理论支持。

附图说明

图1为添加单一糖类对短双歧杆菌的增殖促进作用的菌液测定OD₆₀₀结果图；

图2为确定GOS与2'-FL的最佳配比时不同配比的菌液测定OD₆₀₀结果图；

图3为确定GOS与2'-FL的最佳配比时比例优化的菌液测定OD₆₀₀结果图；

图4为确定GOS与2'-FL的最佳配比时比例最佳的平板涂布检验活菌数结果图；

图5为确定GOS与2'-FL的最佳配比时比例最佳的菌液测定OD₆₀₀结果图；

图6为确定GOS与2'-FL的最佳配比时短双歧杆菌发酵液pH值的测定图；

图7为确定GOS与2'-FL的最佳配比时短双歧杆菌产生短链脂肪酸(SCFAs)含量测定图；

图8为确定GOS与2'-FL的最佳配比时短双歧杆菌对还原糖利用量的测定图；

图9为确定GOS与2'-FL的最佳配比时短双歧杆菌产生胞外多糖(EPS)含量的测定图；

图10为确定GOS、2'-FL、LNT的最佳配比时菌液测定OD₆₀₀结果图；

图11为确定GOS、2'-FL、LNT的最佳配比时比例优化的菌液测定OD₆₀₀结果图；

图12为确定GOS、2'-FL、LNT的最佳配比时短双歧杆菌产生胞外多糖(EPS)含量的测定图。

具体实施方式

实施例中采用的菌种、试剂等均为市售。

实施例一菌种的活化及不同碳源对短双歧杆菌的增殖促进作用

1.菌种的活化

1.1盐溶液配制：氯化钙0.2g，七水硫酸镁0.48g，磷酸氢二钾1.0g，磷酸氢钾1.0g，碳酸氢钠10.0g，氯化钠2.0g，调pH至6.5，加去离子水定容至1L。

1.2短双歧杆菌生长培养基的配制：大豆蛋白胨5.0g，胰胨5.0g，酵母提取物10.0g，葡萄糖10.0g，盐溶液40毫升，L-半胱氨酸0.5g，0.1％刃天青1.0毫升，调节pH至7.0，加去离子水定容至1L。

1.3配制短双歧杆菌生长固体培养基，高压蒸汽灭菌后，取-80℃冰箱保藏菌种划线，12h后挑单菌落接种于活化液体培养基，培养环境为37℃厌氧环境，得到一级种子液备用。

2.探究不同单糖对短双歧杆菌的增殖促进作用

2.1依照1.2培养基配方，将葡萄糖换成对应的低聚半乳糖(GOS)、2′-岩藻糖基乳糖(2'-FL)、乳糖-N-四糖(LNT)，以1％(W/V)糖类添加量配制75ml液体培养基，调节pH至7.0，每组设置三个平行，分装进锥形瓶中(每瓶25mL),高压蒸汽灭菌备用。

2.2在厌氧培养箱中，将1.3中短双歧杆菌的一级种子液以1％接种量分别接种在2.1中配制的不同培养基中。每隔6h取发酵液，利用紫外分光光度计测量波长600nm下发酵液的吸光度。

3.结果

如图1所示，①添加量相同情况下，不同糖源对短双歧杆菌的增殖效果表现为GOS最优，其次为LNT，Glu，最后为2'-FL。②从OD值来看，短双歧杆菌对2'-FL的利用率极低，指数生长期短，12h后基本进入稳定期。与1％Glu相比，2'-FL对短双歧杆菌的生长有抑制作用。LNT对短双歧杆菌增殖有促进作用但增殖效果不如GOS显著。

实施例二确定GOS与2'-FL的最佳配比

1保持培养基中1％(W/V)糖类添加总量不变，以GOS为主要糖源，添加少量2'-FL，以1％GOS添加量为对照，探究GOS与2'-FL不同配比对短双歧杆菌的促进效果。

