CN104059946B - 一种以扇贝为原料制备γ-氨基丁酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于水产品生物加工技术领域，具体涉及一种以扇贝为原料制备GABA的方法。将原料磨成匀浆并加入水，室温放置自然发酵获得原料液源液；将原料磨成匀浆烘干后加入水，而后再添加营养物质冷却后得固体分离培养基；将原料磨成匀浆后加入水，而后再添加葡萄糖得到培养液并调节pH值灭菌后得活化培养液；将原料磨成匀浆后加入水，而后再添加葡萄糖和谷氨酸钠得到含谷氨酸钠的培养液；将所述原料液源液稀释，稀释后培养于所述固体分离培养基中30-35℃下培养36-48小时，培养后培养物于培养液中30-35℃下培养1-2天，所得培养液再按1-4％的比例接种于含谷氨酸钠的培养液中于35℃-40℃下发酵培养2-14天，即得到富含GABA的培养物。采用本发明的方法能减少扇贝加工废弃物带来的环境污染问题，实现海产品精加工的高值化利用。

Description

一种以扇贝为原料制备γ-氨基丁酸的方法
技术领域
本发明属于水产品生物加工技术领域，具体涉及一种以扇贝为原料制备GABA的方法。
背景技术
我国是扇贝养殖大国，资源极为丰富，从北到南的整个沿海地区都大量盛产。这些扇贝不但营养丰富，味道鲜美，而且还有很多保健功能，具有重要食用价值和经济价值。随着扇贝养殖业的快速发展，扇贝已出现供过于求和价格下跌的趋势。随着现代分离技术和生物技术的发展使人们对扇贝综合利用价值的重视程度不断提高，对于扇贝的利用已不再局限于海水养殖业，已经从广度和深度上不断拓展，研究内容涉及生态、养殖、医药、毒理、遗传和分子生物学等诸多领域。扇贝含有丰富的蛋白质、脂肪、维生素、微量元素等营养成分，每100g扇贝柱中含蛋白质63.7g、脂肪3g、醣类15g、钙47mg、磷886mg和铁2.9mg。扇贝下脚料中的性腺、裙边等组织亦富含丰富蛋白质，可作为蛋白源利用；扇贝群边的酶解液氨基酸组成齐全，其中必需氨基酸的含量达45.74％。扇贝这些特性使其在食品开发、医疗保健、疾病防治以及化工等领域都有很好的应用和开发前景。对这些扇贝资源进行高值化开发利用，为人类提供理想的海洋食品及海洋药物，并创造出宏观的经济效益，将有助于推动我国海洋产业的迅速发展。
γ-氨基丁酸(γ-Aminobutiricacid,GABA)是哺乳动物、甲壳类动物、昆虫和某些寄生蠕虫神经系统中重要的抑制性神经递质。少数植物中含有这种非蛋白质氨基酸。γ-氨基丁酸也称氨酪酸，是一种非蛋白质组成成份的天然氨基酸，广泛存在于自然界中，是目前研究较为深入的一种重要的抑制性神经递质，它参与多种代谢活动，具有降血压、调节心律失常、改善睡眠、抗焦虑、改善脂质代谢、防止动脉硬化等功效，因此受到越来越多的科学工作者的关注。
发明内容
本发明的目的在于提供一种以扇贝为原料制备γ-氨基丁酸的方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种以扇贝为原料制备γ-氨基丁酸的方法，
1)将原料磨成匀浆，匀浆中加入水，室温放置一周，自然发酵获得原料液源液；
2)将原料磨成匀浆烘干后加入水，而后再添加营养物质冷却后得固体分离培养基；
3)将原料磨成匀浆后加入水，而后再添加葡萄糖得到培养液，调节培养液pH值6.5-7.0，灭菌后得活化培养液；
4)将原料磨成匀浆后加入水，而后再添加葡萄糖和谷氨酸钠得到含谷氨酸钠的培养液；
5)将所述原料液源液稀释至106-107倍，稀释后培养于所述固体分离培养基中30-35℃下培养36-48小时，培养后培养物于培养液中30-35℃下培养1-2天，所得培养液再按1-4％的比例接种于含谷氨酸钠的培养液中于35℃-40℃下发酵培养2-14天，即得到富含GABA的培养物。
