CN115786187B - 一株能降解尿酸的植物乳杆菌、益生菌组合物及其应用 - Google Patents
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Landscapes
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Abstract
本发明公开一株能降解尿酸的植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)，名称为YC，分类名称为：Lactobacillusplantarum，保藏编号为：CGMCC No.25306，保藏日期：2022年7月15日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路1号院3号。本发明获得高效降解尿酸的菌株，体外降解效果在30％左右，且该菌株具有高效降解核苷酸(肌苷、鸟苷)的能力，有较好的耐胃液及肠液的能力。本菌株具有一定的降解血液中尿酸含量的能力，是一株较有潜力的益生菌株，也具有良好的发酵性能，遗传稳定性好，十分具有工业应用前景，弥补了目前拥有的降尿酸益生菌株的空白。
Description
技术领域
本发明属于微生物、高尿酸血症及痛风疾病防治技术领域，尤其是一株能降解尿酸的植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)、益生菌组合物及其应用。
背景技术
高尿酸血症(HUA)是指在正常嘌呤饮食状态下，非同日两次空腹血尿酸水平男性高于420μmol/L，女性高于360μmol/L，即称为高尿酸血症。
尿酸是人类嘌呤化合物的终末代谢产物。嘌呤代谢紊乱导致高尿酸血症。本病患病率受到多种因素的影响，与遗传、性别、年龄、生活方式、饮食习惯、药物治疗和经济发展程度等有关。根据近年各地高尿酸血症患病率的报道，目前我国约有高尿酸血症者1.2亿，约占总人口的10％，高发年龄为中老年男性和绝经后女性，但近年来有年轻化趋势。正常的尿酸浓度对于人体是无害的，但现代社会的高能量、高嘌呤饮食习惯很容易打破体内的尿酸平衡，使得越来越多人的尿酸浓度超标而患HUA，HUA可导致弱水溶性尿酸盐饱和而以尿酸单钠晶体的形式析出，其偶尔出现在肾小管中导致肾结石，最常发生的是在关节滑膜液中累积引发痛风，而痛风是成年人最常见的关节炎类型。除此之外，HUA还与心血管疾病、2型糖尿病、慢性肾病等许多代谢性疾病有着紧密的联系。
目前，有几种抗高尿酸的药物，包括别嘌呤醇、非布索坦、丙磺舒等。其中别嘌呤醇可能会引起别嘌呤醇超敏综合征，非布索坦会造成肝、肾功能异常，丙磺舒会造成胃肠道反应、皮疹、过敏。总之，目前治疗高尿酸的药物都存在着较为严重的副作用，一些新的药物也在临床试验中。
目前，人们对肠道菌群调控机体健康的研究不断深入，发现肠道菌群与高尿酸血症的关系紧密，且肠道菌群构成的微生态系统已被认定是高尿酸血症治疗的新靶点。目前有些报道益生菌在缓解高尿酸血症方面的功效，补充益生菌可直接减少尿酸的积累，还可通过调节肠道菌群及其代谢产物间接降低尿酸水平。所以筛选出具有高效降解尿酸作用的益生菌并探究菌株作用的机理，将会对后续研究益生菌治疗高尿酸血症具有较为深远的意义。
通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一株能降解尿酸的植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)、益生菌组合物及其应用。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一株可以高效降解尿酸的植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)，名称为YC，分类名称为：Lactobacillusplantarum，保藏编号为：CGMCC No.23506，保藏日期：2022年7月15日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
进一步地，所述植物乳杆菌的形态特性为：
植物乳杆菌是乳酸菌的一种，菌种为直或弯的杆状，单个、成对或成链状；
其在MRS肉汤琼脂培养基上形成白色的小菌落，呈微隆起圆状轮廓；
植物乳杆菌是厌氧或兼性厌氧，适宜生长温度范围为30-35℃；最适pH 6.5左右，属于同型发酵乳酸菌。
