JPS60186289A - ストレプトミセス発現系およびｄｎａ配列をストレプトミセスで発現する方法 - Google Patents

ストレプトミセス発現系およびｄｎａ配列をストレプトミセスで発現する方法

Info

Publication number
JPS60186289A
JPS60186289A JP59115642A JP11564284A JPS60186289A JP S60186289 A JPS60186289 A JP S60186289A JP 59115642 A JP59115642 A JP 59115642A JP 11564284 A JP11564284 A JP 11564284A JP S60186289 A JPS60186289 A JP S60186289A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
streptomyces
sequence
dna sequence
expression
foreign dna
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP59115642A
Other languages
English (en)
Inventor
チヤールズ　ジエイ　トンプソン
ゲイリー　エス　グレイ
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Biogen NV
Original Assignee
Biogen NV
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Biogen NV filed Critical Biogen NV
Publication of JPS60186289A publication Critical patent/JPS60186289A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/76—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Actinomyces; for Streptomyces
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/61—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
    • C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の要約〕 ストレプトミセス発現系および外来り、ＮＡ配列をスト
レプトミセス属で角現するための方法につき開示し、こ
れはストレプトミセスｒ１のアミノグリコシドホスホト
ランスフェラーゼのプロモータ、よりなる群から選択さ
れる少なくとも１種のプロモータを％懲とする。こ１れ
らの発現系および方法稈、成熟核およびウィルス性ＤＮ
Ａ配列ヲストレプトミセスで発現しかつ５れら宿主にお
ける各種の医薬上、畜産上および工業上の生産物の産生
を可能にする。。
〔発明のＦ４−ｔ−る、技術外野〕 本発明は、ストレプトミセス発現系お±９外来ＤＮＡ配
列をストレプトミセス属で発現させる方法に関するもの
！する。さらに詳細には、本発明はストレプトミセス属
におけるこれら外来ＤＮＡ配列により、コードされたポ
リペプチドおよび蛋白質の製造不法に関するものである
。
これらポリペプチドおよび蛋白質はワクｔン、医薬品お
よび動物健亭増進物質、工業製品などにおいて有用であ
り、かつくれら製品または従来の化学的もしくは生物学
的方法によるこの種のその他の製品を製造する際の中間
隼牛して有用である。
〔従来技術とその問題点〕　。
多くの成熟核およびウィルス性遺伝子が、グラム眸性−
菌工あ、る大腸菌（Ｅｓｏｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ
）で頼現ａｉ−ｔ−“６・″種０発現０伊、りは・　３
１白血球インタフエロンの生物学的もしくは免疫学的活
憔キ示すポリペプチド〔ニス令ナガタシ、［ヒト中血球
マンタフエロンの活性を有するポリペプチドの大腸菌に
おける竺成−１，、ネイチャー、第ｘｌｒｐ巻、第３．
１５．２０頁（、ｉｙ、ｉｒｏ＞〕、ヒ）Ｂ型肝炎つイ
クス抗原の特異性牟示す抗原〔シーφジエー争バレル等
、［フラスミ）”ｐＢＲ３２，２でクローン化されたＢ
型肝轡つィシスＤ　Ｎ　Ａ　ｉｄ、ｐｌの大腸菌におけ
る発現１、ネイチャ　１−１第２７２巻、第≠３−グア
頁（ｌり７り）；エムＩＩハセク等、「Ｂ型肝炎ウィル
ス遺伝子お　゛よびその大腸菌における発現」、ネイチ
ャー、第コｔλ巻、第３７！−７２頁（／り７り）〕お
よびＦＭＤウィルス抗櫻シス原性を示すポリペプチド〔
エッチ・キ亡ツバー＝ｙ、、、、ｒ口蹄疫ウィルスの主
要抗原のｃ　Ｄ　Ｎ　Ａのクローン化および大腸菌にお
ける発現、］、ネネイチャー第２ｔり巻、第ｊｊｊｔ−
！り頁（１９′ざ／））　の産生を包含する。
しかしながら、イー・コリ（大腸菌）におけるこの種の
有用な成熟核およびウィルス性生産物の産生は幾つかの
欠点を伴う。たとえば１一般にイー・コリは動物および
人間の腸管内に存在するので、不慮の感染を防止するに
は所望生産物を産生ずるよう改変したイー・コリ宿主の
慎重な取扱いが必要とされる。現在、所望生産物を産生
ずるために使用しうるイー・コリ宿主は、実験室環境の
外部では増殖させないものに制約される。さらに、形質
転換したイー・コリ宿主は、商度の閉込め条件下におい
て密閉系で増殖させねばならない（現在、ナショナル・
インスチチュート・オプ・ヘルスなどの政府機関の指針
により強制されている）。さらに、得られたイー・コリ
培養物はこの系を環境に島呈する前に細菌を死滅させる
よう処理せねばならない。これらの要件は、明らかにイ
ー・コリを使用する発酵法の材料および装置コストを著
しく増大させる。さらに、イー・コリの細菌生産物の成
るものは内毒素である。したがって、イー・コリ宿主で
産生された成熟核およびウィルス性生産物が動物および
人間において使用されうるためには、イーｅコリ内毎素
を完全に所望生産物から除去せねばならない。明らかに
、この除去はさらに高コストかつ面倒な精製および単離
工程を伴う。
さらに、多くの成熟核およびウィルス性遺伝子がグラム
陽性細菌であるバチルス属の種々の菌株で発現されてい
る。この種の発現の例はＢ型肝炎つィシス心核抗原〔ケ
ー・バーディ等、［肝炎６核抗原および口蹄疫ウィルス
の主要抗原の枯草菌における産生」、ネイチャー、第２
２３巻、第Ｖざ−Ａ３頁（ｌりざ／））および口蹄疫ウ
ィルスの抗原〔ケー・バーディ等、上記〕を包含する。
バチルス宿主におけるこの種の生産物の雄牛は、イー・
コリ宿主と比較して多くの点で有利である。たとえば、
最も一般的に使用されるバチルス宿主で壱る枯草菌は非
病原性である。これは、人間または動物に感染する能力
を持たない。さらに、これは内毒素を産生じない。した
がって、成熟核およびウィルス性蛋白質の枯草菌宿主に
おける産生け、イー争コリ発酵につき強制されている不
利な高度閉込めという発酵および回収条件を回避する。
さらに、全ての微量の宿主生成毒素を除去するため生産
物を精製する必要が回避される。最後に、バチルス宿主
は自然にその蛋白生産物の規程かを細胞外の空間中へ分
泌する。したがって、この種の生産物を細胞から容易に
回収して、これを宿主細胞の溶菌または破壊から生ずる
付随汚染物を伴わずに精製することができる。
イー・コリおよびバチルス宿主は、現在これら宿主を形
質転換させるために使用される各種の外来ＤＮＡ配列に
よりコードされた蛋白質およびポリペプチドを産生ずる
ために使用されているが、これら宿主には完全な組換Ｄ
Ｎ人技術の能力が実現されていない。これには幾つかの
理由がめる。たとえば、イー命コリおよびバチルス宿主
を極めて高密度で増殖させるのが困貼である。したがっ
て、発酵収率は各社基準において、高密度で増殖させう
る培養物について可能であるよシも低いものである。さ
らに、イー・コリおよびバチルス宿主は、それらを固定
化しない限り長期間にわたる所望生産物の活性な生産菌
々なりえない。さらにこの結果、その他の場合に得られ
るよりも低い発酵収率をもたらす。
