JPS5810600A - ブタレラクシン鎖発現のための合成遺伝子 - Google Patents
ブタレラクシン鎖発現のための合成遺伝子Info
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- JPS5810600A JPS5810600A JP57106645A JP10664582A JPS5810600A JP S5810600 A JPS5810600 A JP S5810600A JP 57106645 A JP57106645 A JP 57106645A JP 10664582 A JP10664582 A JP 10664582A JP S5810600 A JPS5810600 A JP S5810600A
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/64—Relaxins
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、レラクシン（ｒｅｌａｘｉｎ ）製造のため
の組み換えＤＮＡ技術に関する。より具体的には、本発
明は、レラクシンのための合成遺伝子およびそれの発現
、相当する組み換えプラスミド２よび形質転換された細
胞およびそれらによる生成物に関する。
の組み換えＤＮＡ技術に関する。より具体的には、本発
明は、レラクシンのための合成遺伝子およびそれの発現
、相当する組み換えプラスミド２よび形質転換された細
胞およびそれらによる生成物に関する。
レラクシンは卵巣およびいくつかの他の組織中に、荷に
燈娠中に生産されるポリペプチドホルモンである。卯集
中で合成され貯蔵されるけれども、ブタ、ラット、モル
モット、マウスおよびハムスターでは、妊娠の末期にな
ると、しばしば劇的に、免疫血清反応性のレラクシンか
上昇する。レラクシンは、ルｂ骨結合、予言、乳腺、ち
よび結合織に影響し、頚管の成熟をおこし、そして分娩
を開始させる（たとえば、５ｔｅｉｎｅｔｚ、 Ｂ、Ｇ
、等、（１９８０）。
燈娠中に生産されるポリペプチドホルモンである。卯集
中で合成され貯蔵されるけれども、ブタ、ラット、モル
モット、マウスおよびハムスターでは、妊娠の末期にな
ると、しばしば劇的に、免疫血清反応性のレラクシンか
上昇する。レラクシンは、ルｂ骨結合、予言、乳腺、ち
よび結合織に影響し、頚管の成熟をおこし、そして分娩
を開始させる（たとえば、５ｔｅｉｎｅｔｚ、 Ｂ、Ｇ
、等、（１９８０）。
１Ｊｉｌａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｕｔｅｒｉｎｅ Ｃｅｒｕ
ｉｘ、凡ａｓ、Ｎａｆｔｏｌｉｎ。
ｉｘ、凡ａｓ、Ｎａｆｔｏｌｉｎ。
Ｆ、、および５ｔｕｂｂｌｅｆｉｅｌｄ、 Ｐ、 Ｇ、
、 Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ。
、 Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ。
Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、 １５７−１７７ ；およびＳｃｈ
ｗａｂｅ、 （３，、等、（１９８Ｑ ）、 Ｒｅｃｅ
ｎｔ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｈｏｒｍｏｎｅ Ｒｅ
５ｅａｒｃｈ。
ｗａｂｅ、 （３，、等、（１９８Ｑ ）、 Ｒｅｃｅ
ｎｔ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｈｏｒｍｏｎｅ Ｒｅ
５ｅａｒｃｈ。
Ｒｅ１ａＸｉｎ、 ３４．１２３−１９９をみよ）。
レラクシンは、イン ピボーおよびイン ビト兄二の両
方の試級および÷の抗原性において顕著な種間反応性を
示し、それでブタのレラクシンは、外科的陣痛の誘導を
必要とする臨床試験に用いられた。（たとえば、上記引
