HU197937B - Process for producing new cloning carriers usable for the expression of polypeptides in microbiological host cells - Google Patents

Description

A találmány a rekombináns genetika területére vonatkozik, részletesebben olyan plazmid klónozó hordozók egy csoportjára, amelyekkel külső gének fejezhetők ki transzformáit baktérium sejtekben.

A találmány szerint előállított plazmid klónozó hordozók olyan rekombináns plazmidok, amelyek egy Gram-negatív baktérium egy külső membrán protein génjéből származó legalább egy funkcionális fragmenst meghatározó első dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciát tartalmaznak, leolvasási fázisban hozzákötve ^a) egy olyan második dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciát, amely egy indukálható promotert határoz meg, és

b) egy olyan harmadik dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciát, amely legalább egy polipeptid aminosav-szekvenciáját írja le, vagy egy olyan inszerciós helyet, amely leolvasási fázisban kapcsolódik egy transzlációs kodonhoz, és amely alkalmas a fenti harmadik dezoxi-ribonukleinsav-szekvencia befogadására;

a fenti plazmidok tartalmaznak továbbá egy olyan negyedik dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciát, amely a fenti indukálható promoter szignál helyéhez kapcsolódni képes represszor protein aminosav-szekvenciáját határozza meg, ezzel szelektíve gátolva az innen kiinduló transzkripciót.

A rekombináns plazmidok előállítására a találmány értelmében úgy járunk el, hogy leolvasási fázisban összekapcsolunk egy Gram-negatív festődésű baktérium külső membrán protein génjéből származó, legalább egy funkcionális fragmenst meghatározó dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciát (első DNS-szekvencia) — a lac promoter-operátor rendszert meghatározó valamely dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciával (második DNS-szekvencia), és — egy, az adott, legalább egy polipeptid aminosav-szekvenciáját meghatározó dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciával (harmadik DNS-szekvencia), vagy egy transzlációs iniciációs kodonnal leolvasási fázisban kapcsolt, az adott harmadik dezoxi-ribonukleinsav-szekvencia befogadására alkalmas beépítési helylyel, és — a lacl gént kódoló dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciával (negyedik DNS-szekvenc^:a).

A találmány tárgya továbbá eljárás polipeptid előállítására transzformált baktérium sejtben, oly módon, hogy

a) a baktérium sejtet egy olyan rekombináns plazmiddal transzformáljuk, amely tartalmaz egy első olyan dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciát, amely egy Gram-negatív baktérium külső membrán protein génjéből származó legalább egy funkcionális fragmenst meghatározó dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciát tartalmaz leolvasási fázisban kapcsolódva egy olyan második dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciával, amely egy indukálható promoter szignált határoz meg, és egy olyan harmadik dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciával, amely a fenti polipéptid aminosav-szekvenciáját írja le; a fenti plazmid továbbá tartalmaz egy olyan negyedik dezoxi-ribonukleinsav-szek' venciát, amely egy olyan represszor protein aminosav-szekvenciáját határozza meg, amely az adott indukálható promoter szignálhoz kötődve szelektíven gátolja az innen kiinduló transzkripciót;

b) izoláljuk és tenyésztjük a kapott baktériumsejtet, nagymennyiségű tenyészet előállítására;

c) a tenyészethez a represszor proteinhez kötődni képes inducert adagolunk, amikor az adott represszor protein lehasad az indukálható promoter szignál-helyről, és végül

d) az adott polipeptidet előállítjuk a tenyészetből.

A találmány vonatkozik továbbá a rekombináns plazmidot tartalmazó transzformánsokra.

Ahogy az a szakemberek körében jól ismert, a genetikai információ kétszálú dezoxi-ribonukleinsav (DNS) molekulában (génekben) van meghatározva, oly módon, hogy a dezoxi-ribonukleinsav kódoló szálja tartalmazza az ismétlődő nukleotid bázisokat. A dezoxi-ribonukleinsav nukleotidok két szálát jellemző négy nitrogéntartalmú bázis hidrogénhíd-kötésekkel komplementer párokká kapcsolódik, és így létrejön a kettős csigavonal. A négy bázis az adenin, ez a timinhez kapcsolódik, illetve a citozinhoz kapcsolódó guanin. A kódolt információ kifejeződése két részből álló folyamat során jön létre. A génben lévő bizonyos szabályozó szakaszok által meghatározott törvények szerint egy enzim, az RNS-polimeráz végighalad a dezoxi-ribonukleinsav kódoló szálján, és az úgynevezett transzkripciós folyamat során hírvivő (messenger) ribonukleinsavat (mRNS) szintetizál. A dezoxi-ribonukleinsav kódoló szál úgynevezett szignálokat tartalmaz, ezek képesek felismerni a ribonukleinsav-polimerázt, így elkezdődik, illetve befejeződik a transzkripció. Az ezt követő transzlációs lépés során a sejtek riboszómái a transzfer-ribonukleinsavval együtt a ribonukleinsavban lévő üzenetet proteinné vagy polipeptidekké fordítják, ezek meghatározzák a sejt alakját és funkcióját. A dezoxi-ribonukleinsavból származó és az mRNS molekulára átírt információ tartalmazza azokat a jeleket is, amelyek a riboszómális transzláció kezdetét és végét meghatározzák, tartalmaz további olyan jeleket, amelyek szigorúan meghatározzák a polipeptidet felépítő aminosavak minőségét és sorrendjét.

A kódoló dezoxi-ribonukleinsav szál nukleotid tripletek hosszú szekvenciáját tartalmazza, ezeket kodonoknak nevezzük, és amely jellemző nukleotid bázisok mindegyik triplettje vagy

-2197937 kodonja specifikus információt hordoz. így például az adenin-timin-guanin triplet olyan mRNS szignált eredményez, amely meghatározza a transzláció kezdetét, ugyanakkor a transzláció végét a terminációs kodonok, a TAG, TAA és TGA határozza meg. Az Iniciációs és a terminációs kodon között az úgynevezett strukturgén helyezkedik el, vagyis azok a kodonok, amelyek a transzlatált aminosav-szekvenciát írják le. A definíciók a jól megalapozott genetikai kódból származtathatók (például Watson, Molecular Biology of the Gene, 3. kiadás; New York, Benjámin, Inc., 1976), a genetikai kód a különböző aminosavakat leíró kodonokat határozza meg. Mivel 64 lehetséges kodon szekvencia létezik, de csak 20 ismert aminosav van, a genetikai kód degenerált abból a szempontból, hogy különböző kodonok hasonló aminosavakat határoznak meg. Ugyanakkor a kód fontos abból a szempontból, hogy mindegyik aminosavra legalább egy kodon létezik, és abban, hogy mindegyik kodon csak egy aminosavat ír le, és nem többet. így például a TTT, TTC, TTA és TTG kodonok szerint határoznak meg, és nem más aminosavat. Nyilvánvaló, hogy a transzláció során a megfelelő leolvasási fázist és irányt be kell tartani ahhoz, hogy a termelődő polipeptid megfelelő aminosav-szekvenciájú legyen.

A szabályozó génszakaszon belül eső azt a dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciát, amely a transzkripció kezdetét határozza meg, a gén promoterének nevezzük, ugyanakkor a dezoxi-ribonukleinsavon a strukturgént követően elhelyezkedő specifikus szignált, amely a transzkripció végét írja le transzkripciós terminációs helynek nevezzük. Bár a transzkripció iniciálása és terminálódása nem teljesen ismert mechanizmus szerint folyik, valószínű, hogy a promoteren van az a hely, ahol a ribonukleinsav-polimeráznak kötődnie kell ahhoz, hogy a transzkripció elkezdődjön, és valószínű az is, hogy egy adott promoter vagy terminációs szignál hatékonysága vagy „ereje*¹ attól függ, hogy milyen hatékonysággal képes a ribonukleinsav-polimeráz felismerni és kapcsolódni ezekhez a jelekhez. Ez ugyanakkor nagyrészben attól függ, hogy milyen a dezoxi-ribonukleinsav bázis-szekvenciája ezen a helyen, vagy ehhez a helyhez közel [lásd Rosenberg és munkatársai, Ann. Rév. Génét., 13, 319— 353 (1979)].

Egyes gének szabályozó szakaszai tartalmazhatnak olyan-dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciákat, amelyeket bizonyos effektor molekulák felismernek, ezek hatására pozitívan vagy negatívan változik a ribonukleinsav-polimeráz és a dezoxi-ribonukleinsav kölcsönhatása, és ezzel tovább szabályozódik a génkifejeződés a transzkripciós szinten. Az ilyen génekben kódolt genetikai információ kifejeződése gátlódhat például egy adott anyag hiánya esetén, ezért ezt indukálható génnek nevezzük. Másrészről, léteznek olyan gének (például a Gram-negatív Escherichia coli baktérium lipoprotein génje), amelyek szabályozó szakaszait effektor molekulák nem befolyásolják. Az ilyen gének genetikai információjának kifejeződése a sejt élete során folyamatos, és ezért konstitutív géneknek nevezzük ezeket. Az ilyen gének szabályozó szakaszai általában egy promoter és egy terminátor szignálból állnak, ezek megelőzik, illetve követik a leírásra kerülő dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciát.

Az mRNS szintézist elindító szabályozó szakaszok, a transzkripciós iniciációs hely a promoteren vagy annak közelében helyezkedik el, és a transzkripciós terminációs helyig tart, ezáltal egy meghatározott hosszúságú és bázis-szekvenciájú olyan mRNS molekula jön létre, amely komplementer a leírt dezoxiribonukleinsav bázis-szekvenciájával. A két pont között elhelyezkedő dezoxi-ribonukleinsav-szekvencia nemcsak á strukturgént határozza meg, azaz a transzlatált polipeptid kodonjaif, de meghatároz a strukturgén egyik oldalán egy úgynevezett nem transzlatált szakaszt is.

A transzkripció során így olyan mRNS molekula jön létre, amely egy transzlatálható RNS-szekvenciát tartalmaz két transzlációra nem kerülő szakasz között. A struktúr-szekvenciát megelőző, nem transzlatált szakaszt 5’-nem transzlatált szakaszként ismerjük, míg a struktúrjeleket követő szakaszt 3’-nem transzlatált régióként említjük, Ahogy azt az alábbiakban ismertetjük, a találmány szerinti új klónozó hordozók előállításakor a fenti nem transzlatált szakaszokat leíró dezoxi-ribonukleinsav kódoló szekvenciákat, továbbá bizonyos gének promoter szignálját és terminációs szignálját leíró dezoxi-ribonuk'einsav kódoló szekvenciákat, azaz együttesen elnevezve a funkcionális génfragmenseket hatékonyan felhasználjuk.

A leírás során klónozó hordozó alatt egy olyan nem kromoszómális, kétszplú plazmid dezoxi-ribonukleinsav molekulát értünk, amely egysejtű mikroorganizmusba juttatva (transzformálva) replikálódni képes. Az így transzformált mikroorganizmust transzformánsnak nevezzük. A jelen leírás során plazmid alatt értünk egy kör alakú, nem kromoszómális, kétszálú, olyan dezoxi-ribonukleinsav molekulát, amely vírusból vagy baktériumból ered, ez utóbbit bakteriális plazmidnak nevezzük.

A biokémia jelen években tapasztalható fejlődése a rekombináns klónozó hordozók előállításához vezetett, a hordozókban, például a plazmidokban idegen, külső dezoxi-ribonukleinsav van. Az egyes esetekben a rekombináns plazmid az adott, transzformációra érzékeny mikroorganizmusban közönséges körülmények között nem termelődő polipeptidet leíró dezoxi-ribonukleinsavat tartalmazhat, a külső eredetű dezoxi-ribonukleinsav egyes esetekben humán genetikai anyagot tartalmazhat. A pdazmidokat hasítják, 3

-3197937 amikor ligálható végekkel rendelkező lineáris dezoxi-ribonukleinsavat kapnak. Ezeket a molekulákat ligálható végekkel rendelkező külső (idegen) génhez kapcsolják, amiután egy adott fenotípust meghatározó, biológiailag funkcionális molekulához jutnak. A rekombináns molekulát transzformációval egy mikroorganizmusba juttatják, és a transzformánsokat izolálást követően klónozzák, majd a nagyszámú sejtből álló populáció kifejezi az új genetikai információt. Az irodalomban széleskörűen ismertetik a rekombináns klónozó hordozók és transzformánsok előállításának módszereit és eszközeit, általános ismertetőként lásd például Cohen, Scientific American, 233, 24—33, 1975. július és Gilbert és munkatársai, Scientific American, 242, 74— 94, 1980. április.

Dezoxi-ribonukleinsav rekombinációhoz több technika áll rendelkezésünkre, ezek szerint különböző dezoxi-ribonukleinsav-fragmensek végeit összekötjük, ligáljuk. A ligálás a foszfodiészter-kötések kialakulását jelenti a szomszédos nukleotidok között, a reakciót például a T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligáz katalizálja. A blunt (tompa) végekkel rendelkező dezoxi-ribonukleinsav-fragmensek közvetlenül ligálhatók. A komplementer egyszálú összekötendő végekkel rendelkező fragmensek hidrogén-kötéssel kapcsolhatók össze és ezután ligálhatók. Ilyen egyszálú végek, általában kohézív végeknek nevezzük ezeket, kialakíthatók oly módon, hogy terminális transzferázzal nukleiotidokat kapcsolunk a tompa végekhez, esetleg lamba-exonukleázzal egy szálat leemésztünk, amiután tompa véghez jutunk. Legáltalánosabban azonban az egyszálú végeket restrikciós endonukleázokkal, úgynevezett restrikciós enzimekkel alakítjuk ki, ezek egy adott, 4—6 bázispárból álló nukleotid-szekvencia mentén hasítják a foszíodiészter kémiai kötéseket. Több restrikciós endonukleázt ismerünk az általunk felismert szekvenciával együtt, az úgynevezett EcoRI endonukleáz egyike a legszélesebb körűen használt enzimeknek.

Az adott szekvenciák mentén a kétszálú dezoxi-ribonukleinsavat hasító restrikciós endonukleázok (például a forgási szimmetriával rendelkező palindrom szekvenciák) kohézív végű molekulát eredményeznek. Így egy plazmidot vagy más klónozó hordozót hasíthatunk, amiután a restrikciós endonukleáz által felismerhető hely felét képviselő végeket kapunk. Egy hasonló restrikciós endonukleázzal hasított idegen dezoxi-ribonukleinsav a plazmid végekkel komplementer végekkel rendelkezik. A hasított hordozóba beépíthetünk kohézív végekkel rendelkező szintetikus dezoxi-ribonukleinsavat is. Annak meggátlására, hogy a hordozó kohézív végei önmagukkal újra kapcsolódjanak, amikor a külső dezoxi-ribonukleinsav beépítése gátolttá válhat, a végeket alkalikus foszfatázzal kezelhetjük, amikor tulajdonképpen molekulá4 ris szelekciót végzünk a külső fragmens beépítésének érdekében. Elősegíthetjük egy fragmens beépítését a hordozó más helyeihez viszonyítva megfelelő orientációban oly módon, ha a hordozó dezoxi-ribonukleinsavat két különböző restrikciós endonukleázzal hasítjuk, és a fragmens maga a két adott, különböző endonukleáz által felismerhető szekvencia felét-felét hordozza a végein.

A rekombináns dezoxi-ribonukleinsav kutatás utóbbi években bekövetkező fejlődése révén több sikeres és könnyen alkalmazható módszer vált ismertté funkcionális polipeptid kifejezésre, például az inzulin, szomatosztatin és a humán,és állati növekedési hormon, A jelen leírás ezen módszerek továbbfejlesztésére vonatkozik.

Több olyan rekombináns baktérium plazmid klónozó hordozót ismertetünk, amelyek alkalmasak transzformált baktérium sejtben külső gének kifejezésére, és amelyek az adott polipeptidet kódoló beépített dezoxi-ribonukleinsav-fragmenst tartalmazzák leolvasási fázisban, egy vagy több, olyan funkcionális fragmenssel, amelyek valamely Gram-negatív baktérium külső membrán protein génjéből származnak. A találmány szerinti eljárás egy előnyös kivitelezési változata szerint a külső dezoxi-ribonukleinsav emlős hormonokat, enzimeket vagy immunogén proteineket (vagy ezek intermedierjeit) határoz meg, a funkcionális fragmensek pedig az E. coli lipoprotein génjéből származnak: az adott polipeptidet E. coli transzformánsokban fejezzük ki. A találmány szerinti eljárás egy előnyösebb kivitelezési változata szerint az adott proteint meghatározó dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciát négy specifikus, olyan funkcionális fragmenssel kapcsolva fejezzük ki, amelyek az E. coli lipoprotein génjével vannak kapcsolatban, nevezetesen a promoterrel, az 5’-nem transzlatált szakasszal, a 3’-nem transzlatált szakasszal, és a gén transzkripciós terminációs helyével.

Ezek a kifejeződő plazmidok egy második promotert is tartalmazhatnak, előnyösen indukálható promotert és legelőnyösebben az

E. coli β-galaktozidáz vagy lac promoterét; ezt a lipoprotein promoter közvetlen közeiében a DNS-en lefelé haladva építjük be úgy, hogy az exogén (idegen) dezoxi-ribonukleinsav csak abban az esetben fejeződik ki, ha laktóz inducer van jelen. Indukáláskor az adott polipeptidet meghatározó dezoxi-ribonukleinsav mindkét promoterről átíródik, így fokozódik az adott termék hozama. Ily módon mind konstitutív, mind pedig indukálható gének kifejezése elérhető.

Indukálható klónozó hordozok esetén különleges E. coli törzseket használunk transzformánsként, különösen azok előnyösek, amelyek a laktóz represszor molekulát túltermelik. A vad típusú E. coli sejtben csak 10 laktóz represszor molekula létezik bármely időpontban, ez éppen elég ahhoz, hogy a sejtben közönséges körülmények között jelen-4197937 lévő egy lacZ gén represszálva legyen. Ugyanakkor ez nem elegendő egy indukálható kifejeződő plazmidba klónozott külső dezoxi-ribonukleinsav kifejeződésének gátlására, mivel 10—20 klónozó hordozó létezhet egy adott időpontban mindegyik sejtben, és mindegyik tartalmaz egy aktív lac promotert. Ezért nagyobb mennyiségű laktóz represszor szükséges, és így transzformációhoz előnyösen egy speciális E. coli törzset használunk, a JA221/F’ lacl*lac⁺ pro⁺ mutánst, ez hordozza a mutáns lacl* gént. A lacl’ gén az lacl mutánsa, ez utóbbi a laktóz represszort meghatározó normális gén. A mutáns gén túltermeli a laktóz represszort, egy adott időpontban 100—150 molekula/sejt koncentrációt biztosít. A lacl’ gén az F’ plazmidon helyezkedik el ebben az E. coli törzsben.

Az a tény, hogy a jelen módszer szerint a transzformánsokban az adott polipeptid kifejezéséhez olyan sejtekre van szükségünk, amelyek az F’ plazmidot hordozzák, bizonyos hátrányokkal jár. Mindenekelőtt az indukálható kifejeződő plazmid recipiense (befogadó sejtje) olyan E. coli törzs kell, hogy legyen, amely hordozza a lacl’ gént, mivel ennek a génnek a hiányában a sejt nem termel elegendő mennyiségű laktóz represszort, és így folyamatosan kifejeződik az adott termék.

Másodszor, az F’ plazmid egy szex faktor; ez konjugációra készteti az E. coli sejteket, aminek következtében az F’ plazmid egyik sejtből átjut a másikba. Ezt a faktort hordozó E. coli törzseket eukarióta gén klónozására felhasználnunk nehézkes, ezért a módszer felhasználhatósága tovább csökken.

Végül, mivel általában sejtenként 2 vagy 3 F’ plazmid-másolat létezik (mindegyikük 100—150 laktóz repressor molekulát határoz meg), és mivel mindegyik sejt az indukálható kifejeződő plazmidból is tartalmaz 1020 másolatot (mindegyik hordoz egy funkcionális lac promotert), a represszor molekulák aránya a lac promoterekéhez sejtről sejtre széles határok között változik, és — egyes esetekben — ném következik be az adott kifejeződő termék teljes repressziója.

A találmány szerinti eljárás célja olyan új plazmid klónozó hordozó előállítása, amelyek nem rendelkeznek a fenti hátrányokkal.

A találmány szerinti eljárás értelmében úgy járunk el, hogy' előállítunk olyan külső gének transzformált baktérium gazdasejtben való kifejezésére alkalmas rekombináns bakteriális plazmid klónozó hordozókat, mindegyik plazmid egy adott polipeptidet meghatározó dezoxi-ribonukleinsav-fragmenst tartalmaz, egy vagy több olyan funkcionális fragmenshez kapcsolva, melyek egy Gram-negatív féstődésű baktérium külső membrán protein génjéből származik, és kapcsolva leolvasási fázisban tartalmaz egy indukálható promoter fragmenst is. Mindegyik plazmid tartalmaz egy olyan dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciát is, amely meghatároz egy, az indukálható promoter fragmenshez kötődni képes proteint, és ezzel represszálja a transzkripciót. Egy előnyös kivitelezési változat szerint a funkcionális fragmensek az E. coli lipoprotein génjéből származnak, az indukálható promoter fragmens az E. coli lac promoterje, a represszort meghatározó dezoxi-ribonukleinsav-szekvencia egy intakt, funkcionális E. coli lacl gén, és az adott polipeptidet

E. coli transzformánsokban fejezzük ki.

Három csoportba osztható plazmidot állítunk elő, mindegyikük a három alternatív beépítési hely egyikét tartalmazza. Ily módon egy adott plazmid vagy egy adott plazmidcsoport szelektálásával meghatározható a gén kifejeződését kővetően az a tényleges hely, ahonnan a kifejeződő termék izolálható. A beépíthető helyek egyikét használva például az adott polipeptid egy olyan vezető szekvenciával együtt fejezhető ki, amely az amino-terminális véghez kapcsolódik, és amely tartalmazza az E. coli lipoprotein szignál peptidjét, ily módon az adott termék átléphet a citoplazma membránján, és a szignálpeptid a transzformáns számára természetes folyamattal in vívó lehasítását követően megkapjuk a külső gén által meghatározott terméket. Ha a másik két beépíthető hely egyikét vagy másikát használjuk fel, ügy a kifejeződő termék vagy a citoplazmában, vagy a sejtfalban halmozódik fel.

Mindegyik alcsoportba tartozó plazmid egy közönséges beépítési hellyel rendelkezik, azonban egymástól a leolvasási sémában különböznek. Így mindegyik alcsoport 3 plazmidot reperezentál, ezek leolvasási sémája egy bázispárban különbözik, ezzel lehetségessé válik mindegyik beépíthető hely szempontjából bármilyen kívánt leolvasási séma kiválasztása, és ezzel fokozódik a találmány szerinti eljárás felhasználhatósága nagyszámú dezoxi-ribonukleinsav beépített fragmens kifejezésére anélkül, hogy ezeknek a fragmenseknek a leolvasási fázisát közvetlenül módosítanunk kellene.

Egy adott polipeptidet leíró külső dezoxiribonukleinsav a találmány szerinti plazmidokban csak akkor fejeződik ki, ha laktóz inducer van jelen. Laktóz inducer hiányában a klónozott gén transzkripciója teljesen represszált, mivel a gazdasejtben jelenlévő kifejeződő plazmid mindegyik másolatában jelen van egy lacl gén. Így indukálható génkifejeződés valósítható meg a klónozó hordozók használatával, anélkül, hogy F’ plazmidot hordozó transzformánsokat használnánk. A találmány szerinti klónozó hordozók genetikai információjának kifejeződését az egyes plazmidokon belül szabályozzuk, így a gén kifejeződése autoregulált.

A továbbiakban röviden ismertetjük a mellékelt ábrákat.

A találmány szerinti géntermékek, például a humán inzulin bakteriális transzformánsok kifejezésére alkalmas rekombináns baktérium plazmidok szerkezetét és funkcióját az aláb5

-5197937 biakban magyarázzuk, a mellékelt ábrákkal együtt:

az 1. ábrán vázlatosan megadjuk az E. coli lipoprotein gén 814 bázispárból álló dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciáját, a transzkripciós és a terminációs jeleket háromszöggel jelezzük.