しかしながら、イー・コリおよびバチルス宿主のこれら
欠点はストレプトミセス宿主の使用により回避され、所
望の成熟核およびウィルス性生産物を産生ずることがで
きる。ストレプトミセス属は非毒性である。病気を引起
こしたり、或いは人間または動物の共食性となるものは
知られていない。さらに、ストレプトミセスは、たとえ
ばアミノグリコシド、マクロ２イドおよびβ−ラクタム
、ポリエーテル並びにグリコペプチド抗生物質のような
抗生物質を産生ずるために広く使用されている。したが
って、当業界で使用しうるストレプトミセスの発酵およ
び精製に関し、広範囲の知識および経験が存在する。
たとえば、ストレプトミセスは極めて高い培養密度藍で
増殖させることができる。さらに、ストレプトミセスは
、植物増殖の完了の後に二次的代圓を示して、所望生産
物の活性な合成を数週間にわたって保ち続けうる。最後
に、ストレプトミセスはこの二次的代謝の際にそれらの
生産物の多くを分泌する。２トレプトミセスは広範囲の
この種の細胞外加水分解酵素、たとえばプロテアーゼ、
アミラーゼ、セルラーゼ、リパーゼ、ヌクレアーゼなど
をイー・コリ゛またはバチルスよりも多く含有するので
、ストレプトミセス宿主はイー・コリまたはバチルスよ
りも所望生産物の分泌に対して一層適している。
しかしながら、所望の成熟核、ウィルス性などの外来生
産物を産生ずるための組換ＤＮＡ技術にストレプトミセ
ス宿主を使用するのが有利であるにも拘わらず、外来Ｄ
ＮＡ配列、特に成熟核もしくはウィルス性ＤＮＡ配列の
ストレプトミセス宿主における発現に関しまだ成功した
クローン化系は報告されていない。
寧ろ、ストレプトミセスに関する従来の研究は、ストレ
プトミセスの遺伝学、そのプラスミド、ファージおよび
ＤＮＡ、ストレプトミセス中へのストレプトミセスＤＮ
Ａの再導入方法および細菌由来ＤＮＡ配列のこれら宿主
における発現に関する研究に制約されている。たとえば
、ケーΦエフ・チェター等、［ストレプトミセスにおけ
る遺伝子クローン化］、カレント・トピックス拳イン・
マイクロバイオロジー・アンド・イミューノロジー、第
６ター１３頁（ｔ　９ｇ、２）；シー・ジエー・トンプ
ソン等、［抗生物質産生ストレブトミ、セスからクロー
ン化された耐性決定子の生化学的特性化Ｊ１ジャーナル
・バクテリオロジー、第１よ７巻１、第６７ｇ−ｔ！頁
（ｚ９Ｊ−２）ｉシー拳シエー・トンプソン等、「スト
レプトミセスにおけ６抗生物質耐性および栄養性遺伝子
のクローン化」′、レジャール・バクテリオロジー、第
１！１巻、第４４ｆｆ−７７Ｍ（／　Ｐｔλ）；シー拳
ジエー・トンプソン等、［ストレプトミセスからの抗生
物質耐性遺伝子の物理分析およびベクター作成における
その使用］、ジイーン、第２０巻、′−第！１−６２頁
（ｚＰｌ、ｚ）＋ティー・キーザー等、ｌ’−ｐＩＪ／
　０／、多コピー広宿主範囲のストレプトミセスプラス
ミド！　ＤＮＡクローン化ベクターの官能分析および開
発Ｊ１そレキュラー〇ジェネラル・ジエネテイツクス、
第１♂！巻、第一２３−３１頁（７りｒ、２）；エム・
ジエーφビブ等、「ストレプトミセスに対するクローン
化系の開発Ｊ１デイベロツプト・インダストリアル・マ
イクロバイオロジー、第、２７巻、第５ｒ−ｔ＋頁（ｌ
りｒ　ｏ　）　＋シー・ジエー・トンプソン等。
［ストレプトミセスにおけるＤＮＡクローン化：抗生物
質産生菌種からの耐性遺伝子」、ネイチャー、第、２５
６巻、第１．２３−コア頁（ｌりＩ　ｏ　）　；および
ヨーロッパ特許出願第７７ｊＩＩ２号。
仁れら研究のいずれも、成熟核、ウィルス性などの外来
ＤＮＡ配列をストレプトミセスにクローン化させたり或
−は・それによりコー　ドされるポリペプチドを産生さ
せるようその宿主にお□いて発現させることに成功して
いない。
〔発明の゛目的〕　゛ 本発明の目的は、上記の問題を解決し、ストレプトミセ
ス発現系並びに外来ＤＮＡ配列、特に成熟核およびウィ
ルス性ＤＮＡ配列をストレプトミセスで発現させるため
のこれら′の系を使用する方法を提供することである。
　・〔発明の要点〕　・ 本発明によれば上記目的は、ストレプトミセス属の７ミ
ノグリコシドホスホトランスフエラーゼのプロモータよ
り造る群から選択される少なくとも１種のプロモータを
特徴とする、外来″ＤＮＡ配列をストレプトミセスで発
現するためのストレプトミセス発現系により達成される
。
本発明によれば、ストレプトミセス宿主を用いて成熟核
、ウィルス性などの外来ポリペプチドおよび蛋白質をス
トレプトミセスで合成することに初めて成功した。さら
に、本発明の発現系はこれら所望生産物をコードする外
来ＤＮＡ配列のクローン化、これらＤＮＡ配列によるス
トレプトミセス宿主の形質転換、およびストレプトミセ
スにおけるこれら外来ＤＮＡ配列の発現を可能にする。
したがって、本発明の発現系および方法は、組換ＤＮＡ
技術を介する生産物の産生および分泌をストレプトミセ
ス宿主において実現しうるという利点を初めて可能にす
る。
以下の記載から判るように、組換ＤＮＡ技術とストレプ
トミセス宿主とのこの新規な組合せは、広範囲の医薬、
動物健康および工業用途において有用な生産物の大規模
かつ高収率の産生を可能にする。
さらに、本発明のプロモータおよび発現系は、各種の抗
生物質およびその個有用な生産物をコードするストレプ
トミセス由来のＤＮ”Ａ配列の発現を増大するために有
利に使用することができる。
〔発明の実施例〕
本発明を以下の実施例によりさらに詳細に説明する。こ
の説明において次の用語を使用する：ポリペプチド：　
隣接するアミノ酸のα−アミノ基とカルボキシ基との間
のペプチド結合により互いに結合されたアミノ酸の線状
列。
発　現：　ポリペプチドを産生ずるためにＤＮＡ配列ま
たは遺伝子が受ける過程。これは転写（ＤＮＡ配列から
ｍ　ＲＮ　Ａを生成する過程）と翻訳（ｍＲＮＡからポ
リペプチドを産生ずる過程）との組合せである。
プラスミド：　プラスミドが宿主細胞で複製されるよう
な完全「レプリコン」からなる非染色体二重鎖ＤＮＡ配
列。プラスミドを単細胞生物内に挿入すると、生物の特
性はプラスミドのＤＮＡの結果として変化し、或いは形
質転換することができる。たとえば、テトラサイクリン
耐性（Ｔｅｔ”　）に対する遺伝子を有するプラスミド
は、予めテトラサイクリンに対し感受性の細胞をテトラ
サイクリンに対し耐性の細胞まで形質転換することがで
きる。プラスミドにより形質転換された細胞ｆｆ：、ｒ
形質転換体」と呼ぶ。
ファージまたはバクテリオファージ：　細菌性ウィルス
で必って、その多くは蛋白質エンベロブまたはコート（
「カプシド蛋白質」）にカプセル化されたＤＮＡ配列よ
りなっている。
ストレプトミセスクローン化ベクター：（ａ）クローン
化ベヒクルがストレプトミセス宿主において複製しつる
ような完全レプリコンと、（ｂ）１個もしくは少数のエ
ンドヌクレアーゼ識別部位とを有するプラスミド、７ア
ージＤＮＡまたはその他のＤＮＡ配列であって、これら
のＤＮＡ配列はクローン化ベヒクルの本質的な生物学機
能、たとえばコート蛋白質の複製または産生を付随的に
喪失することなく決定可能に切断しうるものである。好
ましくは、ストレプトミセスクローン化ベクターは、最
初に作成されたままで或いはそこに外来ＤＮＡ配列を挿
入した後に、正確に形質転換された細胞の同定に使用す
るのに適する標識、たとえばビオマイシン耐性、チオス
トレプトン耐性、エリスロマイシン耐性、または他の成
る種の他の検出可能な蛋白生産物の産生またはこの種の
生産物もしくは抗生物Ｖ（に対する感受性を有する。ス
トレプトミセスクローン化ベクターはしばしばｊ’）レ
ズトミセスクローン化ベヒクルと呼ばれる。
クローン化：前記生物もしくけ配列の７種から誘導され
る生物またｌｄ：　Ｄ　Ｎ　Ａ配列の集落を無性繁殖に
よって得る過程。
組換ＤＮＡ分子またはハイブリッドＤＮＡｚ生細胞の外
部で端部結合されており、かつ成る種の宿主細胞に感染
し２てそこに維持される能力を有する異なるゲノ４から
のＤＮＡ断片よりなる分子。
ストレプトミセス属の発現制御配列ｊ、　ストレプトミ
セス宿主におけるＤＮＡ配列の発現をこれらＤＮＡ配列
に作用結合された場合にｔｌｉ１徒１するヌクレオチド
の配列。ここで「作用結合」という用語は、所望生産物
をコードしかつ正確な読枠を維持して外来ＤＮＡ配列の