所述步骤5)所得发酵所得培养液再经活化培养液活化，活化后按1％-4％的比例接种于pH值6.0-7.0并灭菌后的谷氨酸扇贝培养液中，35℃-40℃，发酵培养2-14天，即得到富含GABA的培养物。其中，活化条件为30-37℃，培养1-2天。
所述原料液源液为将原料扇贝用匀浆机研磨成匀浆，匀浆中加水混匀后室温静置4-7天，自然发酵，待用；其中，匀浆与水按质量体积为1：5-10的比例混合。
所述固体分离培养基为将原料扇贝用匀浆机研磨成匀浆，匀浆在100-110℃下烘干，得原料干粉，原料干粉中加水混合，每升混合液中加入葡萄糖10-15g，无水醋酸钠1-2g，吐温-800.5-1ml和琼脂15-20g，而后调节pH值至6.5-7.0，灭菌后待用；其中，原料干粉与水质量体积为1：40-60的比例混合。
所述培养液为将原料扇贝用匀浆机研磨成匀浆，匀浆中加水混匀，每升混合液中加入葡萄糖5-10g，即为培养液；培养液pH值调节至6.5-7.0，灭菌后即为活化培养液；其中匀浆与水按质量体积为1：5-10的比例混合。
所述含谷氨酸钠的培养液为将原料扇贝用匀浆机研磨成匀浆，匀浆中加水混匀，每升混合液中加入葡萄糖5-10g和谷氨酸钠10-20g混合均匀后调节pH值至6.0-7.0，灭菌，待用；其中，匀浆与水按质量体积为1：5-10的比例混合。
所述原料为扇贝边、扇贝内脏、扇贝柱中的一种或几种的混合。
本发明所具有的优点
1.本发明利用扇贝及其加工下脚料制备GABA，相较于目前普遍应用的MRS培养基和GYP培养液，大大节约了生产成本，极大简化了培养基、培养液的配制过程，更适合于工业化生产。
2.我国是扇贝养殖大国，在其加工过程中，大量的裙边、内脏等下脚料基本未被加工利用。本发明实现了扇贝及其加工下脚料的高值利用，充分利用了我国丰富的贝类资源，提高了水产业的经济效益，同时也减少了加工废料随意丢弃所带来的环境污染问题。
具体实施例
下面对本发明作进一步说明，并且本发明的保护范围不仅局限于以下实施例。
实施例1
(1)原料液源为：0.1kg新鲜扇贝肉用匀浆机研磨成匀浆，匀浆中添加其质量10倍体积清水(w/v)，制成扇贝-水混合液Ⅰ。混合液Ⅰ室温静置4天，自然发酵，得原料液源液。
(2)将原料液源液加去离子水，稀释10-7倍，得稀释液Ⅰ。
(3)固体分离培养基：0.2kg新鲜扇贝肉用匀浆机研磨成匀浆，在100℃烘箱中烘干水分，得扇贝干肉粉。扇贝干肉粉中添加其质量40倍体积清水(w/v)，得扇贝-水混合液Ⅱ。1L混合液Ⅱ中加入葡萄糖10g，无水醋酸钠1g，吐温-800.5ml，琼脂15g，配制成扇贝溶液A，调节扇贝溶液A的pH值至6.5，而后于120℃条件下灭菌15分钟。取灭菌后20ml扇贝溶液A，倒入50ml培养皿中，冷却凝固后得固体分离培养基。
(4)活化培养液：0.4kg新鲜扇贝肉用匀浆机研磨成匀浆，匀浆中添加其质量10倍体积清水(w/v)，制成扇贝-水混合液Ⅲ。1L混合液Ⅲ中加入葡萄糖10g，配制成扇贝溶液B，调节扇贝溶液B的pH值至6.5，而后于120℃条件下灭菌15分钟。取灭菌后50ml扇贝溶液B，倒入100ml锥形瓶中，冷却后得活化培养液。
(5)含谷氨酸钠的培养液：0.4kg新鲜扇贝肉用匀浆机研磨成匀浆，匀浆中添加其质量10倍体积清水(w/v)，制成扇贝水混合液Ⅲ。1L混合液Ⅲ中加入葡萄糖10g，谷氨酸钠10g，配制成扇贝溶液C，调节扇贝溶液C的pH值至6.5。而后于120℃条件下灭菌15分钟。取灭菌后50ml扇贝溶液B，倒入100ml锥形瓶中，冷却后得含谷氨酸钠的培养液。
(6)培养物的分离：将0.1ml稀释液Ⅰ涂布于固体分离培养基上，33℃培养2天，获得不同培养物。
(7)活化培养：将上述所得不同培养物分别接种于50ml活化培养液中，33℃培养1天，得不同培养物的种子培养液。
(8)制备GABA：取不同培养物的种子培养液按1％(v/v)比例分别接种于50ml含谷氨酸钠的培养液中，35℃发酵培养3天，HPLC法(详见：GABA含量检测方法Q/LJS0006S-2013)测定不同培养物发酵液中GABA含量，得到GABA产量为2.21g/L不同培养物。
