CN114410514A - 斯密氏芽孢杆菌及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种斯密氏芽孢杆菌(Bacillus smithii)XY‑1，其保藏编号为CGMCC NO:19412。本发明还同时公布了上述斯密氏芽孢杆菌(Bacillus smithii)XY‑1的用途：促进鱼类生长发育，防治肠炎。
Description
技术领域
本发明涉及一株分离自咖啡渣发酵物的史氏芽孢杆菌(Bacillus smithii)XY1及其在促进鱼类生长、防治动物(特别是鱼类)慢性胃肠炎中的应用。
背景技术
益生菌一般是指通过定殖在宿主体内，改变宿主某一部位菌群组成的一类对宿主有益的活性微生物。目前水产用益生菌在养殖业领域具有极高的应用价值，广泛应用于功能性动物保健品的开发。水产用益生菌可用于制备微生物发酵饲料，既无药残、无污染，又可改善水产动物的健康状况，净化水质，改善养殖环境，最终可使养殖动物生长发育更快更好，抗病能力更强。目前，虽然对于益生菌促进鱼类生长发育方面有较多的研究，然而目前对于可利用的益生菌菌种资源依旧很少，研究开发新型益生菌具有重要意义。
乳酸菌是一类能发酵产生大量乳酸的细菌统称，是重要的功能性菌群，在鱼类养殖中的研究较多，且具有良好效果。但目前的乳酸菌在水体中的竞争优势较弱，与此相对，芽孢杆菌因其具有耐高温、抗性强等特点，在工业生产中占据重要地位，也可在水体微生物环境中占据优势地位。
肠炎可出现在人、鱼类、禽类、畜类等多种生物体中，可引起高等动物腹痛腹泻、消化不良，甚至引起重感染，乃至休克，急重性肠炎亦或导致养殖动物的死亡。
目前肠炎的治疗药物主要分为抗菌类药物(抗生素等)以及抗炎药物(糖皮质激素类等)。然而抗菌药物的大量使用会导致细菌耐药性的产生，不利于绿色农业的发展。而普通抗炎类药物一般用于诊断后，过量使用也会带来兽药残留等问题。因此研究开发更有效、更安全动物和人体肠炎相关保健品和药物具有重要意义。其中益生菌预防及治疗是最有希望的替代方案之一。
201910036872.6公开一种嗜热菌Bacillus smithii Ths1及其应用。所述嗜热菌Bacillus smithii Ths1的菌株保藏号为CGMCC No.16868。本发明嗜热菌Bacillussmithii Ths1高温适应性强，适合的温度范围广，能够分泌大量的纤维素酶和蛋白酶，能够快速分解有机固体废弃物中的纤维素和蛋白类物质，加快有机固体废弃物的堆肥化进程，提高堆肥的有机质含量。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种斯密氏芽孢杆菌(Bacillus smithii)XY-1及其用途。
为解决上述技术问题，本发明提供一种斯密氏芽孢杆菌(Bacillus smithii)XY-1，其保藏编号为CGMCC NO:19412。
本发明还同时提供了斯密氏芽孢杆菌(Bacillus smithii)XY-1的用途：促进鱼类(幼鱼)生长发育。具体为：促进鱼类(幼鱼)体重增重、体长增长。可制备成鱼类生长促进剂。
本发明还同时提供了斯密氏芽孢杆菌(Bacillus smithii)XY-1的另一种用途：防治肠炎(防治溃疡性肠炎)。具体为：用于制备防治鱼类肠炎的药物。
本发明还提供了斯密氏芽孢杆菌(Bacillus smithii)XY-1的活性益生菌体的制备方法。
本发明的斯密氏芽孢杆菌(Bacillus smithii)XY-1，分离自高温咖啡渣发酵物。
该菌株的菌落特征如下：为杆菌，产芽孢，革兰氏阳性，在固体培养基上，菌落呈圆形，表面凸起、光滑，边缘完整，呈米黄色，不透明。
菌株鉴定：分离纯化的XY-1，根据16S rDNA测序鉴定方法初步鉴定该菌株为斯密氏芽孢杆菌，该菌株16S rDNA基因序列如SEQ ID NO:1所示。之后根据菌种的细胞形态、生理生化特征、16S rRNA基因序列等试验数据综合分析，参考《伯杰氏系统细菌学手册》以及International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology有关研究论文，鉴定结果为：斯密氏芽孢杆菌(Bacillus smithii)XY-1。其微生物学特性如下表1所示。