発現および発現制御配列の制御下における所望生産物の
産生を可能にする外来遺伝予め前方におけふ適当な出発
信号またはＤＮＡ配列を有することを意味する。ストレ
プトミセス属の発現制御配列はプロモータ領域並びに各
種の１ベレータ領域、リポソーム結合部位およびその他
の配列を包含し、必要に応じ作用結合されたＤＮＡ配列
の発現を制御するＡＴＧ開始信号を包含する。
ストレプトミセス宿主：　ストレプトミセス属から選択
される微生物菌株ンこれはたとえばニス・アクリミシニ
（Ｓ、　ａｏｒｉｍｙｏｉｎｉ　）、ニス・アルプス（
Ｓ、　ａｌ’ｂｕｓ’　）、ニスｅアズレウス（ｓ、　
ａｚｕｒｅｕｓ　）　、　ニス＊フラジアエ（Ｓ、　ｆ
ｒａｄｉａｅ　）　。
ニス・グラウセツセンス（Ｓ、ｇｌａｕａｅｓ’ｏｅｎ
ｓ’　）、ニス・グリセウス（Ｓ、　ｇｒｉｓｅｕｓ　
）　、ニス・バルブ□シス（Ｓ、　ｐａｒｕｌｕｓ　）
、ニス自グリスチナエスピラリｘ　（Ｓ、　ｐｒ’１ｓ
ｔｉｎａｅｓｐｉｒａｌｉｓ　）　、ニス・リモスス（
Ｓ、　ｒ”ｉｍｏｓｕｓ　）、ニス・ヴィオラセオチュ
、−バ（Ｓ、’ｖｉｏｌａａｅｏｊｕｂｓ−ｒ　）、ニ
ス・リビダンス（Ｓ、　１ｉｖｉｄａｎｓン、ニス１１
　”コ’エリカラニ（８，ｏｏｅ　Ｉｉａ’ｏｌｏｒ　
）　などのストレプトミセス属の菌株を包含するととが
でき、これらはたとえばヨー占ツバ特許出願第７７、Ａ
ゲタ号明細書に記載されている。
外来ＤＮＡ配列：　蛋白質もしくはポリペプチド、特に
成熟核もしくはウィルス起源のものをコードする非スト
レプトミセス由来のＤＮＡ配列。
上記したように、本発明のストレプトミセス廃現系およ
び方法は、ストレプトミセス属のアミノグリコシドホス
ホトランスフェラーゼのプロキニ□りよりなる群から選
択される少々くとも１種のプロモータを特徴とする。多
数のこの種のプロモータが知られている。これらは、こ
のストレプトミセスにおいて作成されるアミノグリコシ
ドに対する′特定ストレプトミセスの耐性に寄港するも
のと思われる。この種のアミノグリコシドホスホトラン
スフェラーゼの例は、ストレプトマイシンホスホトラン
スフェラーゼ、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ
およびカナマイシンホスホトランスフェラーゼである。
ネオマイシンおよびカナマイシンホスホトランスフェラ
ーゼが好適である。
今回、さらにこの種のプロモニタをアミノグリコシドを
産生じないストレプトミセスにおいて使用すると、プロ
モータの活性が著しく増大され、これは恐らくこれらの
非ブミノグリコシド産生−株にはりブレラ゛すが存栓し
３ｔ４結果であることが突き止められた。したがって、
この種の非アミノグリコシド−生′楯株“を本発明□に
おけるストレプトミセス宿主□として使用す′暮のが好
適である。しかしながら、本発明めプ）ロモータは、ス
トレプトミセス□のアミノクリコしド産生菌株において
も恐らく小さい程度では漬るが活性であり、これらの宿
主も本発明に使用することができる。　゛ 本発明の発現系および方法において、上記した各種のス
トレプトミセス属アミングリコシドホスホトランスフエ
ラ」ゼのプロモータ６をストレプ［セス属の発現制御配
列□で使用し七−゛これらの発現制御配列に作用結合さ
れた□外来ＤｉＡ配列がこれ゛らめ尭現制御□配夕１ｊ
と外来ＤＮＡ配゛列′：とを含有す暮ストレプトミセス
クローン化ベクターにおいズ発現されるのを制御する。
次いで、これらのベグターを使用してストレプトミセス
宿主を形質転換さ・せ、必一つこれら形゛質転換宿主番
培養しで所望のポリペプチドおよび蛋白質を産□生１せ
る。□ 上記したように、これ石の発現系および方法は、各種の
外来ＤＮＡ配列、物に成熟核゛お□′よびウィルス性起
源のもめをストレプトミセス宿主ヤ発現するのに有用で
あ’ｔｏこの種の成熟核およびヴイ”ル償佳り□ＮＡ配
列の例はとト罫よび□動物白血球イシノフエロノ（ＩＦ
Ｎ−α）、繊維芽細胞インタ′フエロン（ＩＦＮ−β）
およ□び免疫インタ゛フエロン（Ｉ’ＦＩＩ−？’）、
・ヒトインジュリ　：１ ン、ヒトお□よび動物成長ホルモンなど、ヒト血清アル
プ゛肴□”ンお１よび各種１の′ヒト血液ファクタおよ
びプヅスミノータン活”性体、組□織およびウロ□キナ
−’１？、　Ｂ□Ｗ肝炎つ゛イルス心核抗原および□表
面抗原、ＦＭＤウィルス抗原などヒト、動物およびウィ
ルス性ポリペプチドおよび蛋白質をフードする配列であ
る。
さらに、本発明の一具体例において、本発明のストレプ
ｉ・ミセスプロモータおよび発現系を使用して各種の抗
生物質およびその他の生産物をコードするストレプトミ
セス由来のＤＮＡ配列の発現を増大させうることを了解
すべきである。この具体例において、本発明のプロモー
タおよび発現系を使用して、ストレプトミセスにおける
抗生物質などの産生の生物学的過程における律速段階の
速度または収率を向上させる。
このような具体例において５本発明のプロモータまたは
発現系を、代謝経路の律速段階における生産物をコード
するＤＮＡ配列に作用結合させる。
さらに本発明の発現系を有する有用なストレプトミセス
クローン化ベヒクルの範囲には多数の変種も可能である
ことを了解すべきである。
たとえば、広範囲の完全レプリコンをこれらのクローン
化ベクターに使用することができる。
この種のレプリコンは、ストレプトミセスで使用しうる
任意のプラスミドおよびファージから選択することがで
きる。これは、今日壕で検査・したストレプトミセス菌
株の３０ｑ６以上がプラスミドを有するため、極めて多
数存在する。たとえばケー・エフ・チェター、上記：ヨ
ーロッパ特許出願第７７．　、＜　４ＬＰ号；ティー・
ギーザー等、上記およびシー・ジエーートンプンン等、
ネイチャー、上記参照。これらのプラスミドまたはファ
ージからのレプリコンを本発明のストレプトミセスクロ
ーン化ベヒクルに使用することができる。
勿論、上記全てのレプリコンが特定のストレプトミセス
において同等な効率をもって機能するとは限らない。た
とえば、成る種のレプリコンは特定ストレプトミセスに
おいて他のレプリコンよりも抑制される。特に重要なこ
とに、成る種のレプリコンは他のレプリコンよりも多数
のコピーを与える。当業者は、本発明の原理および教示
にしたがって特定ストレプトミセスに有用なレプリコン
を選択することができる。本発明のストレプトミセスク
ローン化ベクターおよび発現制御系においては、ｐＩＪ
／θノの高コヒーレプリコンを使用するのが好適である
〔ティー・キーザー等、上記〕。
さらに、広範囲の選択可能な標識およびエンドヌクレア
ーゼ識別部位を、本発明の発現系に有用なストレプトミ
セスクローン化ベヒクルニおいて使用することができる
。たとえば、この種の標識はネオマイシン、チオストレ
プトンおよびエリスロマイシンに対する耐性もしくは感
受性または検出可能な生産物、たとえばチロシンをメラ
ニン（黒色生産物）まで重合するチロシナーゼの産生ま
たは産生欠如を包含する。本発明の１つの好適具体例に
おいては、チロシナーゼ産生および産生欠如を外来ＤＮ
Ａ配列の挿入に対する分別可能（黒−白）標識として使
用するのが好適である。この好適具体例においては、さ
らにチオストレプトン耐性金コードするＤＮＡ配列をも
ったストレプトミセスクローン化ベヒクルを使用するの
が好適である。
本発明のストレプトミセスクローン化ベヒクルおよび発
現系における有用な制限部位は、たとえば旦凹ｔｖＩ但
蝉Ｌ（Ｉ、１均佳、エフ、斗す１９む工。
Ｓｓｔ　Ｉ並びに利用しうるその他多くの部位またはそ
の組合せを包含する。特定制限部位またはこれら部位の
組合せの選択は、使用する特定ストレプトミセス発現制
御配列およびストレプトミセスクローン化ベクター並び
に発現させることが望まれる特定ＤＮＡ配列によつで調
節される。たとえば、特定蛋白質（たとえば、成熟蛋白
質）を任意の外来アミノ酸を伴わずに産生させる場合、
選択する制限部位はこの蛋白質をコードするＤＮＡ配列
を所望蛋白質を細胞により産生させうるように発現制御
配２列に結合させることかできねばならない。
本発明の生産物および方法において有用な制限部位は、
本発明の範囲を逸脱することなく、当業界で周知された
方法によｐ本発明の発現系で作成することができる。こ
の種の方法は、所望のエンドヌクレアーゼ識別部位を有
する合成もしくは天然ＤＮＡ断片を使用すること、或い