2在低聚糖添加总量为1％(W/V)不变情况下，设置GOS:2'-FL＝90:10、80:20、70:30三种配比作为实验组，1％GOS添加量作为对照组，将短双歧杆菌的一级种子液以1％接种量分别接种到含有不同糖源配比的培养基中，37℃厌氧培养，每隔6h取发酵液，利用紫外分光光度计测量波长600nm下发酵液的吸光度，每组三平行重复。

3GOS与2'-FL的比例优化：在培养基糖类物质添加总量为1％(W/V)，其中GOS:2'-FL的比例为9：1基础上进行比例优化实验,设置GOS:2'-FL＝98：2、95：5、92：8、90：10四种配比进行波长600nm下发酵液的吸光度测试。

4确定GOS与2'-FL的最优配比：以1％GOS和1％Glu作为对照，GOS:2'-FL＝92：8、90：10两种配比为实验组进行实验。每组三平行重复。37℃厌氧培养，进行OD₆₀₀、pH、活菌数、还原糖含量、胞外多糖含量、短链脂肪酸含量测定。

4.1每隔6h取发酵液，利用紫外分光光度计测量波长600nm下不同糖类配比下发酵液的吸光度。

4.2培养至48h时取发酵液1mL，平板涂布检验不同糖类配比下发酵液中的活菌数。

4.3每隔6h取发酵液，测定不同糖类配比下发酵液的pH值。

4.4培养至第72h时取菌液3ml，8000r/min离心5min，取上清液，利用液相色谱仪分别测定菌液中代谢产物短链脂肪酸(乳酸、乙酸、丙酸、丁酸)的含量。

4.5还原糖含量的测定：

4.5.1配制1mg/ml的葡萄糖标准溶液

4.5.2配制DNS试剂：称取酒石酸钾钠18.2g，溶于50ml蒸馏水中，加热(温度不能超过50℃)。于热溶液中依次加入NaOH 2.1g，3,5-二硝基水杨酸0.63g,苯酚0.5g，搅拌均匀，冷却后用蒸馏水定容至100ml，储存于棕色瓶中，室温保存。

4.5.3制作葡萄糖标准曲线：取5支试管，按表1加入1mg/ml葡萄糖标准溶液、蒸馏水和DNS试剂。以1-5号试管吸光度值为纵坐标y，糖含量(mg)为x轴，绘制标准曲线方程，建立回归曲线。

表1

4.5.4样品中还原糖的测定：取适当样品液稀释，使糖浓度为0.1-1.0mg/ml，取稀释后的糖液1.0ml于15ml刻度试管中，加DNS试剂2.0ml，沸水煮沸2min，冷却后用水补足到15ml刻度，在540nm波长下测定吸光度。根据标准曲线求得短双歧杆菌培养液中还原糖的含量。

4.6胞外多糖(EPS)含量的测定

4.6.1制作葡萄糖标准曲线：准确称取葡萄糖0.05g于500mL容量瓶中，加水至刻度，分别吸取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6及1.8mL，各以蒸馏水补至2.0mL，再加入1.0mL的6％苯酚和5.0mL浓硫酸，混匀冷却至室温放置30min后，于490nm波长处测吸光值。空白对照为2.0mL蒸馏水按相同显色操作进行(即加入与上述步骤等量的苯酚和浓硫酸)，葡萄糖浓度为横坐标，纵坐标为吸光值，制作标准曲线。

4.6.2胞外多糖的提取：取菌液10mL，经100℃水浴作用10min，待冷却至室温后，加入质量分数80％的三氯乙酸至浓度最终为5％，4℃静置过夜，以除去蛋白；10000r/min，4℃冷冻离心10min，收集上清液于透析袋中，蒸馏水透析6次左右至无色，收集透析袋内液体，蒸馏水补至10mL，作为样品液。