进一步地，所述MRS肉汤琼脂培养基的配方为：葡萄糖20g,，胰蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母粉5g，无水乙酸钠5g，柠檬酸二铵2g，K2HPO42g，MgSO4·7H2O 0.5g，MnSO4·H2O0.25g，吐温80 1g，琼脂20g，1000ml蒸馏水充分溶解后调节pH值为6.5，121℃、0.1MPa灭菌15min。
进一步地，所述植物乳杆菌具有高效降解核苷酸即肌苷、鸟苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、鸟嘌呤的能力，有较好的耐胃液及肠液的能力，能在pH＝2的条件下存活。
进一步地，所述植物乳杆菌的筛选步骤如下：
从东北发酵食品酸菜中直接用移液器吸取1m L样品于干净的EP管中，用质量浓度为0.85％的生理盐水进行梯度稀释，即从10-1至10-7，每个梯度做三次平行试验；待不同浓度梯度的稀释液中的样品完全溶解均匀后，按稀释浓度从低到高的顺序各取200μL的稀释液分别接入MRS固体培养基中，并用无菌涂布器均匀涂开；待其吸收后放置到37℃恒温培养箱中进行厌氧培养，时间为2天；取培养后平板上的单一菌落进行划线分离，重复此分离纯化步骤2-3次，即可获得形态一致的纯化单一菌落，得到可以高效降解尿酸的植物乳杆菌。
利用如上所述的植物乳杆菌的益生菌组合物，所述益生菌组合物的制备方法如下：
将植物乳杆菌YC在37℃条件下静置18-24h培养成种子液，每取1ml加入9ml空白MRS培养基中静置孵育10h，得活化的二代菌液；
取二代菌液于4000r/min，4℃离心10min，用PBS清洗3次得到菌泥，将离心后的菌泥用2ml无菌水混合均匀后，加入4ml脱脂奶粉和4ml无菌水，其中；倒入玻璃培养皿中，冻干厚度在0.5±0.1厘米，制作好平板后先在-80℃冰箱中预冻2小时，然后进行冻干24小时，去除样品之后，进行冻干存活率的计算；
其中冻干存活率达到65％，其1克菌粉中所含活菌数高达2×1010(CFU/g)。
如上所述的植物乳杆菌在制备降解尿酸药物中的应用。
如上所述的植物乳杆菌在制备降解核苷酸药物中的应用。
如上所述的植物乳杆菌在制备降解肌苷、鸟苷药物中的应用。
如上所述的植物乳杆菌在制备抑制尿酸产生过程中关键酶黄嘌呤氧化酶药物中的应用。
本发明取得的优点和积极效果为：
1、本发明获得了一株高效降解尿酸的菌株，体外降解效果在30％左右。液相色谱图显示峰面积由41540.5降至29400.6其尿酸含量照反应前降低了30％左右(详情见图1和图2)。效果好于大多数益生菌。且该菌株具有高效降解核苷酸(肌苷、鸟苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、鸟嘌呤)的能力，有较好的耐胃液及肠液的能力。是一株较有潜力的益生菌株。且该菌株也具有良好的发酵性能，遗传稳定性好，十分具有工业应用前景，极大的弥补了目前拥有的降尿酸益生菌株的空白。
2、本发明植物乳杆菌同时具有良好的降解尿酸的前体物质即核苷酸的效果。尿酸在产生过程中，其前体物质依次为黄嘌呤、次黄嘌呤、肌苷、鸟苷等，其含量均与最终血液中的尿酸含量有关。因此提前降解核苷便能更好地预防高尿酸血症的发生。此菌株有较好的降解肌苷、鸟苷的能力。
3、本发明植物乳杆菌可以较好地抑制尿酸产生过程中关键酶黄嘌呤氧化酶的活性。黄嘌呤氧化酶既能催化次黄嘌呤生成黄嘌呤，进而生成尿酸，又能直接催化黄嘌呤生成尿酸的酶。该菌株对黄嘌呤氧化酶抑制率达到90％。更好地在生成途径阻断尿酸的生成。
4、本发明植物乳杆菌具有耐酸性，能在pH＝2的条件下存活。它对胃肠液均有较好的耐受性，符合益生菌的特征，在生产方面，它具有十分良好的工业化前景，目前，可以降解尿酸的益生菌较少，本发明可以丰富降尿酸方面的益生菌库，其机制的研究具有重要意义。
附图说明
图1为本发明中没加入菌体之前尿酸含量的液相色谱图；
图2为本发明中使用本发明加入植物乳杆菌反应后的降解尿酸效果的液相色谱图(加入菌体反应后尿酸所剩含量，参考峰面积)；
图3为本发明中尿酸的标品图；
图4为本发明中没添加植物乳杆菌反应前的降解肌苷-鸟苷效果的液相色谱图(肌苷、鸟苷空白)；
图5为本发明添加植物乳杆菌菌株反应后的降解肌苷-鸟苷效果的液相色谱图(鸟苷、肌苷反应后)；
图6为本发明中动物实验血尿酸降解尿酸效果图；其中，空白组(k)，模型组(M)，治疗组(Z)的大鼠血液尿酸含量变化；