はこの種のり、　Ｎ　Ａを改変して所望の部位を生ぜし
めることを包含する。
上記したように本発明の発現系および方法において、有
用なストレプトミセス属の発現制御配列は、ストレプト
ミセス属のアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ
のプロモータよりなる群から選択される少なくとも１種
のプロモータを特徴とする。しかしながら、さらＫこれ
らの発現制御配列はこれに作用結合されたＤＮＡ配列の
発現を制御するのに必要であることが知られた他のヌク
レオチド配列をも包含することを了解すべきである。こ
の種の他の必要な配列は、たとえばオペレータ配列、シ
ャインーダルガルノ配列およびリポソーム結合部位を包
含する。
本発明の好適具体例においては、同じストレプトミセス
属のアミングリコシドホスホトランスフェラーゼからの
プロモータおよびその他の必要な発現配列を使用するの
が好適であるが、本発明はそれのみに限定されない。寧
ろ、ストレプトミセス属のアミングリコシドホスホトラ
ンスフェラーゼの上記に規定したプロモータの少なくと
も１種を、広範囲の原料から得られる合成もしぐは天然
の他の発現配列と組合せて、本発明の発現制御配列を作
成することができる。
たとえば５本発明の発現制御配列のリポソーム結合部位
もしくはシャインーダルガルノ配列またはその両者を、
他のストレプトミセス生成蛋白の合成を制御するＤＮＡ
配列から、または発現することが望まれる蛋白質の合成
を制御するＤＮＡ配列から、または無関係の蛋白質の合
成を制御するＤＮＡ配列から、または合成によｐ或いは
これら原料の任意の組合せにより、銹導することができ
る。本発明の実施に必要とされることは、プロモータを
上記した種類のプロモータから選択することである。
さらに本発明のストレプトミセス属の発現制御配列は、
構成的であっても制御自在であってもよいことを了解す
べきである。しかしながら、たとえば温度変化により或
いは発酵培養物に活性化合物を添加することにより制御
しうるまたは誘発しうる発現制御配列が好適である。こ
の場合、培養物は所望ＤＮＡ配列の発現が活性化される
前に高細胞密度まで増殖させることができる。誘発操作
のこの方式は、産生される生産物が細胞に対し本来毒性
であるがまたは発酵の際に産生されるレベルにおいて細
胞に対し毒性である場合に特に重要である。
さらに、必らずしも全てのストレプトミセス発現制御配
列が特定ストレプトミセス宿主における特定外来ＤＮＡ
配列の発現を制御する際に同等に機能するとは限らない
ことを了解すべきである。寧ろ、所定油虫におけるプロ
モータの転写および翻訳強さ、並びにその抑制１発現制
御配列と発現すべき外来ＤＮＡ配列との間の空間的およ
び配列的関係、宿主における…ＲＮＡ転写の安定性、宿
主に対する腕生物の拗’ｒｌｌ＝、並びに宿主の増殖条
件のような種々の因子ｒ考臆せねばならない。しかしな
がら、これら因子を考慮することにより、当業者はスト
レプトミセス属の発現制御配列と外来ＤＮＡ配列とスト
レプトミセス宿主との適当な組合せを選択して、所望Ｄ
ＮＡ配列の高レベルの発現’Ｈ！）るこ七ができる。
本発明の好適具体例においては、アミングリコシドホス
ホトランスフェラーゼのストレプトミセス発現制御配列
と、アミノグリコシドを産生じないストレプトミセス宿
主とを使用するのが好適である。特に好ましくは、スト
レプトミセス宿主は、この宿主を形質転換させるために
使用される発現系を劣化もしくは分解するような如何な
る制御エンドヌクレアーゼをも産生じない。
本発明の発現系および方法の７つの好適具体例において
は、一般に発現系と共に使用されるストレプトミセス宿
主から分泌されるポリペプチドもしくは蛋白質の信号配
列の少なくとも７部をコードするＤＮＡ配列、或いはス
トレプトミセスにおいて機能的であれば、外来蛋白質自
身の信号配列をコードするＤＮＡ配列の１部を使用して
挿入ＤＮＡ配列の生産物をストレプトミセス宿主から分
泌させかつ熟成させることができる。この好適具体例に
おいて、信号配列をコードするＤＮＡ配列は本発明のス
トレフトミセス発現制御配列に作用結合され、さらに発
現させることが望ましい外来ＤＮＡ配列に対し同じ読枠
にて通常の信号配列の開裂位置を介して結合させる。こ
のようにして外来ＤＮＡ配列によりコードされる生産物
は、ストレプトミセスまたはその他の信号配列と外来蛋
白質とよりなる恐らく融合蛋白質として作成される。次
いで、信号配列は、ストレプトミセス細胞膜を介する融
合蛋白質の移動と信号配列の開裂による所望蛋白質の熟
成とを行なう。たとえば、エル・ビラーコマロフ等、「
プロインシュリンを合成するバクテリヤクローン」、グ
ロシーデイング串ナショナルのアカデミ−・サイエンス
−ＵＳＡ。
第７ｊ巻、第３７．２７−３７頁（ｌｙｇｌ）；ケー・
タルマッシ等、［プロインシュリンへのプレグロインシ
ュリンのバクテリヤ成熟」、プロシーディング・ナショ
ナル・アカデミ−・サイエンス・ＵＳＡ、第７７巻、第
３２ざｇ−Ｆ２頁、（ｌりざθ）；ケー・タルマツチ等
、［成熟核信号配列は大腸菌においてインシュシン抗原
を移動させる」、プロシーディング・ナショナル・アカ
デミ−・サイエンス・Ｕ　Ｓ　Ａ　、第７７巻、第３３
り６−７３頁（／９ざ０）参照。
本発明の他の具体例においては、他の蛋白質もしくはポ
リペプチドの少なくとも７部またはストレプトミセスか
ら分泌される蛋白質もしくはポリペプチドの信号配列の
少なくとも７部をコードするＤＮＡ配列、および本発明
の発現制御配列と所望外来ＤＮＡ生産勢をコードするＤ
ＮＡ配列との間の蛋白質もしくはポリペプチドに対する
コード配列の１部を使用する。この具体例においては、
ＤＮＡ配列によりコードされる蛋白質もしくはポリペプ
チドの１部と外来蛋白質もしくはポリペプチドとよりな
る融合蛋白質が産生される。この種の融合蛋白質は、ワ
クチンにおける改良イミュノジェンとして或いは劣化防
止手段として使用することができる。
この種の作成は、さらに特定宿主における発現のレベル
を向上させるのに有用である。
本発明を一層明確にするため、以下実施例により本発明
をさらに説明する。
この実施例は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ
のプロモータを特徴とする本発明のストレフトミセス発
現系および牛成長ホルモン（Ｂ　Ｇ　Ｈ）をコードする
ＤＮＡ配列をストレプトミセスにおいて発現するための
系およびプロモータの使用を示している。
第１図および第一図は、本発明の発現系の作成における
／具体例を示す略図である。この系においては、ネオマ
イシンホスホトランスフェラーゼのプロモータおよびそ
の他の発現制御配列を使用した。
第１図および第２図に示した具体例において、先ずプラ
スミドｐＩＪＪを用いて作成を開始しり〔シー響ジェー
Φトンプンン等、ネイチャー、第２ｇ６巻、第ｊＪ、　
ｊ　−，２７頁（／９１１０）　）ｏ第１図に示したよ
うに、ｐＩＪＪはネオマイシンホースホトランスフェラ
ーゼをコードスルニス・７ラジアエ（Ｓ、　ｆｒａｄｉ
ａｅ　）からのゲノムＤＮＡ配列を含有する。ｐＩＪ２
を使用して、アミノグリコシドを産生ぜずかつネオマイ
シンに感受性でるるニス・リビダンス６６を形質転換さ
せり場合（エヌΦロモウスカヤ等、ジャーナル・バイロ
ロジー、第り巻、第コｊざ一６２頁（ｌり７２）；ジョ
ン・インネス・ストック　４／Ｊ、２Ａ）、形質転換さ
れた菌株はネオマイシンに対し耐性となった。きらに、
このネオマイシンホスホトランスフェラーゼ活性は高レ
ベル（λ、４Ｕ／Ｉｎｇ）にて発現され、かつ５ＤＳ−
ＰＡＧＥにより豊富な挿入体特異性の３２，０００ダル
トンの蛋白質が得られた。
初期、静止期のニス・リビダンス（Ｓ、ｌ１ｖｉ−ｄａ
ｎｓ）（ｐＩＪ、２）の菌糸体可溶性蛋白抽出物を作成
し、これを音波処理および遠心分離によって酵母抽出物
−マルトエキストラクト培地（ＹＥＭＥ）において増殖
させた〔シー・リュー・トンプソン等、ジャーナルｅバ
クテリオロジー、第１ｊ／巻、第６７１−１３頁（ｌり
Ｉｒ、２）〕。
次いで、このネオマイシンホスホトランスフェラーゼ活
性を抽出物から硫酸アンモニウム沈澱（ｔＯ−タＯチ飽
和）およびＩ（ＰＬＯ（ウォータース、ブラウンリー・
カラム（０，０１１Ａｔ）ｔｂ）、逆転相クロマトグラ