本发明以植物性食品源发酵物——咖啡渣中分离的菌为目标菌群，根据安全性及耐热性效果筛选出具有潜在益生功能、且根据抗炎效果筛选出最具抗炎效力的益生菌---斯密氏芽孢杆菌(Bacillus smithii)XY-1，并通过动物实验验证了其具有促进鱼类生长发育的功能，可作为绿色生物资源促进幼鱼的体长和体重增长。本发明制备的活性菌体具有显著提高鱼类体长体重增长，尤其是体重增重的作用。
本发明还通过动物实验验证了其具有调节肠道过度炎症反应，因此具有防治和修复肠炎，缓解腹泻及腹部不适的功能。本发明通过将斯密氏芽孢杆菌(Bacillus smithii)XY-1的活性菌体在较为成熟的经化合物造模形成的溃疡性肠炎的斑马鱼模型中进行了死亡率和炎症相关因子的验证。因此，本发明经筛选获得了一株用于治疗和缓解肠道炎症的斯密氏芽孢杆菌(Bacillus smithii)XY-1，其具有高效减轻中性粒细胞肠道浸润，促炎因子升高等肠炎表现的潜力。
本发明为益生菌在水产上的应用、以及治疗和预防动物(特别是鱼类)溃疡性肠炎提供了新的菌株以及技术基础，应用前景广阔。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1为不同浓度的活性菌体对斑马鱼幼鱼长时间体长增长影响结果；
图2为不同浓度的活性菌体对斑马鱼幼鱼长时间体重增重影响结果；
图3为益生菌干预对高浓度DSS诱导斑马鱼存活率影响结果；
图4为益生菌干预对低浓度DSS诱导斑马鱼肠道中性粒细胞浸润影响结果；
图5为史氏芽孢杆菌(Bacillus smithii)XY1干预降低肠道炎症因子TNF-α表达量的结果；
图6为史氏芽孢杆菌(Bacillus smithii)XY1干预提高肠道抗炎因子IL-10表达量的结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
MRS液体培养基：每升水中加入：蛋白胨10g；酵母粉5g；牛肉膏8g；葡萄糖20g；磷酸氢二钾(3水)2g；乙酸钠(3水)5.0g；硫酸镁(7水)0.2g；硫酸锰(1水)0.04g；吐温80 1.0ml；柠檬酸氢铵2g；pH6.2-6.6。
MRS琼脂培养基在MRS液体培养基的基础上添加15g/L的琼脂糖。
培养基于115℃中灭菌25min，琼脂培养基倒板处理，液体培养基冷却至室温后使用。
MRS-CaCO3琼脂培养基即MRS琼脂培养基中添加了1％(1g/100mL)的CaCO3，作为分离培养基。
实施例1、益生菌株的分离与筛选
以高温发酵(50℃)的5‰咖啡渣发酵液为分离样品，用带有灭菌吸头的移液器吸取5ml至10ml灭菌一次性移液管中封盖。在超净台中稀释至合适的浓度，用200μl移液枪吸取100μl至MRS-CaCO3琼脂培养皿中，于50℃下培养24-48h。待菌落形成后，用接种环挑取菌落，接种于MRS液体培养基中，50℃下培养24h。待菌株生长良好后，再次划线接种于MRS琼脂培养基中，同样置于50℃条件下，培养24h-48h，仔细观察记录菌落形态和革兰氏染色细胞形态特征。进一步纯化培养，并采用冷藏、-80℃冷藏保存。
将从咖啡渣中分离的乳酸菌菌株，分别进行体内和体外的安全性测试。体外安全性测试为溶血性测试(参照常规的临床微生物学及检验测试法)，将纯化的各乳酸菌株划线接种于含5％羊鲜血的LB平板上，在50℃下培养24h。排除掉不是γ溶血性的菌株，选取溶血性安全的乳酸菌菌株。体内安全性测试为鱼类急性毒理实验(参照国标GBT 27861-2011鱼类急性毒性试验)，将成年斑马鱼放置于终浓度为1×106cfu/mL的菌液中，测试96h后鱼的存活情况，选取没有明显毒性作用的菌株。
对测试为体内体外安全的菌株，经耐热性实验，对菌株的耐热情况进行筛选。共采用了30、35、40、35、50、55、60℃这7种不同温度。通过耐热性实验评价，挑选得到耐60℃高温的，最适宜生长温度在55℃的，适宜商业化发酵的斯密氏芽孢杆菌。
从咖啡渣样品中分离鉴定的27株乳酸菌种，经过上述安全性评价以及耐高温工业化筛选，得到了一株适合与高温发酵的乳酸菌，即斯密氏芽孢杆菌(Bacillus smithii)XY-1。
实施例2、益生菌株的鉴定