Bemutatjuk az ábrán a 78 aminosavból álló prolipoprotein szekvenciát is, ezt a dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciából vezettük le, és a dezoxi-ribonukleinsav megfelelő kodonjai alá írtuk.

A 2. ábrán bemutatjuk az E. coli lipoprotein mRNS teljes 322 nukleotidból álló szekvenciáját, jelöljük az mRNS-szekvenciából levezetett prolipoprotein aminsav-szekvenciáját is, ezt a nukleotid-szekvencia megfelelő kodonjai alá írtuk.

A 3. ábrán az E. coli lipoprotein mRNS másodlagos szerkezetét mutatjuk be, a transzlációs iniciációs kodont bekereteztük.

A 4. ábrán sematikusan mutatjuk be azt az eljárást, amellyel a találmány szerinti klónozó hordozók segítségével egy eukarióta protein vagy egy más polipeptid kifejezhető, a transzkripció kezdetét és végét meghatározó szakaszt nyilakkal jelöljük, a transzláció kezdetét és végét meghatározó helyeket üres nyilakkal adjuk meg.

Az 5—27. ábrákon sematikusan szemléltetjük a találmány szerinti rekombináns plazmid klónozó hordozó előállításának módszereit, az ábrákon megadjuk a különböző restrikciós endonukleázok hasítási helyeinek relatív helyzetét; az Amp^R és a Tc^r sorrendben az ampicillin és tetraciklin rezisztenciát jelöli.

A 28. és 29. ábrákon sematikusan szemléltetjük az 5—27. ábrákon megadott módon előállított plazmidok egyikének előnyös módosítási módszerét, amiután megkapjuk a találmány szerinti egyik plazmidot.

Az alábbiakban ismertetjük a találmány szerinti eljárás legelőnyösebb kivitelezési változatát.

Az eddig ismert kutatási eredmények öszszefoglalása:

A jelen kutatások azt jelzik, hogy a Gram-negatív baktériumok legnagyobb külső membrán proteinjei mindegyik baktériumsejtben nagy mennyiségben vannak jelen. Ügy találták, hogy az egyik legintenzívebben vizsgált membrán protein, az E. coli lipoprotein a sejtben jelenlévő proteinek közül az egyik legnagyobb mennyiségben jelenlévő molekula: körülbelül 700—750-ezer lipoprotein molekula van egyetlen sejtben. Továbbá úgy találták, hogy az E. coli lipoproteinjének csak egyetlen struktúrgénje létezik, így mind transzkripciós, mind pedig transzlációs szinten különösen hatékonyan működő rendszer kell, hogy létezzen. 6

Az a vélemény alakult ki, hogy a lipoprotein gén legalább tízszer hatékonyabban fejeződik ki, mint a riboszómális proteinek génjei.Ugyancsak jelentős mennyiségben vannak jelen más, nagyméretű külső membrán proteinek az E. coli-ban, mint például az ompA protein, és ugyancsak nagy mennyiségben léteznek a Serratia marcescens sejtekben a nagyméretű külső membrán proteinek, mint például a lipoprotein. Mindez azt jelenti, hogy ezen rendszerekben a génkifejeződés szintén igen hatékony. Bár jelen leírásban elsősorban az E. coli lipoprotein rendszeréről beszélünk, érthető módon a találmány olyan rekombináns klónozó hordozókra is vonatkozik, amely bármely Gram-negatív festődésű baktérium bármely külső membrán proteinjének génkifejeződésével van összefüggésben.

Bár ez igen hatékony E. coli lipoprotein génkifejeződés mechanizmusa nem teljesen ismert, az a vélemény alakult ki, hogy több tényező hozzájárul a baktériumsejtben lévő lipoprotein molekulák nagy számának szintézisében. Ahogy az az 1. ábrán látható, az E. coli lopoprotein gén dezoxi-ribonukleinsav nukleotid-szekvenciáját meghatározták, így nyilvánvalóvá vált, hogy több egyedülálló tulajdonság függ össze ezen gén kifejeződésével.

Elsősorban az látszik, hogy az E. coli gének más ismert promoter szekvenciájával összehasonlítva, a lipoprotein promoter régió különleges abból a szempontból, hogy igen magas az adein-timin tartalma; ez valószínűleg alapvető fontosságú a lipoprotein gén rendkívül hatékony transzkripciójához. A transzkripció kezdetét meghatározó helyet megelőző 261 bázispárból álló szegmens (a —261-től a —1 bázispárig terjedő rész; lásd az 1. ábrát) igen magas, 70% adenin-timin tartalmú, ugyanakkor, az átírt szakasz (vagy mRNS szakasz) 322 bázispárból álló része ( +1-től +322 bázispárig) 53%, a transzkripció leállását meghatározó szakasz (+323-tól +449 bázispárig) 126 bázispárból álló része 44%, és az E. coli kromoszóma átlagosan 49%-os adenin-timin tartalmú. A —45 — —1 helyzetű szegmens adenin-timin tartalma különösen magas, 80%; itt helyezkedik el a lipoprotein (lpp) promoter vége. Ez a %-os összetétel legmagasabb az eddig ismert E. coli promoterekkel öszszehasonlítva. A promoter-szekvencia adeninben és timinben való gazdagsága valószínűleg destabilizálja a dezoxi-ribonukleinsav hélix-szerkezetét, és ezzel a transzkripció kezdetéhez szükséges, a ribonukleinsav-polimeráz által szabályozott szálkicsavaro'dást elősegíti.

Az lpp promoter adenin-timin tartalmán túlmenően, a —15 — —9 terjedő szakaszon (ez csak 8 bázispárnyi távolságban van a transzkripció kezdetét meghatározó helytől) egy heptanukleotid szekvenciát tartalmaz; ez homológ az általános érvényű Pribnow-boxszal, tartalmaz továbbá a —38 — —27

-6197937 bázispárig egy dodekanukleotid-szekvenciát, ez pedig homológ az általános érvényű ribonukleinsav polimeráz felismerő hellyel. Ezen szekvenciák homológiája meglepő abban, hogy az lpp promoter Pirbnow-box-szekvenciája csak egyetlen bázispárban tér el az általános érvényű szekvenciától, míg a felismerő hely szekvenciája a 12 általános érvényű bázis-szekvenciától csak 5 helyen tér el. Ezen specifikus bázis-szekvenciák ezen a helyen, ahogy az jól ismert, rendkívül fontos szerepet játszanak a hatékony transzkripcióban, ugyanis megnővekedett promoter hatékonysággal rendelkező mutánsok ezeken a helyeken fokozottab homológiát mutatnak az általános érvényű szekvenciákkal.

Az 1. ábrán megadott dezoxi-ribonukleinsav-szekvencia további analízis során kiderül, hogy az igen „erős promoter jelenléte mellett a lipoprotein gén egy oligó-T transzkripciós terminációs szignállal is rendelkezik; ez a +316 és +322 bázispárok között helyezkedik el, és ez legalább olyan hatékony, mint más — vizsgált — E. coli transzkripciós terminációs helyek. Valószínű, hogy ez a tényező hozzájárul a transzkripció igen nagy hatékonyságához, oly módon, hogy meghatározza az mRNS termelést, és korlátozza a dezoxi-ribonukleinsavról átírt mRNS molekula nagyságát.

Ahogy az a 2. ábrán látható, az E. coli lipoprotein mRNS teljes nukleotid-szekvenciája ismert, kiderül, hogy az mRNS több olyan különleges tulajdonsággal rendelkezik, amely fontos az mRNS hatékony transzlációjához. Az mRNS 322 nukleotidból áll, 38 az 5’-nem transzlatált régión és 50 a 3’-nem transzlatált régión helyezkedik el; a többi 234 transzlatált nukleotid meghatározza a prolipoproteint, a lipoprotein prekurzorát. A 2. ábrán megadott mRNS-szekvencia komplementer az 1. ábrán ismertetett dezoxi-ribonukleinsavszekvenciával; egyetlenegy kivétellel: a 313. nukleotid a 2. ábrán citozin (ezt ribonukleinsav-szekvenálással határoztuk meg), míg az 1. ábrán a dezoxi-ribonukleinsav-szekvenálás szerint adenin. E különbség oka jelenleg még nem ismert.

A lipoprotein mRNS szokatlanul stabil, úgy gondolják, hogy ez a stabilitás valószínűleg a molekulán belül kialakuló extenzív másodlagos szerkezetnek tulajdonítható. Ahogy az a 3 ábrán látható, az mRNS 9 stabil, úgynevezett „hajcsat szerkezetet képes kialakítani (ezt az ábrán I—IX. számokkal jelöljük), ezek közül a legstabilabb (I) a 3’-nem transzlatált szakaszon helyezkedik el. Ez a másodlagos szerkezet felelős lehet a hosszú funkcionális felezési időért, amit más E. coli mRNS molekulákkal összehasonlítva a lipoprotein mRNS esetén tapasztalhatunk, így ez lehetővé teheti a riboszómális transzlációkor rendelkezésre álló molekulák számánák növekedését.

Bár az mRNS molekulában jelenlévő öszszes nukleotid 68%-a részt vesz a „hajcsat-szerkezet kialakításában (lásd a 3. ábrát), megjegyzendő, hogy az 5’-végtől számítva az első 64 nukleotid nem alakít ki ilyen szerkezetet; ugyanakkor a 65. nukleotid és a 3'-vég közötti nukleotidok 85%-a kialakítja ezt a szerkezetet. Ez fontos, mivel az 5’nem transzlatált szakaszon (+1-től +38. nukleotidig) két kiterjedt, ismétlődő nukleotid-szekvencia helyezkedik el, ezek valószínűleg meggátolják ezen szakaszon belül a szekunder szerkezet kialakulását, és lehetővé teszik a riboszóma kötőhely és a riboszómák kapcsolódását, ezzel elősegítvén a transzláció kezdetét. A transzláció elkezdése ezenkívül valószínűleg tovább erősödik azzal, hogy a molekula ezen szakaszában két lehetséges riboszóma kötőhely helyezkedik el.

Végül, az mRNS 3’-nem transzlatált szakaszán mindhárom transzlációs terminációs kodon jelen van (UAA a +273 — +275 helyen, UAG, +276--(-278. helyen és UGA a a +285 és +287. bázispár között; lásd a 2. ábrát), mindhárom· hasonló leolvasási fázisban van, mint a transzlatálható vagy kódoló szakasz, ezzel egy egyedülálló tandem terminátor alakul ki, ami valószínűleg hozzájárul a hatékony transzlációhoz azzal, hogy a transzláció megfelelő terminációja biztonságosan bekövetkezik.

Ezen fenti tények kumulatív hatása és a lipoprotein mRNS más egyedülálló tulajdonságai eredményezik valószínűleg az E. coli sejtekben ennek a genetikai információnak az igen hatásos transzlációját.

A fentiekben ismertetett hatásos kifejeződésen túlmenően, az E. coli lipoprotein más fontos tulajdonsága az, hogy az egy szekretálódó protein, azaz egy prekurzorból jön íétre, ez a prekurzor a citoplazma membránon áthaladva lipoproteinné alakul. így a lipoprotein mRNS transzlációjakor valójában egy prekurzor molekula jön létre, ezt prolipoproteinnek nevezzük, ennek egy peptid-része vagy szignál peptid-része 20 aminosavból áll, és amino-terminális végen helyezkedik el; ennek szekvenciáját meghatározták. Ezután követke_T zik a lipoprotein ismert 58 aminosava. Bár a szekretálódás mechanizmusai nem teljesen ismertek, a szignál peptid valószínűleg az in vivő transzlokációt szabályozza a citoplazma membránon át, abban a folyamatban, amikor a szignál peptid-rész lehasad, és érett lipoprotein jön létre.

Valószínű, hogy hasonló folyamatok játszódnak lé az összes Gram-negatív festődésű baktérium nagy külső membrán proteinjeinek keletkezésekor. így például a Serratia marcescens lipoprotein gén dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciájának és az E. coli lipoprotein gén dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciájának analízisekor és összehasonlításakor kiderült, hogy a promoter szakasz 84%-os, és az 5'-nem transzlatált szakasz 95%-os homológiával rendelkezik. Az S. marcescens lipoprotein 7

-7197937 génjén lévő promoter szakasz adenin-timin tartalma igen magas (78%), ahogy azt az E. coli lipoprotein gén esetében is tapasztaltuk (80%). Ezenkívül, bár az S. marcescens prolipoproteinjének szignál peptid-részét meghatározó dezoxi-ribonukleinsav-szekvencia részben különbözik az E. coli-étől, az aminosav-szekvenciában megfigyelhető változások nem változtatják meg a szignál peptid alapvető tulajdonságait, mint amiket az E. coli prolipoproteinjénél megadtunk, és amelyek más bakteriális szekretálódó proteineknél is léteznek. Az S. marcescens lipoprotein mRNS, ahogy a dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciából adódik, 7 stabil „hajcsat“-szerkezetet képes kialakítani. A lipoprotein különböző Gram-negatív festődésű baktériumnál képződik, és megfigyelték, hogy az E. coli lipoprotein mRNS hibridizálódik legalábbis az alábbi 7 baktériumfaj (az S. marcescens-en kívül) dezoxi-ribonukleinsavával: az Enterobacteriaceae családon belül: Shigella dysenteriae, Salmonella typhimurium, Citrobacter freundii, Klebsiella aerogenes, Enterobacter aerogenes, Edwardsiella tarda és Erwinia amylovora, ez bizonyítja a lipoprotein gén homológiáját E. coli és más Gram-negatív festődésű baktériumok között. A találmány oltalmi körének kiterjesztését az analóg és bármely Gram-negatív festődésű baktériumból származó igen hatékony génkifejeződési mechanizmust használó rekombináns plazmid klónozó hordozókra a fentiek és más eredmények alapján értelemszerüleg találjuk.

A Gram-negatív festődésű baktériumok külső membrán proteinjeinek jellegzetes bioszintézise a lipoprotein géneket és más, külső membrán protein géneket igen használható alannyá teszik abból a szempontból, hogy bakteriális transzformánsokban lévő külső eredetű dezoxi-ribonukleinsav beépített fragmensek kifejeződését szabályozzuk. A leírás során több ilyen klónozó hordozó szerkezetét és funkcióját adjuk meg.

Az alábbiakban ismertetjük a génkifejezés stratégiáját.

Az előzőekből kiderül, hogy az E. coli lipoprotein génjének hatásos transzkripciójáért és transzlációjáért felelős részek a gén funkcionális fragmensein helyezkednek el, nevezetesen a promoter, az 5’-nem transzlatált szakasz, a 3’-nem transzlatált szakasz és a transzkripciós terminációs hely, amelyek, ahogy azt a 4. ábra a. betűvel jelölt részén látjuk, az lpp struktúrgéntől vagy jobbra vagy balra haladva helyezkednek el. Egy eukarióta proteint vagy más, megfelelő pepiidet meghatározó struktúrgént az előző funkcionális fragmensek kombinációját tartalmazó kifejeződő plazmidba való beépítésével és ennek a plazmidnak egy baktériumsejtbe való transzformálásával elérhetjük, hogy a struktúráén transzkripciója és az ezt követő transzláció ezen funkcionális fragmensek szabályozása alatt menjen végbe.

A szakemberek számára érthető okokból, különösen előnyös az, ha az előzőekben említett funkcionális fragmenseket együttesen, tandem formában egyetlen kifejeződő plazmidon használjuk fel. Azzal, hogy az adott polipeptid struktúrgénjét ennek 5’-végén hozzákapcsoljuk az E. coli lpp gén promoterét és 5’-nem transzlatált szakaszát tartalmazó dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciához (ez a dezoxi-ribonukleinsav-szekvencia előnyösen tartalmazza a transzkripció kezdetét meghatározó jelet követő 260 bázispárból álló teljes A-T gazdag dezoxi-ribonukleinsav-szegmenst is) igen hatékony transzkripciót érünk el, mivel az egyik legerősebb baktérium promotert használjuk, ugyanakkor a transzláció is igen hatékony, mivel olyan dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciát használunk, amely meghatározza a transzláció kezdetét, és a leghatásosabb riboszóma kötőhelyet. Ezenkívül, ha a struktúrgént ennek 3’-végén hozzákapcsoljuk az E. coli lpp gén 3’-nem transzlatált szakaszát és a transzkripciós terminációs jelet hordozó dezoxi-ribonukieinsav-szekvenciához, a transzkripció hatékonysága valószínűleg tovább fokozódik, mivel kiküszöbölődik a transzkripciós átolvasás (az mRNS szükségtelenül hosszú 3’-nem transzlatált szakaszának szintézise), és ami még fontosabb, fokozódik az mRNS termelés mértéke. Az mRNS molekula stabilitása szintén biztosítva van azzal, hogy létrejön a 3’-nem transzlatált szakasz másodlagos szerkezete.

Ahogy azt az alábbiakban részletesen megadjuk, a lipoprotein szekretálódó termeszeiét felhasználhatjuk egy eukarióta protein vagy más, adott polipeptid kifejeződésének más szempontok szerinti szabályozására, nevezetesen arra, hogy a kifejeződő termék hol legyen megtalálható. A külső eredetű dezoxi-ribonukleinsav lpp génbe való beépítésének helyétől függően a kifejeződő termék vagy a transzformáns sejt citoplazmáján belül a periplazmatikus térben, vagy a sejt külső membránjában helyezkedik et.

A 4. ábrán vázlatosan szemléltettünk egy olyan folyamatot, amelynek során egy transzformáns mikroorganizmus kifejez az előzőekben megadott séma szerint egy természetes eukarióta proteint. A 4. ábrán szemléltetett egyedi eset során az eukarióta protein struktúrgénjét az lpp gén szignál peptidjét meghatározó szakaszába építettük be, több bázissal a transzlációs iniciációs kodon után, és jobbra haladva bizonyos funkcionális fragmensektől (nevezetesen, a promotertől és az 5’-nem transzlatált szakasztól), ezek közönséges körülmények között a lipoprotein génhez kapcsolódnak. A 4. ábra a. és b. betűkkel jelölt részének összehasonlításakor kiderül, hogy ezen funkcionális fragmensek orientációja azonos ezen elemek lipoprotein génben való természetes orientációjával, ugyanakkor a külső eredetű dezoxi-ribonukleinsav beépített fragmens helyettesíti a szig-8197937 nál pepiid legnagyobb részét és a lipoprotein gén struktúr-szakaszának egy részét is.

A 4. ábrán látszik az is (b. rész), hogy a külső eredetű gén 3’-végén kapcsolódik egy extra transzlációs terminációs kodonhoz, ez ugyanakkor a lipoprotein strukturgén megmaradó részéhez kapcsolódik. Ez jobbra haladva szabályosan kapcsolódik az lpp gén 3’-nem transzlatált szakaszához és egy transzkripciót befejező hellyel végződik. Az ábra a. és b. részének összehasonlításakor kiderül az is, hogy a beépített dezoxi-ribonukleinsavat követő funkcionális fragmensek lényegében azonosak azokkal, amelyek közönséges körülmények között a lipoprotein génben szerepelnek.

Az lpp génből származó 3’-nem transzlatált régió egy olyan mRNS-szekvenciát kódol, amely képes a 3. ábrán megadott és ott I. számmal jelzett hurokszerkezet kialakítására, és ez — ahogy azt az előbbiekben ismertettük — a lipoprotein mRNS molekulában a legstabilabb másodlagos szerkezet. A 4. ábra b. szakaszán megadott rekombináns dezoxi-ribonukleinsav-szekvencia a lipoprotein struktúrgén egy terminális részét is tartalmazza; ez 105 bázispárból áll, a + 168 számmal jelzett bázistól kezdődően (ezt a helyet a 3. ábrán satírozott nyíllal jelöltük). Ezt a szakaszt úgy választjuk meg, hogy az átírt mRNS stabilitása tovább növekedjen a négy további hurokszerkezet kialakulásával (ezt a 3. ábrán ff., ííf., ÍV. és

V. számokkal jelöltük), anélkül, hogy á termelt mRNS molekula nagysága túlzottan megnőne. Ahogy azt az alábbiakban tárgyaljuk, ez a szakasz gyengén transzlatálódik.

A 4. ábra b. részén megadott rekombináns dezoxi-ribonukleinsav-szekvencia transzkripcióját követően egy olyan mRNS-szekvencia jön létre, amit a 4. ábra c. részén ábrázolunk. Látható, hogy a szekvencia tartalmazza az 5’-nem transzlatált szakaszt és a 3’-nem transzlatált régiót; mindkettő közönséges körülmények között kapcsolódik a lipoprotein termeléséhez. Az mRNS ugyanakkor az eukarióta proteint meghatározó szakaszt is tartalmazza, előtte a lipoprotein szignál peptidjének egy rövid szegmensét leíró szakasz látható, és utána pedig egy további szakasz, amely a lipoprotein egy szegmensét határozza meg. Ez utóbbi szakasz valójában nem transzlatálódik, mivel az eukarióta struktúrgén 3’-végénél egy terminációs kodon épült be (ezt a 4. ábra b. és c. helyein nyíllal jelöljük). Transzlációt követően olyan polipeptid keletkezik, amely több többlet aminosavat tartalmaz, majd — ezek után — az adott eukarióta protein aminosav-szekvenciája következik (lásd a 4. ábra d. részén). Ez a konjugált kifejeződő termék a sejt citoplazmáján belül halmozódik fel, mivel a szekretálódás nem következhet be a teljes szignál peptid hiányában. Bizonyos proteinek esetén a kifejeződő termék ismert módon izolálható a ci16 toplazmából, és a felesleges protein fragmens ezután a természetes protein termékről ismert módon lehasítható és eltávolítható (lásd a 4. ábra e. részét), amiután felhasználásig tárolható adott polipeptidet kapunk.

Eljárhatunk úgy is, hogy a felesleges aminosavakat kódoló dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciát a baktériumsejt transzformációja előtt ismert módon kihasítjuk a kifejeződő plazrnidból, ekkor a kifejeződő termék pontosan megfelel a számunkra kívánatos külső eredetű proteinnek, amit azután ismert módon tisztíthatunk.

A találmány szerinti következő előnyös kivitelezési változat szerint a fentiekkel azonos funkcionális fragmenseket használunk, azonban az adott polipeptidet meghatározó dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciát jobb felé haladva építjük be, a szignál peptid utolsó kodonja után (azaz a szignál peptid hasítási helyére, vagy ahhoz közel). A szakemberek számára érthetően, ebben az esetben is azonos a funkcionális fragmensek orientációja ezen elemek lipoprotein génben meghatározott természetes orientációval, azaz az ezekkel együttjáró transzkripciós és transzlációs hatékonyság fennmarad, ugyancsak megmarad az előzőekben ismertetett, és az mRNS másolat stabilitását biztosító négy további hurokszerkezet.

Egnnek a rekombináns dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciának a transzkripciója és az ezt követő tianszláció a fentiekkel és a 4. ábrán megadottakkal azonos módon történik, azzal a különbséggel, hogy a transzlációt követően a prolipoprotein szignál peptidjének megfelelő szignál pepiidet tartalmazó polipeptid jön létre, ezután pedig az adott eukarióta protein aminosav-szekvenciája következik. Ez a prekurzor termék átléphet a citoplazma membránon, ezt a szignál peptid szabályozza, a folyamat során a peptid hosszúsága nő, és ezután az E. coli transzformáns sejtek számára természetes enzimes reakcióval ez a rész lehasad, amiután a természetes eukarióta proteint tartalmazó termék keletkezik, talán néhány, az amino-terminális. véghez kapcsolódó extra aminosavval együtt, amelyeket a fentiekben megadottak szerint eljárva lehasíthatunk. Ez a termék túlnyomórészben a periplazmatikus térben halmozódik fel, és átléphet a külső membránon át a táptalajba, akkor, ha bizonyos, a továbbiakban részletesen ismertetett E. coli transzformáns törzseket használunk.