图7为本发明中动物实验中大鼠尿液中尿酸排泄增加效果图；其中，空白组(k)，模型组(M)，治疗组(Z)的大鼠尿液中尿酸含量变化；
图8为本发明植物乳杆菌的菌落形态图。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明进一步说明，下属实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规市售产品，本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法，本发明所用各物质质量均为常规使用质量。
一株可以高效降解尿酸的植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)，名称为YC，分类名称为：Lactobacillusplantarum，保藏编号为：CGMCC No.23506，保藏日期：2022年7月15日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
所述植物乳杆菌的形态特性为：
植物乳杆菌是乳酸菌的一种，菌种为直或弯的杆状，单个、成对或成链状；
其在MRS肉汤琼脂培养基上形成白色的小菌落，呈微隆起圆状轮廓；可以如图8所示。
植物乳杆菌是厌氧或兼性厌氧，适宜生长温度范围为30-35℃；最适pH 6.5左右，属于同型发酵乳酸菌。
较优地，所述MRS肉汤琼脂培养基的配方为：葡萄糖20g,，胰蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母粉5g，无水乙酸钠5g，柠檬酸二铵2g，K2HPO42g，MgSO4·7H2O 0.5g，MnSO4·H2O0.25g，吐温80 1g，琼脂20g，1000ml蒸馏水充分溶解后调节pH值为6.5，121℃、0.1MPa灭菌15min。
较优地，所述植物乳杆菌具有高效降解核苷酸即肌苷、鸟苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、鸟嘌呤的能力，有较好的耐胃液及肠液的能力，能在pH＝2的条件下存活。
较优地，所述植物乳杆菌的筛选步骤如下：
从东北发酵食品酸菜中直接用移液器吸取1m L样品于干净的EP管中，用质量浓度为0.85％的生理盐水进行梯度稀释，即从10-1至10-7，每个梯度做三次平行试验；待不同浓度梯度的稀释液中的样品完全溶解均匀后，按稀释浓度从低到高的顺序各取200μL的稀释液分别接入MRS固体培养基中，并用无菌涂布器均匀涂开；待其吸收后放置到37℃恒温培养箱中进行厌氧培养，时间为2天；取培养后平板上的单一菌落进行划线分离，重复此分离纯化步骤2-3次，即可获得形态一致的纯化单一菌落，得到可以高效降解尿酸的植物乳杆菌。
本发明可以高效降解尿酸的植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)的菌株序列如下：
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具体地，具体的制备及相关检测如下：
实施例1
一株可以高效降解尿酸的植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)，名称为YC，分类名称为：Lactobacillusplantarum，保藏编号为：CGMCC No.23506，保藏日期：2022年7月15日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
将植物乳杆菌YC在37℃条件下静置18-24h培养成种子液，分别取1ml加入9ml空白MRS培养基中静置孵育10h。取适量活化二代菌液，用生理盐水调整菌液OD600为1.5，4000r/min离心10min，弃上清，收集菌体，菌体用无菌生理盐洗涤2次，向清洗后的菌体中加入10ml尿酸浓度为10mmol/L的缓冲液，混合均匀37℃静置孵育8h。孵育之后离心取上清过0.22μm水相滤膜。进行HPLC色谱检测。分析反应液中尿酸的减少量。上述菌株体外降解尿酸效果在29％左右。
其中，尿酸HPLC检测条件为：
检测器：VWD检测器
柱温：25℃
进样量：20uL
流速：1mL/min
检测波长：280nm
流动相：10mmol/L乙酸铵：甲醇＝99：1