分离纯化的斯密氏芽孢杆菌(Bacillus smithii)XY-1，根据16S rDNA测序鉴定方法初步鉴定该菌株为斯密氏芽孢杆菌，该菌株16S rDNA基因序列如SEQ ID NO.1所示。之后根据菌种的细胞形态、生理生化特征、16S rRNA基因序列等试验数据综合分析，参考《伯杰氏系统细菌学手册》以及International Journal of Systematic and EvolutionaryMicrobiology有关研究论文，鉴定结果为：斯密氏芽孢杆菌(Bacillus smithii)。其微生物学特性如表1所示。
表1、斯密氏芽孢杆菌(Bacillus smithii)的生理生化特性
注：+阳性反应；-阴性反应
菌株保藏信息如下：
菌株XY-1，保藏名称为斯密氏芽孢杆菌(Bacillus smithii)，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号：CGMCC NO:19412，保藏时间2020年01月19日。
实施例3、斯密氏芽孢杆菌(Bacillus smithii)XY-1有效菌体的制备
将斯密氏芽孢杆菌(Bacillus smithii)XY-1从-80℃中取出，于MRS琼脂培养基中50℃条件下放置18h活化一代，并挑取一接种环的单菌落于5ml的MRS液体培养基中50℃静置培养18h再次活化，取第二次活化的液态培养物以2％(体积％)的添加量加入最终液态培养基(即，新的MRS液体培养基)，继续50℃静置培养18h。将最终培养物置于灭菌离心管中离心(12000RPM的转速下离心1分钟)。弃去上清液，用养鱼水洗涤2次后，得到纯净菌体，纯净菌体需重溶于鱼水中并稀释至最适浓度后使用。
养鱼水是满足国家斑马鱼资源中心(CZRC)推荐条件的水。
实施例4、斯密氏芽孢杆菌(Bacillus smithii)XY-1菌体施用浓度、次数及其提高斑马鱼幼鱼的体长作用
将斯密氏芽孢杆菌(Bacillus smithii)XY-1纯净菌体重溶于养鱼水，并制备成102～105CFU/ml的XY-1菌液为含益生菌养鱼水，将4日龄(4dpf)的幼鱼饲养在含有不同浓度益生菌的养鱼水中，培养至21日龄(21dpf)，除首次添加菌液外，不再次添加益生菌液。幼鱼的饲养参考国家斑马鱼资源中心(China Zebrafish Resource Center)推荐流程饲养。分别于首日(4dpf)，一周后(10dpf)，以及17天后(21dpf)检测幼鱼的体长变化。
如图1结果显示对于4日龄的小鱼，104cfu/ml终浓度的斯密氏芽孢杆菌(Bacillussmithii)XY-1菌体是促进幼鱼体长的最适浓度。在小鱼年幼时期添加一次斯密氏芽孢杆菌(Bacillus smithii)XY-1即可在长达17日的时间内都起到促进小鱼体长生长的效果，在一周内组间差异最为明显。4日龄小鱼的体长为3.83±0.08mm，在一周内养殖于104cfu/ml史氏芽孢杆菌(Bacillus smithii)XY1菌液的小鱼体长增长至5.55±0.04mm，增长了44.9％。相较于不加菌的对照组4.81±0.11mm的只增长了25.6％而言，加菌组额外增长了19.3％的体长。而根据放大效应，17日后养殖于104～105cfu/ml斯密氏芽孢杆菌(Bacillus smithii)XY-1菌液的效果则相较于不加菌对照则可额外增长20％。
如图2结果显示对于4日龄的小鱼，104cfu/ml终浓度的斯密氏芽孢杆菌(Bacillussmithii)XY-1菌体是促进幼鱼体重的最适浓度。在小鱼年幼时期添加一次斯密氏芽孢杆菌(Bacillus smithii)XY-1即可在长达17日的时间内都起到促进小鱼体重增重的效果。4日龄小鱼在17内施加104cfu/ml斯密氏芽孢杆菌(Bacillus smithii)XY-1菌体的小鱼体重可至4.17±0.48mg。相较于不加菌的对照组2.17±0.38mg而言，加菌组额外增重了92.1％的体长。
实验例5、斯密氏芽孢杆菌(Bacillus smithii)XY-1预防高浓度DSS诱导的斑马鱼肠炎