4.6.3胞外多糖的测定：取0.2mL的待测液，以蒸馏水补至2.0m L,加入1mL6％苯酚和5.0mL浓硫酸，混匀冷却至室温放置30min后，于490nm波长处测吸光值。以葡萄糖(mg/L)标准曲线计算双歧杆菌胞外多糖含量。

5.结果：

5.1图2所示，①在保持总糖量1％不变的情况下，不同配比体现出随GOS添加量的减少而2'-FL添加量的增加，对短双歧杆菌不仅没有表现出促进作用反而抑制了其生长。②GOS:2'-FL＝9:1配比表现出微量2'-FL的加入可以在生长后期促进短双歧杆菌的增殖，推测可能短双歧杆菌主要利用的碳源是GOS，所以在配比中GOS添加量的减少导致了生长的抑制。所以，2'-FL在适当的微量添加下才对短双歧杆菌生长有增殖促进作用，过量添加反而有抑制作用。

5.2图3所示，①GOS:2'-FL不同配比中，GOS:2'-FL＝98:2对短双歧杆菌的生长促进作用较差于其他三个配比。②除GOS:2'-FL＝98:2外，其它三个配比对短双歧杆菌的增殖作用相差不大，其中以GOS:2'-FL＝90：10最优。

5.3图4所示，①从OD值来看，三者间总细菌数差别不大，但涂布结果表明三者间的活菌数存在显著差异。②添加了2'-FL的实验组，其活菌数均高于1％GOS，推测在培养基中添加2'-FL对短双歧杆菌的主要作用可能是提高存活率，而对生长增殖的促进作用不大。

5.4图5所示，①糖源的不同影响短双歧杆菌的生长。②与葡萄糖相比，含GOS组对短双歧杆菌的增殖效果影响显著，使双歧杆菌生长更快，菌体密度持续提高时间更长。③以1％Glu为碳源的短双歧杆菌在24h后基本进入稳定器，对数生长期较短，而添加GOS实验组对数期较长，在24～36期间OD值仍有缓慢增加。④但碳源为GOS:2'-FL＝92：8、90：10所培养短双歧杆菌生长曲线基本无显著差别。

5.5图6所示，①随培养时间的增加，0～18h菌液中的pH急剧下降，18后下降幅度减小，24h后趋于平缓。②不同糖源对短双歧杆菌增殖过程中的pH影响显著，以GOS为糖源的培养基pH值均低于1％Glu组。原因可能是GOS通过短双歧杆菌的增殖③但碳源为GOS:2'-FL＝92：8、90：10所培养短双歧杆菌pH值变化无显著差别。

5.6图7所示，①碳源不同，短双歧杆菌产酸种类差异显著，产乳酸量：1％GOS>92>90，产乙酸量：1％GOS>92>90产丙酸量：92>1％GOS>90，产丁酸量：92>1％GOS>90。②以LNT为碳源能显著提高短双歧杆菌产丙酸能力。以GOS为碳源能极显著提高短双歧杆菌产乳酸、丁酸能力。但过多的乳酸积聚导致浓度升高会影响人体对营养、水的吸收。③与1％GOS组相比，以GOS:2'-FL＝92：8配比为碳源促进了短双歧杆菌产丙酸能力，略微促进产丁酸能力。所以，从产有机酸含量来看GOS:2'-FL＝92：8产四种酸能力显著优于GOS:2'-FL＝90：10。

5.7图8所示，①不同碳源对短双歧杆菌的糖利用率影响显著。②1％Glu培养的短双歧杆菌对糖总消耗量仅为40％，而1％GOS组与GOS、2′-F配比组所培养短双歧杆菌对糖总消耗量达75％以上。③1％Glu组与含GOS组分别在54h、30h处还原糖含量上升，推测可能源于益生菌自身产生的糖分泌至培养液中从而导致含量升高。④从糖消耗量来看，GOS:2'-FL＝90：10略优于GOS:2'-FL＝92：8。