用の５ｔｅｉｎｅｔｚ、 Ｂ、Ｇ。
方の試級および÷の抗原性において顕著な種間反応性を
示し、それでブタのレラクシンは、外科的陣痛の誘導を
必要とする臨床試験に用いられた。（たとえば、上記引
用の５ｔｅｉｎｅｔｚ、 Ｂ、Ｇ。
等： Ｓｃｈｗａｂｅ、 Ｏ，等： Ｏ’Ｂｙｒｎｅ、
ＥｏＭ、 、および５ｔｅｉｎｅｔｚ、 Ｉ：Ｉ、
Ｇ１’（１９７６） Ｐｒｏｃ、Ｓｏｃ、ＫＸｐ、Ｂｉ
ｏｌ。
ＥｏＭ、 、および５ｔｅｉｎｅｔｚ、 Ｉ：Ｉ、
Ｇ１’（１９７６） Ｐｒｏｃ、Ｓｏｃ、ＫＸｐ、Ｂｉ
ｏｌ。
Ｍ６１（ｉ、 、 １５２．２７２−２７６ ；お Ｌ
ａｒｋｉｎ、 Ｌ、Ｈ，等、（１９７９）、Ａｃｔａ
、Ｋｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｉｃａ、 ９２．５６８−
５７６をみよ）。レラクシンの投与後、大部分の患者は
改良された頚管状態を示し、対照に比して、オキシトシ
ンを用いて陣痛を増大する例は減少し、副作用はない（
たとえば、Ｍａｃｈｅｎｎａｎ、 Ａ、Ｈ，等（１９８
０）、 ｒｈ Ｌａｎｃｅｔ、 ２ Ｆｅｂｒｕａｒｙ
、 ２２０−２２５）をみよ。それで、ブタ レラクシ
ンは、陣痛の導入および調節に有用であると考えられる
。
ａｒｋｉｎ、 Ｌ、Ｈ，等、（１９７９）、Ａｃｔａ
、Ｋｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｉｃａ、 ９２．５６８−
５７６をみよ）。レラクシンの投与後、大部分の患者は
改良された頚管状態を示し、対照に比して、オキシトシ
ンを用いて陣痛を増大する例は減少し、副作用はない（
たとえば、Ｍａｃｈｅｎｎａｎ、 Ａ、Ｈ，等（１９８
０）、 ｒｈ Ｌａｎｃｅｔ、 ２ Ｆｅｂｒｕａｒｙ
、 ２２０−２２５）をみよ。それで、ブタ レラクシ
ンは、陣痛の導入および調節に有用であると考えられる
。
出産中の雌豚にブタレラクシンを投与することは、子豚
の死産率を低下さすのにも有用でありえよう。特に、１
度に生ず子豚の数が多い時に、最後の子豚か死産となる
ことか観察された（たとえば、Ａｓｄｅｌｌ、 Ｓ、Ａ
、、およびＷｉｌｌｍａｎ、 Ｊ、Ｐ、（１９４１）。
の死産率を低下さすのにも有用でありえよう。特に、１
度に生ず子豚の数が多い時に、最後の子豚か死産となる
ことか観察された（たとえば、Ａｓｄｅｌｌ、 Ｓ、Ａ
、、およびＷｉｌｌｍａｎ、 Ｊ、Ｐ、（１９４１）。
Ｊ、Ａｇ、Ｒｅｓ、、 ６５．３４５−５５５ ）。こ
こでレラクシン量は減少しているのであろう。
こでレラクシン量は減少しているのであろう。
レラクシンは、インスリン様ポリペプチドノヒとつで、
ジスルファイド橋で結合された２つのポリペプチドｍＡ
およびＢを包合する。（たとえは、Ｓｃｈｗａｂｅ、
Ｃ０，およびＭｃＤｏｎａｌ＋ｉ、 Ｊ、に、、 （１
９７７）。
ジスルファイド橋で結合された２つのポリペプチドｍＡ
およびＢを包合する。（たとえは、Ｓｃｈｗａｂｅ、
Ｃ０，およびＭｃＤｏｎａｌ＋ｉ、 Ｊ、に、、 （１
９７７）。
５ｃｉｅｎｃｅ、 ｉ９７．９１４−９１５ ； ｒ３
ｅ６ａｒｌｃａｒ、 Ｓｏ等（１９７７）、 Ｎａｔｕ
ｒｅ、 ２７０．４４９−４５１ ；工５ａａｃｓ、Ｎ
、 。
ｅ６ａｒｌｃａｒ、 Ｓｏ等（１９７７）、 Ｎａｔｕ
ｒｅ、 ２７０．４４９−４５１ ；工５ａａｃｓ、Ｎ
、 。
等（１９７８）、 Ｎａｔｕｒ６＋、 ２７１．２７８
−２８１をみよ）。
−２８１をみよ）。
ブタのＡ鎖は、表１に示すように２２個のアミノ酸を含
有する。
有する。
表 １
ＮＨ２−Ａｒｇ Ｍｅｔ Ｔｈｒ Ｌｅｕ ５ｅｒ−Ｇ
ｌｎ Ｌｙｓ Ｏｙｓ Ｃ！ｙｓ Ｇｌｎ−Ｖａｌ Ｇ
ａｙ （３ｙｓ工１（ｌ Ｊｒｇ−Ｌｙａ Ａｓｐ工ｌ
ｅ Ａｌａ Ａｒｇ−Ｌｅｕ Ｃｙｓ −０００Ｈ 明らかに、細かい点での不均質さが存在して、１０位の
グルタミン酸結合から２０％かグルタミン酸でおき代え
られたＡ酸を有するレラクシンか混在する。（たとえば