将上述所得发酵液扩大化培养，将上述获得出培养物接种于活化培养液中，37℃培养1天，按1％(v/v)的比例接种于含谷氨酸钠的培养液中，35℃发酵培养3天，得GABA含量2.21g/L的扇贝发酵培养液。
实施例2
(1)原料液源为：0.2kg扇贝内脏与扇贝裙边混合物用匀浆机研磨成匀浆，匀浆中添加其质量8倍体积清水(w/v)，制成扇贝-水混合液Ⅰ。混合液Ⅰ室温静置5天，自然发酵，得原料液源液。
(2)将原料液源液加去离子水，稀释10-7倍，得稀释液Ⅰ。
(3)固体分离培养基：0.3kg扇贝内脏与扇贝裙边混合物用匀浆机研磨成匀浆，在110℃烘箱中烘干水分，得扇贝干肉粉。扇贝干肉粉中添加其质量50倍体积清水(w/v)，得扇贝-水混合液Ⅱ。1L混合液Ⅱ中加入葡萄糖10g，无水醋酸钠1g，吐温-801ml，琼脂15g，配制成扇贝溶液A，调节扇贝溶液A的pH值至6.8，而后于120℃条件下灭菌20分钟。取灭菌后25ml扇贝溶液A，倒入50ml培养皿中，冷却凝固后得固体分离培养基。
(4)活化培养液：0.5kg扇贝内脏与扇贝裙边混合物用匀浆机研磨成匀浆，匀浆中添加其质量8倍体积清水(w/v)，制成扇贝-水混合液Ⅲ。1L混合液Ⅲ中加入葡萄糖10g，配制成扇贝溶液B，调节扇贝溶液B的pH值至6.8，而后于120℃条件下灭菌20分钟。取灭菌后50ml扇贝溶液B，倒入100ml锥形瓶中，冷却后得活化培养液。
(5)含谷氨酸钠的培养液：0.5kg扇贝内脏与扇贝裙边混合物用匀浆机研磨成匀浆，匀浆中添加其质量8倍体积清水(w/v)，制成扇贝水混合液Ⅲ。1L混合液Ⅲ中加入葡萄糖10g，谷氨酸钠15g，配制成扇贝溶液C，调节扇贝溶液C的pH值至6.8。而后于120-125℃条件下灭菌20分钟。取灭菌后50ml扇贝溶液C，倒入100ml锥形瓶中，冷却后得含谷氨酸钠的培养液。
(6)培养物的分离：将0.2ml稀释液Ⅰ涂布于固体分离培养基上，30℃培养2天，获得不同培养物。
(7)活化培养：将上述所得不同培养物分别接种于50ml活化培养液中，33℃培养1天，得不同培养物的种子培养液。
(8)制备GABA：取不同培养物的种子培养液按1％(v/v)比例分别接种于50ml含谷氨酸钠的培养液中，37℃发酵培养4天，HPLC法(详见：GABA含量检测方法Q/LJS0006S-2013)测定不同培养物发酵液中GABA含量，得到GABA产量为3.07g/L不同培养物。
将上述所得发酵液扩大化培养，将上述获得出培养物接种于活化培养液中，37℃培养2天，按2％(v/v)的比例接种于含谷氨酸钠的培养液中，37℃发酵培养4天，得GABA含量3.07g/L的扇贝发酵培养液。
实施例3
(1)原料液源为：0.2kg新鲜扇贝柱用匀浆机研磨成匀浆，匀浆中添加其质量10倍体积清水(w/v)，制成扇贝-水混合液Ⅰ。混合液Ⅰ室温静置7天，自然发酵，得原料液源液。
(2)将原料液源液加去离子水，稀释10-6倍，得稀释液Ⅰ。
(3)固体分离培养基：0.2kg新鲜扇贝柱用匀浆机研磨成匀浆，在110℃烘箱中烘干水分，得扇贝干肉粉。扇贝干肉粉中添加其质量50倍体积清水(w/v)，得扇贝-水混合液Ⅱ。1L混合液Ⅱ中加入葡萄糖10g，无水醋酸钠1g，吐温-800.5ml，琼脂15g，配制成扇贝溶液A，调节扇贝溶液A的pH值至6.5，而后于120℃条件下灭菌15分钟。取灭菌后20ml扇贝溶液A，倒入50ml培养皿中，冷却凝固后得固体分离培养基。
(4)活化培养液：0.4kg新鲜扇贝柱用匀浆机研磨成匀浆，匀浆中添加其质量10倍体积清水(w/v)，制成扇贝-水混合液Ⅲ。1L混合液Ⅲ中加入葡萄糖10g，配制成扇贝溶液B，调节扇贝溶液B的pH值至6.5，而后于120℃条件下灭菌15分钟。取灭菌后50ml扇贝溶液B，倒入100ml锥形瓶中，冷却后得活化培养液。