MRS培养基的配方为：葡萄糖20g,，胰蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母粉5g，无水乙酸钠5g，柠檬酸二铵2g，K2HPO42g，MgSO4·7H2O 0.5g，MnSO4·H2O 0.25g，吐温80 1g，950ml蒸馏水充分溶解后调节pH值为6.5，121℃、0.1MPa灭菌15min。
尿酸的标品图如图3所示，检测结果如图1和图2所示，从图1和图2可以看出，加入只含有尿酸的缓冲溶液反应8小时后，尿酸的峰面积由41540.5(空白)降至29400.6(反应结束后)。可见加入益生菌之后尿酸的含量有显著的下降。
实施例2
由于尿酸在产生过程中，其前体物质依次为黄嘌呤、次黄嘌呤、肌苷、鸟苷等，其含量均与最终血液中的尿酸含量有关。故釆用磷酸盐缓冲液体系测得上述菌株降解肌苷、鸟苷的能力。将菌株37℃静置18-24h养成种子液，取1ml加入9ml空白MRS培养基中静置孵育10h。取适量活化二代植物乳杆菌菌液，用生理盐水调整菌液OD600为1.5，4000r/min离心10min，弃上清，收集菌体，菌体用0.8％无菌生理盐水洗涤2次。向清洗后的菌体中加入1mL浓度为0.1mg/ml鸟苷-肌苷溶液中，37℃静置孵育8h。孵育后，取lmL菌液4℃、4500r/min离心5min，取上清810微升，加入90微升反应终止剂0.1mol/L高氯酸溶液，混合均匀后4500r/min离心5min，取上清液经0.22um水相滤膜过滤后用于HPLC检测。分析反应液中鸟苷、肌苷的减少量。该菌株对此浓度下的鸟苷、肌苷几乎全部降解。
其中，五种核苷酸HPLC检测条件如下：
检测器：VWD检测器
柱温：25℃
进样量：20uL
流速：0.8mL/min
检测波长：248nm
流动相：甲醇：水＝10：90
检测结果如图4、图5所示，从图4和图5可以看出，经反应后，肌苷、鸟苷的含量几乎为零。表示在0.1mg/ml鸟苷-肌苷溶液的浓度下，菌株将肌苷、鸟苷全部降解。说明此菌株有较好的降解尿酸前体物质的能力。
实施例3
耐酸性(pH＝2，pH＝3)试验：
取2代活化的植物乳杆菌YC菌悬液于4000r/min，4℃离心10min，然后用PBS清洗3次菌泥，按3％的接种量接种于HCl调整后p H值为2.0、3.0的液体MRS培养基中，37℃培养，分别取0、1、2、3h时的菌液稀释涂布，以新鲜MRS培养基为空白对照，计算存活率。结果如表1所示，可以看出，菌株在两种条件下均有较好存活率。
表1酸性条件下菌株存活率
实施例4
耐胆盐试验：
取2代活化的植物乳杆菌YC菌悬液于4000r/min，4℃离心10min，然后用PBS清洗3次菌泥。按3％的接种量将菌悬液接种于胆酸盐质量浓度为0.3％的MRS液体培养基中，37℃培养0、1、3和4h时，分别取100μL样品进行10倍梯度稀释，取适当梯度的稀释液进行涂布计数，以新鲜MRS培养基为空白对照，计算存活率。结果如表2所示，可以看出，该菌株有较好的胆盐耐受性。
表2菌株对胆盐的耐受性
| 植物乳杆菌 | 胆盐耐受性(0.3％) |
| 0h | 100％ |
| 1h | 84％ |
| 3h | 66％ |
| 4h | 53％ |
实施例5
环境耐受性试验(人工胃液、人工肠液)：
取2代的植物乳杆菌YC菌悬液于4000r/min，4℃离心10min，离心后用PBS清洗3次，将菌泥重悬于经滤膜过滤除菌的人工胃液(质量浓度0.35％胃蛋白酶、质量浓度0.3％NaCl、调整pH至3.0)中，37℃分别培养0、1、2、3h时取100μL菌液稀释涂布，用平板菌落计数法计算活菌数，测定菌株在酸性胃液条件下的耐受性。当菌体在人工胃液中处理3h后，吸取1mL含菌人工胃液，加入至9m L经滤膜过滤除菌的人工肠液(1.1％碳酸氢钠、0.3％NaCl、0.1％胰蛋白酶、0.6％胆盐，调整p H至8.0)中，于37℃培养，分别在0、3、5、8h时吸取100μL菌液稀释涂布，用平板计数法计算活菌数，测定菌株在肠中的耐受性。以新鲜MRS培养基为空白对照，计算存活率。结果如表3所示，可以看出，此菌株有较好的胃肠液耐受性，在肠道内经过一系列反应后仍旧可以存活。
表3菌株对人工胃液的耐受性
| 植物乳杆菌 | 人工胃液存活率 |
| 0h | 100％ |
| 1h | 67％ |
| 2h | 54％ |
| 3h | 38％ |
表4菌株对人工肠液的耐受性