将斯密氏芽孢杆菌(Bacillus smithii)XY-1制备成1x106CFU/ml的终浓度益生菌溶液，同时在0.6％DSS诱导条件下对3日龄斑马鱼(3dpf)幼鱼进行预防肠炎试验。10尾3dpf龄的斑马鱼为一组放入24孔板中，每孔加入2ml 0.6％浓度的硫酸葡聚糖钠盐(DSS)用以诱导小鱼急性肠炎，设置3组生物学重复。同时在DSS处理水中分别等量加入益生菌溶液和对照菌株(菌株来自于本实验室菌种库或商业菌株)以及阳性对照药物泼尼松龙(prednisolone)，其中细菌终浓度为1x106CFU/ml，药物终浓度为25μg/ml。经过3天处理后，如图3结果显示高浓度0.6％DSS可以增加斑马鱼幼鱼的死亡率。本发明的斯密氏芽孢杆菌(Bacillus smithii)XY-1干预则可以提高幼鱼的存活率。相较于其他筛选得到的菌株以及商业化阳性益生菌菌株，史氏芽孢杆菌(Bacillus smithii)的效果更接近于抗生素以及糖皮质激素类药物泼尼松龙。
实验例6、斯密氏芽孢杆菌(Bacillus smithii)XY-1治疗低浓度DSS诱导的斑马鱼肠炎
将本发明的斯密氏芽孢杆菌(Bacillus smithii)XY-1制备成1x106CFU/ml的终浓度益生菌溶液，对已使用低浓度0.5％DSS诱导2日的5日龄肠炎斑马鱼(5dpf)幼鱼进行肠炎治疗试验。6尾3dpf龄的Tg(mpx:EGFP)i114品系斑马鱼尾一组放入24孔板中，每孔加入2ml0.5％浓度的硫酸葡聚糖钠盐(DSS)用以诱导小鱼急性肠炎，设置3组生物学重复。经过2日的培养，将5dpf龄的小鱼经过2次新鲜鱼水的洗涤后放入另一块孔板中。孔板中同样加入2ml的新鲜鱼水(无DSS)，并且水中分别等量加入益生菌溶液和对照菌株(菌株来自于本实验室菌种库或商业菌株)以及阳性对照药物泼尼松龙(prednisolone)，其中细菌终浓度为1x106CFU/ml，药物终浓度为25μg/ml。继续培养1日。最终在荧光显微镜下观察荧光强度，记录在肠道中聚集的中性粒细胞的数目。
同时，继续做相同的实验，使用TAKARA的RNAiso Plus试剂盒提取1组幼鱼RNA，设置3次生物学重复。使用gDNA Eraser进行cDNA的合成。使用SYBR方法检测实时荧光定量PCR，最终用StepOne软件分析mRNA的表达量。使用ΔΔCt方法分析。此处，我们分别检测了促炎因子TNF-α和抑炎因子IL-10的表达量。
如图4结果显示低浓度0.5％DSS可以增加斑马鱼幼鱼的中性粒细胞肠道浸润。而史氏芽孢杆菌(Bacillus smithii)干预则可以减轻中性粒细胞浸润的肠炎表型。相较于其他筛选得到的菌株以及商业化阳性益生菌菌株，史氏芽孢杆菌(Bacillus smithii)的效果更接近于糖皮质激素类药物predinisolone。
如图5-6所示，DSS诱导可以增加模型组IBD斑马鱼模型肠中的TNF-α表达量，且降低抗炎因子IL-10的表达；而斯密氏芽孢杆菌(Bacillus smithii)XY-1的干预则可以降低TNF-α表达量，且提高抗炎因子IL-10的表达。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
序列表
<110> 上海新溢生物科技工程研究中心(有限合伙)
<120> 斯密氏芽孢杆菌及其用途
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1442
<212> DNA
<213> 斯密氏芽孢杆菌(Bacillus smithii)
<400> 1
gggggggcgt gctatactgc aagtcgagcg gactttcaag aagcttgctt tttgaaagtt 60
agcggcggac gggtgagtaa cacgtgggca acctgcctgc aagacgggga taactccggg 120
aaaccggggc taataccgga taatatcttc cttcgcatga aggaaggttg aaaggcggcg 180
caagctgccg cttgcagatg ggcccgcggc gcattagcta gttggtgagg taacggctca 240
ccaaggcgac gatgcgtagc cgacctgaga gggtgatcgg ccacactggg actgagacac 300