、Ｎ１ａｌｌ、 ＨｏＤｏ等、（１９８０）、工ｎ５ｕ
ｌｉｎ ： ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、 ５ｔｒｕｃｔｕｒ
ｅ ａｎａ ｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆ １ｎｓｕｌｉｎ
ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ ｈｏｒｍｏｎｅｓ、 Ｅｄｓ
。
ｌｎ Ｌｙｓ Ｏｙｓ Ｃ！ｙｓ Ｇｌｎ−Ｖａｌ Ｇ
ａｙ （３ｙｓ工１（ｌ Ｊｒｇ−Ｌｙａ Ａｓｐ工ｌ
ｅ Ａｌａ Ａｒｇ−Ｌｅｕ Ｃｙｓ −０００Ｈ 明らかに、細かい点での不均質さが存在して、１０位の
グルタミン酸結合から２０％かグルタミン酸でおき代え
られたＡ酸を有するレラクシンか混在する。（たとえば
、Ｎ１ａｌｌ、 ＨｏＤｏ等、（１９８０）、工ｎ５ｕ
ｌｉｎ ： ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、 ５ｔｒｕｃｔｕｒ
ｅ ａｎａ ｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆ １ｎｓｕｌｉｎ
ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ ｈｏｒｍｏｎｅｓ、 Ｅｄｓ
。
Ｂｒａｎｄｅｎｂｕｒｇ、 Ｄ、、 ａｎｄ Ｗｏｌｌ
ｍｅｒ、 Ａ＋、 １Ｖａｌｔｅｒ （ＬｅＧｒｕｙｔ
ｅｒ、 Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、 ７１９−７２６） 。ブ
タＢ鎖は、表２に示すように２８から６１個のアミノ酸
を含有する。ここで、ＰＧＡはピログルタミン酸を表わ
す。Ｂｉ２のカルボキシ末端は不均質であるようである
。これは、表中に縦線を入れて示しである。
ｍｅｒ、 Ａ＋、 １Ｖａｌｔｅｒ （ＬｅＧｒｕｙｔ
ｅｒ、 Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、 ７１９−７２６） 。ブ
タＢ鎖は、表２に示すように２８から６１個のアミノ酸
を含有する。ここで、ＰＧＡはピログルタミン酸を表わ
す。Ｂｉ２のカルボキシ末端は不均質であるようである
。これは、表中に縦線を入れて示しである。
表 ２
ＮＨ２−ＰＧＡ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ａｓｐ −
０ Ｐｈｅ 工１ｅ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｏｙｓ −５ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｖａｎ −Ａｒｇ
Ｌｅｕ−Ｔｒｐ Ｖａｌ Ｇｌｕ −５ 工ｌｅ Ｃ！ｙｓ Ｇｌｙ ８ｅｒ Ｖａｌ−：
ｌ ３０ ； Ｓｅｒ Ｔｒｐ Ｇａｙ ； Ａｒｇ ’、 Ｔｈ
ｒ； −Ａｌａ −０００Ｈ ふつうに分離される、Ｃ！Ｍ−ａ’ （臨床試験で使用
）および（３Ｍ−ａの大型成分は、それぞれ、２９およ
び６１の残基を壱するＢ＠である。（たとえば、Ｎ１ａ
ｌｌ、 Ｈ，Ｄ６等の上記引用の文献をみよ）。別の報
告されているＢ頚は２６残基を含有し、上記の桐造に相
当する。ただし、２４から２６までの残基はＶａｎ−Ｔ
ｒｐ−８ｅｒ （たとえばｓｑｈｗａｂｅ等（１９７７
）、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、 Ｒｅｓ、 Ｏ
ｏｍｍ、、 ７５．５Ｑ３−５１Ｑ）である。さらに、
３０残基を含有するＢ鎖桝造も報告されている。これは
、２７から６０まではＴｈｒ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ
であること以外は類似している（たとえば、ＫＷＯｋ、
Ｓ、、およびＢｒｙａｎｔ −Ｇｒｅｅｎｗｏｏａ、
