CN105802877A - 一株产谷氨酰胺酶的解淀粉芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一株产谷氨酰胺酶的解淀粉芽孢杆菌及其应用，属于微生物筛选及发酵领域。所述菌株为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)BOSAR‑X6，于2015年11月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.11760。该菌株培养、发酵条件简单，遗传性质稳定，发酵产生的酶具有谷氨酰胺活性，且液体发酵效率高，操作简单更易于工业化生产。由于该菌株来源于高温温泉，所分泌谷氨酰胺酶具有耐盐和耐高温的特殊性质，具有重要工业利用价值。

Description

一株产谷氨酰胺酶的解淀粉芽孢杆菌及其应用
技术领域
本发明属于微生物筛选及发酵领域，特别涉及一株产谷氨酰胺酶的解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens，BOSAR-X6)及其应用。
背景技术
酶是生物体产生，能起催化作用的大分子物质，绝大部分是蛋白质。酶催化剂除具有明显的高效性外，与其它催化剂相比，还具有催化的专一性。由于微生物几乎能分泌所有现今已知的酶类，并且微生物来源的酶制剂，相比于木瓜、猪胰脏等动植物来源的酶制剂有其不可替代的优势，为了寻求更广泛的微生物及活性物质资源，发现新型菌株及其所生产的酶是当前研究的一大热点。
谷氨酰胺酶(glutaminase)是酰胺酶的一种，是一种催化L-β-谷氨酰胺水解成L-谷氨酸和氨的反应的酶。自从日本的学者池田菊苗发现了海带中的鲜味物质为谷氨酸，谷氨酸钠盐就开始销售，并在全世界被当做调味料广泛使用。酱油、酱汤、植物蛋白水解物、肉类鱼类蛋白水解物、酵母提取物、米酒、果蔬提取物以及菌菇的保健品等各类食品中，添加谷氨酰胺酶可以增加谷氨酸的含量，改善氨基酸组成，从而增强食品的呈味性能；此外，添加谷氨酰胺酶是纯绿色的添加剂，不能带来安全隐患，灭活后也无需再说食品中做额外标记；添加谷氨酰胺酶还可以避免食品中的谷氨酰胺形成具有不愉快味道的焦谷氨酸。在提倡无化学品添加的食品时代，谷氨酰胺酶的重要性越来越突出，但是目前国内还没有可以大规模产谷氨酰胺酶的菌株。
在高温、高盐等极性环境中存在的微生物经过不断的进化选择，其所产生的酶具备一般微生物所不具备的特殊性质，通常能够耐高温高盐。从高温、高盐等极性环境中筛选具有特定功能的微生物为人类利用被广泛认可。
中国专利201510222162.4中公开了一株解淀粉芽孢杆菌及其在发酵产谷氨酰胺酶中的应用。该解淀粉芽孢杆菌是通过固体发酵产谷氨酰胺酶，但是不适宜通过液体发酵产谷氨酰胺酶；固体发酵效率低，操作复杂不利于工业化生产，并且该菌株产的谷氨酰胺酶不具有耐高温高盐的性能。
发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种产谷氨酰胺酶的解淀粉芽孢杆菌。该解淀粉芽孢杆菌是从贵州息烽山温泉的沉积物中来源的谷氨酰胺酶生产菌株。
本发明的另一目的在于提供所述的产谷氨酰胺酶的解淀粉芽孢杆菌的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一株产谷氨酰胺酶的解淀粉芽孢杆菌，命名为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)BOSAR-X6，是从贵州息烽温泉的沉积物中筛选出的。
所述的解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)BOSAR-X6的保藏信息：保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期：2015年11月30日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中科院微生物研究所，保藏编号：CGMCCNo.11760。
所述的解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)BOSAR-X6菌株进行形态学及生理生化鉴定，有以下特征：(1)菌落形态：白色，形状不规则，表面有颗粒感，乳头状凸起，不透明，边缘呈波状；(2)细胞形态：直杆状，链状排列，周生鞭毛，革兰氏阳性；(3)生理生化特征：可在4～40℃环境中生长，好氧，能耐受7％(wt)氯化钠，能水解明胶、淀粉、酪素、柠檬酸盐，能利用硫酸铵、硝酸铵，可利用果糖、葡萄糖、甘露醇、木糖为碳源，吲哚反应、V.P.反应、甲基红试验、接触酶和氧化酶试验为阳性，能产过氧化氢酶，不产硫化氢。
所述的解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)BOSAR-X6菌株的16SrDNA基因进行PCR扩增与序列测定，测得16SrDNA基因片段长度为1269bp，具体序列见SEQIDNO：1。该基因序列与Genbank中已登录的基因序列进行分析得知，该菌株与数据库中Bacillusamyloliquefaciens不同菌株的16SrDNA序列性具有96％的相似性，与BacillusamyloliquefaciensstrainR8和Bacillusamyloliquefacienssubsp.PlantarumstrainSDF002相似性最高，同源性达96％，鉴定该菌株为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)。将此结果结合菌株形态学及生理生化鉴定特征，确定该菌为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)。
所述的解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)BOSAR-X6在产谷氨酰胺酶中的应用。
所述的解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)BOSAR-X6在液体发酵产谷氨酰胺酶中的应用。
利用康维皿弥散法对解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)BOSAR-X6所产谷氨酰胺酶的活性的鉴定。
所述的解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)BOSAR-X6菌株通过单因素试验对其液体发酵产谷氨酰胺酶的耐盐和耐高温性能进行了测试，发现所述的解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)BOSAR-X6菌株发酵所产的谷氨酰胺酶具有耐高温高盐的特性。该谷氨酰胺酶在60℃的测定条件下活性最高；在70℃下处理5min，仍然保持80％以上的活性；在盐浓度为20％时，仍然保持70％以上的活性。