Ha a fentiek szerint járünk el, a sejten belül felhalmozódó nagymennyiségű kifejeződő termék valószínűleg kevéssé hat a sejt növekedésére, mivel az eukarióta fehérje egy, a sejt számára természetes szignál peptiddel van kapcsolva. Ugyanakkor a szignál peptid jelenléte védheti a külső eredetű fehérjét a sejten belüli degradációs hatásoktól, amelyek egyébként a fehérje hozamát csökkenthetik, és okozhatják a külső protein 9

-9197937 szennyeződését is az egye heterogén degia dációs termékekkel, ami viszont tisztítási nehézségeket okoz.

Az előzőekben ismertetett séma egy másik kivitelezési változata szerint eljárva, ismét a fentiekben ismertetett funkcionális fragmenseket használjuk, de az adott polipeptidet meghatározó dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciát méginkább jobbra haladva építjük be, például a szignál peptid hasítási helye után elhelyezkedő 8. aminosavat meghatározó kodont követően. A szakember számára érthető, hogy ebben az esetben is azonos a funkcionális fragmensek orientációja ezen elemek lipoprotein génben való természetes orientációjával, aminek következtében az ezzel őszszefüggő transzkripciós és transzlációs hatékonyságot ismét előnyösen felhasználhatjuk, fennáll továbbá a négy további hurokszerkezet révén kialakuló növekedett mRNS stabilitás is.

Ezen rekombináns dezoxi-ribonukleinsav-szekvencia transzkripcióját is transzlációját követően (lásd a 4. ábrát) a fentiekkel azonos folyamat játszódik le, kivéve, hogy transzlációt követően olyan polipeptid keletkezik, amely 20 aminosavból álló szignál pepiidet tartalmaz, ez megfelel a prolipoprotein szignál peptidjének, majd ezután az érett lipoprotein első 8 aminosavának megfelelő 8 aminosavból álló szekvencia következik, és ezután az adott eukarióta protein aminosav-szekvenciája. Ahogy az az előző kivitelezési változat szerint bekövetkezik, ez a prekurzor termék természetes módon áthalad a citoplazma membránon, ennek a folyamatnak a során a szignál peptid felismerődik és lehasad. A termék azonban nem halmozódik fel a periplazmatikus térben, ugyanis a lipoproteinnek megfelelő 8 aminosavat a sejt felismeri, és a kifejeződő termék további folyamatok során a sejt külső membránjába kerüli hasonlóan a lipoprotein külső membránba való természetes elhelyezkedéséhez. Ha, mint ahogy az várható, a kifejeződő terméknek csak a lipoproteinnek megfelelő 8 aminosava kötődik a külső membránhoz, a kifejeződő termék többi része, amely az eukarióta proteinből vagy más, kiválasztott polipeptidből áll, lehasad a külső membránról.

A szakember számára ezek után érthető, hogy a fentiekben megadott három beépítési hely egyikét vagy másikát felhasználva felépített plazmid klónozó vektorral, és ennek a plazmidnak a külső géntermékének a kifejezésével a termék elhelyezkedése nagy valószínűséggel előre meghatározható, és könynyen javasolhatjuk a termék izolálására és tisztítására alkalmas módszereket. A beépítési hely kiválasztását gyakran az adott polipeptid identitása és szerkezete határozza meg, különösen abban az esetben, ha a legmegfelelőbb tisztítási módszer az adott termék kapcsán ismert.

Több külső eredetű dezoxi-ribonukleinsav-fragmens a találmány szerinti klónozó hordozókkal való kifejeződésének további elősegítésére egy sor polinukleotid-szekvencia építhető be mindegyik kifejeződő plazmiddal, olyan szekvenciák, amelyek tartalmazzák az EcoRI, HindlII és BamHI restrikciós enzimek felismerő helyeit. Ez további lehetőségeket biztosít, ugyanis hat különböző restrikciós fragmens típus építhető be ily módon mindegyik plazmidba, ismert és az előzőekben megadott módon. A fentiek szerint eljárva, bármely olyan dezoxi-ribonukleinsav-fragmenst felhasználhatunk, amely az alábbi kohézív végpárokkal rendelkezik: EcoRI-EcoRI, HindlII-Hindin, BamHI-BamHI, EcoRI -HindlII, EcoRI-BamHI és HindlII-BamHI.

Ahogy az előbbiekben megjegyeztük, a genetikai információ kifejeződése indukálható akkor, ha a transzkripció nem kezdődhet el bizonyos molekulák hiányában. Az indukálható génkifejeződés legjobb példája az E. coli lac promoter-operátor rendszere, ez a β-galaktozidáz enzim termelését határozza meg, az enzim a laktóz emésztésében játszik szerepet. Közönséges körülmények között a gén kifejeződése úgynevezett kikapcsolt állapotban van; ezt a laktóz represszor biztosítja. A represszor a lac promoter-operátorhoz kapcsolódik, ezzel lehetetlenné válik a ribonukleinsav-polimeráz és a promoter-szekvencia kapcsolódása, azaz a transzkripció gátolt (és az ezt követő transzláció sem következik be) a β-galaktozidáz struktiírgénen. Laktóz jelenlétében a represszor molekula lehasad a dezoxi-ribonukleinsavról, a gén bekapcsolódik, és lehetségessé válik a transzkripció, amely addig folytatódik, míg megfelelő mennyiségű β-galaktozidáz enzim termelődik a jelenlévő laktóz emésztésére. Ezután a represszor ismét kikapcsolja a gént.

A fentiekben ismertetett konstitutív lpp gén klónozó hordozók indukálhatóvá tehetők oly módon, hogy az lpp promotertől jobbra haladva, de a külső dezoxi-ribonukleinsav beépített fragmenstől balra, beépítjük az lac promotert. Ezen körülmények között bármelyik promoter által szabályozott külső dezoxi-ribonukleinsav transzkripció a represzszor molekula által gátolva van, és egy adott anyag, a laktóz inducer hiányában nem következhet be. A jelen célokra ez az inducer egy olyan molekula lehet, amely reagál a laktóz represszor molekulával, és ezzel megváltoztatja úgy, hogy a represszor a továbbiakban nem tud kapcsolódni a lac promoter-operátor rendszerhez. Laktózzai való indukáláskor (vagy szintetikus inducer, például IPTG jelenlétében) a külső dezoxi-ribonukleinsav transzkripciója mind a lpp, mind pedig, függetlenül az előzőtől, a lac promotertől kiindulva elkezdődhet, amikor körülbelül ötszörös erősségű génkifejeződés következik be, mintha csak a lac promotert használnánk.

-10197937

Az indukálható lpp gén klónozó hordozók ugyanakkor autoregulálóvá tehetők oly 'módon, hogy mindegyik plazmidba funkcionális E. coli lacl gént építünk be. Ekkor a laktóz represszor gének és a lac promoterek 1:1 aránya az adott polipeptid kifejezésére kiválasztott transzformánsokban megtartható, ez az arány áll fenn a vad típusú E. coli sejtekben is. Ezek a transzformánsok nem kell, hogy tartalmazzák az F’-dezoxi-ribonukleinsavat, ugyanakkor nem alkalmasak arra, hogy az adott termék kifejeződését represszálják azokban a mikroorganizmusokban, amelyeket az E. coli lacl gént nem tartalmazó kifejeződő plazmidokkal transzformáltunk.

Érthető, hogy a kifejeződő plazmidok konstitutív és indukálható lpp génjei kapcsán az előzőekben mondottak előnyösen felhasználhatók az autoregulálódó indukálható lpp gént hordozó, és a találmány oltalmi köréhez tartozó kifejeződő plazmidok esetén. Felhasználható az lpp gén négy adott funkcionális fragmenséhez kapcsolódó transzkripciós és transzlációs hatékonyság, a lipoprotein strukturgén terminális részének mRNS transzkripciós termékében jelenlévő négy további hurokszerkezet által biztosított megnővekedett mRNS stabilitás, a külső dezoxi-ribonukleinsav három lehetséges beépítési helyéből adódó lehetőség, arra vonatkozóan, hogy a kifejeződő termék hol helyezkedik el, és a plazmidok külső dezoxi-ribonukleinsavat tartalmazó részébe beépíthető EcoRI, HindtlI és BamHI restrikciós enzimet felismerő szekvenciák, amelyek több dezoxi-ribonukleinsav beépített fragmens kifejezését teszik lehetővé.

Érthető továbbá az is, hogy gyakorlatilag bármely adott polipeptidet kiféjező struktdrgén kifejezhető a találmány szerinti rekombináns plazmidokkal. Ilyen polipeptid lehet például az emlős és a humán hormonok sora, enzimek és immunogén proteinek (vagy ezek intermedierjei). Ilyen proteinek például az alábbiak: az inzulin A- és B-lánca, a proinzulin, a növekedési hormon, a szomatosztatin, az interferon vagy a trypanosoma antigén, továbbá más termékek.

Az alábbiakban a transzformánsokat ismertetjük.

Az adott eukarióta proteint vagy más polipeptidet meghatározó gént hordozó autoregulált indukálható rekombináns klónozó plazmidokkal előnyösen speciális E. coli törzseket transzformálunk, és ezekben klónozzuk és fejezzük ki a termelendő proteint. A használt gazdasejtet úgy választjuk ki, hogy az az lpp génben egy deléciós mutációt tartalmazzon, azaz a gazdasejt nem képes a lipoprotein termelésére. Transzformánsként deléciós mutánst használva, valószínűleg stimulálhatjuk az idegen protein termelését. Ezenkívül az idegen protein szekretálódása a citoplazma membránon át az lpp-sérült gazdasejtekben fokozódik, mivel a lipoprotein szekretálódására egyébként felhasznált szekréciós helyek a membránban az idegen protein szekretá'ódására állnak rendelkezésre.

Az lpp-sérült sejtek használata különösen akkor előnyös, ha az idegen proteint meghatározó gént a lipoprotein szignál peptidjének hasítási helyére vagy annak közelébe építettük be. Ez azért van így, mivel ezek a sejtek úgynevezett „leaky sejtek, azaz a sejtek citoplazma membránján át szekretálódó proteinek kikerülnek a táptalajba a sejt külső membránján áthaladva. Ez valószínűleg nemcsak azért előnyös, mivel az adott idegen protein a táptalajba kerülve egyes esetekben könnyebben izolálható és tisztítható, mintha a sejtben maradna, de azért is, mivel az idegen protein egyébként a periplazmatikus térben halmozódna fel, és ez valószínűleg károsan befolyásolná a sejt normál aktivitását vagy növekedését. Az eukarióta géntermék sejten kívülre történő szekretálódásakor a sejtben közönséges körülmények között jelenlévő proteolitikus enzimek hatása csökkenhet, és a termék nem hasad kis fragmensekre.

A következőkben a kísérleteket ismertetjük.

A találmány szerinti rekombináns bakteriális plazmid klónozó hordozók egy csoportjának előállítására a fentiekben ismertetett stratégiát és technikákat kísérletesen alkalmaztuk. A teljesség kedvéért a konstitutív és indukálható lpp gént hordozó klónozó hordozók előállításának specifikus kísérleti lépéseit teljes egészében ismertetjük, majd megadjuk azokat a kísérleti lépéseket, amelyek során a találmány szerinti plazmidok egyikét állítjuk elő. Két típusú vagy két családba tartozó hordozót ismertetünk: az egyik konstitutív génkifejezésre alkalmas (pIN-I típusként jelöljük), a másik csoportba az indukálható genkifejezésre alkalmasak tartoznak (ezeket pIN-II jellel jelöljük). A találmány szerinti autoregulált indukálható kifejeződő plazmidokat közös néven pIN-III típusú plazmidoknak nevezzük.

A továbbiakban a prolipoprotein szignál peptidjét meghatározó dezoxi-ribonukleinsav-szekvencián belül eső beépítési helyet A helylyel jelöljük, azt a helyet, amely a szignál peptid utolsó kodonja után helyezkedik el, B helynek, végül azt a beépítési helyet, amely az érett lipoprotein 8. aminosavát meghatározó kodon után helyezkedik el, C helylyel jelöljük (lásd az 5. ábrát). Mindegyik hely kapcsán három plazmid állítható elő (ezek megfelelnek a három lehetséges leolvasási fázisnak), amikor összesen kilenc kifejeződő plazmidot kaphatunk, ezeket A-l, A-2, A-3, B-l, B-2, B-3, C-1, C-2 és C-3 jellel jelöljük.

A kísérletek során használt restrikciós enzimeket a New Egland Biolabs. és a Bethesda Research Laboratories-től szereztük be. A T4 dezoxi-ribonukleinsav-lígázt ez utóbbi cégtől vásároltuk (kivéve, ha másként adjuk meg),

-11197937 ugyanakkor az SÍ nukleázt a Miles Laboratories-től kaptuk.

A) Az A-típusú plazmidok (pIN-I) előállítása

A 6—15. ábrákon sematikusan szemléltetjük azoknak a rekombináns plazmidoknak az előállítását, amelyekben az A beépítési helyet töltjük fel, és az alábbiakban ismertetjük a részletes eljárást.

1) A pKENI 11 plazmid előállítása

Az A típusú lpp gén klónozó hordozók előállításának első lépéseként egy olyan plazmidot állítunk elő, amely az lpp gén komponenseinek forrásaként szolgál az eljárás további lépései során. Az E. coli lpp gént felvevő plazmidként a pSCIOl plazmidot választjuk (molekulatömege 5,8 megadelton), a plazmid a tetraciklinnel szembeni rezisztenciát meghatározó gént tartalmazza [Cohen és munkatársai, J. Bacteriol., 132, 734—737 (1977)]. A 6. ábrán láthatjuk, hogy a pSCIOl tartalmaz a tetraciklin rezisztenciát meghatározó gén 5’-végén egy EcoRI restrikciós endonukleázzal hasítható helyet. A pSCIOl plazmidot Ohtsubo-tól kaptuk (Department of Microbiology, State University of New York, Stony Brock).

A 6. ábra 101 jellel jelölt részén sematikusan ábrázoljuk az eljárást, amely szerint 2 pg pSCIOl dezoxi-ribonukleinsavat 2 egység EcoRI restrikciós endonukleázzal teljesen emésztünk 5 pl alábbi összetételű reakcióelegyben:

100 mmól trisz-hidrogén-klorid, pH=7,5 75 mmól nátrium-klorid, mmól magnézium-klorid, mmól β-merkapto-etanol literenként és lOOpg/ml borjú szérum albumin.

A reakcióelegyet a továbbiakban EcoRI pufferként jelöljük. A reakció 37°C hőmérsékleten végezzük, 60 percen át. Az EcoRI enzimmel kezelt pSCIOl dezoxi-ribonukleinsav önmagával való összekapcsolódásának gátlására alkalikus foszfatázt adagolunk (0,1 egység Worthington BAPF) és az inkubálást 60 percen át folytatjuk, 37°C hőmérsékleten. A reakciót fenolos extrakcióval állítjuk le, és a linearizált dezoxi-ribonukleinsavakat etanolos kicsapással különítjük el.

A 6. ábra 102 jellel jelölt része szerint eljárva, az E. coli lpp gént tartalmazó 2,8 kb nagyságú dezoxi-ribonukleinsav-fragmenst állítunk elő az E. coli lpp gént (lambda lppEc-1 jellel jelöljük) hibrid lambda fágból. Az lpp gént előzőleg egy lambda fág vektorba klónozták, ez a lambda 540 [Murray és Murray, J. Mól. Bioi., 98, 551—564 (1975)]. Az alábbiak szerint járunk el: 200 pg teljes dezoxi-ribonukleinsavat izolálunk az lpp gén szempontjából merodiploid E. coli K12 törzsből [JE5519/F506, Movva és munkatársai,

J. Bacteriol., 133, 81—84 (1978)]. A dezoxi-ribonukleinsavat 200 egység HindlII restrikciós enzimmel kezeljük. A dezoxi-ribonukleinsav-fragmenseket preparatív agaróz gélen sze12 párái juk, és a 10 kb nagyságú dezoxi-ribonukleinsav-fragmenseket tartalmazó frakciókat összegyűjtjük. Ezek a fragmensek a Southern-hibridizációs technikával pozitív hibridizációt mutatnak az 5’-p³²-lipoprotein mRNS molekulákkal [J. Mól. Biok, 98, 503— 517]. A körülbelül 20-szorosra töményített, 10 kb nagyságú HindHI fragmenseket tartalmazó elegyet és a HindlII enzimmel hasított lambda540 vektor dezoxi-ribonukleinsavat T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligázzal reagáltatjuk. A ligáit dezoxi-ribonukleinsavval E. coli K802 sejteket fertőzünk (NRRL B-15016, Blattner-től kaptuk, Laboratory of Genetics, University of Wisconsin-Madison). Ezt a törzset letétbe helyeztük az alábbi állandó törzsgyűjteményben: Northern Régiónál Research Laboratory, US. Department of Agriculture, Peoria, Illinois, USA. Olyan lpp gént hordozó rekombináns fágot keresünk, amelyet Benton és Davis hibridizációs technikájával ki tudunk mutatni [Science, 196, 180— 182 (1977)]. A kísérlet során 5’-P³²-lipoprotein mRNS-t használunk. Egy pozitív hibridizációt adó plakkot találtunk; ez a teljes funkcionális lpp gént hordozza, a fágot lambda lppEc-1 jellel jelöljük.

200 pg lambda lppEc-1 dezoxi-ribonukleinsavat 200 egység HaelII restrikciós enzimmel teljesen emésztünk 500 pl alábbi összetételű reakcióelegyben:

mmól trisz-hidrogén-klorid, pH=7,5, 6 mmól magnézium-klorid, mmól nátrium-klorid, mmól β-merkapto-etanol literenként és lOOpg/ml borjú szériumalbumin.

Ezt a reakcióelegyet a továbbiakban HaelII puffernak nevezzük. A reakciót 2 órán át 37°C hőmérsékleten végezzük, és a 2,8 kb nagyságú, az E. coli lpp gént hordozó HaelII fragmenst 5%- poliakril-amidot tartalmazó gélen frakcionálva tisztítjuk, az alábbiak szerint: a rakcióelegyet először fenollal extraháljuk, és a dezoxi-ribonukleinsav-fragmenseket 2,5 térfogatnyi etanollal kicsapjuk, csökkentett nyomású térben szárítjuk, 200 pl alábbi összetételű pufferban végül oldjuk:

5% glicerin, mmól/1 etilén-diamin-tetraecetsav,

0,05% bróm-fenol kék és

0,05% xilol-cianol (ezt az elegyet a továbbiakban gél-puffernak nevezzük). Ezután végezzük az 5% poliakril-amidot tartalmazó gélen való frakcionálási A 2,8 kb-nak megfelelő távolságra elmozdult dezoxi-ribonukleinsav-csíkot kivágjuk a gélből, és a dezoxi-ribonukleinsav-fragmenseket elektroforézissel eluáljuk. A dezoxi-ribonukleinsav gélen való elhelyezkedésének megfigyelésére használt etidium-bromid festéket fenolos extrakcióval távolítjuk el a dezoxi-ribonukleinsav fragmensekről. 2,5 térfogat etanollal kicsapjuk a dezoxi-ribonukleinsav-fragmenseket centrifugáljuk, 200 pl 0,3 mólos nátrium-acetát-oldatban oldjuk, 0,5 ml etanollal újra kicsapjuk, és csökkentett nyomású

-12197937 térben szárítjuk. Így 10 μg tiszta, 2,8 kb nagyságú HaelII fragmenshez jutunk.

A 2,8 kb nagyságú HpelII fragmens pSCIOl plazmidba való klónozására EcoRI linker molekulákat kötünk a 2,8 kb nagyságú HaelII fragmens végeire (lásd a 6. ábra 103 jellel jelölt részét). Az EcoRI linkereket (5’-GGAATTCC³’; Collaborative Research) T4 polinukleotid-kinázzal foszforilezzük (a kináz a Biochemicals P.L. terméke) ATP jelenlétében, az alábbi összetételű rakcióelegyben:

μΐ a rakcióelegy össztérfogata; tartalmaz:

mól linkért, mmól trisz-hidrogén-kloridot, pH=7,5, mmól magnézium-kloridot, mmól β-merkapto-etanolt, μπιόΐ ÁTP-t literenként, és egység T4 polinukleotid-kinázt.

percen át 37°C hőmérsékleten inkubáljuk a reakcióelegyet, majd 10 percen át 60°C hőmérsékleten tartjuk, és ezután 37°C-ra hűtjük, 0,1 mól/1 β-merkapto-etanol 5 μΐ-ét és 10 egység T4 polinukleotid-kinázt adunk az elegyhez, és további 30 percen át folytatjuk az inkubálást 37°C hőmérsékleten. A reakciót úgy állítjuk le, hogy az elegyet szárazjég-etanol fürdőben lefagyasztjuk.

pg 2,8 kb nagyságú HalII fragmenst 150 pikomól foszforilezett EcoRI linkerrel keverünk, és az elegyet 4 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligázzal kezeljük 12,5 μΙ alábbi összetételű reakcióelegyben:

mmól trisz-hidrogén-klorid, pH=7,5, mmól magnézium-klorid, mmól ditio-treitol (ezt a reakcióelegyet a továbbiakban ligáz-pufferként említjük), és

0,6 mmól ATP literenként.

A reakciót 15 órán át 12,5°C hőmérsékleten végezzük. A reakció leállítására az elegyet 20-szorosra hígítjuk EcoRI pufferral és 10 percen át 60°C hőmérsékleten tartjuk. 30 egység EcoRI restrikciós enzimet adunk a reakcióelegyhez, és 1 órán át 37°C hőmérsékleten inkubáljuk EcoRI kohézív végek előállítására. A reakciót úgy állítjuk le, hogy az elegyet 10 percen át 60°C hőmérsékleten tartjuk.

A kapott elegyhez 2 pg előzőleg linearizált pSCIOl dezoxi-ribonukleinsavat adunk, és fenollal extrahálunk. Éteres extrakciót követően etanollal kicsapjuk a dezoxi-ribonukleinsavakat, csökkentett nyomású térben szárítjuk és 100 pl ligáz-pufferban oldjuk. Az elegyet 5 percen át 37°C hőmérsékleten tartjuk, és az EcoRI kohézív végeket 4°C hőmérsékleten 16 órán át, és ezután 1 órán át 0°C hőmérsékleten hasítjuk. Ezután 0,4 mmól végkoncentrációig adenozin-trifoszfátot adagolunk, majd 1 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligázt és az elegyet 12,5°C hőmérsékleten inkubáljuk, 7 órán át.

A ligációs elegy negyedrészével E. coli lpp deléciós mutáns törzset transzformálunk [JE5527, NRRL B-15012; F”, mán, lpp-2, pps, thi, his, rpsL, gyrA, recÁl; Hirota és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74, 1417— 1420 (1977)]. A törzset Hirota-tól kaptuk, National Institute of Genetics, Mashima.Japán A törzs az alábbi állandó törzsgyűjteményből beszerezhető: Northern Régiónál Research Laboratory, U.S. Department of Agriculture, Peoria, Illinois, USA. A transzformációt Cohen és munkatársai szerint végeztük [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69, 2110-2114(1972)]. A tetraciklinre rezisztens transzformánsokat egy éjszakán át olyan Whatman 3MM szűrőpapíron növesztettük, amelyeket 10 pg/ml tetraciklint tartalmazó L-táptalajra helyeztük. Az lpp kiónokat telephibridizációval választjuk ki [Gergen és munkatársai, Nucleic Acids Rés., 7, 2115-2136 (1979)]. Az lpp gént tartalmazó, 0,95 kb nagyságú Mspl fragmenst elválasztjuk a lambda lppEc-l-ből, és a nick-transzlatáljuk (a-³²P] dATP-vel és [α-P³²] dCTP-vel Maniatis és munkatársai szerint eljárva {Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 72, 1184—1188 (1975)]. Ezt használjuk R³²-próbaként. Egy pozitív hibridizációt mutató transzformáns tartalmazza azt a plazmidot, amelynek a szerkezetét a 6. ábra 104 jellel jelölt részén mutatjuk be. Ezt a plazmidot pKENI 11 jellel jelöljük. A plazmid az E. coli CC620/pKEN 111 törzsből (NRRL B-15011) nyerhető, ez az alábbi állandó törzsgyűjteményben található meg: Northern Régiónál Research Laboratory, U.S. Department of Agriculture, Peoria, Illinois, USA. A plazmidot az NRRL B-15011 sejtekből ismert módon izolálhatjuk.