Ｇ、、 （ｉ９７７）、 Ｎａｔ、ｕｒｅ、 ’１５
７．５４４−５４６）。
０ Ｐｈｅ 工１ｅ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｏｙｓ −５ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｖａｎ −Ａｒｇ
Ｌｅｕ−Ｔｒｐ Ｖａｌ Ｇｌｕ −５ 工ｌｅ Ｃ！ｙｓ Ｇｌｙ ８ｅｒ Ｖａｌ−：
ｌ ３０ ； Ｓｅｒ Ｔｒｐ Ｇａｙ ； Ａｒｇ ’、 Ｔｈ
ｒ； −Ａｌａ −０００Ｈ ふつうに分離される、Ｃ！Ｍ−ａ’ （臨床試験で使用
）および（３Ｍ−ａの大型成分は、それぞれ、２９およ
び６１の残基を壱するＢ＠である。（たとえば、Ｎ１ａ
ｌｌ、 Ｈ，Ｄ６等の上記引用の文献をみよ）。別の報
告されているＢ頚は２６残基を含有し、上記の桐造に相
当する。ただし、２４から２６までの残基はＶａｎ−Ｔ
ｒｐ−８ｅｒ （たとえばｓｑｈｗａｂｅ等（１９７７
）、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、 Ｒｅｓ、 Ｏ
ｏｍｍ、、 ７５．５Ｑ３−５１Ｑ）である。さらに、
３０残基を含有するＢ鎖桝造も報告されている。これは
、２７から６０まではＴｈｒ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ
であること以外は類似している（たとえば、ＫＷＯｋ、
Ｓ、、およびＢｒｙａｎｔ −Ｇｒｅｅｎｗｏｏａ、
Ｇ、、 （ｉ９７７）、 Ｎａｔ、ｕｒｅ、 ’１５
７．５４４−５４６）。
衣１および表２に示した既知のアミノ酸配列をもとにし
て、Ａ＠３よひＢ鎖の別々に対応する新規合成遺伝子が
決定された。また、Ｃ配りりがＢおよびＡ鎖のあいだの
ペプチド結合をコードするとして、雑種Ｂ−０−Ａ 遺
伝子に対応するものも決定された。結合Ｃの配列を−Ａ
ｓｐ−Ｐｒｏ−にもとづくように決定した。これは約−
２で水解されやすいことの知れている結合である（たと
えは、ＬＯｎｄＯｎ。
て、Ａ＠３よひＢ鎖の別々に対応する新規合成遺伝子が
決定された。また、Ｃ配りりがＢおよびＡ鎖のあいだの
ペプチド結合をコードするとして、雑種Ｂ−０−Ａ 遺
伝子に対応するものも決定された。結合Ｃの配列を−Ａ
ｓｐ−Ｐｒｏ−にもとづくように決定した。これは約−
２で水解されやすいことの知れている結合である（たと
えは、ＬＯｎｄＯｎ。
Ｍ、 （１９７７）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｆｉｎｚ
ｙｍｏｌｏｇｙ ４７ｔ １４５ ）。
ｙｍｏｌｏｇｙ ４７ｔ １４５ ）。
このペプチドに実際に選択した配列は
−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−である。
第６表をみよ。
この結合は、ＡおよびＢ鎖が歪むことなしに正常のフン
ホメーションを取ることを可能とする。バイブリドＢ−
０−Ａは単一ペプチドとして生産される。
ホメーションを取ることを可能とする。バイブリドＢ−
０−Ａは単一ペプチドとして生産される。
これは、そのま才用いうるし、または、低−で切断して
、Ｃペプチドを除去しうる。
、Ｃペプチドを除去しうる。
表 ６
ＮＨ２−ＰＧＡ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ａｇｎ Ａｓｐ −
Ｐｈｅ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｃｙｓ −Ｇｌｙ
Ａｒｇ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｖａｌ −Ａｒｇ Ｌｅｕ
Ｔｒｐ Ｖａｎ Ｇｌｕ −工１ｅ Ｏｙｓ Ｇｌｙ
Ｓａｒ Ｖａｌ −Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−