5.8图9所示，①碳源的不同对短双歧杆菌产胞外多糖与利用胞外多糖均有显著影响。②在12～36h，1％Glu和含GOS组培养的短双歧杆菌产胞外多糖含量均逐渐上升。③在36h～48h，1％Glu和1％GOS胞外多糖含量持续增加，而GOS与2'-FL配比组的胞外多糖含量均呈下降趋势。推测可能是细菌在前期利用了大量的碳源进行增殖，但随着碳源的消耗，添加2'-FL的配比组中由于含有更少的GOS，而2'-FL的增殖促进作用不显著。导致短双歧杆菌后期选择利用EPS作为营养物质从而造成含量下降。所以，添加GOS为碳源可显著增加短双歧杆菌产EPS的能力，但GOS:2'-FL＝92：8、90：10的胞外多糖的最大产量无显著差异。

实施例三确定GOS、2'-FL、LNT三种低聚糖的最佳配比

1由实施例二得出的结果，GOS与2'-FL的比例确定为92:8(用A表示)。保持培养基中糖类总添加量为1％不变，向培养基中添加少量LNT，设置培养基中A与LNT的不同配比为实验组(即A:LNT＝95:5、90:10、85:15、80:20)，添加量为1％A、1％LNT为对照组，每组三平行重复。

1.1配制1中不同低聚糖配比液体培养基高压蒸汽灭菌，放凉备用，将实施例一中活化后的短双歧杆菌的一级种子液以1％接种量分别接种到灭菌后培养基中，37℃厌氧培养，每隔6h取发酵液，利用紫外分光光度计测量波长600nm下发酵液的吸光度，每组三平行重复。

2在1.1实验结果的基础上，保持培养基糖类总添加量1％(W/V)不变，设置更小梯度的A与LNT的配比为实验组即(A:LNT＝84：16、85:15、86:14、87:13、88:12、89:11、90:10)，添加量为1％A为对照组，每组三平行重复。

2.1配制2中不同低聚糖配比液体培养基高压蒸汽灭菌，放凉备用，将实施例一中活化后的短双歧杆菌的一级种子液以1％接种量分别接种到灭菌后培养基中，37℃厌氧培养，每隔6h取发酵液，利用紫外分光光度计测量波长600nm下发酵液的吸光度，每组三平行重复。培养至第72h时取菌液3ml，8000r/min离心5min，取上清液，利用液相色谱仪分别测定菌液中短链脂肪酸(乳酸、乙酸、丙酸、丁酸)的含量，得出三种低聚糖的最佳配比。

3.结果

3.1图10所示，保持各组总糖量1％不变的情况下，LNT的添加量介于0.1％～0.15％(即A:LNT＝90:10与A:LNT＝85:15)间对短双歧杆菌的增殖促进作用最优。表明LNT的添加应在适当范围内，过多或过少均不利于短双歧杆菌的增殖。

3.2图11所示，A:LNT＝90:10至A:LNT＝85:15范围内所培养的短双歧杆菌生长曲线无显著差别，对短双歧杆菌的增殖效果相近。在OD值上无法直观的判断配比间的优劣。

3.3图12所示，①在GOS、2'-FL两种低聚糖组合(即图中A)中，微量添加LNT制成三种低聚糖组合成的碳源对短双歧杆菌产四种酸均有影响。②三糖配比中由于LNT的添加相应的会降低GOS含量从而影响短双歧杆菌产乳酸的能力，但适量添加LNT促进了短双歧杆菌产丙酸、丁酸的能力。③三种低聚糖配比中拟定最优配比为A:LNT＝88:12，即GOS:2'-FL:LNT＝80.96％:7.04％:12％。

Claims (1)

1.一种短双歧杆菌活性促进剂，其特征在于，所述短双歧杆菌活性促进剂由低聚半乳糖、2’-岩藻糖基乳糖和乳糖-N-四糖组成，所述低聚半乳糖、2’-岩藻糖基乳糖和乳糖-N-四糖在短双歧杆菌活性促进剂中的质量百分比为80.96:7.04:12。