フィーのためのＲＰ３００Ｃｔｌマトリックスを充填）
によって精製した。
ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ活性を単一ピー
ク（り０％回収率）として、：ｙ、ｔ　％トリフルオロ
ー酢酸を含有する４Ｉ−０−１００φアセトニトリル勾
配においてり／チで溶出させた。活性フラクションをプ
ールした後、これらを凍結乾燥し、水に対して透析し、
かつ５ＤＳ−ＰＡＧＥまたはアミノ酸分析にかけた（ア
プライド・バイオシステム、モデル’１７０Ａ型、気相
蛋白配列決定器）。ブロックした（ホルミル化した）ア
ミン末端を検出しないような条件下で行なったこの分析
の結果、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ活性の
アミン末端配列がＮ、Ｈ２−未知−Ａｓｐ　−Ａｓｐ−
８ａｒ　−Ｔｂｒ−Ｌｅｕ−未知一未知−Ｌｙｓ−Ｔｙ
ｒであることを決定した。
次いで、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼをコー
ドする遺伝子とその発現制御領域とヲ有するｐＩＪ２の
ニス・フラジアエ由来の配列の７部に関するヌクレオチ
ド配列をマキサム−ギルバート技術によって決定した〔
ニーφマキサムおよびダブリュー・ギルバート、メソッ
ド−イン番エンチモロシー、エル・グロスマンおよびケ
ーーモルディブ編、アカデミツク・プレス社、ニューヨ
ーク、第４ｔ（１）巻、第弘タターｓ１．ｏＱ（ｔｙｒ
θ）〕。ヌクレオチド配列決定は、ニス・フラジアエ由
来のＤＮＡ配列の部分をイー・コリクローン化ベクター
中ヘザプクローン化することにより行なった。例数なら
、これはイー・コリ宿主における配列決定に必要とされ
る多量のＤＮＡを産生するのがより簡単であるからであ
る。この配列を第３図および第μ図に示す。さらに、ネ
オマイシンホスホトランスフェラーゼをコードするＤＮ
Ａ配列の開始を、この蛋白質につき予め決定したアミノ
末端配列およびこの蛋白質の完全アミノ酸配列と比較し
て第３図および第４図に示す。さらに、ネオマイシンホ
スホトランスフェラーゼの３′および５′非コード領域
の部分をも第３図および第ｊ図に示す。第３図に示した
ように、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＤＮＡ
配列のコード領域の開始部にはＮｏｏ’Ｉエンドヌクレ
アーゼ識別部位が存在した。
第３図に示し次ｊ′非コード領域には、イー・コリにお
ける遺伝子発現につき提案さｔｔだ一般的配列と比較し
て、ニス・フラジアエネオマイシンホスホトランスフエ
ラーゼの転写赴よび翻訳を制御するようなりＮＡ配列を
ｌ特定的に同定することができなかった〔エム・ローゼ
ンベルりおよびディー・コート、アニュアル・レビュー
φジエネテイツクス、第１３巻、第３／ター、ｔ３頁（
ｌり７り）；エル・ゴールド等、アニュアルΦレビュー
ｅマイクロバイオロジー、　第３５巻、第３６６−≠０
３頁（／りｇｌ）〕。或いは、バチルス・ズブチリスに
つき提案されたような配列を同定することができ外かっ
た〔エム・ゼット−ギルマン等、ヌクレイツク−アシッ
ド書リサーチ、第り巻、第５タデ／−６０００頁（ｌり
ｇｌ）〕。しかしながら、この配列においてコード配列
のＳｓｔ　ｌ制限部位と開始部との間におけるストレプ
トミセスプロモータの存在（第３図）が、本発明におけ
るゲノム配列の担１１断片を特徴とする各種のプラスミ
ドで形質転換されたストレプトミセス菌株においてネオ
マイシンホスホトランスフェラーゼの発現により確認さ
れた。
次いで、ｐＩＪ、２のへｌＫｂ尺す■断片をｐＢＲＪ、
２．２のＰｓｔ１部位にザブクローン化させて、ｐＩＪ
３２を作成した（第１図）。プラスミドｐＩＪＪ、２は
ネオマイシンホスホトランスフェラーゼの最初の一２／
３に対するコード領域と、そのプロモータおよび発現に
必要なその他の配列を含有した。ｐＢＲＪ、２．２はイ
ー・コリのレプリコンを有するので、このサブクローン
化はイー・コリにおいてその後の作成を行なうことを可
能にした。
次いで、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ由来の
ＤＮＡ配列を有するρＩＪＪ、！の／、／Ｋｂ旦すＩ断
片を単離し、これをイー・コ＋）ＪＭ１０／を用いてＰ
ｓｔ　Ｉ部位ｐＵＣり中へサブクローン化させた〔ジエ
ー・ビエイラおよびジエー・メツシング、「ｐＵＣプラ
スミド、すなわち一般的合成プライマに関する挿入突然
変異および配列決定のためのＭ／ｊｍｐ７−に基づくシ
ステム」、ジイーン、第１り巻、第、２ｊタ一６♂頁（
／りｌｒ、２）’）。得られたプラスミドをｐＥＣ／り
と命名した。
第１図に示したように、このプラスミドは、プロモータ
の上流における一連の有用な制限部位ト、ネオマイシン
ホスホトランスフェラーゼ由来のＤＮＡ配列の発現制御
領域（すなわち、遺伝子に対し、／）　とを有した。さ
らに、このｐＵＣり由来のプラスミドを操作すべくイー
中コリ宿主において作業することができた。
次いで、ｐＥｃ／りから約ｔｏｏｏｂｐべ叩ニー　Ｅｏ
ｏ　ＲＩ断片を単離し、この断片はネオマイシンホスホ
トランスフェラーゼ配列のプロモータと発現制御領域と
を有した（第３図）。ネオマイシンホスホトランスフェ
ラーゼのコード配列のＡＴＧ開始コドンはＮａｏＩ部位
の７部であるため、このｔｏｏｂｐ断片はネオマイシン
ホスホトランスフェラーゼ由来のＤＮＡ配列の非コード
ｊ′領域を含み、かつこの蛋白質に対するコード領域の
開始部で終端する。
ネオマイシンポスホトランスフェラーゼ発現系を有する
上記のｔｏｏｂｐ断片をｐ／＆７のＮｅｏ　Ｉ一旦叩−
ＲＩ断片と組合せた（第１図）。
後者の断片は、牛成長ホルモン（ｒＢＧＨＪ　）に関す
るコード領域を有した。このｐ／６７はジー・プエル氏
の寄贈物である。これは／りｇλ年ｇ月１６日付けで、
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託
し、ＡＴＣＣ寄託番号３り１７３号を受けた。この培養
物は本明細書の後記に記載した培養物と同時にかつ同じ
条件下で使用することができる。
この新規なプラスミドをｐＥｃ２’ｌと命名した（第１
図）。これは、完全な構成において■些工結合を介して
ｒ−ｍｅｔＢＧＩ（のコード配列のＡＴＧ開始コドンに
結合したネオマイシンホスホトランスフェラーゼのプロ
モータと発現制御配列とを有した。
現 ｐ　Ｅ　Ｃ２４ｔからの約／３００ｂｐ桓）ｉＩ断片を
ストレプトミセスプラスミドｐ　Ｉ　Ｊ７０．２の拘り
Ｂ部位中ヘクローン化させた（第２図）。
物理的寸法決定による正確な形質転換体およびμ已１部
位の欠如を選択した（ＢａｍＨＩおよびＢｇ１１部位の
結合はいずれの部位も再生しない）。
プラスミドル工Ｊ７０コはｐ　Ｉ　Ｊ／　０／の訪導体
である〔ティー・キーザー等、モレキュラー争ジェネラ
ル・ジエネテイツクス、第”’巻、第コλ３−３ざ頁（
／り、ｒ−２）　’）。ｐＩＪ７（７／（後記）の他の
訪導体であるｐＩＪ７０３の試料を寄託した。プラスミ
ドｐＩＪ７０コおよびｐＩＪ７０Ｊは、チロシナーゼ決
定子（ｍｌ）をコードする遺伝子とチオストレプトン耐
性（ｔｓｒ　）をコードする遺伝子とを含有する断片が
入替えられている以外は同一のハイブリッドである〔イ
ーｅキャツッ等、ジャーナル・ジェネラル−マイクロバ
イオロジー％　第ｔ２ｙ巻、第、２７０３−／グ頁（／
？ざ３）〕。このプラスミドはチオストレプトン耐性を
コードする遺伝子を含む。さらに、これはチロシナーゼ
をコードする遺伝子をも含む（第２図）。チロシナーゼ
は、チロシンを黒色であるメラニンまで重合させる。こ
の遺伝子の馬已■部位における外来ＤＮＡ挿入により失
活されたチロシナーゼ遺伝子を有するクローンはチロシ
ンの存在下で白色であり、これはこの種の挿入体をもた
なイ黒色のクローンと対称的である。この黒色−白色分
別を用いて、これらクローンのいずれがストレプトミセ
スネオマイシンホスホトランスフェラーゼプロモータと
発現制御配列とを含有するＤＮＡ断片とＢＧＭのコード
配列とにょって正確に形質転換されたかを決定した。
プラスミドｐＩＪ７０２を用いてニス・リビダンス乙６
〔ジョーンΦインネス・ストック涜／Ｊ、２Ａｉロモウ