Ａｓｐ−Ｐｒｏ −Ａｒｇ Ｍｅｔ Ｔｈｒ Ｌｅｕ
ｂａｒ −Ｇｌｕ Ｌｙｓ （３ｙａ Ｏｙｓ Ｇｉｎ
−−ＶａＩＧｉｙ Ｏｙｓ工ＩＪＡｒｇ−Ｌｙｓ Ａ
ｓｐ工１ｅ Ａｌａ Ａｒｇ −Ｌｅｕ Ｏｙｓ −０
００Ｈ 多数の可能のコドンが、遺伝子コードの縮重より可能で
あるが、い（つかの基準を守って至適の配列を選択した
。第１に、遺伝子を発現さす細胞、特に、ム４す４−に
もつとも許容されうるトリニュクレオチドコドンを使用
すべきである。（たとえはＧｒａｎｔｈａｍ、 Ｒ，、
等、 （１９８０）、 Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄａ Ｒｅｓ
、。
Ｐｈｅ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｃｙｓ −Ｇｌｙ
Ａｒｇ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｖａｌ −Ａｒｇ Ｌｅｕ
Ｔｒｐ Ｖａｎ Ｇｌｕ −工１ｅ Ｏｙｓ Ｇｌｙ
Ｓａｒ Ｖａｌ −Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−
Ａｓｐ−Ｐｒｏ −Ａｒｇ Ｍｅｔ Ｔｈｒ Ｌｅｕ
ｂａｒ −Ｇｌｕ Ｌｙｓ （３ｙａ Ｏｙｓ Ｇｉｎ
−−ＶａＩＧｉｙ Ｏｙｓ工ＩＪＡｒｇ−Ｌｙｓ Ａ
ｓｐ工１ｅ Ａｌａ Ａｒｇ −Ｌｅｕ Ｏｙｓ −０
００Ｈ 多数の可能のコドンが、遺伝子コードの縮重より可能で
あるが、い（つかの基準を守って至適の配列を選択した
。第１に、遺伝子を発現さす細胞、特に、ム４す４−に
もつとも許容されうるトリニュクレオチドコドンを使用
すべきである。（たとえはＧｒａｎｔｈａｍ、 Ｒ，、
等、 （１９８０）、 Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄａ Ｒｅｓ
、。
旦、 ｒ４７− ｒ６２ ）。第２に、遺伝子の５′末
端は、制限サイトたとえばＥｃｏＲ工 を有すべきで、
そうすることで、１接着末端１を８１ニユクレアーゼで
処理して生ずる１平滑末４ｍが、コード配列の正確に５
′末端にあるようにすべきである。第６に、６′末端は
鎖停止コドンを有すべきである。第４へ６′末端は、適
当なグラスミドに挿入するのに用いるためのＨ１ｎｄエ
エエサイトのような制限サイトを有すべきである。第５
に、５′および６′末端での制限サイトは、その遺伝子
をを、適当なノラスミｙたとえばｐＢＲ３２２にクロン
化して入れたり切り出したりすることを可能とすべきで
ある。（たとえば、Ｂｏｌｉｖａｒ、 Ｆ、、 ％ 、
（１９７７）、 Ｇｏｎｅ、 ’ｌ、 ９５−１１６
をみよ）。第６に、いずれかの鎮または２重鎮上の、自
己相補性または他の配列（正しい配列以外の）に相補性
である、遺伝子中の配列は、でき葛だけ最小に留むべき
である。
端は、制限サイトたとえばＥｃｏＲ工 を有すべきで、
そうすることで、１接着末端１を８１ニユクレアーゼで
処理して生ずる１平滑末４ｍが、コード配列の正確に５
′末端にあるようにすべきである。第６に、６′末端は
鎖停止コドンを有すべきである。第４へ６′末端は、適
当なグラスミドに挿入するのに用いるためのＨ１ｎｄエ
エエサイトのような制限サイトを有すべきである。第５
に、５′および６′末端での制限サイトは、その遺伝子
をを、適当なノラスミｙたとえばｐＢＲ３２２にクロン
化して入れたり切り出したりすることを可能とすべきで
ある。（たとえば、Ｂｏｌｉｖａｒ、 Ｆ、、 ％ 、
（１９７７）、 Ｇｏｎｅ、 ’ｌ、 ９５−１１６
をみよ）。第６に、いずれかの鎮または２重鎮上の、自
己相補性または他の配列（正しい配列以外の）に相補性
である、遺伝子中の配列は、でき葛だけ最小に留むべき
である。
コンピューターに用い、すべての可能の相互作用に由来
するエネルギーが計算された（たとえば、’ｒｉｎｏｃ
ｏ、 Ｔｒ、、１１等、 （１９７１）、 Ｎａｔｕｒ