ggcccagact cctacgggag gcagcagtag ggaatcttcc gcaatggacg aaagtctgac 360
ggagcaacgc cgcgtgagcg aagaaggtct tcggatcgta aagctctgtt gtcagggaag 420
aacaagtacc gttcgaacag ggcggtacct tgacggtacc tgaccagaaa gccacggcta 480
actacgtgcc agcagccgcg gtaatacgta ggtggcaagc gttgtccgga attattgggc 540
gtaaagcgcg cgcaggcggt ctcttaagtc tgatgtgaaa gcccacggct caaccgtgga 600
gggtcattgg aaactgggag acttgagtgc agaagaggag agcggaattc cacgtgtagc 660
ggtgaaatgc gtagagatgt ggaggaacac cagtggcgaa ggcggctctc tggtctgtaa 720
ctgacgctga ggcgcgaaag cgtggggagc gaacaggatt agataccctg gtagtccacg 780
ccgtaaacga tgagtgctaa gtgttagagg gcttccaccc tttagtgctg cagctaacgc 840
attaagcact ccgcctgggg agtacggccg caaggctgaa actcaaagga attgacgggg 900
gcccgcacaa gcggtggagc atgtggttaa ttcgaagcac gcgaagacct taccaggtct 960
tgactccttc gctactctag agtagaggtt ccctttcggg gacgaatgac agtggtgcat 1020
ggttgtcgtc agctcgtgtc gtgagatgtt gggttaagtc ccgcaacgag cgcaaccctt 1080
gaccttagtt gccagcattc agttgggcac tctaaggtga ctgccggtga caaaccggag 1140
gaaggtgggg atgacgtcaa atcatcatgc cccttatgac ctgggctaca cacgtgctac 1200
aatggatggt acaaagggtc gcgaaaccgc gaggtggagc caatcccaaa aaaccattct 1260
cagttcggat tgcaggctgc aactcgcctg catgaagccg gaatcgctag taatcgcgga 1320
tcagcatgcc gcggtgaata cgttcccggg ccttgtacac accgcccgtc acaccacgag 1380
agtttgcaac acccgaagtc ggtgaggtaa cccttacggg agccagccgc cgaagggacc 1440
aa 1442
Claims (6)
1.斯密氏芽孢杆菌(Bacillus smithii)XY-1，其特征在于：保藏编号为CGMCC NO:19412。
2.如权利要求1所述的斯密氏芽孢杆菌(Bacillus smithii)XY-1的用途，其特征在于：促进鱼类生长发育。
3.根据权利要求2所述的斯密氏芽孢杆菌(Bacillus smithii)XY-1的用途，其特征在于：促进鱼类体重增重、体长增长。
4.根据权利要求3所述的斯密氏芽孢杆菌(Bacillus smithii)XY-1的用途，其特征在于：制备鱼类生长促进剂。
5.根据权利要求2～4任一所述的斯密氏芽孢杆菌(Bacillus smithii)XY-1的用途，其特征在于：防治肠炎。
6.根据权利要求5所述的斯密氏芽孢杆菌(Bacillus smithii)XY-1的用途，其特征在于：用于制备防治鱼类肠炎的药物。
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