スカヤ等、ジャーナル・パイロロジー、第り巻、第２！
ｇ−６２頁（／り７．２）’１を形質転換させ、そして
白色コロニーを選択した。プラスミドｐ　ＢＯ２２を含
有するこれらコロニーの１つをニス・リビダンスＴＣ９
ｇと命名した（第２図）。この培養物の試料を寄託した
（後記）。
ニス・リビターンスＴＣりｇをＹＥＭＥおよび最小培地
において数週間までの種々の時間にわたり３０℃にて培
養した。次いで、遠心分離およびリゾチーム処理または
音波処理により細胞抽出物を作成し、そしてＢＧＨの存
在につき抽出物を分析した。これら抽出物中にＢＧＨを
検出した。形質転換されたストレプトミセス菌株のＢＧ
Ｈ産生は、先ず定常状態のレベルまで上昇した。このレ
ベルの産生け、次いでストレプトミセスの植物増殖が完
結する甘で数週間にわたり維持された。
ニス・リビダンスの溶菌物における蛋白質を５ＤＳ−Ｐ
ＡＧＥによりかつ次いで免疫吸収によって分析したが、
実際のホルモンより小さい免疫反応性生産物が見られず
、このことはニス・リビダンスにおいてＢＧＭが劣化さ
れないことを示唆する（この過程は／弘Ｋｄより小さい
分解生産物を検出しない）。
ＢＧＨ遺伝子を含むプラスミドをイー・コリおよびニス
・リビダンスに導入して、これら２１１（＋の宿主にお
ける遺伝子の発現を比較した。細胞の全蛋白質含量に対
し収率を基準化した場合、ニス・リビダンスはイー嗜コ
リに含まれるホルモンの３倍を含有したことが確認され
た。いずれの菌株の増殖後にも、培地中にはＢＧＨが検
出されなかった。
成熟ＢＧＭをコードするＤＮＡ配列を、成熟ＢＧＨの最
初の２個のアミノ酸に対するコード領域が除去されてお
りかつＣＴＧからＴＴＧまで改変されたＩＯ番目のアミ
ノ酸のコード領域がそのアミノ酸（ロイ７ン）を変化し
ない変化を受けているＤＮＡ挿入体で交換することによ
り、ニス・リビダンスからのＢＧＨの収率を著しく増大
させうることが判明した。
勿論、本発明の上記具体例はネオマイシンホスホトラン
スフェラーゼのプロモータおよびその他の発現制御配列
と、ＢＧＨをコードするＤＮＡ配列との組合せに関する
ものであるが、この作成は同様に種々の他の工程順序で
も行ないうろことを了解すべきである。たとえば、ＢＧ
ＨをコードするＤＮＡ配列を所望の９．現制御配列を既
に有するストレプトミセスクローン化ベクター中に挿入
し、或い（ｌ−ｉ発現制御配列をＢＧＨコード配列を既
に有するストレプトミセスクローン化ベクター中に挿入
することもできる。
さらに、この実施例における全発現制御配列ヲネオマイ
シンホスホトランスフエラーゼ遺伝子から採取する必要
がないことも了解すべきである。上記したように、本発
明の発現制御配列のプロモータのみをストレプトミセス
属のアミングリコシドホスホトランスフェラーゼから誘
導する必要がある。発現制御配列の他の要素は、独立し
て別途に訪専し或いｅよ作成することができる。
さらに、最終的ストレプトミセス発現系に到る操作をイ
ー・コリにおいて行なう必要がないことを了解すべきで
ある。寧ろ、これらは任意の宿主菌株で行ないうるであ
ろう。しかしながら操作、形質転換および菌株における
増殖が容易であるため、イー・コリを使用するのが好適
である。
最後に、ｐＩＪ７０．２のレプリコンが機能的である任
意のストレプトミセス宿主をこの実施例に使用して、牛
成長ホルモンを産生じうろことを了解すべきである。
本発明の方法により作成された微生物および組換ＤＮＡ
分子は、／りｒｓ年６月６日付けでメリーランド州、ロ
ックビル在、アメリカンΦタイプ・カルチャー・コレク
ションに寄託されかつ。
Ａ：ストレプトミセスφリビダンス６ｔ（ｐＩＪ７（７
Ｊ） Ｂ：ストレプトミセス・リビダンス６６（ｐＢＧ２．２
） もしくはニスΦリビダンスＴＣりざ と同定された培養物により例示される。これらの培養物
は、それぞれ寄託番号第３２３７ｇ号および第３２３７
り号を受けている。
上記と同様な方法を使用して、ヒト血清アルブミンをコ
ードする遺伝子をニス・リビダンスで発現することに成
功した。これは、本発明の方法が各種の遺伝子をストレ
プトミセスで発現するのに有用であることを示す。
以上、本発明を多くの具体例につき説明したが、この基
本構成を改変して、本発明の方法および組成物を利用す
る他の具体例を提供しうろことが明らかである。したが
って、本発明の範囲は上記の具体例のみに限定されない
ことが了解されよう。
〔発明の効果〕
本発明の上記構成により、初めて成熟核、ウィルス性ま
たはその他の外来ＤＮＡ配列をストレプトミセス属でク
ローン化し、これによシコードされるポリペプチドをス
トレプトミセスで産生ずることが可能となった。
【図面の簡単な説明】
第１図および第２図は本発明のストレプトミセス発現系
の／具体例およびこの系を使用して所望の動物ホルモン
（牛成長ホルモン）を産生ずる方法の略図であり、 第３図および第７図はネオマイシンホスホトランスフェ
ラーゼ並びにそのＤＮＡ配列の３′およびｊ′非コード
領域の部分をコードするヌクレオチド配列およびそのア
ミノ酸配列を示す配列図であり、ネオマイシンホスホト
ランスフェラーゼコード配列のプロモータおよびその他
の発現制御配列は第３図に示したｊ′非コード領域にお
いてこのコード領域のＳｇｔ　１部位と開始部との間に
位置する。 図面の浄書（内容に変更なし） ０　０　０　０　０　０　０　’０ ■　へ　００　５Ｏｔｊ）　Ｗ　００ −　−　へ　Ｎ”ｔ　ｌ／Ｖ３＋ｒ −Ｃフ　−　（）　＋　ＬＪ　−（Ｊ　−＊コ　＋　（
り＋＠　−ＬＪＯ−ＬＪ＞ｔＪ　ＬＯｔＤｌ−１−ヒｍ
　ＬＪＩＪ　＋４０．ｎｌ、−Ｕ　ロ　■　く　リ〉　
Ｕ山　００ＬＪ　（ｆｊ　＋−Φ　くつ　Ｏα　Ｕ−（
Ｊ　ＬＪ　Ｌｊ　（＋−Ｌｌ−１＜Ａ　ｕａ＋ヒ　ト　
Ｕ　く　く　ロ＜　Ｑリ　ＨりＬＤ　Ｑ　（■　ＬＪ　
ｔＪψ　ＬＪＯ■コＬＯＬ）　ＬＪ　（ｔＪ　＜ｄｔＪ
ｌａ　＋−ωく　■　■　ＬＪ　１．）　ＬＪ工　Ｑ〜
　Ｑ−■　Ｕ　■　く　ヒ　ロα　Φコ　Ｕα−ＣＪ　
−ｅ　−ＬＪ　−ＬＪ　−ＬＪ　−ＣＤＩＪ　−（−争
くψｔＪ　ｌ−ｔＪ　■　ヒ　Ｉ−←　ＷＶ　Ｗ＜Φ　
ＬＪ　ｌ−ｕ　ＬＪ　Ｌ）コ　ＬＪＯＬＪωυ　じ　ｔ
Ｊ　ＬＪ　υ　（−１（ＪＩＪ　＋ぶＬＪ　）−ＬＪ　
ＣＪ　Φ　ＣｊＣ！ｌ　ＣＪＩｌｌｉ　１−ＩＬＬＯＬ
Ｊ　（ｕ　υ　ＱΦ　Ｕ冶　Ｕ旬ＱＬＪ　■　く　υ　
くＨ■−Ｕ− ｃＪ　１−　Ｌ）　ＬＪ　ｌ−ｕＥ　！ＩＪ　！＜＋Φ
−ＬＪ　−）−−（−Ｌ：Ｉ−１５■−ＬＪＩＪ−ＬＪ
句困　６　Ｂ　：　ｇ　：、ｆ：に　＝タ　８宗Ｌ）　
ＩＪ　ロ　１−　Ｃり　ＬｊＯＮ　Ｌｌｌ−Ｉ　ＬＪ１
７１吊　８　８　目　３　８時　二ｇ　８曝Φ　Ｉ−Ｌ
Ｊ　１．４）　ｄ　Φり　Ｑω　ＱＯ（Ｊ　ＬＪ　（ｊ
　ＬＪ　Ｌ）　、ｌ−ω　トぶ　０餉ヒ　ＬＪ　（Ｊ　
ｕ　ｕ　＋−１−−Ｕ山０　０　０　０　０　０ ｚ　ＣＪ　の　へ　の　ζ い　Φ　■　ｋ　ｈ　ω −Ｘコ　鼎　ジ　注　津　津 ＣＪ２　１Ｊ）＋６　Ｌ）ｅ　ＬＤ、−Ｉ　ＬンＨＯα
コ３　呂四　３赳　＝；　−２き埒 ０餉　Ｕ煽　Ｕ坊　ｔＪ’ＯＣＪ仁　Ｕ（°＝ε　−呂
冒　て詔　８と−３埒゛８Ｊ第１頁の続き ＱＩｎｔ、ＣＩ、’　識別記号　庁内整理番号Ｊ−７糸
ダ５　ネ市　１１巳　−ト（方式）昭和５１１イ「（）
月６　ｔＪ ’Ｒｒ＋ｉ’ｌ庁ＩＱ゛自　志　ｉ＝、：　、ｉｉ！ｌ
１ｌＪ１、’Ｉｉ（’ｌの表小 昭和５１凶　’ｌ！Ｉ”ｉｆ”１願　第１１５〔）４２
号２　発明θ片′１■ｊ１゜ ソ訃しゾトミセス発現糸才；よびＩ）ＮＡ配列をストレ
ゾトミ１！スで発現する力ｌ去 ３、袖１１．をＪる省 １１１（’ｌトノ関１余’１４＋１ｉ’１ｌｌｉｌ＋）
ＩＡ名称　ハ・イ」ジｆ、ン　チーム１ｊ−ス　ヘンツ
ノ１ノやノゾ（ｊ１１７１髪）　（オーシンダ領“）′
ンチル）４代理人 ６　補正の内容 −に　糸売　ネ市　Ｊｌそ　’ｉＩ；’　（方式ン昭用
ｇ８年＋−ＩＪＪ金Ｉ１１ ’ｌ！Ｉ’ｊ’Ｒｊｌｋ’１Ｙ、こ、（゛ｔ　′」＋、
　Ｉ、ｆｕｌ　°Ｉｌ’ｌ　Ｏ）Ｊ、小 昭和”　”ｌ　４．′ｒ＋：’ｌ’１頭　第Ｎ５ら４２
１．、；′ｌ　発明の名称 ・′）　袖１１４・するＩＩｆ ’Ｉ＋ｉ’ｌ）ノ閏１系４’＋１：’ｌ’：ｌｉＩ！’
ＩＩｖ＼′ｃ′１付、ハ・１′ね１．−ン　ノ＝ム１１
−ス　・、ンノノ１ノー１ノブ（国１１°ｉ）　（オソ
ンタイｉｌ’ｌ“）′ンーｆ−ル）４、ｌ（：　ｌ甲　
人