| 植物乳杆菌 | 人工肠液存活率 |
| 0h | 100％ |
| 3h | 78％ |
| 5h | 64％ |
| 8h | 54％ |
实施例6
植物乳杆菌菌粉(益生菌组合物)的制作：
取2代的植物乳杆菌YC菌悬液于4000r/min，4℃离心10min，用PBS清洗3次得到菌泥，将菌泥用2ml无菌水混合均匀后，加入4ml脱脂奶粉和4ml无菌水。倒入玻璃培养皿中，冻干厚度在0.5厘米左右，制作好平板后先在-80℃冰箱中预冻2小时，然后进行冻干24小时，去除样品之后，进行冻干存活率的计算。
其中冻干存活率达到65％，其1克菌粉中所含活菌数高达2×1010(CFU/g)。
实施例7
动物实验：
采用灌胃氧嗪酸钾联合含质量浓度4％的尿酸鼠粮饮食联合建立高尿酸血症大鼠模型，实验动物采用雄性昆明小鼠24只，在室温下饲养，自由饮水，经1周适应性饲养后，随机分成正常对照组、高尿酸血症模型组(M)、植物乳杆菌YC益生菌治疗组(Z)。每组6只。除正常对照组(正常对照组饲喂普通鼠粮)外，其他两组大鼠按750mg/kg体重标准灌胃氧嗪酸钾-羧甲基纤维素钠混悬液和含4％尿酸的鼠粮。此外M组大鼠灌胃脱脂牛奶(无浓度要求)，Z组灌胃植物乳杆菌益生菌粉(每天一次，每次1g，菌粉含活菌数为2×1010CFU)。灌喂时间为早上九点灌喂氧嗪酸钾，十一点灌喂益生菌粉。其中造模时间为7天，治疗时间为14天，整个周期为21天。
治疗期间每隔三天取血测量血清中尿酸含量，同时测定尿液中尿酸含量。检测结果如图6和图7所示，尿酸浓度为umol/L。K为空白组，M为模型组。Z为治疗组。由图6看出随着治疗时间的延长，在最后两次取样时间点，也就是第D4和D5天，治疗组大鼠血尿酸明显低于模型组。表示益生菌在降低大鼠血液尿酸方面有一定效果。图7看出在前两次取样也就是第D1,D2两个时间点中，治疗组尿酸的排泄量明显高于模型组，可见刚开始对大鼠进行益生菌干预实，益生菌主要是通过增加尿酸的排泄量来抑制大鼠体内生成更多的尿酸。而后期由于对大鼠持续性造模，大鼠的肝肾功能受到影响。我们可以看出后续治疗组尿酸排泄并没有显著增高。但是后期治疗阶段，由于长时间益生菌的干预，大鼠体内血尿酸含量得到明显控制。这是初步猜测本实验益生菌降尿酸的机理。该菌株在治疗高尿酸血症大鼠有一定的控制效果。该益生菌在一定程度上有预防和防止高尿酸血症的发生。其机制的进一步探索也极其重要。
尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。
Claims (3)
1.一株能降解尿酸的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，其特征在于：名称为YC，分类名称为：Lactobacillus plantarum，保藏编号为：CGMCC No.25306，保藏日期：2022年7月15日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
2.利用如权利要求1所述的植物乳杆菌制备的益生菌组合物，其特征在于：所述益生菌组合物的制备方法如下：
将植物乳杆菌YC在37℃条件下静置18-24h培养成种子液，每取1ml加入9ml空白MRS培养基中静置孵育10h，得活化的二代菌液；
取二代菌液于4000r/min，4℃离心10min，用PBS清洗3次得到菌泥，将离心后的菌泥用2ml无菌水混合均匀后，加入4ml脱脂奶粉和4ml无菌水；倒入玻璃培养皿中，厚度在0.5±0.1厘米，制作好平板后先在-80℃冰箱中预冻2小时，然后进行冻干24小时，去除样品之后，进行冻干存活率的计算；
其中冻干存活率达到65％，其1克菌粉中所含活菌数高达2×1010CFU/g。
3.如权利要求1所述的植物乳杆菌在制备降解尿酸药物中的应用。
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| 降血尿酸乳酸菌筛选及乳杆菌对高血尿酸血症大鼠作用的研究;杨殿斌;中国优秀硕士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑(第1期);参见摘要，表1-3，表1-4，图1-11，图1-12，图1-13，图1-14，图1-21，表1-10，正文第12, 16，29-32和37-38页 * |
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