ｅ、 ２３０゜６６２−５６７ ：およびＰｏｗｅｒｓ
、 Ｇ、Ｊ、、等（１９７５）。
するエネルギーが計算された（たとえば、’ｒｉｎｏｃ
ｏ、 Ｔｒ、、１１等、 （１９７１）、 Ｎａｔｕｒ
ｅ、 ２３０゜６６２−５６７ ：およびＰｏｗｅｒｓ
、 Ｇ、Ｊ、、等（１９７５）。
ＪＡＯ８，９７，８７５−８８９）、それで１．オフー
ディアゴナＡ／ （ｏｆｆ−ｄｉａｇｏｎａｌ ）相互
作用はできるだけ避は侍よう。
ディアゴナＡ／ （ｏｆｆ−ｄｉａｇｏｎａｌ ）相互
作用はできるだけ避は侍よう。
ひとつの具体例として、本発明は、つきの配列５’
ＯＧＣＡＴＧ ＡＣＴ ＯＴＧ ＴＯＣ−５” ＧＯ
Ｇ ＴＡＯＴＧＡ ＧＡＣＡＧＧ −ＧＡＧ ＡＡＡ
ＴＧＴ ＴＧＯＯＡＧ −ＣＴＣＴＴＴ Ａ
ＯＡ ＡＯ，） ＧＴＣ−ＧＴＴ ＧＧＴ ＴＧＴ
ＡＴＯＯＧＴ −０ＡＡ ＯＣＡ ＡＣＡ
ＴＡＧ ＧＯＡ −ＡＡＡ ＧＡＯＡＴＴ Ｇ
ＯＴ ＣＧＴ −ＴＴＴ Ｃ！ＴＧ ＴＡＡ
ＣＧＡ ＧＯＡ −ＣＴＧ ’ｌ”ＧＴ ３’ ＧＡＯＡＯＡ ５’ を含有するブタレラクシンムを発現するための合成遺伝
子に関する。
ＯＧＣＡＴＧ ＡＣＴ ＯＴＧ ＴＯＣ−５” ＧＯ
Ｇ ＴＡＯＴＧＡ ＧＡＣＡＧＧ −ＧＡＧ ＡＡＡ
ＴＧＴ ＴＧＯＯＡＧ −ＣＴＣＴＴＴ Ａ
ＯＡ ＡＯ，） ＧＴＣ−ＧＴＴ ＧＧＴ ＴＧＴ
ＡＴＯＯＧＴ −０ＡＡ ＯＣＡ ＡＣＡ
ＴＡＧ ＧＯＡ −ＡＡＡ ＧＡＯＡＴＴ Ｇ
ＯＴ ＣＧＴ −ＴＴＴ Ｃ！ＴＧ ＴＡＡ
ＣＧＡ ＧＯＡ −ＣＴＧ ’ｌ”ＧＴ ３’ ＧＡＯＡＯＡ ５’ を含有するブタレラクシンムを発現するための合成遺伝
子に関する。
本発明のさらに別の具体例として、Ａ遺伝子は、コード
配列に加えて、停止コドン、ｐＡＴ １５６のようなプ
ラスミド（たとえば、ＴＷｉｇｇ、 Ａ、 Ｊ、、およ
び８ｈｅｒｒａｔｔ、 Ｄ、 、 （１９１３Ｑ）、
Ｎａｔｕｒｅ、 ２８３．２１６−２１８）または発現
グラスミド、特にｐＷＴ ５７１ （たとえば公告され
たヨーロッパ特許ｊｉｉ）！腐５２００２）中への挿入
な可能とするためのＫｃＯＲ工およびＨｌｎｄＩＩＩの
ための制限サイト、ＡｒｇおよびＭｅｔをコーＰするコ
ドンを欠如する遺伝子（Ａｒｇを欠如し発現シラスミド
により導入される末端イニシエーターメチオニンを有す
るかまたは有しない遺伝子による生成物は、Ａｒｇ残基
な含有しそしてイニシエーターメチオニ／を有するかま
たは有しないもとの遺伝子よりの生成物より、より活性
を有する）をクロン化することを可能とする、Ｈ１ｎｆ
工制限サイトおよびＥｃｏＲ２制限サイトを含有する。
配列に加えて、停止コドン、ｐＡＴ １５６のようなプ
ラスミド（たとえば、ＴＷｉｇｇ、 Ａ、 Ｊ、、およ
び８ｈｅｒｒａｔｔ、 Ｄ、 、 （１９１３Ｑ）、
Ｎａｔｕｒｅ、 ２８３．２１６−２１８）または発現
グラスミド、特にｐＷＴ ５７１ （たとえば公告され
たヨーロッパ特許ｊｉｉ）！腐５２００２）中への挿入
な可能とするためのＫｃＯＲ工およびＨｌｎｄＩＩＩの
ための制限サイト、ＡｒｇおよびＭｅｔをコーＰするコ
ドンを欠如する遺伝子（Ａｒｇを欠如し発現シラスミド
により導入される末端イニシエーターメチオニンを有す
るかまたは有しない遺伝子による生成物は、Ａｒｇ残基
な含有しそしてイニシエーターメチオニ／を有するかま
たは有しないもとの遺伝子よりの生成物より、より活性
を有する）をクロン化することを可能とする、Ｈ１ｎｆ
工制限サイトおよびＥｃｏＲ２制限サイトを含有する。
（表４をみよ）。
表 ４
５’ ＡＡＴＴＯＧＯＡＴＧ ＡＣＴ ＣＴＧ ＴＣＯ
−ＧＡＧ ＡＡＡ ＴＧＴ ＴＧＯＯＡＧ −ＧｒＴ
ＧＧＴ ＴＧＴ ＡＴＯＯＧＴ −３ＡＡ （３０Ａ
ＡＯＡ ＴＡＧ ＧＯＡ −ＡＡＡ ＧＡＯＡ
ＴＴ ＧＯＴ ＣＧＴ −ＴＴＴ （３ＴＧ ＴｒＡＣ
ＧＡ ＧＯＡ −Ｍｉｎｄエエエ この具体例として、本発明は、配列 ５’ Ａ ＡＴＴ Ｏ＋）ＯＡＴＧ ＡＣＴ Ｏ
ＴＧ ＴＯＣ−５” ＧＯ＋） ＴＡＯＴ
ＧＡ ＧＡＯＡＧＧ −ＧＡＧ ＡＡＡ ＴＧＴ