2) A pKENOO8 plazmid előállítása

Az lpp gént kifejező találmány szerinti plazmidok előállításához használt szülői plazmid a pBR322. Ennek molekulasúlya 2,6 megadelton. A plazmid ampicillinre (Amp) és tetraciklinre (Te) rezisztenciát biztosító géneket hordoz [Bolivár és munkatársai, Gene, 2, 95—113 (1977)]. Ahogy azt a 7. ábrán látjuk, a pBR322 a tetraciklin rezisztenciát meghatározó gén 5’-végén egy EcoRI hasítási helyet tartalmaz, ugyanakkor a tetraciklin rezisztencia gén promoterén belül egy HindlII hasítási helyet, és az ampicillin rezisztencia génen belül pedig egy Pvul hasítási hely található. A pBR322 plazmidot Arnheim-től kaptuk [Department of Biochemistry, State University of New York, Stony Brook], A plazmid a Bethesda Research Laboratoriestől vásárolható meg.

Az 5. ábrán sematikusan szemléltetjük az lpp gén különböző komponenseit, mindegyiket jelekkel vagy satírozással jelöljük. A besötétített szegmensek, amelyeket „a“ betűvel jelölünk, adeninben és timinben gazdag szakaszt reprezentálnak, ez 260 bázispárból áll, és megelőzi a transzkripció kezdetét meghatározó helyet, továbbá tartalmazza az lpp promotert. Az 5’-nem transzlatált szakaszt a 13

-13197937 körrel jelölt kockával jelöljük, illetve a „b“ betűvel. A proliprotein szignál peptid szakaszát a diagonális vonalakkal és a „c“ betűvel jelzett satírozott szegmenssel adjuk meg. Az lpp gén struktűrszakaszát a diagonális szegmenssel jelöljük, amit „d“ betűvel jelzünk, míg az „e“ betűvel jelölt szegmens a 3,-nem transzlatált szakaszt és a transzkripció terminációs helyét jelzi. Ezeket a jeleket és a satírozást felhasználjuk az lpp gén hasonló funkcionális fragmenseinek jelölésekor a 7—11., 15., 17—18., 21—23. és 26—29. ábrákon is.

A 7. ábrán azt a stratégiát szemléltetjük, amellyel a pBR322 plazmidba beépítjük az lpp gén promoterét és 5’-nem transzlatált szakaszát hordozó fragmenst. A célra választott fragmens egy 462 bázispárból álló pKENl 11-ből származó Alul fragmens, ezt sematikusan szemléltetjük az 5. ábra 105A részén. Ez nemcsak a promoter-szekvenciát és az 5’-nem transzlatált szakaszt tartalmazza (—45-től a —1-ig és a -j-l-től a +39-ig terjedő rész, sorrendben), de tartalmazza az lpp gén teljes adenin-timin-gazdag szegmensét, amely a promoter szekvenciát előzi meg.

Az lpp promoter szakaszt tartalmazó 462 bázispárból álló Alul fragmens pBR322-be való klónozására a pBR322 EcoRI ésHindlII hasítási helyek közé eső dezoxi-ribonukleinsav-fragmenst először kihasítjuk, ahogy azt a 7. ábra 106 jellel jelölt részén szemléltetjük. Ügy járunk el, hogy 11 pg pBR322 plazmid dezoxi-ribonukleinsavat 11 egység Hindin restrikciós endonukleázzal kezelünk 200 μΐ alábbi összetételű reakcióelegyben:

mmól trisz-hidrogén-klorid, pH=7,5, mmól magnézium-klorid, mmól nátrium-klorid, mmól β-merkapto-etanol literenként, és 100 pg/ml borjú szérum albumin (ezt a reakcióelegyet a továbbiakban HindlII-puffernek nevezzük).

A reakciót 37°C hőmérsékleten végezzük 1 órán át. Az emésztés teljessé-válása után fenolos extrakciót végzünk, és a dezoxi-ribonukleinsavakat etanolos kicsapással különítjük el.

A HindlII kohézív végek eltávolítására a dezoxi-ribonukleinsavat 1,5 μΐ SÍ nukleázzal [Miles Laboratories] kezeljük, 300 μΐ alábbi összetételű reakcióelegyben:

mmól nátrium-acetát, pH=4,25,

0,3 mól nátrium-klorid és mmól cink-szulfát (literenként) (a továbbiakban ezt az elegyet Sl-puffernak nevezzük).

A reakciót 1 órán át végezzük 20°C hőmérsékleten. Ezután a reakció leállítására 30 μΐ 500 mmólos trisz-hidrogén-kloridot (pH=8,0) és 30 μΐ 250 mmólos etilén-diamin-tetraecetsavat adagolunk, majd ezt követően fenollal extrahálunk. A fenol eltávolítására az elegyet éterrel extraháljuk, és az alábbi elegy14 gyei szemben dializáljuk, 4°C hőmérsékleten, egy éjszakán át:

0,01 X SSC (SSC: 0,15 mól nátrium-klorid + 0,015 mól nátrium-citrát literenként)

A dezoxi-ribonukleinsavakat etanolos kicsapással különítjük el.

Ezután 200 pikomól foszforilezett EcoRI linkért adagolunk, és az elegyet 4 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav-1 igazzal kezeljük,

12,5 μΐ 0,6 mmól/1 adenozin-trifoszfátot tartalmazó ligáz-pufferban. A reakciót 12,5°C hőmérsékleten végezzük 16 órán át. 30 egység EcoRI restrikciós enzim adagolásával kohézív végeket állítunk elő 75 μΐ EcoRI-pufferban. A reakciót 2 órán át 37°C hőmérsékleten végezzük. A reakció leállítására fenollal extrahálunk, és a dezoxi-ribonukleinsavakat etanolos kicsapással különítjük el.

Az EcoRI kohézív végeket ligáljuk, és a plazmidot így újra körré zárjuk 0,3 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav-Iigázzal 20 μΐ ligázpufferban, amelyhez 0,4 mmól/1 adenozin-trifoszfátot adunk. A ligálást 7 órán át 12,5°C hőmérsékleten végezzük. A ligáit dezoxi-ribonukleinsav 0,5 ug-nyi alikvot mennyiségét használjuk az E. coli JE5519 törzs (NRRL B-15013, F^_, aroD, mán, argE, lac, gal, rpsL, gyrA, recAl) transzformálására. A törzset Hirota-tól kaptuk (National Institute of Genetics, Mashima, Japán). A törzs az alábbi állandó törzsgyűjteményben van letétbe helyezve: Northern Régiónál Research Laboratory, U.S. Department of Agriculture, Peoria, Illinois, USA. Tíz ampicillin-rezisztens és tetraciklinre érzékeny transzformánst egy éjszakán át növesztünk 1 ml L-táptalajban, amelyhez 50 pg/ml ampicillint adtunk. A plazmid dezoxi-ribonukleinsavakat 0,5 ml tenyészetekből izoláljuk a gyors, alkalikus-denaturációs módszerrel, amit Bimbóim és Doly írtak le [Nucleic Acids Rés., 7, 1513 (1979)]. A terméket restrikciós enzimmel térképezve analizáljuk. A plazmidok egyikének szerkezetét a 107 jellel jelzett helyen a 7. ábrán adjuk meg, ezt ρΚΕΝΟΟδ jellel jelöljük.

A 7. ábra 108 jellel jelölt részén sematikusan ábrázoljuk azt, ahogy az lpp promotert tartalmazó 462 bázispár nagyságú Alul fragmenst kapjuk. Ügy járunk el, hogy 100 pg pKENl 11 plazmid dezoxi-ribonukleinsavat Mspl restrikciós enzimmel emésztünk 600 μΐ alábbi összetételű pufferban:

mmól trisz-hidrogén-klorid, pH=7,5, mmól magnézium-klorid, mmól kálium-klorid, mmól ditio-treitol literenként, és 100 μg/ml borjú szérum albumin (ezt a reakcióelegyet a továbbiakban Hpal-puffernak nevezzük).

A reakciót 37°C hőmérsékleten végezzük 3 órán át. (Bár a pKENl 11 több Mspl hasítási helyet tartalmaz, csak kettő, számunkra érdekest adtunk meg a 7. ábra 109 helyén.) A dezoxi-ribonukleinsav-fragmenseket feno-14197937 los extrakciót követően 2,5 térfogatnyi etanollal kicsapjuk, csökkentett nyomású térben szárítjuk, 100 μί gél-pufferban oldjuk és 5% poliakril-amidot tartalmazó gélen frakcionáljuk. Ezután 6 pg tisztított, 0,95 kb nagyságú Mspl fragmenst emésztünk Alul restrikciós endonukleázzal, 400 pl Hindlll-pufferban, 37°C hőmérsékleten, 2 órán át. Ily módon megkapjuk a 462 bázispárból álló Alul fragmenst, ezt gél-elektroforézissel tisztítjuk.

pg 462 bázispárból álló Alul fragmenst 150 pikomól foszforilezett EcoRI linkerrel keverünk, és az elegyhez 4 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligázt adunk, 10 pl, 0,6 mmól/ /1 adenozin-trifoszfátot tartalmazó ligáz-pufferban. A reakciót 16 órán át végezzük 12,5°C hőmérsékleten. A ligáit dezoxi-ribonukleinsavat 40 egység EcoRI restrikciós enzimmel emésztjük 100 pl EcoRI-pufferban, 37°C hőmérsékleten, 1 órán át, amiután EcoRI kohézív végeket kapunk. Az emésztés leállítására az elegyet 10 percen át 60°C hőmérsékleten tartjuk, majd az elegyhez 0,6 pg EcoRI enzimmel emésztett pKEN005 plazmid dezoxi-ribonukleinsavat adunk és fenollal extrahálunk. A dezoxi-ribonukleinsavakat etanolos kicsapással különítjük el, és az EcoRI kohézív végeket 0,4 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligázzal kapcsoljuk össze 20 pl, 0,4 mmól/1 adenozin-trifoszfátot tartalmazó ligáz-pufferban, 12,5°C hőmérsékleten, 7 órán át. A ligáit dezoxi-ribonukleinsavakkal E. coli JE5519 (NRRL B-15013) törzset transzformálunk, és a transzformánsokat L-táptalajon 12,5 pg/ml tetraciklin jelenlétében tetraciklin rezisztenciára szelektáljuk. A tetraciklinre rezisztens transzformánsok plazmid dezoxi-ribonukleinsavát gyors alkalikus-denaturációs módszerrel analizáljuk, izoláljuk. Az eredmények szerint a pKEN005 EcoRI helyére beépült a 462 bázispárból álló Alul fragmens.

Ezt mutatjuk be a 7. ábra 110 helyén.

Az így kapott plazmidot pKEN008 jellel jelöljük.

3) A pKENOlO plazmid előállítása

Az A helyen beépített szakaszt tartalmazó lpp gént hordozó klónozó hordozók előállításának következő lépéseként a pKEN008 két EcoRI hasítási helye közül az egyiket elimináljuk. Ez azért szükséges, hogy biztosak legyünk abban, hogy csak egyetlen beépítési pont áll rendelkezésre a klónozásra kiválasztott külső eredetű gén számára, mégpedig jobbra haladva a 462 bázispárból álló Alul fragmenst közvetlenül követő helyen (ez most egy EcoRI fragmens), amely egyébként tartalmazza az lpp gén promotert és az 5’-nem transzlatált szakaszt. A 8. ábrán részletesen ábrázoljuk az lpp gén promoterétől távolabb eső EcoRI hely eltávolításának stratégiáját.

Az alábbiak szerint járunk el: 4 pg EcoRI enzimmel emésztett pBR322 plazmid dezoxi-ribonukleinsavat először SÍ nukleázzal keze28 lünk az EcoRI kohézív végek eltávolítására, majd ezután BAP-val az önmagával való kapcsolódás meggátlására. Ahogy azt a 8. ábra 111 jellel jelzett részén sematikusan bemutatjuk, a dezoxi-ribonukleinsavakat ezután 0,76 pg tisztított, 462 bázispárból álló Alul fragmenssel keverjük (ez a 7. ábra kapcsán az előzőekben leírtak szerint a pKENl 11-ből származik), majd tompa-végligációt* végzünk 2,4 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligázzal, 10 pl, 0,6 mmól adenozin-trifoszfátot tartalmazó ligáz-pufferban, 12,5°C hőmérsékleten, 16 órán át. A ligáit dezoxi-ribonukleinsav felével E. coli JE5519 törzset (NRRL B-15013) transzformálunk, a transzformánsok egyike tartalmazza a 8. ábra 112 jellel jelölt részén ábrázolt szerkezetű plazmidot. Ezt a plazmidot pKEN002 jellel jelöljük. A pKEN002 plazmid dezoxi-ribonukleinsav 25 pg-ját Pvul és Xbal restrikciós enzimekkel kezeljük, 500 pl alábbi összetételű pufferban:

mmól trisz-hidrogén-klorid, pH=7,9, 6 mmól magnézium-klorid,

150 mmól nátrium-klorid, mmól β-merkapto-etanol literenként, és

100 pg/ml borjú szérum albumin (az előző összetételű elegyet a következőkben BamHI-puffernak nevezzük). A reakciót 1 órán át 37°C hőmérsékleten végezzük. A kapott 1,04 kb nagyságú Pvul-Xbal dezoxi-ribonukleinsav-fragmenst (lásd a 8. ábra 113 részét) gél-elektroforézissel tisztítjuk.

A 8. ábra 114 helyén sematikusan szemléltetjük azt, hogy hogyan származik a 24 bázispárból álló Xbal-EcoRI dezoxi-ribonukleinsav-fragmens a pKEN008-ból. Ügy járunk el, hogy 25 pg pKEN008 plazmid dezoxi-ribonukleinsavat EcoRI restrikciós enzimmel emésztünk, és egy 470 bázispárból álló EcoRIfragmenst gél-elektroforézissel tisztítunk. 1 pg, 470 bázispárból álló EcoRI-fragmenst ezután Xbal restrikciós enzimmel emésztünk, és 1 pg 1,04 kb nagyságú Pvul-Xbal dezoxi-ribonukleinsav-fragmenssel keverünk, amely utóbbit előzőleg állítottunk elő. Az elegyhez előzőleg Pvul és EcoRI restrikciós enzimmel emésztett 0,75 pg mennyiségű pKEN005 plazmid dezoxi-ribonukleinsavat adunk (lásd a 8. ábra 115 jellel jelölt helyét). A dezoxi-ribonukleinsav-elegyet 0,8 egység T4 dezoxiribonukleinsav-ligázzal kezeljük, 50 pl 0,4 mmól/1 adenozin-trifoszfátot tartalmazó ligáz-pufferban, 12,5°C hőmérsékleten, 7 órán ét. A ligáit dezoxi-ribonukleinsav felével E. coli JE5519 törzset transzformálunk (NRRL B-15013), és a transzformánsokat tetraciklin rezisztenciára szelektáljuk. A 0,5ml tetraciklin-rezisztens transzformánsokból készült tenyészetből gyors alkalikus-denaturációs módszerrel plazmid dezoxi-ribonukleinsavakat izolálunk, ezek analízise szerint az egyik plazmid a 8. ábra 116 helyén megadott szerkezetű. Ezt a plazmidot pKENOlO jellel jelöljük.

-15197937

4) A pKEN018 plazmid előállítása

A 9. ábrán szemléltetjük a 3’-nem transzlatált szakaszt és az lpp gén transzkripciós terminációs helyét hordozó dezoxi-ribonukleinsav-fragmens klónozásának stratégiáját. A célra választott fragmens a pKENI 11 0,95 kb nagyságú PvuII-Hpal fragmense, ezt az 5. ábra 105D helyén sematikusan ábrázoljuk.

Mivel a Pvull restrikciós enzim az lpp gént a +167 és +168 bázisok között hasítja, ez a fragmens az lpp körülbelül felét tartalmazza (lásd az 1. és 5. ábrát). A promoter fragmenshez viszonyítva, hasonló orientációba a klónozó hordozóba úgy építjük be ezt a fragmenst, hogy BamHI és Sáli linkért kötünk a pvull illetve a Hpal hasítási helyekre.

A 9. ábra 117 helyén sematikusan ábrázoljuk azt, ahogy a pKENI 111 plazmid dezoxi-ribonukleinsavból egy 2,8 kb nagyságú EcoRI fragmenst kapunk EcoRI restrikciós enzimmel való emésztéssel, és poliakril-amid gélen való frakcionálással. 10 pg ily módon tisztított fragmenst Pvull restrikciós endonukleázzal teljesen emésztünk 500 μΐ HaelII pufferban, 37°C hőmérsékleten, 1 órán át. A reakció leállítására fenolos extrakciót végzünk, majd az elegyet éterrel extraháljuk. A dezoxi-ribonukleinsav-fragmenseket 2,5 térfogatnyi etanollal kicsapjuk, centrifugáljuk, 200 pl 0,3 mólos nátrium-acetátban újra oldjuk és 0,5 ml etanollal ismételten kicsapjuk. 5 pg Pvull emésztéssel kapott, 2,8 kb nagyságú EcoRI fragmenst 390 pikomól foszforilezett BamHI linkerrel keverünk, és tompa-végligációt végzünk 6 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligázzal, 25 pl, 0,6 mmól/1 adenozin-trifoszfátot tartalmazó ligáz-pufferban, I2,5°C hőmérsékleten, 16 órán át. A reakcióelegyet 150 pl térfogatúra egészítjük ki HaelII pufferral, és a T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligáz inaktiválására 10 percen át 60°C hőmérsékleten tartjuk. 60 egység HaelII restrikciós enzim adagolását követően 1 órán át 37°C hőmérsékleten inkubálunk.

Mivel a Collaborative Research cégtől vásárolt, és az EcoRI linker kapcsán leírtakhoz hasonlóan foszforilezett BamHI linker 5’-CCGGATCCGG-3’ bázis-szekvenciával rendelkezik, a HaelII restrikciós enzim ⁵’ GGCC³’

3)CCGG₅i bázisszekvenciájú felismerő helye megfelel az előzőnek, így mindkét linkért a fentivel előállítottnak tekinthetjük. A HaelII restrikciós enzim használatakor a BamHI linkerrel kapcsolt Pvull fragmensek (ezek a fragmensek nem tartalmaznak semmiféle HaelII hasítási helyet) elvesztik a fölös BamHI linker fragmenseket, amelyek a Pvull véghez kapcsolódnak, és ezután csak egy olyan linker fragmens marad hátra, amely közvetlenül kapcsolódik ehhez a véghez. Ez a folyamat nagyban egyszerűsíti az lpp gén 3’-végét tartalmazó dezoxi-ribonukleinsav-frag16 mens tisztítását, ahogy azt az alábbiakban megadjuk.

A HaelII enzimet úgy inaktiváljuk, hogy a reakcióelegyet 10 percen át 60°C hőmérsékleten tartjuk, majd a dezoxi-ribonukleinsav-fragmenseket Hpal restrikciós enzimmel teljesen emésztjük 400 pl Hpal-pufferban, 37°C hőmérsékleten, 2 órán át. Fenollal extraháljuk a reakcióelegyet, és a dezoxi-ribonukleinsav-fragmenseket etanollal kicsapjuk, csökkentett nyomású térben szárítjuk, 100 pl gél-pufferban oldjuk és 5% poliakril-amidot tartalmazó gélen frakción áljuk. A 0,95 kb-nak megfelelő helyre elmozdult dezoxi-ribonukleinsav csíkot kihasítjuk a gélből, és a dezoxi-ribonukleinsav-fragmenseket elektroforézissel leeluáljuk. Fenolos extrakcióval eltávolítjuk az etidium-bromidot, és a dezoxi-ribonukleinsav-fragmenseket 2,5 térfogatnyi etanollal kicsapjuk, centrifugáljuk, 200 pl, 0,3 mólos nátrium-acetátban oldjuk, 0,5 ml etanollal újra kicsapjuk és csökkentett nyomású térben szárítjuk, fgy 1 pg tiszta, 0,95 kb nagyságú HaelII-Hpal fragmenst kapunk, ezt a 9. ábra 118 helyén mutatjuk be.

120 pikomól foszforilezett Sáli linkért (5,-GGTCGACC-3’; a Collaborative Research terméke, az előzőekben megadottak szerint foszforileztük) keverünk 0,75 pg, 0,95 kb nagyságú tisztított HaelII-Hpal fragmenssel, majd ezután tompa-végligációt végzünk 3,5 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligázzal, 25 pl, 0,6 mmól adenozin-trifoszfátot tartalmazó ligáz-pufferban, 12,5°C hőmérsékleten, 16 órán át. A reakcióelegy térfogatát megfelelő mennyiségű BamHI pufferral 300 μΐ-re egészítjük ki, és ezután 10 percen át 60°C hőmérsékleten tartjuk. A reakcióelegyhez megfelelő mennyiségű BamHI és Sáli restrikciós enzimet adunk, és 2 órán át 37°C hőmérsékleten inkubáljuk a Pvull, illetve Hpal végekhez kapcsolt BamHI és Sáli linkerek hasítása céljából, amiután kohézív végeket kapunk. A kapott 0,95 kb nagyságú BamHI-Sall fragmenst a 9. ábra 119 jellel jelölt helyén mutatjuk be. A restrikciós endonukteázokkal való emésztést úgy állítjuk le, hogy a reakcióelegyet 10 percen át 60°C hőmérsékleten tartjuk.

A kísérlet ezen fázisában a 150 pl térfogatú elegy körülbelül 0,38 pg, 0,95 kb nagyságú BamHI-Sall fragmenst tartalmaz. Az elegyet 1 pg pKEN014 plazmid dezoxi-ribonukleinsavval keverjük, ezt a ribonukleinsavat előzőleg azonban BamHI és Sáli restrikciós enzimmel emésztjük és BAP-vel kezeljük (lásd a 9. ábra 120 jellel jelölt helyét). A pKEN014 plazmid a pBR322 plazmidból származik oly módon, hogy az utóbbiból kihasítunk egy 346 bázispárból álló HindlII-BamHI fragmenst, amely a tetraciklin rezisztencia gén nagy részét tartalmazza. A fragmenst azért hasítjuk ki, hogy a kifejeződő plazmid nagyságát lehető legkisebb

-16197937 értéken, körülbelül 5 kb-on tartsuk. A fragmens delécióját a 9. ábra 121 jellel jelölt helyén bemutatottak szerint végezzük HindlII emésztéssel, és ezt követően SÍ nukleázos kezeléssel. Ezt a kezelést 1 órán át 20°C hőmérsékleten végezzük, majd BamHI linkért kapcsolunk a fragmenshez, BamHI enzimmel teljesen emésztjük, T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligázzal újra zárjuk a molekulát, és tetraciklinre érzékeny transzformánsokra szelektálunk.

A pKEN014 linearizált dezoxi-ribonukleinsavat és a 0,95 kb nagyságú BamHI-Sall fragmenseket tartalmazó keveréket fenollal extraháljuk, és a dezoxi-ribonukleinsavakat 2,5 térfogatnyi etanollal kicsapjuk, centrifugáljuk és 200 pl, 0,3 mólos nátrium-acetátban oldjuk. A dezoxi-ribonukleinsavakat ezután 0,5 ml etanollal újra kicsapjuk, centrifugáljuk és csökkentett nyomású térben szárítjuk. A fragmensek kohézív végeit 0,4 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligázzal kapcsoljuk 60 μΐ, 0,4 mmól/1 adenozin-trifoszfátot tartalmazó ligáz-pufferban, 12,5°C hőmérsékleten, 7 órán át. 12 μΐ ligációs eleggyel E. coli JE5519 törzset (NRRL B-15013) transzformálunk, és 12 ampicillinre rezisztens transzformánst egy éjszakán át 1 ml, 50 pg/ /ml ampicillint tartalmazó L-táptalajban tenyésztünk. 0,5 ml tenyészetből gyors alkalikus-denaturációs módszerrel izoláljuk a plazmid dezoxi-ribonukleinsavakat, és agaróz gél-elektroforézissel analizáljuk. 5 plazmid dezoxi-ribonukleinsav hordozza a 0,95 kb nagyságú BamHI-SalI fragmenst, a plazmidok egyikét pKEN018 jellel jelöljük. A pKEN018 plazmid dezoxi-ribonukleinsav dezoxi-ribonukleinsav-szekvenálása azt mutatja, hogy a plazmid szerkezete a 9. ábra 122 helyén megadottakkal azonos. Az eredmények szerint a BamHI linker a PvuII helyre az lpp génen belül megfelelő pozícióba kapcsolódott be.