Claims (9)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）ストレプトミセス属のアミノグリコシドホスホト
    ランスフェラーゼのプロモータよりなる群から選択され
    る少なくとも１種のプロモータを特徴とする、外来ＤＮ
    Ａ配列をストレプトミセスで発現するためのストレプト
    ミセス発現系。
  2. （２）　ストレプトミセス属のアミングリコシドホスホ
    トランスフェラーゼがネオマイシンホスホトランスフェ
    ラーゼである特許請求の範囲第１項記載の発現系。
  3. （３）外来ＤＮＡ配列が成熟核およびウィルス性ＤＮＡ
    配列よりなる群から選択される特許請求の範囲第１項ま
    たは第１項記載の発現系。
  4. （４）外来ＤＮＡ配列がヒトおよび動物の白血球、繊維
    芽細胞および免疫インタフエロン、ヒトインシュリン、
    動物およびヒトの成長ホルモンおよびその他のホルモン
    、ヒト血液ファク・り、Ｂ型肝炎ウィルス抗原およびＦ
    ＭＤウィルス抗原をコードするＤＮＡ配列よりなる群か
    ら選択される特許請求の範囲第３項記載の発現系。
  5. （５）外来ＤＮＡ配列をストレプトミセス属の発現制御
    配列に作用結合させ、前記発現制御配列がストレプトミ
    セス属のアミングリコシドホスホトランスフェラーゼの
    プロモータより邊る群から選択される少なくとも／８！
    のプロモータで６．Ｌことを特徴とする、外来ＤＮＡ配
    列をストレプトミセスで発現する方法。
  6. （６）ストレプトミセス属のアミングリコシドホスホト
    ランスフェラーゼがネオマイシンホスホトランスフェラ
    ーゼである特許請求の範囲第５項記載の方法。
  7. （７）　外来ＤＮＡ配列を成熟核およびウィルス性　゛
    ＤＮＡ配列よりなる群から選択する特許請求の範囲第５
    項または第６項記載の方法。
  8. （８）外来ＤＮＡ配列を、ストレプトミセスから分泌さ
    れる蛋白質もしくはポリ、ペプチドの信号配列の少なく
    と、も１部またはストレプトミセスにおいて機能する他
    の信号配列の少なくとも１部をコードするＤＮＡ配列゛
    を介してストレプトミセス属の発現制御配列に作用結合
    。 させ、信号配列をコードする前記ＤＮＡ配列を前記スト
    レプトミセス属の発現制御配列の制御下で前記外来ＤＮ
    Ａ配列と一緒に発現させて、外来ＤＮＡ配列によりコー
    ドされた蛋白質もしくはポリペプチドの分泌および成熟
    を生せしめる特許請求の範囲第ｊ項乃至第７項のいずれ
    かに記載の方法。
  9. （９）外来ＤＮＡ配列を、他の蛋白質もしくはポリペプ
    チドの１部または他の蛋白質もしくはポリペプチドの信
    号□配列およびコード配列の１部をコードするＤＮＡ配
    列を介してストレプトミセス属の発現制御配列に作用結
    合させ、前記ＤＮＡ配列を前記ストレプトミセス属の発
    現制御配列の制御下で前記外来ＤＮＡ配列と一緒に発現
    させて、融合蛋白質もしくはポリペプチドを産生させる
    特許請求の範囲第ｊ項乃至第７項のいずれかに記載の方
    法。 Ｑｌ　ストレプトミセス属のアミノグリコンドホスホト
    ランスフェラーゼのプロモータよりな□　る群から選択
    される少なくとも１種のプロモータを使用することを特
    徴とする、ストレプトミセス由来の抗生物質もしくはそ
    の郵の生産物の産生を増大させる方法。 αυ　アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼがネ
    オマイシンホスホトランスフェラーゼである特許請求の
    範囲第ｉｏ項記載の方法。。 Ｑ′！Ｊ　アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ
    がカナマイシンホスホトランスフェラーゼである特許請
    求の範囲第１０項記載の方法。
JP59115642A 1983-06-07 1984-06-07 ストレプトミセス発現系およびｄｎａ配列をストレプトミセスで発現する方法 Pending JPS60186289A (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB838315579A GB8315579D0 (en) 1983-06-07 1983-06-07 Streptomyces expression systems
GB8315579 1983-07-07