(5)含谷氨酸钠的培养液：0.8kg新鲜扇贝柱用匀浆机研磨成匀浆，匀浆中添加其质量5倍体积清水(w/v)，制成扇贝水混合液Ⅲ。1L混合液Ⅲ中加入葡萄糖20g，谷氨酸钠20g，配制成扇贝溶液C，调节扇贝溶液C的pH值至6.5。而后于120℃条件下灭菌15分钟。取灭菌后50ml扇贝溶液B，倒入100ml锥形瓶中，冷却后得含谷氨酸钠的培养液。
(6)培养物的分离：将0.1ml稀释液Ⅰ涂布于固体分离培养基上，33℃培养2天，获得不同培养物。
(7)活化培养：将上述所得不同培养物分别接种于50ml活化培养液中，33℃培养1天，得不同培养物的种子培养液。
(8)产GABA菌株筛选：取不同菌株的种子培养液按1％(v/v)比例分别接种于50ml含谷氨酸钠的扇贝培养液中，37℃发酵培养5天，HPLC法(详见：GABA含量检测方法Q/LJS0006S-2013)测定不同菌株发酵液中GABA含量，得到GABA产量为4.17g/L菌株。
将上述所得发酵液扩大化培养，将上述获得出培养物接种于活化培养液中，37℃培养1天，按1％(v/v)的比例接种于含谷氨酸钠的培养液中，37℃发酵培养5天，得GABA含量4.17g/L的扇贝发酵培养液。

Claims (6)

1.一种以扇贝为原料制备γ-氨基丁酸的方法，其特征在于：
1)将原料磨成匀浆，匀浆中加入水，室温放置自然发酵获得原料液源液；
2)将原料磨成匀浆烘干后加入水，而后再添加营养物质冷却后得固体分离培养基；
3)将原料磨成匀浆后加入水，而后再添加葡萄糖得到培养液，调节培养液pH值6.5-7.0，灭菌后得活化培养液；
4)将原料磨成匀浆后加入水，而后再添加葡萄糖和谷氨酸钠得到含谷氨酸钠的培养液；
5)将所述原料液源液稀释至106-107倍，稀释后培养于所述固体分离培养基中30-35℃下培养36-48小时，培养后培养物于步骤3)得到的培养液中30-35℃下培养1-2天，所得培养液再按1-4％的比例接种于含谷氨酸钠的培养液中于35℃-40℃下发酵培养2-14天，即得到富含γ-氨基丁酸的培养物；
所述固体分离培养基为将原料扇贝用匀浆机研磨成匀浆，匀浆在100-110℃下烘干，得原料干粉，原料干粉中加水混合，每升混合液中加入葡萄糖10-15g，无水醋酸钠1-2g，吐温-800.5-1ml和琼脂15-20g，而后调节pH值至6.5-7.0，灭菌后待用；其中，原料干粉与水质量体积为1：40-60的比例混合。
2.按权利要求1所述的以扇贝为原料制备γ-氨基丁酸的方法，其特征在于：所述步骤5)所得发酵所得培养液再经活化培养液活化，活化后按1％-4％的比例接种于pH值6.0-7.0并灭菌后的含谷氨酸钠的培养液中，35℃-40℃，发酵培养2-14天，即得到富含γ-氨基丁酸的培养物。
3.按权利要求1所述的以扇贝为原料制备γ-氨基丁酸的方法，其特征在于：所述原料液源液为将原料扇贝用匀浆机研磨成匀浆，匀浆中加水混匀后室温静置4-7天，自然发酵，待用；其中，匀浆与水按质量体积为1：5-10的比例混合。
4.按权利要求1所述的以扇贝为原料制备γ-氨基丁酸的方法，其特征在于：步骤3)所述的培养液为将原料扇贝用匀浆机研磨成匀浆，匀浆中加水混匀，每升混合液中加入葡萄糖5-10g，即为培养液；培养液pH值调节至6.5-7.0，灭菌后即为活化培养液；其中匀浆与水按质量体积为1：5-10的比例混合。
5.按权利要求1所述的以扇贝为原料制备γ-氨基丁酸的方法，其特征在于：所述含谷氨酸钠的培养液为将原料扇贝用匀浆机研磨成匀浆，匀浆中加水混匀，每升混合液中加入葡萄糖5-10g和谷氨酸钠10-20g混合均匀后调节pH值至6.0-7.0，灭菌，待用；其中匀浆与水按质量体积为1：5-10的比例混合。
6.按权利要求1、3、4或5所述的以扇贝为原料制备γ-氨基丁酸的方法，其特征在于：所述原料为扇贝边、扇贝内脏、扇贝柱中的一种或几种的混合。
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