5) A pKEN021 plazmid előállítása

Az lpp gént hordozó klónozó molekula A helyének beépítése során a következő lépés az, hogy az lpp promoter fragmenst kombináljuk, mégpedig hasonló orientációban a transzkripciós terminációs fragmenssel. A lépés értelmében a pKEN018 630 bázispárból álló Pvul-EcoRI fragmensét kicseréljük, ahogy azt a 10. ábrán leegyszerűsítve ábrázoljuk.

Ügy járunk el, nogy 20 pg pKENOlO plazmid dezoxi-ribonukleinsavat teljesen emésztünk (lásd a 10. ábra 123 helyén jelzetteket) Pvul restrikciós endonukleázzal 100 μΐ BamHI pufferban, 37°C hőmérsékleten, 1,5 órán át. A Pvul enzim inaktiválására a reakcióelegyet 10 percen át 60°C hőmérsékleten tartjuk, majd ezután a reakcióelegyhez 52 μΐ vizet, 40 μΐ, 0,5 mólos trisz-hidrogén-kloridot (pH=7,5), 4 μΙ, 0,1 mólos magnézium-kloridot és 40 egység EcoRI restrikciós enzimet adunk. 1 órán át 37°C hőmérsékleten inkubáljuk a reakcióelegyet, majd a reakció leállítására fenollal extrahálunk.

A dezoxi-ribonukleinsav-fragmenseket 2,5 térfogat etanollal kicsapjuk, csökkentett nyomású térben szárítjuk, 100 μΙ gél-pufferban oldjuk és 5% poliakril-amidot tartalmazó gélen frakcionáljuk. Miután az elkülönült dezoxi-ribonukleinsav-fragmenseket eluáljuk a gélről, 4 pg, 1,1 kb nagyságú Pvul-EcoRI fragmenshez jutunk.

0,75 pg tisztított fragmenst ezután 0,6 pg pKEN018 plazmid dezoxi-ribonukleinsavval keverünk, amelyet előzőleg kétszeresen emésztettünk Pvul, illetve EcoRI restrikciós enzimmel, és BAP-vel kezeltünk (lásd a 10. ábra 124 helyét). A Pvul és az EcoRI kohézív végeket 0,4 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligázzal összekötjük 50 pl, 0,4 mmól/1 adenozin-trifoszfátot tartalmazó ligáz-pufferban, 12,5°C hőmérsékleten, 7 órán át. 25 pl ligáit eleggyel E. coli JE5519 (NRRL B-15013) törzset transzformálunk, és a transzformánsokat ampicillin rezisztenciára szelektáljuk. Az ampicillin-rezisztens transzformánsokból izoláljuk a plazmid dezoxi-ribonukleinsavakat és agaróz gél-elektroforézissel analizáljuk. A restrikciós enzimmel végzett térképezés szerint a plazmidok egyike a 10. ábra 125 helyén megadott szerkezetű, ezt pKEN021 jellel jelöljük.

6) A pKEN037 plazmid előállítása

Az lpp gént tartalmazó kifejeződő plazmid első A helyének előállítása során az utolsó lépést a 11. ábrán mutatjuk be. Ahogy azt all. ábra 126 helyén látjuk, a pKEN021 hordozza az lpp promoter fragmenst és az lpp transzkripciós terminációs fragmenst, a kettőt a pBR322-ből származó 32 bázispárból álló fragmens választja el. Az utóbbi fragmens deléciójával és az adott polipeptidet meghatározó dezoxi-ribonukleinsav-szekvencia beépítésével megkapjuk az adott polipeptid kifejezésére alkalmas funkcionális csoportot. Mivel a 32 bázispárból álló fragmens végein EcoRI és BamHI hasítási helyeket találunk, a pKEN021 plazmid szerkezetéből adódóan csak olyan külső eredetű dezoxi-ribonukleinsav-fragmenst építhetünk be, amely EcoRI-EcoRI, BamHI-BamHI vagy EcoRI-BamHI kohézív végekkel rendelkezik. A beépíthető külső gének számának növelése érdekében, továbbá más kohézív végek kombinációjával végződőek integrálhatósága érdekében ezen szakasz dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciáját megváltoztatjuk oly módon, hogy a létező EcoRI és BamHI helyek közé egy HindlII hasítási helyet építünk be.

Ügy járnak el, hogy a pKEN021 bázispárból álló HindlII-Clal fragmensét elimináljuk a plazmid nagyságának csökkentése érdekében. Ennek érdekében 5 pg pKEN021 plazmid dezoxi-ribonukleinsavat 1 egység Clal restrikciós enzimmel hasítunk 100 μΐ alábbi összetételű reakcióelegyben:

100 mmól trisz-hidrogén-klorid, pH=8,0, mmól magnézium-klorid literenként, és

100 pg/ml borjú szérum albumin.

-17197937

A reakciót 1 órán át 37°C hőmérsékleten végezzük. Fenolos extrakciót és etanolos kicsapást követően a Clal kohézív végeket 600 egység SÍ nukleázos kezeléssel eltávolítjuk. A reakciót 200 pl Sl-pufferban végezzük, 1 órán át 20°C hőmérsékleten. A reakció leállítására 20 pl, 0,5 mólos trisz-hidrogén-kloridot (pH=8,0) és 20 pl, 0,25 mólos etilén-diamin-tetraecetsavat adagolunk. Ezután fenollal extraháljuk az elegyet és 4 órán át 0,01 X SCC-vel szemben dializáljuk. A dezoxi-ribonukleinsavakat 2,5 térfogat etanollal kicsapjuk, centrifugáljuk, és lOOpl, 0,3 mólos nátrium-acetátban oldjuk. A dezoxi-ribonukleinsavakat ezután 250 μΙ etanollal újra kicsapjuk, centrifugáljuk és csökkentett nyomású térben szárítjuk.

pg SÍ-kezelt dezoxi-ribonukleinsavat 70 pikomól foszforilezett HindlII linkerrel (5’-CCAAGCTTGG-3'; a Collaborative Research terméke, az előzőekben megadottak szerint foszforileztük), és tompa-végligációt végzünk 4 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligázzal 20 pl, 0,6 mmól adenozin-trifoszfátot tartalmazó ligáz-pufferban, 12,5°C hőmérsékleten, 16 órán át. 100 μΐ HindlII pufferral hígítjuk az elegyet, és 10 percen át 60°C hőmérsékleten tartjuk. Ezután 20 μΐ HindlII restrikciós endonukleázt adagolunk, és az elegyet 1 órán át 37°C hőmérsékleten inkubáljuk, a feles linker molekulák eltávolítására és HindlII kohézív végek előállítására. Ezután fenollal extraháljuk a reakcióelegyet, a dezoxi-ribonukleinsavakat pedig etanollal kicsapjuk. 0,5 μg plazmid dezoxi-ribonukleinsavat újra körré zárunk oly módon, hogy 0,8 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligázzal kezeljük, 15 pl, 0,4 mmól/1 adenozin-trifoszfátot tartalmazó ligáz-pufferban, 12,5°C hőmérsékleten, 7 órán át. 8 μΐ ligáit eleggyel E. coli JA221 (NRRL B-15014; recaA-, hr-, h⁴, delta-trpES, thr, leu, thi, lacY-; Carbon-tól kaptuk: Dept. of Biological Sciences, University of California, Santa Barbara) törzset transzformálunk. A törzset az alábbi állandó törzsgyűjteményben helyeztük letétbe: Northern Régiónál Research Laboratory, U.S. Department of Agriculture, Peoria, Illinois, USA. Az ampicillinre rezisztens transzformánsokból plazmid dezoxi-ribonukleinsavat izolálunk, az, egyikből izolált plazmid szerkezetét a 11. ábra 127-es helyén mutatjuk be, ezt a plazmidot pKEN030 sorszámmal jelöljük.

A pKEN030 HindlII hasítási helyének eliminálására 2,5 pg pKEN030 plazmid dezoxi-ribonukleinsavat 5 egység HindlII restrikciós enzimmel kezelünk 50 μΙ HindlII pufíerban, 1 órán át, 37°C hőmérsékleten. Fenol extrakciót követően etanollal kicsapjuk a dezoxi-ribonukleinsavat, és a HindlII kohézív végeket 400 egység Sl-nukleázzal eltávolítjuk, 200 pl Sl-pufferban, 20°C hőmérsékleten, 1 órán át tartó reakcióval, A dezoxi-ribonukleinsavat elkülönítjük és 0,75 pg-ját 18 újra körré zárjuk oly módon, hogy 2 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligázzal 10 pl, 0,6 mmól adenozin-trifoszfátot tartalmazó ligáz-pufferban 12,5°C hőmérsékleten, 16 órán át tartó reakcióval. 3 pl ligációs eleggyel E. coli JA221 (NRRL B-15014) törzset transzformálunk, és az ampicillinre rezisztens transzformánsokból izolált egyik plazmid szerkezetét a 11. ábra 128 jellel jelölt helyén mutatjuk be. A plazmid HindlII hasítási helyet nem tartalmaz, és pKEN033 sorszámmal jelöljük.

A 11. ábra 129 számmal jelölt helyén, és részletesebben, a 12. ábrán bemutatjuk, hogy a pKEN033 plazmid dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciáját az EcoRI és BamHI restrikciós helyek között elhelyezkedő HindlII hasítási hely előállítására módosítjuk. Ügy járunk el, hogy 5 pg pKEN033 plazmid dezoxiribonukleinsavat (dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciáját lásd a 12. ábra a. helyén) kezelünk 50pl BamHI pufferban, 37°C hőmérsékleten, 1 órán át. A reakcióelegyet a BamHI enzim inaktiválására 10 percen át 60°C hőmérsékleten tartjuk, majd a linearizált dezoxi-ribonukleinsav-fragmenseket 10 egység EcoRI enzimmel tovább hasítjuk 100 pl EcoRI pufferban, 37°C hőmérsékleten, 1 órán át tartó reakció során (lásd a 12. ábra b. helyét). Fenolos extrakciót és etanolos kicsapást kővetően a kapott 3,6 pg-nyi mennyiségű dezoxi-ribonukleinsavakat 3 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav-polímerázzal (Bethesda Research Laboratories) kezeljük, 20 pl alábbi összetételű reakcióelegyben:

mmól trisz-hidrogén-klorid, pH=8,0,

100 mmól kálium-klorid, mmól magnézium-klorid, mmól ditio-treitol, literenként.

(Ezt a reakcióelegyet a továbbiakban polimeráz-puffernak nevezzük.)

A reakcióelegyhez 0,1 mmól/1 dATP-t, dGTP-t, dCTP-t és dTTP-t adunk. A reakciót 45 percen át végezzük 12,5°C hőmérsékleten. A reakció során a BamHI és az EcoRI kohézív végeket, ahogy azt a 12. ábra c. részén látjuk, feltöltjük.

A dezoxi-rroonukleinsavak izolálását követően 300 pikomól foszforilezett HindlII linkért adagolunk, majd tompa-végligációt végzünk 4 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligázzal, 15 pl ligáz-pufferban, amelyhez 0,6 mmól/1 adenozin-trifoszfátot adunk. A reakciót 12,5°C hőmérsékleten, 16 órán át végezzük. Ezután 100 pl HindlII pufferral hígítjuk a reakcióelegyet, és 100 egység HindlII restrikciós enzimmel hasítunk. A reakcióelegyet 1 órán át 37°C hőmérsékleten inkubáljuk, a feles linker molekulák eltávolítására, és HindlII kohézív végek előállítására (lásd 12. ábra, d. pont), ezeket később összekapcsoljuk; ezzel újra körré zárjuk a plazmid dezoxi-ribonukleinsavakat. A körré-zárást 0,8 pg dezoxi-ribonukleinsavval és 0,4 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligázzal

-18197937 végezzük, 20 μΐ 0,4 mmól/l adenozin-trifoszfátot tartalmazó ligáz-pufferban, 12,5°C hőmérsékleten, 7 órán át. A ligációs eleggyel E. coli JA221 (NRRL B-15014) törzset transzformálunk, az ampicillin-rezisztens telepekből izoláljuk a plazmid dezoxi-ribonukleinsavat, ezek közül az egyiknek a szerkezetét all. ábra 130 jellel jelölt részén adjuk meg. A plazmidot pKEN037 jellel jelöljük. A pKEN037 plazmid dezoxi-ribonukleinsav nukleotid-szekvenciájának analízisekor kiderült, hogy a 12. ábrán megadott dezoxi-ribonukleinsav-szekvencia az érvényes (e. rész), kiderül az is, hogy egy G-C-pár kiesett a HindlII és BamHI hasítási helyek között (ennek oka jelenleg nem ismert), és bizonyítottnak tekinthetjük, hogy a pKÉN037 a konstitutív A-l klónozó hordozóval azonos.

7) A pKEN039 és a pKEN040 plazmidok előállítása

A pKEN037 plazmidba beépített dezoxi-ribonukleinsav-fragmensek leolvasási fázisától különböző termékek előállítására az A-2 és az A-3 lpp gén klónozó hordozókat állítjuk elő, oly módon, hogy a pKEN030 leolvasási fázisát az EcoRI hasítási helyre helyezzük át. A 13. és 14. ábra a. részén szemléltetjük a pKENl 11-ben lévő prolipoprotein transzlációs iniciációs helyét környező dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciákat. Ahogy az látszik is, ez a szekvencia a +45 és +46 pozíciókban egy Alul hasítási helyet tartalmaz. A pKEN008 plazmid előállítására egy EcoRI linkért kötünk az Alul véghez, amiután megkapjuk a 13. és 14. ábrák b. részén szemléltetett dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciát a pKEN008, a pKENOlO, és a pKEN021, illetve pKEN030 plazmidokban. A +47 és +48 pozíciók között egy EcoRI hasítási helyet állítunk elő. A pKEN030 dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciáját az EcoRI helynél módosítjuk, ahogy azt a 13. és 14. ábra c. részén jelöljük, aminek eredményeképpen a leolvasási fázist egy, illetve két bázissal módosítjuk.

Ügy járunk el, hogy az A-2 leolvasási fázisú plazmid előállítására 5 pg pKEN030 plazmid dezoxi-ribonukleinsavat EcoRI restrikciós enzimmel teljesen emésztünk 100 pl EcoRI pufferban, 37°C hőmérsékleten, 60 percen át tartó reakció során. Fenolos extrakciót és etanolos kicsapást követően a dezoxi-ribonukleinsavakat 3 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav-polimerázzal kezeljük, 30 pl polimeráz-pufferban, 0,1 mmól/l dGTP és 0,1 mmól/l dAIP jelenlétében, 12,5°C hőmérsékleten, 45 percen át. A reakció leállítására 25 mmól végkoncentrációban etilén-diamin-tetraecetsavat adagolunk, majd fenollal extrahálunk. Az eljárás során a négy bázisból álló EcoRI ragadós vég fele két adeninnel feltöitődik. A megmaradó két egyszálú adenincsoportot SÍ nukleázzal eltávolítjuk, 200 pl SÍ-pufferban, 20°C-on 1 órán át végzett reakcióval. A reakció leállítására 20 pl, 0,5 mólos trisz-hidrogén-kloridot (pH=8,0) és 20 pl,

0,25 mólos etilén-diamin-tetraecetsavat adagolunk. Az elegyet fenollal extraháljuk, és egy éjszakán át 0,01 X SSC-vel szemben dializáljuk. A dezoxi-ribonukleinsavakat 2,5 térfogat etanollal kicsapjuk, centrifugáljuk és 100 pl, 0,3 mólos nátrium-acetátban szuszpendáljuk. Az oldott dezoxi-ribonukleinsavakat 250 pl etanollal újra kicsapjuk, centrifugáljuk és csökkentett nyomású térben szárítjuk.

Az EcoRI hasítási hely visszaállítására

I pg SÍ-kezelt dezoxi-ribonukleinsavat először 70 pikomól foszforilezett EcoRI linkerrel keverünk, és 3,2 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligázzal tompa-végligációt végzünk

II pl, 0,6 mmól/l adenozin-trifoszfátot tartalmazó ligáz-pufferban 16 órán át 12,5°C hőmérsékleten. Az elegyet 50 pl-re hígítjuk EcoRI-pufferral, és 10 percen át 60°C hőmérsékleten tartjuk. 20 egység EcoRI restrikciós endonukleázt adagolunk, és az elegyet 1 órán át 37°C hőmérsékleten inkubáljuk, a felesleges linker molekulák eltávolítására, és EcoRI kohézív végek előállítására. Ezután fenollal extraháljuk a reakcióelegyet, és a dezoxi-ribonukleinsavakat etanollal kicsapjuk. 0,5 pg plazmid dezoxi-ribonukleinsavat újra körré zárunk oly módon, hogy 0,8 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligázzal . kezeljük, 15 pl, 0,4 mmól/l adenozin-trifoszfátot tartalmazó ligáz-pufferban, 12,5°C hőmérsékleten, 7 órán át. 8 pl ligációs eleggyel E. coli JA221 (NRRL B-15014) törzset transzformálunk. Három ampicillin-rezisztens transzformánsból izoláljuk a plazmid dezoxi-ribonukleinsavat, az izolálás előtt a sejteket egy éjszakán át 10 ml L-táptalajban tenyésztjük, amelyhez ml-enként 50 pg ampicillint adunk. A dezoxi-ribonukleinsav EcoRI hasítási helyének dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciáját megállapítjuk. Az egyiknek a szekvenciáját a 13. ábra c. részén mutatjuk be, ezt pKEN024 sorszámmal jelöljük (A-2).

Az A-3 leolvasási fázisban lévő plazmid előállítására 5pg pKEN030 plazmid dezoxi-ribonukleinsavat teljesen emésztünk EcoRI restrikciós enzimmel, 100 pl EcoRI pufferral készült reakcióelegyben, 37°C hőmérsékleten, 60 percen át. Fenolos extrakciót és etanolos kicsapást követően az EcoRI ragadós végeket eltávolítjuk oly módon, hogy 4,4 pg dezoxi-ribonukleinsavat 500 egység Sl-nukleázzal kezelünk, 150 pl Sl-pufferban, 20°C hőmérsékleten, 1 órán át. A reakciót 15 pl, 0,5 mólos trisz-hidrogén-klorid (pH= =8,0) és 15 pl, 0,25 mólos etilén-diamin-tetraecetsav adagolásával állítjuk le. Fenollal extraháljuk az elegyet, és 4 órán át 0,01 X SSC-vel szemben (lásd előbb) dializáljuk. A dezoxi-ribonukleinsavat 2,5 térfogat etanollal kicsapjuk, centrifugáljuk, és 100 pl, 0,3 mólos nátrium-acetátban újra szuszpendáljuk. A dezoxi-ribonukleinsavakat ezután 250 pl etanollal újra kicsapjuk, centrifugáljuk, és csökkentett nyomású térben szárítjuk.

-19197937

Az EcoRI hasítási hely visszaállítására 1 pg SÍ-kezelt dezoxi-ribonukleinsavat először 240 pikomól foszforilezett EcoRI linkerrel keverünk, és tompa-végligációt végzünk 4 egység T4-dezoxi-ribonukleinsav-ligázzal, pl, 0,6 mmól adenozin-trifoszfátot tartalmazó ligáz-pufferban, 12,5°C hőmérsékleten, órán át. Az elegyet ezután 250 pl-re hígítjuk EcoRI-puffer adagolásával, és 10 percen át 60°C hőmérsékleten tartjuk. 100 egység EcoRI restrikciós endonukleázt adagolunk és 1 órán át 37°C hőmérsékleten inkubáljuk a reakcióelegyet, a fölösleges linker molekulák eltávolítására, és EcoRI kohézív végek előállítására. Fenollal extraháljuk a reakcióelegyet és a dezoxi-ribonukleinsavat etanollal kicsapjuk. 0,3 pg plazmid dezoxi-ribonukleinsavat újra körré zárunk oly módon, hogy 0,8 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligázzal kezeljük 15 pl, 0,4 mmól/1 adenozin-trifoszfátot tartalmazó ligáz-pufferban, 12,5°C hőmérsékleten, 7 órán át. 8 pl ligációs eleggyel E. coli JA221 (NRRL B-15014) törzset transzformálunk. Egy éjszakán át 100 ml, 50 pg/ml ampicillint tartalmazó L-táptalajban tenyésztünk három, ampicillinre rezisztens transzformánst, és izoláljuk a plazmid dezoxi-ribonukleinsavat. Meghatározzuk az EcoRI hasítási helyek dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciáját. Ezek egyikének bázis-sorrendjét a 14. ábra c. részén mutatjuk be, a plazmidot pKEN036 (A-3) jellel jelöljük.

A pKEN037 (A-l) transzlációs leolvasási fázisát a másik két leolvasási fázissá A-2 és A-3 változtatására a pKEN037 kisebb Xbal-EcoRI fragmensét a kisebb, a pKEN024 (A-2) vagy a pKEN036 (A-3) Xbal-EcoRI fragmensével cseréljük ki, ahogy azt a 15. ábrán bemutatjuk. Úgy járunk el, hogy 3 pg pKEN037 plazmidot először (ahogy azt a

15. ábra 131 helyén bemutatjuk) 6 egység Xbal restrikciós enzimmel kezeljük, 50 pl BamHI-pufferban, 37°C hőmérsékleten, 1 órán át. Az Xbal enzim inaktiválását követően a linearizált dezoxi-ribonukleinsav-fragmenseket 6 egység EcoRI restrikciós enzimmel hasítjuk, 100 pl EcoRI-pufferban, 37°C hőmérsékleten, 1 órán át tartó reakció során. Agaróz gél-elektroforézissel izoláljuk a nagyobb Xbal-EcoRI fragmenst a kisebbtől. Az agaróz gélen lévő dezoxi-ribonukleinsav-fragmenseket 1 pg/ml etidium-bromiddal festjük, és a nagy fragmensnek megfelelő csíkot kihasítjuk. Fagyasztást követően eluáljuk ezt a csíkot a gélről. A dezoxi-ribonukleinsav-fragmensekről az etidium-bromidot fenolos extrakcióval távolítjuk el, és a dezoxi-ribonukleinsavakat etanolos kicsapással izoláljuk.

A szárított dezoxi-ribonukleinsav-fragmenseket 20 pl vízben oldjuk, és 1 pl alikvot pKEN037 dezoxi-ribonukleinsav-f ragmeris-keveréket egyesítünk 0,1—0,1 pg kisméretű, a pKEN024 vagy a pKEN036 plazmidokból származó Xbal-EcoRI restrikciós fragmensekkel (lásd a 15. ábra 132 helyét). Eze20 két a fragmenseket az adott plazmidból Xbal és EcoRI kettős restrikciós enzimes kezeléssel, majd géltisztítással állítjuk elő, ahogy azt a 15. ábra 133 jellel jelölt helyén látjuk. Az Xbal-EcoRI fragmensek ragadós végeit 0,2 egység T4 dezoxi-ribonukleinsavligázzal kapcsoljuk. Á reakciót 20 pl, 0,4 mmól/1 adenozin-trifoszfátot tartalmazó ligáz-pufferban végezzük, 12,5°C hőmérsékleten, 7 órán át. A ligációs eleggyel E. coli JA221 (NRRL B-15014) törzset transzformálunk. Az ampicillinre rezisztens transzformánsok között olyan telepeket találunk, amelyek plazmid dezoxi-ribonukleinsava Á-2 és Á-3 leolvasási fázissal rendelkezik, ezeket, sorrendben pKEN039 és pKEN040 jellel jelöljük. Szerkezetüket a 15. ábra 134 helyén mutatjuk be.