ＴＧ：！ ＯＡＧ −０ＴＯＴＴＴ ＡＯ
Ａ ＡＣＧ ＧＴＯ−０ＴＴ ＧＧＴ ＴＧＴ
ＡＴｃ （３ＧＴ −０ＡＡ ＣＯＡ ＡＯ
Ａ ＴＡＧ ＧＯＡ −ＡＡＡ ＧＡＣｉ
ＡＴＴ ＧＯＴ ＯＧＴ −ＴＴＴ Ｃ！Ｔ
Ｇ ＴＡＡ ＯＧＡ ＧＯＡ −０ＴＧ Ｔ
ＧＴ ＴＡ ５”ＧＡＯＡＯＡ ＡＴＴ
ＯＧＡ ５’を有するブタレラクシンＡ鎖発現のた
めの合成遺伝子に関する。
−ＧＡＧ ＡＡＡ ＴＧＴ ＴＧＯＯＡＧ −ＧｒＴ
ＧＧＴ ＴＧＴ ＡＴＯＯＧＴ −３ＡＡ （３０Ａ
ＡＯＡ ＴＡＧ ＧＯＡ −ＡＡＡ ＧＡＯＡ
ＴＴ ＧＯＴ ＣＧＴ −ＴＴＴ （３ＴＧ ＴｒＡＣ
ＧＡ ＧＯＡ −Ｍｉｎｄエエエ この具体例として、本発明は、配列 ５’ Ａ ＡＴＴ Ｏ＋）ＯＡＴＧ ＡＣＴ Ｏ
ＴＧ ＴＯＣ−５” ＧＯ＋） ＴＡＯＴ
ＧＡ ＧＡＯＡＧＧ −ＧＡＧ ＡＡＡ ＴＧＴ
ＴＧ：！ ＯＡＧ −０ＴＯＴＴＴ ＡＯ
Ａ ＡＣＧ ＧＴＯ−０ＴＴ ＧＧＴ ＴＧＴ
ＡＴｃ （３ＧＴ −０ＡＡ ＣＯＡ ＡＯ
Ａ ＴＡＧ ＧＯＡ −ＡＡＡ ＧＡＣｉ
ＡＴＴ ＧＯＴ ＯＧＴ −ＴＴＴ Ｃ！Ｔ
Ｇ ＴＡＡ ＯＧＡ ＧＯＡ −０ＴＧ Ｔ
ＧＴ ＴＡ ５”ＧＡＯＡＯＡ ＡＴＴ
ＯＧＡ ５’を有するブタレラクシンＡ鎖発現のた
めの合成遺伝子に関する。
さらに別の具体例として、本発明は、配列５’ Ｏ
ＡＧ ＴＯＧ ＡＣｏ ＡＪ田ＧＡＴ ＴＴＯＡＴＯ−
３’ ＧＴＯＡＧＣＴＧＧ ＴＴＧ ＣＴＡ ＡＡ
Ｇ ＴＡＧ −ＡＡＡ ＧＯＴ ＴＧＴ ＧＧＡ ＯＧ
Ｔ ＧＡＧ ＴＴＡ −ＴＴＴ ＯＧＡ ＡＯＡ Ｃ
ＯＴ ＧＯＡ ＣＴＣＡＡＴ −ＧＴＴ ＯＧＴ
ＴＴＡ ＴＧＧ ＧＴＴ ＧＡＧ ＡＴＯ−ＣＡＡ
ＧＣＡ ＡＡＴ ＡＯＯＯＡＡ ＣＴＣＴＡＧ
−ＴＧＴ ＧＧＯＴＯＴ ＧＴＡ ＡＧＴ ＴＧＧ Ｇ
ＧＴ−ＡＣＡ ０ＯＧＡＧＡ （３ＡＴ ＴＯＡ ＡＯ
Ｏ０ＯＡ−ＯＧＴ ＡＯＯＧＯＡ ５’ ＧＯＡ ’ｒＧｅ ＯＧＴ ５’を有するブタレ
ジ２９フ８発現のための合成遺伝子に関する。
ＡＧ ＴＯＧ ＡＣｏ ＡＪ田ＧＡＴ ＴＴＯＡＴＯ−
３’ ＧＴＯＡＧＣＴＧＧ ＴＴＧ ＣＴＡ ＡＡ
Ｇ ＴＡＧ −ＡＡＡ ＧＯＴ ＴＧＴ ＧＧＡ ＯＧ
Ｔ ＧＡＧ ＴＴＡ −ＴＴＴ ＯＧＡ ＡＯＡ Ｃ
ＯＴ ＧＯＡ ＣＴＣＡＡＴ −ＧＴＴ ＯＧＴ
ＴＴＡ ＴＧＧ ＧＴＴ ＧＡＧ ＡＴＯ−ＣＡＡ
ＧＣＡ ＡＡＴ ＡＯＯＯＡＡ ＣＴＣＴＡＧ
−ＴＧＴ ＧＧＯＴＯＴ ＧＴＡ ＡＧＴ ＴＧＧ Ｇ
ＧＴ−ＡＣＡ ０ＯＧＡＧＡ （３ＡＴ ＴＯＡ ＡＯ
Ｏ０ＯＡ−ＯＧＴ ＡＯＯＧＯＡ ５’ ＧＯＡ ’ｒＧｅ ＯＧＴ ５’を有するブタレ
ジ２９フ８発現のための合成遺伝子に関する。
本発明のさらに別の具体例として、Ｂ遺伝子は、コード
配列に加えて、停止コドン、イニシエーターメチオニン
コドン、 ｐＡＴ １５３のようなプラスミドへの挿入
を容易にするためのＯｌａよりよびＢａｎＨ工のための
制限サイト、および８ａｌ 、 Ｈｌｎｄ ＩＩ工。
配列に加えて、停止コドン、イニシエーターメチオニン
コドン、 ｐＡＴ １５３のようなプラスミドへの挿入
を容易にするためのＯｌａよりよびＢａｎＨ工のための
制限サイト、および８ａｌ 、 Ｈｌｎｄ ＩＩ工。
ＢｇｌエエおよびＲｓａ工（第５表をみよ）を含有する
。
。
Ｂ鎖の異なるＣ端をコードする異なる６′末端領域をそ
れぞれ有する６個の別様の形がある。
れぞれ有する６個の別様の形がある。
第５表
５’ Ｃ！ＧＡＴＧ ＯＡＧ ＴＯＧ ＡＣＯＡＡＣＧ
ＡＴ ＴＴＯ−０１ａ 工 Ｓａｌ
工ＡＴＯＡＡＡ ＧＯＴ ＴＧＴ ＧＧＡ ＯＧＴ
ＧＡＧ−Ｈｉｎｄ エエエ ＴＴＡ ＧＴＴ 、ＯＧＴ ＴＴＡ ＴＧＧ ＧＴＴ
ＧＡＧ−ＡＡＴ ＯＡＡ ＧＯＡ ＡＡＴ ＡＯ
ＯＯＡＡ 芒二今Ｔｏ ＴＧＴ ＧＧＯＴＯＴ ＧＴ
Ａ ＡＧＴ ＴＧＧ−Ｂｇｌエエ Ｒｓａ Ｉ Ｊｊａｍ Ｍｌこの
具体例において、本発明は、配列 ５ ’ ０ＧＡＴＧ ＯＡＧ ＴＯＧ ＡＣＯＡＡＣＧ
ＡＴ ＴＴＯ−５” ＴＡＯＧＴＣｉＧｏ ＴＧＧ