本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果：
本发明公开一株产谷氨酰胺酶的解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)BOSAR-X6。该菌株培养、发酵条件简单，遗传性质稳定，发酵产生的酶具有谷氨酰胺活性，且液体发酵效率高，所产菌液的酶活是中国专利201510222162.4中公开了一株解淀粉芽孢杆菌发酵所产谷氨酰胺酶酶活的近40倍，且操作简单更易于工业化生产。由于该菌株来源于高温温泉，所分泌谷氨酰胺酶具有耐盐和耐高温的特殊性质，具有重要工业利用价值。
附图说明
图1是不同温度下发酵液中谷氨酰胺活性的结果图。
图2是处理温度对发酵产谷氨酰胺酶活性的影响。
图3是盐浓度对发酵产谷氨酰胺酶活性的影响。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。
实施例1
富集及种子培养基：蛋白胨5g/L，酵母膏1g/L，葡萄糖15g/L，硫酸镁0.1g/L，硫酸铁0.1g/L，pH7.6～7.8，用温泉水配制。
发酵培养基：糖蜜20g/L，酵母粉10g/L，氯化钙2.8g/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸锰0.01g/L，氯化钠1g/L，磷酸氢二钠1g/L，磷酸二氢钾1g/L，pH7.5，用去离子水配制。
所述的解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)BOSAR-X6菌株的鉴定
将活化的解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)BOSAR-X6菌株接种于LB培养基中，37℃，150r/min培养12h，经LB培养基传代培养2～3次后，取1.5mL对数生长末期的菌体培养物，4℃，10000r/min离心5min，收集菌体，去尽培养液。菌体经SDS及蛋白酶K裂解、酚-氯仿-异戊醇抽提、转移上清、0.6倍体积异丙醇析出DNA沉淀后短暂离心、70％乙醇洗涤、TE溶解模板DNA。电泳检测后采用通用引物进行PCR(正向引物：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，反向引物：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)。
扩增总反应体系为(20μL)：模板基因DNA0.5μL；上下游引物(20μmol/L)各1.0μL；TaqDNA聚合酶0.2μL；10×buffer2.0μL；4种脱氧核苷酸混合物dNTP(各2.5mmol/L)1.6μL，25mmol/LMgCl21.6μL，双蒸水(ddH2O)12.1μL。PCR扩增条件：95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃1.5min，共30个循环；72℃10min；10℃。PCR产物纯化后完成测定的16SrDNA基因基因片段长度为1269bp，与Bacillusamyloliquefaciensstrains相似性最高，同源性达96％，具体序列见SEQIDNO：1。结合菌株形态学、生理生化特征，判定该菌株为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)，命名为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)BOSAR-X6。
所述的解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)BOSAR-X6所产谷氨酰胺酶的活性的鉴定。
康维皿弥散法测定发酵液的谷氨酰胺活性，取0.05M谷氨酰胺溶液0.25mL，及酶液0.1mL于试管中，于37℃保温60分钟，使酶充分水解谷氨酰胺后，取清液于康维皿的外室。另加入半饱和的碳酸钾溶液，于康维皿中央室置指示剂及1％硼酸溶液，于37℃保温60分钟，谷氨酰胺释放的氨被硼酸吸收，用标准盐酸滴定硼酸的消耗量。根据释放的氨的毫克书计算谷氨酰胺酶的活力。
解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)BOSAR-X6发酵产谷氨酰胺酶
将活化好的对数生长期的解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)BOSAR-X6的种子液，以2％的接种量接种于发酵培养基，在37℃恒温培养48h，结束发酵后，在30℃测定谷氨酰胺活性为12U/mL。
对发酵产谷氨酰胺酶的耐高温和耐盐能力的测试。
(1)在pH7.5测定不同温度下发酵液的谷氨酰胺活性。横坐标-温度(℃)，纵坐标-相对活力(％)。结果如图1所示，表明，该谷氨酰胺酶在60℃的测定条件下活性最高。
(2)将谷氨酰胺酶在不同温度下处理5min，然后在pH7.5，30℃下测定酶活。横坐标为处理温度(℃)，纵坐标为相对活性(％)。结果如图2所示，表明，在70℃下处理5min，仍然保持80％以上的活性。
(3)在不同的盐浓度条件下测定发酵液的谷氨酰胺活性。然后在pH7.5，30℃下测定酶活。横坐标为盐浓度(NaCl％)，纵坐标为相对活性(％)。结果如图3所示，表明，在盐浓度为20％时，仍然保持70％以上的活性。
解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)BOSAR-X6菌株的遗传稳定性
将解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)BOSAR-X6菌株连续传代培养，并测其酶活，以酶活力作为评价遗传稳定性的指标。结果如表1，传代8次，谷氨酰胺酶活力保持在12.0U/mL左右，表明菌株有较好的遗传稳定性。
表1解淀粉芽孢杆菌BOSAR-X6发酵产谷氨酰胺酶活力的遗传稳定性
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一株产谷氨酰胺酶的解淀粉芽孢杆菌，其特征在于：名称为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)BOSAR-X6，于2015年11月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCCNo.11760。
2.权利要求1所述的产谷氨酰胺酶的解淀粉芽孢杆菌在产谷氨酰胺酶中的应用。
3.权利要求1所述的产谷氨酰胺酶的解淀粉芽孢杆菌在液体发酵产谷氨酰胺酶中的应用。
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