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JPS60186289A true JPS60186289A (ja) 1985-09-21

Family

ID=10543906

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP59115642A Pending JPS60186289A (ja) 1983-06-07 1984-06-07 ストレプトミセス発現系およびｄｎａ配列をストレプトミセスで発現する方法

Country Status (4)

Country Link
EP (1) EP0148552A1 (ja)
JP (1) JPS60186289A (ja)
AU (1) AU2991884A (ja)
GB (1) GB8315579D0 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS62285789A (ja) * 1986-06-02 1987-12-11 Toyobo Co Ltd コレステロールオキシダーゼの製造法

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4745056A (en) * 1984-10-23 1988-05-17 Biotechnica International, Inc. Streptomyces secretion vector
US4783415A (en) * 1985-03-28 1988-11-08 Meiji Seika Kabushiki Kaisha Gene coding for signal peptides and utilization thereof
CA1295567C (en) * 1988-07-25 1992-02-11 Lawrence T. Malek Expression system for the secretion of bioactive human granulocyte, macrophage-colony stimulating factor (gm-csf) and other heterologous proteins from streptomyces
IL83601A0 (en) * 1986-08-28 1988-01-31 Lilly Co Eli Method for selecting recombinant dna-containing streptomyces and other host cells
WO1988007079A1 (en) * 1987-03-09 1988-09-22 Cetus Corporation Expression of heterologous genes in streptomyces species
ZA929284B (en) * 1991-12-12 1993-06-02 Serono Lab P0438, an new calcium-regulated promoter.
CU23460A1 (es) * 2004-03-18 2009-12-01 Inst Finlay Ct De Investigacio Composiciones vacunales obtenidas a partir de streptomyces

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4416994A (en) * 1981-10-19 1983-11-22 Eli Lilly And Company Plasmid pEL7 and related cloning vectors for use in streptomyces and related organisms

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS62285789A (ja) * 1986-06-02 1987-12-11 Toyobo Co Ltd コレステロールオキシダーゼの製造法
JPH082295B2 (ja) * 1986-06-02 1996-01-17 東洋紡績株式会社 コレステロールオキシダーゼの製造法

Also Published As

Publication number Publication date
EP0148552A1 (en) 1985-07-17
GB8315579D0 (en) 1983-07-13
AU2991884A (en) 1985-01-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JPH0665305B2 (ja) 組換えｄｎａ含有宿主細胞の安定化法
FR2490675A1 (fr) Production microbienne d'interferon de fibroplaste humain
JPS6091986A (ja) ポリペプチドの産生を増強する発現用プラスミド及び該プラスミドを含む形質転換宿主細胞
JPH06504446A (ja) 肺炎球菌タンパクの構造遺伝子
DE3390105C2 (ja)
DE60127561T2 (de) Phagen-abhängige superproduktion biologisch aktiver proteine und peptide
SU1720493A3 (ru) Способ получени штамма SтRертососсUS SaNGUIS, способного секретировать @ -1,3-глюкан-3-глюканогидролазу
WO2023221787A1 (zh) 重组i型胶原蛋白毕赤酵母工程菌及其构建方法与应用
US5650320A (en) Lanthionine antibiotic compositions and methods
JPS60186289A (ja) ストレプトミセス発現系およびｄｎａ配列をストレプトミセスで発現する方法
AU735447C (en) Novel lanthionine antibiotic compositions and methods
SU1479004A3 (ru) Способ конструировани вектора pVM061
JPH01502076A (ja) プロテインｇをコ−ドするクロ−ン化されたストレプトコッカス遺伝子及びプロテインｇを生産するために組み替え微生物を構築するための用途
AU638022B2 (en) Saf polypeptide, gene, promoter and use for expression in streptomyces
JPS60260598A (ja) ポリペプチドの製造方法
CN108531438A (zh) 一种通过改造氨基酸代谢途径制备地衣芽孢杆菌的方法及所得菌株的应用
Chakraborty et al. Overexpression, purification and characterization of recombinant salmon calcitonin, a therapeutic protein, in streptomyces avermitilis
CN108441508A (zh) 通过敲除lrpC基因构建地衣芽孢杆菌的方法及菌株及其应用
CA1222709A (en) Streptomyces expression systems and methods for expressing dna sequences in streptomyces
DE69929590T2 (de) Vektoren zur kontrollierter expression von rekombinanten genen in prokaryontischen zellen
US5340732A (en) Antiviral protein
JP3489865B2 (ja) ヒト成長ホルモンの製造法
CN115232829A (zh) 变异链球菌中的蛋白诱导表达质粒及其制备方法和应用
JP3089287B2 (ja) う蝕ワクチンの製造法
NO864206L (no) Derivat av interleukin-2, dets fremstilling og anvendelse.