Az előzőekben ismertetett kísérleteket a pKEN039 (A-2) és a pKEN040 (A-3) első esetben való előállítására végeztük. A szakemberek számára azonban érthető, hogy ezen plazmidok előállítására más módszereket is használhatunk. így például a pKEN037 (A-l) plazmid EcoRI hasítási helyének szomszédságában lévő dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciát magát is módosíthatjuk a 13. ábra b. és c. vagy a 14. ábra b. és c. helyén megadottak szerint eljárva, amiután megkapjuk a pKEN039 (A-2) vagy a pKEN040 (A-3) plazmidokat.

B) A B-típusú plazmidok (pIN-I) előállítása

A 16—21. ábrákon sematikusan szemléltetjük azoknak a rekombináns plazmidoknak az előállítását, amelyek a B-beépítési helyet tartalmazzák. Az ábrákat az alábbiakkal öszszevetve kell vizsgálni.

1) A pKEN221 plazmid előállítása

A B-helyet tartalmazó kifejeződő plazmidok előállításának első lépéseként egy olyan plazmidot állítunk elő, amely tartalmazza az lpp gén fragmenseket, mégpedig úgy, hogy az rendelkezzen egy restrikciós hasítási helylyel a szignál peptid hasítási helyén, vagy annak közelében. A kiválasztott gén a Serratia marcescens lipoproteint határozza meg, és a szignál peptid 3’-végén egy Fnu4H-I restrikciós endonukleáz által felismerhető helyet hordoz. Az S. marcescens lpp gént felvevő plazmidként a pBR322 plazmidot választottuk.

Ahogy azt á 16. ábra 135 jellel jelölt részén látjuk, 2 pg pBR322 plazmid dezoxi-ribonukleinsavat 2 egység BamHI restrikciós endonukleájzzal teljesen emésztünk 50 μΐ BamHI-pufferban, 37°C hőmérsékleten, 60 percen át. A BamHI enzim inaktiválására a reakcióelegyet 10 percen át 60°C hőmérsékleten tartjuk, majd 2 egység EcoRI-t és 100 μΐ EcoRI-puffert adagolunk. 60 percen át 37°C hőmérsékleten inkubáljuk a reakcióelegyet, majd a reakció leállítására fenolos extrakciót végzünk. A linearizált dezoxi-ribonukleinsav-fragmenseket etanolos kicsapással izoláljuk.

-20197937

Közben egy 8,5 kb nagyságú, az S. marcescens Ipp gént hordozó dezoxi-ribonukleinsav-fragmenst izolálunk (lásd a 16. ábra 136 helyét) egy lambda hibrid tágból, amely hordozza az S. marcescens lpp gént. (lambda lppSm-1.) Az lpp gént előzőleg egy lambda tág vektorba a Charon 14-be klónozták [Blattner és munkatársai, Science, 196, 161 — 169 (1977)]. Az alábbiak szerint járunk el:

Az S. marcescens-ből izolált össz-DNS 200 pg-ját 200 egység EcoRI restrikciós enzimmel kezeljük. A dezoxi-ribonukleinsav-fragmenseket preparatív agaróz gélen különítjük el, és az 5’-32P-lipoprotein mRNS molekulával pozitív hibridizációt mutató, 8,5 kb nagyságú dezoxi-ribonukleinsav-fragmenseket tartalmazó frakciókat összegyűjtjük. A hibridizációt Southern-hibridizációs módszerrel végezzük. A 8,5 kb nagyságú EcoRI fragmenseket (körülbelül 20-szorosra sűrítve) és az EcoRI enzimmel hasított Charon 14 vektor dezoxi-ribonukleinsavat T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligázzal kapcsoljuk. A ligáit dezoxi-ribonukleinsavval E. coli K802 (NRRL B-15016) törzset fertőzünk. Az lpp gént hordozó rekombináns tagokat plakk-hibridizációs technikával választjuk ki [Benton és Davis módszerével, 5’-P³²-lipoprotein mRNS-t használva] . Egy pozitív hibridizációt adó plakk-ot lambda lppSm-1 jellel jelölünk.

Két pg lambda lppSm-1 dezoxi-ribonukleinsavat ezután BamHI és EcoRI restrikciós enzimekkel teljesen kezelünk a fentiekben a pBR322 linearizálásakor megadottak szerint eljárva. 0,5 pg lambda lppSm-1 dezoxi-ribonukleinsav-fragmenst 0,5 pg előzőleg linearizált pBR322 dezoxi-ribonukleinsavval keverünk 40 pl ligáz-pufferban. Az elegyet 5 percen át 37°C hőmérsékleten tartjuk, és az EcoRI és BamHI kohézív végeket 16 órán át 4°C hőmérsékleten, és 1 órán át 0°C hőmérsékleten át tartó kezeléssel kapcsoljuk. 0,4 mmól végkoncentrációban adenozin-trifoszfátot és 0,4 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligázt adagolunk, majd az elegyet 7 órán át 12,5°C hőmérsékleten inkubáljuk.

A ligációs elegy negyed részével ezután E. coli lpp deléciós mutáns JE5527 jelű (NRRL B-l5012) törzset transzformálunk. A transzformációt Cohen és munkatársai szerint végezzük [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69, 2110—2114 (1972)]. Az ampicillin-rezisztens transzformánsokat egy éjszakán át Whatman 3MM szűrőpapíron növesztjük, L-táptalajt tartalmazó agar felületére helyezzük a szűrőpapírokat, az agarba ml-enként 50 pg ampicillint adunk. Telep-hibridizációval vizsgáljuk az lpp kiónokat. Lpp gént tartalmazó, a lambda IppEc-1-ből származó, 0,95 kb nagyságú Mspl fragmens nick-transzlatálódott az [α-P³²] dATP és az [a-P³²]dCTP molekulákhoz, a kísérletet Maniatis és munkatársai szerint végeztük [Proc. Natl. Acad. Sci., USA. 72, 1184 — 1188 (1975)]. Ezt használtuk P³²-próbaként. Egy pozitív hibridizációt mutató transzformáns tartalmazta a 16. ábra 137 helyén jelzett szerkezetű plazmidot, ezt pKEN221 jellel jelöljük.

2) A pKEN009 plazmid előállítása

A B-helyet tartalmazó klónozó hordozók előállítására az lpp promotert és az 5’-nem transzlatált szakaszt, továbbá az S. marcescens lpp gént (ezt a fragmenst sematikusan az 5. ábra 105B helyén mutatjuk bé) tartalmazó, 329 bázispárból álló Feu4H-I fragmensét először a 17. ábra 138 helyén megadottak szerint eljárva, a pKEN005 plazmidba klónozzuk, az alábbiak szerint:

pg pKEN221 plazmid dezoxi-ribonukleinsavat 100 egység Fnu4H-I restrikciós endonukleázzal (New England Biolabs.) teljesen emésztünk, 400 pg HaelII pufferban, majd a kapott 324 bázispárból álló Fnu4H-I fragmenst akrilamid gél-elektroforézissel tisztítjuk.

Mivel a Fnu4H-I restrikciós enzimmel végzett emésztés után mindkét végen ragadós végű fragmensek keletkeznek, ezeket a végeket T4 dezoxi-ribonukleinsav-polimerázzal tompa végekké töltjük fel. 2 pg tisztított, 324 bázispárból álló Fnu4H-I fragmenst 3 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav-polimerázzal kezelünk, 20 pl polimeráz-pufferban, 0,1 — 0,1 mmól dATP, dGTP, dCTP és dTTP jelenlétében, 12,5°C hőmérsékleten, 45 percen át. Fenollal extraháljuk az elegyet, és etanollal kicsapjuk a dezoxi-ribonukleinsav-fragmenseket, majd ezeket 400 pikomól foszforilezett EcoRI linkerrel keverjük, és 4 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligázzal egészítjük ki a 20 pl térfogatú ligáz-pufferral készült reakcióelegyet, amelyhez 0,6 mmól adenozin-trifoszfátot is adunk. A reakciót 12,5°C hőmérsékleten végezzük, 16 órán át. 300 pi-re egészítjük ki az elegy térfogatát EcoRI-pufferral, és EcoRI kohézív végek előállítására 150 egység EcoRI restrikciós enzimmel emésztünk.

pg EcoRI enzimmel emésztett fragmenst keverünk 0,5 pg EcoRl-emésztett pKEN005 plazmid dezoxi-ribonukleinsavval, és az elegyhez 0,4 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligázt adunk, 40 pl, 0,6 mmól adenozin-trifoszfátot tartalmazó ligáz-pufferban. A reakciót 12,5°C hőmérsékleten végezzük, 16 órán át. 20 pl ligációs eleggyel E. coli JE5519 (NRRL B-15013) törzset transzformálunk. A tetraciklinre rezisztens transzformánsokból gyors alkalikus-denaturációs módszerrel izoláljuk a plazmid dezoxi-ribonukleinsavat, és restrikciós enzimmel analízist végzünk. Az egyik plazmid hordoz egy 334 bázispárból álló, a 329 bázispárból álló Fnu4H-I fragmensből' származó EcoRI fragmenst. Ezt a plazmidot pKEN009 jellel jelöljük, és a 17. ábra 139 helyén mutatjuk be. A pKEN009 plazmid dezoxi-ribonukleinsavának nukleotid-szekvencia-analíziséből kiderül, hogy a pKEN009 EcoRI helye a B-beépítési helyhez kerül, és megfelel a B-l leolvasási fázisnak. A plazmid dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciáját a 19.

-21197937 és 20. ábra b. részén mutatjuk be. Jelenleg nem érthető miért, de úgy találtuk, hogy a +90 pozícióba három extra bázispár épült be, (így egy extra aminosav bioszintézise van itt meghatározva), továbbá egy extra G-C bázispár található a +99 pozícióban. Ezen változások meglepő kumulatív hatásaként az S. marcescens lpp gén szignál peptidjének hasítási helyét meghatározó szakasz aminosav-szekvenciája átalakult az E. coli lpp génnek megfelelő szakasszá.

3) A pKEN017, a pKEN026 és a pKEN027 plazmidok előállítása

A B-2 és a B-3 leolvasási mintának megfelelő B-helyet tartalmazó kifejeződő plazmidok előállítására először elimináljuk a két EcoRI hasítási helyet a pKEN009 plazmidból. A 18. ábrán sematikusan ábrázoljuk az lpp promotertől balra eső EcoRI hely eltávolításának stratégiáját. Az eljárás során egy 80 bázispárból álló Xbal-EcoRI fragmenst (ez tartalmazza az S. marcescens lpp gén szignál peptidjét és az 5’-nem transzlatált szakasz egy részét) átépítjük a pKEN009-ből a pKENOlO Xbal-EcoRI helyére.

Ügy járunk el, hogy 5 pg pKENOlO plazmid dezoxi-ribonukleinsavat 5 egység BxaI restrikciós endonukleázzal emésztünk 50 pl BamHI-pufferban, majd ezt követően 100 pl EcoRI-pufferban 5 egység EcoRI restrikciós enzimmel hasítunk. A linearizált dezoxi-ribonukleinsavat ezután 5 pl BAP-vel kezeljük, 100 pl alábbi összetételű reakcióelegyben:

mmól trisz-hidrogén-klorid, pH+8,0, és 0,1 mmól etilén-diamin-tetraecetsaV literenként.

A reakciót 30 percen át 37°C hőmérsékleten végezzük. A plazmid dezoxi-ribonukleinsavat fenollal extraháljuk, és etanollal kicsapjuk, majd 0,5 pg dezoxi-ribonukleinsavat 0,2 pg, 80 bázispárból álló Xbal-EcoRI fragmenssel keverünk, ez utóbbit úgy kapjuk, hogy 50 pg pKEN009 plazmid dezoxi-ribonukleinsavat EcoRI és Xbal restrikciós enzimekkel kezelünk, és poliakril-amid gél-elektroforézist végzünk. A dezoxi-ribonukleinsav-keveréket ezután 0,4 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligázzal kezeljük, 40 pl ligáz-pufferban, amelyhez 0,4 mmól/l adenozin-trifoszfátot adunk. A reakciót 16 órán át végezzük 12,5°C hőmérsékleten. 20 pl ligációs eleggyel E. coli JE5519 (NRRL B-15013) törzset transzformálunk. Az ampicillin-rezisztens transzformánsokból a gyors alkalikus-denaturációs módszerrel kapott plazmid dezoxi-ribonukleinsavak restrikciós enzim-analízise szerint az egyik plazmid hordozza a kívánt 80 bázispárból álló, és az S. marcescens lpp gén szignál pepiid szakaszát B-l leolvasási fázisban hordozó Xbal-EcoRI fragmenst, ahogy azt a 18. ábra 140 jellel jelölt részén látjuk. Ezt a plazmidot pKEN017 jellel jelöljük.

A pKEN017 plazmidban lévő B-beépítési hely leolvasási fázisát ezután módosítjuk olyan plazmidok előállítására, amelyekben B-2 és B-3 a leolvasás módja, mégpedig az előzőekben az A-l leolvasás A-2 vagy A-3 leolvasássá alakítás módszere szerint eljárva. Ezt a módszert sematikusan a 18. ábra 141 és 142 helyén ábrázoljuk. Az EcoRI hasítási hely körül elhelyezkedő dezoxi-ribonukleinsav-szekvencia megfelelő módosításait a 19. és 20. ábrákon mutatjuk be. Érthető, hogy hasonló módszereket használunk a pKEN024 (A-2) és a pKEN036 (A-3) előállítására a pKEN030 (A-l) plazmidból kiindulva. A 13. és 14. ábrákon megadottak szerint eljárva állítjuk elő a pKEN017 (B-l) plazmidból a pKEN026 (B-3) és a pKEN027 (B-3) plazmidokat.

4) A pKEN041, a pKEN047 és a pKEN048 plazmidok előállítása A 21. ábrán sematikusan szemléltetjük a B-helyet hordozó klónozó molekulák előállításának utolsó lépését, amelynek során a pKEN037 Xbal-EcoRI A-helyet hordozó fragmensét kicseréljük a pKEN017, pKEN026 és a pKEN027 plazmidok három különböző, Xbal-EcoRI B-helyet hordozó fragmenseivel. Erre azért van szükség, hogy a B-helyet tartalmazó plazmidokba a külső dezoxi-ribonukleinsav beépítésére alkalmas helyen hasonló EcoRI, HindlII és BamHI restrikciós enzim felismerő szekvenciákat biztosítsunk,-mint az A-helyet hordozó plazmidokban. Ahogy azt a

21. ábra 143 jellel jelölt részén sematikusan szemléltetjük, a pKEN017, a pKEN026 és a pKEN027 plazmidokból származó három B-helyet tartalmazó fragmens mindegyike tartalmazza az S. marcescens lpp gén Fnu4H-I fragmenséből származó szignál peptidet meghatározó dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciát.

Ügy járunk el, mint ahogy a 15. ábra kapcsán megadtuk, a pKEN037 plazmid nagyobb Xbal-EcoRI fragmensének előállítását.

μΐ pKEN037 dezoxi-ribonukleinsav-fragmens-keveréket egyesítünk a pKEN017, a pKEN026 és a pKEN027 plazmidokból előállított 0,1 pg mennyiségű, különböző Xbal-EcoRI kis fragmenssel. A kis fragmenseket Xbal és EcoRI restrikciós enzimekkel való kettős emésztéssel és az ezt követő géltisztítással állítjuk elő. A dezoxi-ribonukleinsav-keveréket 0,2 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligázzal kezeljük 20 μΐ, 0,4 mmól/l adenozin-trifoszfátot tartalmazó ligáz-pufferban, 12,5°C hőmérsékleten, 16 órán át. A ligációs elegyek mindegyikének 10 μΐ-ével E. coli JA221 (NRRL B-15014) törzset transzformálunk. Az ampicillin-rezisztens transzformánsok között a B-l, B-2 és B-3 leolvasási fázisban lévő plazmid dezoxi-ribonukleinsavakat tisztítjuk, és ezeket sorrendben PKEN041, pKEN047 és pKEN048 jellel jelöljük, szerkezetűket a 21. 'ábra 144 helyén adjuk meg.

C) A C-hellyel rendelkező plazmidok (pIN-I) előállítása

-22197937

A 22—26. ábrákon sematikusan szemléltetjük a C beépítési hellyel rendelkező rekombináns plazmidok előállításának módját, az ábrákat az alábbi, részletes leírással kell összevetnünk.

1) A pKEN006 plazmid előállítása

A C hellyel rendelkező klónozó hordozók előállítására a pKEN005 plazmidba a 22. ábra 145 helyen jelölt része szerint eljárva klónozzuk a 193 bázispárból álló, az lpp promotert tartalmazó Sau3A fragmenst és az 5’-nem transzlatált régiót, továbbá az E. coli lpp gén szignál peptid szakaszát és az első 8 struktúr kodont (ezt a fragmenst az 5. ábra 105C helyén ábrázoljuk). Ügy járunk el, hogy 200 pg pKENI 11 plazmid dezoxi-ribonukleinsavat, amit ismert módon az E. coli CC620/pKENl 11 (NRRL B-15011) törzsből állítunk elő, teljesen emésztünk 200 egység Sau3A restrikciós endonukleázzal, 400 μΐ alábbi összetételű reakcióelegyben:

mmól trisz-hidrogén-klorid, pH=7,5, 10 mmól magnézium-klorid, mmól nátrium-klorid literenként, és

100 pg/ml borjú szérum albumin.

A reakciót 1 órán át végezzük, 37°C hőmérsékleten. Az emésztés teljessé-válását követően fenolos extrakciót végzünk, a dezoxi-ribonukleinsavat etanolos kicsapással különítjük el, és a 193 bázispárból álló Sau3A fragmenst akrilamid gél-elektroforézissel tisztítjuk.

Mivel az Sau3A restrikciós enzimmel való kezeléskor ragadós végek keletkeznek mindkét végen, ezeket a végeket tompa végű molekulák előállítására T4 dezoxiribonukleinsav-polimerázzal feltöltjük. A 2 pg tisztított, 193 bázispárból álló Sau3A fragmenst 3 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav-polimerázzal kezelünk, 20 pl polimeráz-pufferban, amelyhez 0,1-0,1 mmól/1 dATP, dGTP, dCTP és dTTP vegyületet adunk. A reakciót 12,5°C hőmérsékleten végezzük, 45 percen át. Fenollal extraháljuk az elegyet és etanollal kicsapjuk, a kapott dezoxi-ribonukleinsav-fragmensekét 400 pikomól foszforilezett EcoRI linkerrel keverjük és 4 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligázzal kapcsolunk 20 pl, 0,6 mmól/ /1 adenozin-trifoszfátot tartalmazó ligáz-pufferban, 12,5°C hőmérsékleten, 16 órán át. 300 μΙ-re hígítjuk az elegyet EcoRI-pufferral, és 150 egység EcoRI restrikciós enzimmel emésztünk EcoRI kohézív végek előállítására.

pg EcoRI enzimmel emésztett fragmenst 0,5 pg EcoRI enzimmel emésztett pKEN005 plazmid dezoxi-ribonukleinsavval keverünk, és a keverékhez 0,4 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligázt adunk 40 pl ligáz-pufferban, amelyhez 0,6 mmól/1 adenozin-trifoszfátot adunk. A reakciót 16 órán át végezzük 12,5°C hőmérsékleten. 20 pl ligációs eleggyel E. coli JE5519 (NRRL B-15013) sejteket transzformálunk. A tetraciklinre rezisztens transzformánsokból gyors alkalikus-denatu44 rációs módszerrel izolált plazmid dezoxi-ribonukleinsavak restrikciós enzimmel végzett analízise szerint a plazmidok egyike a 193 bázispárból álló Sau3A fragmensbői származó EcoRI fragmenst hordoz. Ezt a plazmidot a 22. ábra 146 helyén mutatjuk be, és PKEN006 jellel jelöljük. A pKEN006 plazmid dezoxi-ribonukleinsavának nukleotid-szekvencia-analízise szerint a pKEN006 EcoRI a C beépítési helynél helyezkedik el, és megfelel a C-l leolvasási sablonnak.

2) A pKEN007, pKEN019 és pKEN046 plazmidok előállítása

A C-2 és a C-3 leolvasási mintának megfelelő C-helyet tartalmazó kifejeződő plazmidok előállítására először eliminálnunk kell a pKENOOö két EcoRI hasítási helye közül az egyiket. A 23. ábrán sematikusan ábrázoljuk az lpp promotertől balra eső EcoRI hely eltávolításának stratégiáját.

Az eljárás során a pKEN006 plazmidból egy 106 bázispárból álló Xbal-EcoRI fragmenst, (ez a fragmens tartalmazza a szignál pepiidet, az 5’-nem transzlatált régió egy részét és az E. coli lpp gén strukturgén-szekvenciájának egy szakaszát) átjuttatjuk a pKENOlO plazmid Xbal-EcoRI helyére.

Ügy járunk el, hogy 5 pg pKENOlO plazmid dezoxi-ribonukleinsavat először 5 egység Xbal restrikciós endonukleázzal kezelünk, 50 pl BamHI-pufferban, majd az emésztést 5 egység EcoRI restrikciós enzimmel 100 pl EcoRI-pufferban megismételjük. A linearizált dezoxi-ribonukleinsavat ezután 5 pl BAP-vel kezeljük 100 pl alábbi összetételű reakcióelegyben:

mmól trisz-hidrogén-klorid, pH=8,0 és

0,1 mmól etilén-diamin-tetraecetsav, literenként

A reakciót 30 percen át végezzük 37°C hőmérsékleten. A plazmid dezoxi-ribonukleinsavat fenollal extraháljuk és etanollal kicsapjuk, majd 0,5 pg dezoxi-ribonukleinsavat 0,2 pg, 106 bázispárból álló Xbal-EcoRI fragmenssel keverünk, amely utóbbit előzőleg állítottunk elő a pKEN006 plazmid dezoxi-ribonukleinsav 50 pg-jából EcoRI és Xbal restrikciós enzimekkel történő kezeléssel, majd az ezt követő poliakril-amid gél-elektroforézissel. A dezoxi-ribonukleinsav keveréket 0,4 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligázzal kapcsoljuk 40 pl, 0,4 mmól/1 adenozin-trifoszfátot tartalmazó ligáz-pufferban. A reakciót 12,5°C hőmérsékleten végezzük, 7 órán át. 20 pl ligációs eleggyel E. coli JE5519 (NRRL B-15013) törzset transzformálunk. Az ampicillin-rezisztens transzformánsokból gyors alkalikus-denaturációs módszerrel kapott plazmid dezoxi-ribonukleinsavak restrikciós enzim analízise szerint egy plazmid tartalmazza C-l leolvasási sémában az E. coli lpp gén szignál peptid szakaszát hordozó, 106 bázispárból álló Xbal-EcoRI fragmenst. Ezt a 23. ábra 147. helyén mutatjuk be, a plazmidot ΡΚΕΝ007 jellel jelöljük.

-23197937

A pKEN007 plazmid C-beépítési helyének leolvasási sémáját ezután C-2 és C-3 leolvasási sémákat tartalmazó plazmidok előállítására módosítjuk, oly módon, ahogy az előzőekben megadtuk az A-l leolvasási fázis A-2 vagy A-3 leolvasási fázissá alakítása során. Ezt a folyamatot sematikusan ábrázoljuk a 23. ábra 148 és 149 helyén. Az EcoRI hasítási hely körüli dezoxi-ribonukleinsav-szekvencia megfelelő módosításait a 24. és 25. ábrán adjuk meg. Érthető, hogy hasonló módszert használhatunk a pKEN030 (A-l) plazmidból kiinduló pKEN024 (A-2) és a pKEN036 (A-3) plazmidok előállítására, mint amit a fentiekben a 13. és 14. ábrák kapcsán megadtunk a pKEN007 (C-l) plazmidból kiinduló pKEN046 (C-2) és pKEN019 (C-3) előállításakor.

3) A pKEN042, pKEN043 és pKEN044 plazmidok előállítása

A C-helyet tartalmazó kifejeződő plazmidok előállításának utolsó lépéseként a PKEN007, pKEN046 és pKEN019 C-helyet tartalmazó fragmensek három különböző Xbal-EcoRl szakaszait helyettesítjük a pKEN037 plazmid A-helyet tartalmazó Xbal-EcoRl fragmensével. Ezt a 26. ábrán adjuk meg. A helyettesítést úgy végezzük, hogy a C-helyet tartalmazó plazmidok ugyanazt az EcoRI, HindlII és BamHI restrikciós enzimek által felismert szekvenciákat tartalmazzák a külső dezoxi-ribonukleinsav beépítésére szolgáló helyen, mint amit az A- és B-hellyel rendelkező plazmidok. Ahogy azt a 26. ábra 150 jellel jelölt részén sematikusan ábrázoljuk, a pKEN007, pKEN046 és pKEN019 plazmidokból származó három C-helyet tartalmazó fragmens olyan dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciát hordoz, amely tartalmazza az E. coli lpp gén Sau3A fragmenséből kapott szignál peptid részt.

Ügy járunk el, ahogy a 15. ábra kapcsán leírtuk a pKEN037 nagyobb Xbal-EcoRI fragmensének előállítása kapcsán. 1 μΐ vizes pKEN037 dezoxi-ribonukleinsav-fragmens-keveréket kombinálunk az előzőleg a pKEN007, pKEN046 és pKEN019 plazmidokból előállított, 0,1—0,1 pg-nyi különböző Xbal-EcoRI kisebb fragmensekkel. Ezeket Xbal és EcoRI restrikciós enzimekkel történő kezeléssel és az ezt követő gél-elektroforézises tisztítással kapjuk. Mindegyik dezoxi-ribonukleinsav-keveréket 0,2 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligázzal kezeljük 20 pl, 0,4 mmól/1 adenozin-trifoszfátot tartalmazó ligáz-pufferban, 12,5°C hőmérsékleten 16 órán át. 10—10 μί ligációs eleggyel E. coli JA221 (NRRL B-15014) sejteket transzformálunk. Az ampicillin-rezisztens transzformánsok között olyan plazmid dezoxi-ribonukleinsavakat hordozó sejteket találunk, amelyek C-l, C-2 és C-3 leolvasási sémát hordoznak. A plazmidokat tisztítjuk és pKEN042, pKEN043 és pKEN044 jellel jelöljük. Szerkezetüket a 26. ábra 151 helyén adjuk meg.

D) Az indukálható kifejeződő plN-Il plazmidok előállítása

A 27. ábrán sematikusan ábrázoljuk azt az eljárást, amelynek során előállítjuk az A-beépítési helyet A-l leolvasási fázisban hordozó indukálható plazmid klónozó hordozók (a pKEN037 konstitutív plazmidoknak felel meg) előállítását. Az lac UV5 promoter-operátor a pOP203-3 plazmidból ered (Fullertől kaptuk, Department of Biochemistry and Molecular Biology, Harvard University). A lac UV5 promoter-operátor rendszert az E. coli 4288 recA/pKM006 (NRRL B-15017) törzsből nyerhetjük, a törzset letétbe helyeztük a Northern Régiónál Research La boratory, U.S. Department of Agriculture, Peoria, Illinois, USA, állandó törzsgyűjteményében. A lac UV5 promoter-operátor rendszert a pKEN006 plazmid 95 bázispárból álló Xbal fragmense tartalmazza. A plazmidot az NRLL B-15017 sorszámú törzsből ismert módon izoláljuk, és a 95 bázispárból álló Xbal fragmenst ezután szintén ismert technikákkal különítjük el.

A lac UV5 promoter-operátor rendszert a pKEN037 plazmid Xbal hasítási helyébe építjük be (az lpp gén 5’-nem transzlatált szakaszán belül). Ügy járunk el, hogy 200 pg pOP203-3 plazmid dezoxi-ribonukleinsavat 200 egység Alul restrikciós enzimmel teljesen emésztünk 400 μί HindlII-pufferban, és a 95 bázispárból álló Alul, az lac UV5 promotert és operátort hordozó fragmenst (a 27. ábra 152. helyén diagonális vonalkázott résszel jelöljük) poliakril-amid gél-elektroforézissel tisztítjuk. 1 pg, 95 bázispárból álló Alul fragmenst 400 pikomól foszforilezett Xbal linkerrel (5’-CTCTAGAG-3’; a Collaborative Pesearch terméke, foszforilezését az előzőekben megadottak szerint végezzük) keverünk, és 5 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligázzal tompa-végligációt végzünk 20 pl, 0,6 mmól/1 adenozin-trifoszfátot tartalmazó ligáz-pufferban, 12,5°C hőmérsékleten, 16 órán át. A ligáit elegyet BamHI-pufferral 300 pl térfogatra hígítjuk, és 10 percen át 60°C hőmérsékleten tartjuk. Ezután 100 egység Xbal restrikciós enzimmel kezeljük a keveréket 1 órán át 37°C hőmérsékleten, amiután Xbal kohézív végeket kapunk. Az elegyet fenollal extraháljuk, majd ezt követően etanollal kicsapjuk és fagyasztva szárítjuk. A dezoxi-ribonukleinsav-fragmenseket 10 pl vízben oldjuk, és 0,3 pg így előállított lac fragmenst 0,5 pg pKÉN037 plazmid dezoxi-ribonukleinsavval keverünk, ez utóbbit előzőleg Xbal restrikciós enzimmel hasítjuk. Az elegyet 0,4 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligázzal kezeljük 20 pl, 0,4 mmól/1 adenozin-trifoszfátot tartalmazó ligáz-pufferban, 12,5°C hőmérsékleten, 16 órán át, amikor az Xbal kohézív végek összekapcsolódnak és a plazmid újra körré zárul. 10 pl ligációs eleggyel E. coli JA221/F’-lacl’ (NRRL B-15015) sejteket transzfor-24197937 maiunk, a törzset úgy állítottuk elő, hogy a X90/F’lacI’ lac+pro+törzs (Beckwith-től kaptuk, Department of Biochemistry and Molecular Biology, Harvard University) F’-faktorát bejuttattuk az E. coli JA221 törzsbe 5 (NRRL B-15014). Az E. coli JA221/F’lacl^í törzs a Northern Régiónál Research Laboratory, U.S. Department of Agriculture, Peoria, Illinois, USA, állandó törzsgyűjteményében található meg. Az ampicillin-rezisz- ¹⁰ tens transzformánsokból izolált plazmid dezoxi-ribonukleinsavak (gyors alkalikus-denaturációs módszer) restrikciós enzim-analízise szerint egyikük egy másolat 95 bázispárból álló, a pKEN037 Xbal helyére megfelelő őrien- 15 tációban beépült Alul fragmenst tartalmaz, ahogy azt a 27. ábra 153 jellel jelölt helyén látjuk. A plazmidot pKEN038 jellel jelöljük.

A B- és C-beépítési helyeket tartalmazó, indukálható plazmidok előállításának egy- ²⁰ szerűsítésére először eltávolítjuk a pKEN038 lac promoter-operátor fragmensét körülvevő Xbal hasítási helyek (kettő) egyikét. A lac promoter-operátor fragmenstől balra eső Xbal hasítási hely eltávolítását a 27. ábra 154. jel- 25 lel jelölt helyén mutatjuk be. Ügy járunk el, hogy kihasználjuk azt a tényt, hogy az Xbal linker kötődése a 95 bázispárból álló lac promoter-operátor fragmenshez egy új Sstf hasítási helyet hozott létre a lac promo- 30 tér balra eső végénél, de nem jött létre ilyen hely a jobbra eső végen. Ahogy azt a 27. ábra 155. jellel jelölt részén látjuk, az SstI restrikciós enzim által felismerhető szekvencia átfedi az Xbal enzim szekvenciáját, fgy az 35 SstI hasítási hely 4 bázisból álló ragadós végének Sl nukleázzal való eltávolítása az Xbal felismerési hely egy részét is eltávolítja, ezzel megszűnik az Xbal hasítási szakasz.

Ügy járunk el, hogy 5 pg pKEN038 plaz- 40 mid dezoxi-ribonukleinsavat· 10 egység SstI restrikciós endonukleázzal emésztünk 50 μΐ BamHI-pufferban, és ezután 500 egység Sl nukleázzal kezeljük 200 μΐ Sl pufferban, 20°C-on, 1 órán át. Az Sl-kezelt dezoxi-ribo- ₄₅ nukleinsav 0,5 pg-nyi mennyiségét 5 egység T4 dezoxi-ribönukleinsav-ligázzal kezeljük, pl, 0,6 mmól/1 adenozin-trifoszfátot tartalmazó ligáz-pufferban, a tompa végek kapcsolására. A reakciót 16 órán át végezzük, 50 12,5°C hőmérsékleten. 5 pl ligációs eleggyei E. coli JA221/F’lacI’törzset (NRRL B-15015) transzformálunk. A 27. ábra 156. helyén sematikusan ábrázolt szerkezetű plazmidot izoláljuk az ampicillin-rezisztens transzformánsokból gyors alkalikus-denaturációs módszerrel izolált egyik plazmidból. Az ábrán a restrikciós enzimmel végzett analízis eredményeit mutatjuk be. A plazmidot pKEN045 jellel jelöljük (pIN-II A-l).

Több módszer áll rendelkezésünkre az A-2 és A-3 leolvasási sémával rendelkező pIN-II plazmidok előállítására. Az A-2 és A-3 pIN-I típusú, rendelkezésre álló plazmidokat figyelembevéve, az egyik módszer szerint a pKEN039 és pKEN040 plazmidokba beépítjük a lac promoter-operátor fragmenst, mégpedig a 27. ábra és az előzőekben a pKEN037 plazmid kapcsán megadottak szerint eljárva. Eljárhatunk úgy is, hogy ez az előnyös módszer, hogy a pKEN039 és pKEN040 Xbal-EcoRI kisebb fragmensét beépítjük a pKEN045 Xbal-EcoRI helyére, mégpedig a

15. ábra kapcsán elmondottak szerint eljárva, fgy megkapjuk a pKEN049 (pIN-II, A-2) és pKEN050 (pIN-II, A-3) plazmidokat.

Másrészről, mivel a megfelelő konstitutív plazmidokat még nem állítottuk elő, az indukálható pKEN049 (A-2) és pKEN050 (A-3) indukálható plazmidokat közvetlenül előállíthatjuk a KEN045 (A-l) plazmidból. A pKEN045 plazmid EcoRI hasítási helyének szomszédságában lévő dezoxi-ribonukleinsav-szekvencia maga is módosítható a 13. ábra b. és c. sémája szerint, vagy a 14. ábra b. és c. részén megadottak szerint eljárva, amikor közvetlenül megkapjuk a pKEN049 (A-2) vagy pKEN050 (A-3) plazmidokat. Ez ezen plazmidok előállításának legelőnyösebb módja, mivel nem szükséges a megfelelő konstitutív plazmidokat előállítanunk.

A B- és C-beépítési helyeket magába foglaló pIN-II plazmidok előállítására is többféleképpen járhatunk el. Mivel a megfelelő pIN-I plazmidokat már előállítottuk, mindegyik módosítható a lac promoter-operátor-fragmens beépítésével, amit egyébként a 27. ábrán megadottak szerint végzünk, vagy előnyösen apKEN045 (pIN-II, A-l) kisebb Xbal-EcoRI fragmensét helyettesítjük a konstitutív B-helyet tartalmazó és C-helyet tartalmazó plazmidok kisebb Xbal-EcoRI fragmensével, amiután az I. táblázatban megadott pIN-II plazmidokhoz jutunk.

a t _f fül-l plN-11

Beépítési hely Leolvasási séma plazmidok plazmidok

B	3 2	pKEUOM pKTMOhY	PK12NO51 pKENO52
	3	pKFNOAB	PKEHO53
C	1	pKTN042	PKENO54
	2	pKLMO43	pKEMD55
	3	pKENO-Vv	pKElÁ-56

-25197937

Legelőnyösebben azonban úgy járunk el, hogy a pIN-II kifejeződő plazmidok előállítására nem készítjük el a megfelelő pIN-I plazmidokat. A B-beépítési hely esetén a pKEN051 (pIN-II, B-l) plazmid a pKEN221 plazmidból származtatható oly módon, hogy először Fnu4H-l restrikciós enzimmel emésztjük a pKEN221 plazmidot, és ezután a kapott fragmens végeihez EcoRI kohézív végeket kapcsolunk. Mindezt az előzőekben megadottak szerint és sematikusan a 17. ábra 138. hellyel jelölt helyén ábrázolt módon végezzük. Az így kapott EcoRI fragmens ezután Xbal restrikciós enzimmel emészthető, ekkor a fragmenst az Xbal hasítási helynél (ez az 5’-nem transzlatált régióba esik) két részre hasítjuk. Az így kapott kisebb Xbal-EcoRI fragmens tisztításával és a pKEN045 (pIN-II, A-1) kisebb Xbal-EcoRI fragmenssel való helyettesítésével megkapjuk a B-l indukálható klónozó hordozót. A kapott pKEN051 (pIN-II, B-l) plazmid ezután a 18. és 19. ábra 141 helyén és a sematikusan szemléltetett módon, vagy a 18. ábra 142. jellel jelölt helyén és a 20. ábrán sematikusan szemléltetett séma szerint tovább módosítható, amiután megkapjuk a B-2 és B-3 leolvasási fázisnak megfelelő pIN-II plazmidokat, nevezetesen a pKEN052 és pKEN053 plazmidokat.

A pIN-II, C-helyet tartalmazó plazmidok közvetlen előállítására analóg módon járunk el, anélkül, hogy előzőleg előállítanánk a megfelelő pIN-I plazmidokat. Ügy járunk el, hogy a pKENI 11 plazmid dezoxi-ribonukleinsavat Sau3A restrikciós enzimmel emésztjük, és a kapott fragmens EcoRI kohézív végeihez kapcsolunk (lásd az előzőekben megadottakat és a 22. ábra 145. jellel jelölt helyén ábrázoltakat), ezután az így kapott EcoRI fragmenst Xbal restrikciós enzimmel emésztjük, az Xbal helyen két részre vágva ezzel a fragmenst (ez a hasítási hely az 5’-nem transzlatált szakaszon belül helyezkedik el). A szignál peptid régiót hordozó Xbal-EcoRI fragmenst ezután beépítjük a pKEN045 Xbal-EcoRI helyére, amiután megkapjuk a pKEN054 (pIN-II, C-l) plazmidot. A pKEN054 dezoxi-ribonukleinsavnak a 23. ábra 148. helyén és a 24. ábra szerinti, vagy a 23. ábra 149. helyén vagy a 25. ábrán megadottak szerinti további módosításával megkapjuk a C-2 és C-3 leolvasási sémának megfelelő pIN-II plazmidokat, a pKEN055 és pKEN056 jellel jelölt molekulákat.

E) Az autoregulált, indukálható kifejeződő (pIN-IU) plazmidok előállítása

A 28, és 29. ábrákon sematikusan szemléltetjük a pIN-II sorozatba tartozó indukálható A-l plazmid klónozó hordozók lacl génnel való kiegészítésének módszerét, amiután megkapjuk a megfelelő, pIN-III sorozatba tartozó, autoregulált, indukálható kifejeződő plazmidokat. Az alábbiakban az eljárás egyes lépéseit részletesen ismertetjük.

1) A pYM051 plazmid előállítása

A pIN-III sorozatba tartozó A-l kifejeződő plazmidok előállításának első lépéseként a lacl gént klónozzuk a pBR322 plazmidba. A pFB140 plazmidból (ezt Riley-től kaptuk, Department of Biochemistry, State University of New York, Stony Brook) izoláljuk az 5,1 kb nagyságú, a lacl gént tartalmazó dezoxi-ribonukleinsav-fragmenst. Ügy járunk el, hogy 15 μg pFB140 plazmid dezoxi-ribonukleinsavat 80 egység EcoRI restrikciós enzimmel emésztünk 200 μΐ EcoRI-pufferban, 37°C hőmérsékleten, 2 órán át. A reakcióelegyet fenollal extraháljuk, és a dezoxi-ribonukleinsav-fragmenseket 2,5 térfogat etanollal kicsapjuk és csökkentett nyomású térben szárítjuk. A dezoxi-ribonukleinsavat 12 egység PstI restrikciós endonukleázzal teljesen emésztjük 300 μΐ alábbi összetételű reakcióelegyben :

mmól trisz-hidrogén-klorid, pH=7,5, 6 mmól magnézium-klorid, mmól nátrium-klorid, mmól β-merkapto-etanol literenként,és 100μg/ml borjú szérum albumin (ezt a reakcióelegyet a továbbiakban Pstl-puffernak nevezzük). A reakciót 37°C hőmérsékleten végezzük 2 órán át. A lacl gént hordozó, 5,1 kb nagyságú Pstl-EcoRI fragmenst (sematikusan ábrázoljuk a 28. ábra 157. számmal jelölt helyén) agaróz gél-elektroforézissel tisztítjuk. A dezoxLribonukleinsav-fragmenseket, melyek az agaróz gélen vannak, 1 pg/ml koncentrációjú etidium-bromiddal festjük, és az 1,5 kb nagyságú fragmensnek megfelelő csíkot kivágjuk. A gélcsíkról fagyasztást követően eluáljuk a dezoxi-ribonukleinsav-fragmenseket. A fragmensekről az etidium-bromidot fenolos extrakcióval távolítjuk el, és a dezoxi-ribonukleinsavat etanollal kicsapjuk.

Az 5,1 kb nagyságú, a lacl gént hordozó Pstl-EcoRI fragmens pBR322 plazmidba való klónozása érdekében a pBR322 PstI és EcoRI között fekvő kisebb dezoxi-ribonukleinsav-fragrr.enst a 28. ábra 158. számmal jelölt helyén megadottak szerint eljárva kihasítjuk. Ügy járunk el, hogy 10 pg pBR322 dezoxi-ribonukleinsavat két egység PstI restrikciós enzimmel hasítunk, 100 pl Pstl-pufferban. A reakciót 3 órán át végezzük, 37°C hőmérsékleten. Fenolos extrakciót követően etanollal kicsapjuk a dezoxi-ribonukleinsavat, csökkentett nyomású térben szárítjuk, és ezután 80 egység EcoRI restrikciós enzimmel kezeljük, 200 μΐ össztérfogatú EcoRI-pufferban. A reakciót 37°C hőmérsékleten végezzük, 2 órán át. A 3,7 kb nagyságú nagyobb Pstl-EcoRI fragmenst ezután agaróz gél-elektroforézissel tisztítjuk.

0,07 pg tisztított fragmenst 0,1 pg előzőleg előállított, 5,1 kb nagyságú pFB140 fragmenssel keverünk, és a PstI és az EcoRI kohézív végeket összekapcsoljuk oly módon, hogy 20 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav-li-26197937 gázzal kezeljük (az enzimet a New England Biolabs-tól szereztük be). A reakciót 25 μΐ ligáz-pufferban végezzük, amelyhez 0,48 mmól/l adenozin-trifoszfátot adunk. A reakcióhőmérséklet 12,5°C, a reakcióidő 16 óra. 15 pl ligációs eleggyel E. coli W620 recA, NRRL B-15024 (F-, thi-1, pyrD36, gltA6, galK30, strA129- lambda-, supE44) törzset transzformálunk. A törzs az alábbi állandó törzsgyűjteményben van letétbe helyezve: Northern Régiónál Research Laboratory, U.S. Department of Agriculture, Peoria, Illinois, USA. A törzs az E. coli W620 törzsből származik, amelyet az alábbi intézettől kaptunk: Department of Humán Genetics, Yale University, School of Medicine. A tetraciklinre rezisztens transzformánsok egyikéből izolált plazmid dezoxi-ribonukleinsav szerkezetét a 28. ábra 150. számmal jelölt helyén mutatjuk be. Ezt a plazmidot pYM051 (NRRL B-15025) jellel jelöljük, a törzs a fentiekben megadott törzsgyűjteményben van letétbe helyezve. A plazmidot az NRRL B-15025 sejtekből ismert módon izoláljuk.

2) A pYM052 és pYM053 plazmidok előállítása

A pYM051 plazmid olyan 5,1 kb nagyságú Pstl-EcoRI dezoxi-ribonukleinsav-fragmenst hordoz, amely nemcsak a lacl gént tartalmazza, de hordozza a lacZ gén jelentős részét is. A 28. ábra 160. jellel jelölt részén bemutatjuk, hogy ez a fragmens 3 HincII hasítási helyet tartalmaz a lacl gén szomszédságában, kettő ezek közül körülveszi a lacl gént és az egyik, a lacl génen belül helyezkedik el. Az 5,1 kb nagyságú dezoxi-ribonukleinsav-fragmens rövidítésére, és ugyanakkor a lacl intaktságának megőrzése érdekében az alábbiak szerint járunk el: 5 pg pYM051 plazmid dezoxi-ribonukleinsavat részlegesen emésztünk 0,32 egység HincII restrikciós enzimmel, 75 μΐ HindlII-pufferban, 1 órán át, 37°C hőmérsékleten. Fenolos extrakciót és etanolos kicsapást követően a dezoxi-ribonukleinsavat csökkentett nyomású térben szárítjuk. A hasítás során különböző hosszúságú dezoxi-ribonukleinsav-fragmenseket kapunk; ezek egyike hordozza az érintetlen lacl gént (1,7 kb hosszúságú, vertikális és horizontális csíkozással szemléltetjük a 28. ábra 160. számmal jelzett helyén).

A rövid, de a lac,I gént hordozó molekula előállítására egy pYMlll jellel jelölt plazmidot állítunk elő. Ez a plazmid az E. coli JA221/F’lacI’/pYMl 11 törzsből (NRRL B-15038) állítható elő. A törzs az alábbi törzsgyűjtemény része: Northern Régiónál Research Laboratory, U.S. Department of Agriculture, Peoria, Illinois, USA. A plazmid az NRRL B-J5038 törzsből ismert módon izolálható.

Ahogy azt a 28. ábra 161. számmal jelzett helyén sematikusan bemutatjuk, a pYMlll egy Hpal hasítási helyet tartalmaz, viszonylag közel a két EcoRl hasítási helyhez. Ez a plazmid alkalmas recipiens a lacl gén fragmens számára, mivel tagja az alábbi tulajdonságokkal rendelkező plazmid-osztálynak:

1) tartalmaz egy egyedülálló restrikciós enzimmel hasítható helyet (azaz egy olyan helyet, amely csak egyszer fordul elő a plazmidban), aminek hasításakor tompa végek képződnek, mint például Hpal, HincII vagy Pvulí;

2) a pBR322 plazmidból származik, és az egyedülálló hasítási hely nem azon a dezoxi-ribonukleinsav-szekvencián belül fekszik, amely felelős a plazmid replikációjáért;

3) tartalmaz továbbá két, az egyedülálló hasítási helyet körülvevő, restrikciós enzim által felismerhető szakaszt, ez az egyedülálló hasítási hely 400—700 bázispárból álló részén belül helyezkedik el. A két szomszédos hasítási helyet hasonló, könnyen hozzáférhető restrikciós enzim ismeri fel, mint például az EcoRl, Hindin, BamHI vagy a Pstl. Ugyanakkor a két szomszédos hasítási hely egyike sem ismétlődik a lacl génen belül.

A pYMlll plazmid előnyös azért is, mert csak egy Hpal hasítási helyet tartalmaz a két EcoRl hasítási hely körül elhelyezkedő 400—700 bázispáron belül, és azért is, mivel a lacl gén maga nem tartalmaz EcoRl hasítási helyeket. Érthető ugyanakkor, hogy bármilyen plazmidot felhasználhatunk a lacl génfragmens beépítésére, amelyek a fenti tulajdonságokkal rendelkeznek, és amelyek a találmány szerinti eljárás további lépései során ennek a génfragmensnek a forrásaként használhatók.

A lacl gént hordozó dezoxi-ribonukleinsav-fragmenst beépítjük a pYMlll plazmidba, ahogy azt a 28. ábra 162. jellel jelölt helyén sematikusan ábrázoljuk. Úgy járunk el, hogy 4 pg pYMlll plazmid dezoxi-ribonukleinsavat 4 egység Hpal restrikciós endonukleázzal kezelünk 50 μΐ Hpal-pufferban, 37°C hőmérsékleten, 1 órán át. Fenolos extrakciót követően etanolos kicsapással különítjük el a dezoxi-ribonukleinsavat, amit csökkentett nyomású térben szárítunk. A Hpal-kezelt dezoxi-ribonukleinsav-fragmensek önmagukkal való kapcsolódásának meggátlására a száraz dezoxi-ribonukleinsavat 0,15 egység DAP-val kezeljük 100 μΐ alábbi összetételű reakcióelegyben: 10 mmól/l trisz-hidrogén-klorid (pH=8,0) és 0,1 mmól/l etilén-diamin-tetraecetsav. (Ezt a reakcióelegyet a továbbiakban BAP-puffernak nevezzük.) A reakciót 37°C hőmérsékleten végezzük, 45 percen át. A BAP teljes eltávolítására háromszor fenolos extrakciót végzünk, ezután etanollal kicsapjuk a dezoxi-ribonukleinsavat és csökkentett nyomású térben szárítjuk.

Az intakt lacl gént hordozó 1,7 kb nagyságú dezoxi-ribonukleinsav-fragmens pYMl 11 plazmidba való beépítésére 0,1 pg Hpal enzimmel kezelt pYMlll plazmid dezoxi-ribonukleinsavat 0,275 pg olyan dezoxi-ribonuk27

-27197937 leinsav-fragmensekkel keverünk, amelyet a pYM051 plazmid részleges HincII emésztésével kaptunk. A dezoxi-ribonukleinsavrmolekulákat 320 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligázzal (New England, Biolabs.) kapcsoljuk 20 pl, 0,6 mmól/1 adenozin-trifoszfátot tartalmazó ligáz-pufferban. A reakciót 12,5°C hőmérsékleten végezzük, 16 órán át. A ligációs elegy felével E. coli W620 recA törzset (NRRL B-15024) transzformálunk, és a transzformánsokat 50 pg/ml ampicillint és 40 pg/ /ml 5-bróm-4-klór-3-indolil-p-D-galaktozidot (a továbbiakban: X-gal) tartalmazó L-táptalaj felületére juttatjuk. A fehér telepeket fejlesztő transzformánsokat szelektáljuk, ez a szín azt jelenti, hogy a pYMlll plazmidba ebben az esetben beépült a teljes lacl gént hordozó, 1,7 kb nagyságú HincII fragmens. Mivel a transzformáció során kapott plazmidokban a lacl gén két orientációban épül be, a kapott plazmid-típusokat pYM052 és pYM053 jellel jelöljük. A két plazmid szerkezetét a 28. ábra 163. számmal jelzett helyén mutatjuk be.

3) A pYM058 plazmid előállítása

A kifejeződő plazmid nagyságának további csökkentése érdekében, és a lacl gén kifejeződését gátló bármely lehetséges hatás eliminálására (ez a plazmidban még mindig jelenlévő lacZ génrészlet jelenlétéből adódhat) a lacZ génfragmenst eltávolítjuk, ugyanakkor biztosítjuk a lacl gén sértetlenségét. A fragmensnek a pYM053 plazmidból való eltávolításának stratégiáját a 29. ábrán sematikusan ábrázoljuk.

A 29. ábra 164. számmal jelzett helyén szemléltetjük, hogy a lacl gént tartalmazó pYM053 plazmid két EcoRI hasítási helye között milyen a részleges restrikciós térkép. Ez a szakasz tartalmaz a fentiekben, a 28. ábra magyarázata kapcsán és a 28. ábra 157. és 160. számmal jelzett helyével kapcsolatban elmondottak szerint három HincII hasítási helyet. Ahogy azt a 29. ábrán bemutatjuk, ezen HincII helyek közül kettő a Hpal restrikciós endonukleáz által is felismerhető. Ezenkívül, a 29. ábrán ábrázoltak részletesebb vizsgálatakor kiderül, hogy ezen a szakaszon három Mspl hasítási hely is létezik, ezek közül kettő a lacZ génfragmensen belül helyezkedik el, egy pedig a lacl gént a lacZ génfragmens 5’-végétől elválasztó dezoxi-ribonukleinsav-szekvencián belül esik.

A fenti elrendeződés lehetővé teszi a két Hpal hasítási hely közötti 789 bázispárból álló fragmens könnyű izolálását. A fragmens tovább osztható Mspl fragmensek előállításával, ezek közül egy a lacl gén 3’-szakaszát tartalmazza, de nem hordozza a lacZ gén egyetlen részét sem. Ezt a fragmenst később megfelelő orientációba visszaépíthetjük, amiután újra megkapjuk az érintetlen lacl gént.

Ügy járunk el, hogy 100 pg pYM053 plazmid dezoxi-ribonukleinsavat 60 egység Hpal 28 restrikciós enzimmel kezelünk 800 pl Hpalpufferban, 2 órán át, 37°C hőmérsékleten. 5% poliakril-amidot tartalmazó gélen elektroforézissel tisztítjuk a 789 bázispárból álló fragmenst, a dezoxi-ribonukleinsav-fragmenseket a poliakril-amid |élen 1 pg/ml koncentrációjú etidium-bromid-oldattal festjük, és a 789 bázispárból álló fragmensnek megfelelő csíkot kivágjuk. A csíkról a dezoxi-ribonukleinsav-fragmenseket elektroforézissel eluáljuk. Az etidium-bromidot fenolos extrakcióval távolítjuk el a dezoxi-ribonukleinsavról, majd etanolos kicsapással izoláljuk a molekulákat.

1,1 pg tisztított, 7,89 bázíspárból álló dezoxi-ribonukleinsav-fragmenst ezután 12 egység Mspl restrikciós enzimmel emésztünk 75 pl Hpal-pufferban. A reakciót 37°C hőmérsékleten végezzük, 1 órán át. Fenolos extrakciót követően a dezoxi-ribonukleinsavat etanolos kicsapással különítjük el, és csökkentett nyomású térben szárítjuk. Ezután 2000 egység Sl-nukleázzal kezeljük a dezoxi-ribonukleinsav-fragmenseket, a reakciót 150 pl Sl-pufferban végezzük, 20°C hőmérsékleten, 1 órán át. A reakció leállítására 15 pl, 500 mmólos trisz-hidrogén-klorid (pH=8,0) és 15 pl, 250 mmólos etilén-diamin-tetraecetsav-oldatot adagolunk, majd fenolos extrakciót végzünk. A fenol és a cinkionok eltávolítására éterrel extraháljuk az elegyet, és 0,01 XSSC oldattal szemben 4°C hőmérsékleten kétszer 1,5 órán át dializáljuk, majd etanollal kicsapjuk a dezoxi-ribonukleinsavat.

pg pYM053 plazmid dezoxi-ribonukleinsavat közben 12 egység Hpal restrikciós enzimmel emésztünk 100 pl Hpal-pufferban. A reakciót 1 órán át 37°C hőmérsékleten végezzük. 0,7% agaróz gélen elektroforézissel tisztítunk egy 8 kb nagyságú fragmenst, és az 1,1 pg-nyi mennyiségű dezoxi-ribonukleinsavat ezután 0,12 egység BAP-val kezelünk, 75 pl BAP-pufferban, 1 órán át, 37°C hőmérsékleten, a Hpal tompa végek egymáshoz kapcsolásának gátlására. A BAP teljes eltávolítására háromszor fenollal extraháljuk az elegyet, és a dezoxi-ribonukleinsavakat etanolos kicsapással izoláljuk, majd ezután csökkentett nyomású térben szárítjuk. A pYM053 plazmidból származó, 8 kb nagyságú Hpal fragmens 0,4 pg-ját 0,05 pg, a pYM053 plazmidból származó és Mspl enzimmel emésztett 789 bázispárból álló fragmens-készítménnyel keverjük. A dezoxi-riboíiukleinsav-molekulákat 400 egység T4 dezoxi-ribonukleinsavligázzal kapcsoljuk (az enzimet az alábbi helyről vásároltuk: New England Biolabs.). A reakciót 0,8 mmól/1 adenozinn-trifoszfátot tartalmazó, 15 pl térfogatú ligáz-pufferban végezzük, 12,5°C hőmérsékleten, 16 órán át. 10 pl ligációs elegygryel E. coli W620 recA (NRRL B-15024) törzset transzformálunk, és a transzformánsokat 50 pg/ml ampicillint és 40 pg/ml X-gal-t tartalmazó L-táptalaj felületére juttatjuk. A

-28197937 fehérszínű, ampicillinre rezisztens transzformánsokat szelektáljuk, ezzel megállapítjuk, hogy a teljes lacl gént újra előállítottuk. A transzformánsok egyikéből izoláljuk a plazmid dezoxi-ribonukleinsavat, ennek szerkezetét a 29. ábra 165. jellel jelölt részén adjuk meg. A plazmidot pYM058 jellel jelöljük.

4) A pYM061 plazmid és más, autoregulált kifejeződő plazmidok előállítása

Az első autoregulált, indukálható, kifejeződő pIN-III sorozatba tartozó plazmid előállításának utolsó lépéseként a lacl gént beépítjük a pKEN045 (pIN-II, A-l) plazmidba. Ügy járunk el, hogy 30 pg pYM058 plazmid dezoxi-ribonukleinsavat 100 egység EcoRI restrikciós enzimmel kezelünk 250 pl EcoRI-pufferban, 1,5 órán át, 37°C hőmérsékleten. Az előzőekben megadottak szerint eljárva agaróz gél-elektroforézissel tisztítunk egy 2,4 kb nagyságú EcoRI fragmenst. 2,0 pg mennyiségű fragmenst ezután 600 egység Sl-nukleázzal kezelünk 150 μΐ Sl-pufferban, 1 órán át, 20°C hőmérsékleten. A reakció leállítására 15 pl, 500 mmólos trisz-hidrogén-kloridot (pH=8,0) és 15 pl, 250 mmólos etilén-diamin-tetraecetsav-oldatot adagolunk, majd fenollal extrahálunk. A fenol és a cinkionok eltávolítására éterrel extraháljuk az elegyet, és 0.01XSCC oldattal szemben kétszer dializálunk 4°C hőmérsékleten, 1,5 órán át. A dezoxi-ribonukleinsavat etanolos kicsapással különítjük el.

pg pKEN045 plazmid dezoxi-ribonukleinsavat 1 egység HincII restrikciós enzimmel részlegesen emésztünk 751 pl HindlII pufferban, 30 percen át, 37°C hőmérsékleten. Ahogy azt a 29. ábra 166. számmal jelzett részén bemutatjuk, a pKEN045 két HincII hasítási helyet hordoz; az egyik Sáli enzimmel is hasítható. A Hindi restrikciós enzimmel végzett részleges emésztéskor lineáris dezoxi-ribonukleinsav-fragmensek keverékét kapjuk, a leghosszabbak csak egy HincII helyen hasadtak. Ezeket a körülbelül 5,0 kb hosszúságú fragmenseket 0,7% agarózt tartalmazó gélen elektroforézissel izoláljuk, ahogy azt az előzőekben megadtuk.

2,5 pg linearizált dezoxi-ribonukleinsavat ezután 0,15 egység BAP-val kezelünk 50 pl BAP-pufferban, 37°C hőmérsékleten, 1 órán át a HincII tompa végek önmagukkal való kapcsolódásának meggátlására. A BAP teljes eltávolítására háromszor fenollal extrahálunk. A dezoxi-ribonukleinsavakat ezután etanolos kicsapással izoláljuk és csökkentett nyomású térben szárítjuk.

0,15 pg, a pYM058 plazmidból származó 2,4 kb nagyságú EcoRI fragmenst 0,3 pg, a pKEN045 fragmensből származó, 5,0 kb nagyságú fragmenssel keverünk, és az elegyhez 400 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligázt adunk (New England Biolabs), 15 pl ligáz-pufferban, amelyhez előzőleg 0,8 mmól/ /1 adenozin-trifoszfátot adunk. A reakciót órán át végezzük 12,5°C hőmérsékleten. 10 pl ligációs eleggyel E. coli W620 recA (NRRL B-15024) törzset transzformálunk, és az ampicillinre rezisztens transzformánsokat az előzőekben megadottak szerint szelektáljuk X-gal-t használva. A fehérszínű telepek bizonyítják a lacl gén beépülését az Amp^R géntől jobbfelé haladva, a Hindi helyre. A transzformáció során olyan plazmidok keletkeznek, amelyek a lacl gént két különböző orientációban hordozzák, ezek egyikének szerkezetét a 29. ábra 167 helyén adjuk meg. Ennek a plazmidnak a pYMOöl (pIN-III, A-l) jelet adtuk.

Több módszer áll rendelkezésünkre, amelyekkel az A-2 és A-3 leolvasási sémának megfelelő pIN-III plazmidokat előállíthatjuk. Figyelembevéve az A-2 és A-3 plazmidok rendelkezésre álló pIN-I és pIN-II sorozathoz tartozó párjait, az egyik módszer szerint az előzőekben a pKEN045 plazmid kapcsán és a 29. ábrán megadottak szerint eljárva a lacl gén-fragmenst beépítjük a pKEN049 (pIN-II, A-2) és pKEN050 (pIN-II, A-3) plazmidokba. Előnyösen eljárhatunk oly módon is, hogy a pKEN049 és pKEN050 (vagy a pKEN039 (pIN-I, A-2) és a pKEN040 (pIN-I, A-3)) plazmidok kisebb Xbal-EcoRI fragmenseit helyettesítjük a pYMOöl plazmid kisebb Xbal-EcoRI fragmensével. Ebben az esetben a 15. ábra kapcsán az előzőekben megadottak szerint járunk el, és megkapjuk a pIN-III sorozatba tartozó A-2 és A-3 típusú plazmidokat.

Másrészről, meggondolva, hogy a megfelelő pIN-I konstitutív és pIN-II indukálható plazmidokat még nem állítottuk elő, az autoregulált, indukálható A-2 és A-3 plazmidokat közvetlenül előállíthatjuk a pYM061 (A-l) plazmidból. A pYM061 plazmid EcoRI hasítási helyének szomszédságában lévő dezoxi-ribonukleinsav-szekvencia módosítható a

13. ábra b. és c. részén, vagy a 14. ábra b. és c. részén szemléltetett módon, amikor közvetlenül megkapjuk a pIN-III, A-2 és A-3 szerkezetű plazmidokat. Ezen plazmidok előállításának ez a legelőnyösebb módja, mivel ebben az esetben nincs szükségünk a megfelelő pIN-I és pIN-II plazmidok előállítására. Ugyancsak több módszer áll rendelkezésünkre a B- és C-beépítési helyet magába foglaló pIN-III plazmidok előállítására. Mivel a pIN-I és a pIN-II plazmidokat már előállítottuk, ezek a 29. ábrán megadottak szerint módosíthatók oly módon, hogy a lacl gén-fragmenst beépítjük, vagy előnyösebben, a pYM061 (pIN-III, A-l) kisebb Xbal-EcoRI fragmensét helyettesítjük a Billetve C-helyet tartalmazó konstitutív vagy indukálható plazmidok kisebb Xbal-EcoRI fragmenseivel, amiután mindegyik esetben pIN-III típusú, B- vagy C-helyet hordozó plazmidokhoz jutunk. A pYN-III kifejeződő plazmidokat azonban legelőnyösebben úgy állítjuk elő, hogy kihagyjuk a pIN-I vagy 29

-29197937 a pIN-II plazmidok előállítását. A B-beépítési hely esetén a B-t pIN-III plazmidot előállíthatjuk a pKEN221 jelű plazmidból oly módon, hogy a pKEN221 plazmid dezoxi-ribonukleinsavat Fnu4H-l restrikciós enzimmel emésztjük, és ezután EcoRI kohézív végeket kapcsolunk a kapott fragmens végeihez, és ezután EcoRI kohézív végeket kapcsolunk a kapott fragmens végeihez. Ezt az előzőekben megadottak és sematikusan a 17. ábra 138. számmal jelölt helyén ábrázoltak szerint végezzük. A kapott EcoRI fragmenst ezután Xbal restrikciós enzimmel emésztjük, amikor a fragmens két részre válik az 5’-nem transzlatált szakaszon belül elhelyezkedő Xbal hasítási helynél. Az így kapott kisebb Xbal-EcoRI fragmenst tisztítjuk és kicseréljük a pYMOől (pIN-III, A-l) plazmid kisebb Xbal-EcoRI fragmensét, amiután B-l típusú autoregulált, indukálható klónozó hordozót kapunk. A kapott plazmid ezután tovább módosítható a 18. ábra 141. jellel jelölt helyén és a 19. ábrán, vagy a 18. ábra 142. jellel jelölt helyén és a 20. ábrán megadott módon, amiután B-2 és B-3 leolvasási fázisban lévő, megfelelő pIN-III plazmidokat kapunk.

A pIN-III típusú C-helyet tartalmazó plazmidok közvetlen előállítására hasonlóképpen járhatunk el, anélkül, hogy először előállítanánk a megfelelő pIN-I vagy pIN-II plazmidokat. Ügy járunk el, hogy a pKENI 11 plazmid dezoxi-ribonukleinsavat Sau3A restrikciós enzimmel emésztjük, és EcoRI kohézív végeket kapcsolunk a kapott fragmens végeihez (ezt a fentiekben megadottak és a 22. ábra 145. számmal jelzett helyén szemléltetett módon végezzük), a kapott EcoRI fragmenst ezután Xbaí restrikciós enzimmel emésztjük, amikor a fragmens az 5’-nem transzlatált szakaszon belül elhelyezkedő Xbal hasítási helynél két részre hasad. A szignál peptid szakaszt hordozó Xbal-EcoRI fragmenst ezután a pYM061 plazmid Xbal-EcoRI helyébe építjük be, így megkapjuk a pIN-III C-1 típusú plazmidot. A 23. ábra 148. jellel jelzett helyén é a 24. ábrán megadottak szerint, vagy a 23. ábra 149. jellel jelölt helyén és a 25. ábrán megadottak szerint eljárva, a plazmid dezoxi-ribonukleinsavat tovább módosíthatjuk, amiután megkapjuk a C-2, illetve C-3 leolvasási fázisban lévő pIN-III plazmidokat.

A találmány szerinti eljárással előállított rekombináns plazmid klónozó hordozókkal transzformált baktériumsejtekben humán hormon vagy más, polipeptid fejezhető ki, és ezekből jelentős mennyiség termelhető. A szakember számára érthető, hogy a leírásban megadott megvalósítási változatok csak szemléltető jellegűek, és nem limitálják az eljárást, és felhasználhatunk más, külső gének kifejezésére alkalmas rekombináns plazmid klónozó hordozókat is.

Claims (21)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Eljárás transzformált baktériumban legalább egy polipeptid kifejezésére alkalmas, klónozó hordozóként használható rekombináns plazmid előállítására, azzal jellemezve, hogy leolvasási fázisban összekapcsolunk egy Gram-negatív festődésű baktérium külső membrán protein génjéből származó, legalább egy funkcionális fragmenst meghatározó dezoxi-ribonukleinsáv-szekvenciát (első DNS-szekvencia) — a lac promoter-operátor rendszert meghatározó valamely dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciával (második DNS-szekvencia), és — egy, az adott, legalább egy polipeptid aminosav-szekvenciáját meghatározó dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciával (harmadik DNS-szekvencia), vagy egy transzlációs iniciációs kodonnal leolvasási fázisban kapcsolt, az adott harmadik dezoxi-ribonukleinsav-szekvencia befogadására alkalmas beépítési hellyel, és — a lacl gént kódoló dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciával (negyedik DNS-szekvencia).
2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy funkcionális fragmensként egy promoter jelet tartalmazó fragmenst alkalmazunk.
3. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy funkcionális fragmensként promoter jelet és 5’-nem transzlatált szakaszt tartalmazó fragmenst alkalmazunk.
4. 4. Az 1—3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy funkcionális fragmensként 3’-nem transzlatált szakaszt és transzkripciós terminációs jelet tartalmazó fragmenst alkalmazunk.
5. 5. Az 1—4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy fu’nkcionális fragmensként konstitutív promotert tartalmazó fragmenst alkalmazunk.
6. 6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az indukálható promotert a konstitutív promoter jeltől jobbra helyezzük el.
7. 7. Az 1—6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a harmadik dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciát a konstitutív promoter jeltől, az indukálható promoter jeltől és az 5’-nem transzlatált szakasztól jobbra, míg a 3’-nem transzlatált szakasztól és a transzkripciós terminációs jeltől balra helyezzük el.
8. 8. Az 1—6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a nevezett beépítési helyet a konstitutív promoter jeltől, az indukálható promoter jeltől és az 5’-nem transzlatált szakasztól jobbra, míg a 3’-nem transzlatált szakasztól és a transzkripciós terminációs jeltől balra helyezzük el.

   -30197937
9. 9. A 7. vagy 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy első dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciaként egy olyan peptidnyúlványt is kódoló dezoxi-nukleinsav-szekvenciát alkalmazunk, amely peptidnyúlvány legalább egy polipeptid áthaladását szabályozza a baktérium citoplazma membránján át.
10. 10. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a harmadik dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciát vagy beépítési helyet az első dezoxi-ribonukleinsav-szekvencia peptidnyúlványt meghatározó dezoxi-ribonukleinsav -szekvenciáján belül helyezzük el.
11. 11. A 9. vagy 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a harmadik dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciát vagy beépítési helyet az első dezoxi-ribonukleinsav-szekvencia peptidnyúlványt meghatározó dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciájának 3’-végén helyezzük el.
12. 12. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy első dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciaként olyan szekvenciát alkalmazunk, amely egy Gram-negatív festődésű baktérium külső membrán lipoproteinjének csaknem teljes aminosav-szekvenciáját meghatározza.
13. 13. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a harmadik dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciát vagy beépítési helyet egy Gram-negatív festődésű baktérium külső membrán lipoproteinjének csaknem teljes aminosav-szekvenciáját meghatározó első dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciáján belül helyezzük el.
14. 14. Az 1—3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy Gram-negatív festődésű baktériumként Escherichia colit alkalmazunk.
15. 15. Az 1 — 14. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az első dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciában lipoprotein génként az Escherichia coli lipoprotein génjét alkalmazzuk.
16. 16. A 14. vagy 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy második dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciaként az Escherichia coli lac promoter-operátor rendszerét

    5 meghatározó szekvenciát alkalmazzuk.
17. 17. A 14—16. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy negyedik dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciaként az Escherichia coli lacl génjét kódo'ló szek’θ véneiét alkalmazzuk.
18. 18. Az 1—17. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy beépítési helyként EcoRI, HindlII vagy BamHI restrikciós endonukleázok által felismert szek15 véneiét hordozó dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciát alkalmazunk.
19. 19. Az 1. igénypont szerinti eljárás pYM061 jelű plazmid előállítására, azzal jellemezve, hogy az egy Gram-negatív fes²θ tődésű baktérium külső membrán protein génből származó legalább egy funkcionális fragmenst meghatározó dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciát, lac promoter-operátor rendszert meghatározó dezoxi-ribonukleinsav-szekven25 ciát, és egy transzlációs iniciáló kodonnal leolvasási fázisban kapcsolt beépítési helylyel rendelkező szekvenciát t<-rtalmazó pKEN045 plazmidot részlegesen HincII-el hasítunk, bázikus foszfatázzal kezelünk, majd

    30 a lacl gént kódoló DNS szekvenciát tartalmazó pYM058 plazmid EcoRI-gyel végzett hasításával kapott 2,4 kb-s fragmentummal összekapcsoljuk.
20. 20. Eljárás áz 1—9. igénypontok bárme35 lyike szerinti plazmidot tartalmazó Escherichia coli transzformánsok előállítására, azzal jellemezve, hogy az 1 —19. igénypontok bármelyike szerinti plazmiddal kompetenssé tett Escherichia coli törzseket transz40 formálunk.
21. 21. A 20. igénypont szerinti eljárás Escherichia coli W620 recA/pYM061 transzformáns törzs előállítására, azzal jellemezve, hogy Escherichia coli W620 recA (NRRL

    45 B-15024) törzset a 19. igénypont szerinti pYM061 plazmiddal transzformálunk.