ＴＴＧ ＣＴＡ ＡＡＧ −ＡＴＯＡＡＡ ＧＣＴ Ｔ
ＧＴ ＧＧＡ Ｃ！ＧＴ ＧＡＧ −ＴＡＧ ＴＴＴ
ＣＧＡ ＡＯＡ ＱＣ！Ｔ ＧＯＡ ＣＴＯ−ＴＴＡ
ＧＴＴ ＣＧＴ ＴＴＡ ＴＧＧ ＧＴＴ ＧＡＧ −
ＡＡＴ ＯＡＡ ＧＯＡ ＡＡＴ ＡＯＣＯＡＡ ＣＴ
Ｏ−ＡＴＣ！ ＴＧＴ ＧＧＣＴＣＴ ＧＴＡ ＡＧＴ
ＴＧＧ −ＴＡＧ ＡＣＡ ＣＯＧ ＡＧＡ ＯＡＴ
ＴＯＡ ＡｃＯ−ＧＧＴ Ｃ！ＧＴ ＡＯＣＧＣＡ
ＴＡＡ Ｇ ３ ’ＣＣＡ ＧＣＡ ＴＧＧ ＯＧＴ
ＡＴＴ ＱＣ！ＴＡＧ ５’を包含する、ブタレラク
シンＢ鎖発現のたメツ合成遺伝子に関する。
ＡＴ ＴＴＯ−０１ａ 工 Ｓａｌ
工ＡＴＯＡＡＡ ＧＯＴ ＴＧＴ ＧＧＡ ＯＧＴ
ＧＡＧ−Ｈｉｎｄ エエエ ＴＴＡ ＧＴＴ 、ＯＧＴ ＴＴＡ ＴＧＧ ＧＴＴ
ＧＡＧ−ＡＡＴ ＯＡＡ ＧＯＡ ＡＡＴ ＡＯ
ＯＯＡＡ 芒二今Ｔｏ ＴＧＴ ＧＧＯＴＯＴ ＧＴ
Ａ ＡＧＴ ＴＧＧ−Ｂｇｌエエ Ｒｓａ Ｉ Ｊｊａｍ Ｍｌこの
具体例において、本発明は、配列 ５ ’ ０ＧＡＴＧ ＯＡＧ ＴＯＧ ＡＣＯＡＡＣＧ
ＡＴ ＴＴＯ−５” ＴＡＯＧＴＣｉＧｏ ＴＧＧ
ＴＴＧ ＣＴＡ ＡＡＧ −ＡＴＯＡＡＡ ＧＣＴ Ｔ
ＧＴ ＧＧＡ Ｃ！ＧＴ ＧＡＧ −ＴＡＧ ＴＴＴ
ＣＧＡ ＡＯＡ ＱＣ！Ｔ ＧＯＡ ＣＴＯ−ＴＴＡ
ＧＴＴ ＣＧＴ ＴＴＡ ＴＧＧ ＧＴＴ ＧＡＧ −
ＡＡＴ ＯＡＡ ＧＯＡ ＡＡＴ ＡＯＣＯＡＡ ＣＴ
Ｏ−ＡＴＣ！ ＴＧＴ ＧＧＣＴＣＴ ＧＴＡ ＡＧＴ
ＴＧＧ −ＴＡＧ ＡＣＡ ＣＯＧ ＡＧＡ ＯＡＴ
ＴＯＡ ＡｃＯ−ＧＧＴ Ｃ！ＧＴ ＡＯＣＧＣＡ
ＴＡＡ Ｇ ３ ’ＣＣＡ ＧＣＡ ＴＧＧ ＯＧＴ
ＡＴＴ ＱＣ！ＴＡＧ ５’を包含する、ブタレラク
シンＢ鎖発現のたメツ合成遺伝子に関する。
別の具体例として、本発明は、配列
５’ ＧＡＴ Ｃｏｏ ＧＧＧ ＧＡＴ ＣＯＧ ５
’３’ Ｃ！ＴＡ ＧＧＧ ００００ＴＡ ＧＧＯ５
’を含有する。Ｂ＠とＡ＠どのあいたにベゾチド連結 −Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−を有する
ブタレラクシン雑種の発現のための合成遺伝子にも関す
る。
’３’ Ｃ！ＴＡ ＧＧＧ ００００ＴＡ ＧＧＯ５
’を含有する。Ｂ＠とＡ＠どのあいたにベゾチド連結 −Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−を有する
ブタレラクシン雑種の発現のための合成遺伝子にも関す
る。
ＢｇｌＩＩサイトよりのＢ遺伝子の部分のみを含有する
雑種Ｂ−Ｃ−Ａ遺伝子は、Ｂ遺伝子の残りの部分、Ｒｅ
ｓ工、 Ｂａｍ Ｈ工、 Ｘｍａ工、 Ｈ１ｎｆ工およ
びＫｃ。
雑種Ｂ−Ｃ−Ａ遺伝子は、Ｂ遺伝子の残りの部分、Ｒｅ
ｓ工、 Ｂａｍ Ｈ工、 Ｘｍａ工、 Ｈ１ｎｆ工およ
びＫｃ。
Ｒ２に対する内部制限サイトおよび停止コドン（第６表
をみよ、ここで便宜上、最長Ｂ鎖ための杉のみが示しで
ある）を含有する、たとえはｐＷＴ５５１のようなシラ
スミド（たとえは公告ヨーロッパ特許ＩＪｉ１６５２０
０２をみよ）への挿入を容易にするためのＢｇｌエエお
よびＢａｍ Ｈ工に対する制限サイトを有している。
をみよ、ここで便宜上、最長Ｂ鎖ための杉のみが示しで
ある）を含有する、たとえはｐＷＴ５５１のようなシラ
スミド（たとえは公告ヨーロッパ特許ＩＪｉ１６５２０
０２をみよ）への挿入を容易にするためのＢｇｌエエお
よびＢａｍ Ｈ工に対する制限サイトを有している。
遺伝子はいくつかの数のオリゴニュクレオチドブロック
を合成して構成した。
を合成して構成した。
選択合成されたブロックは、表７．８および９に示しで
ある。ブロックは既知の合成法（たとえば工ｔｏ等、（
１９８２）、 Ｎｕｃｌ、 Ａｃ１４．、Ｒｅｓ、、
１０．１７５５−１７６９ ）を用いて構成しうる。
ある。ブロックは既知の合成法（たとえば工ｔｏ等、（
１９８２）、 Ｎｕｃｌ、 Ａｃ１４．、Ｒｅｓ、、
１０．１７５５−１７６９ ）を用いて構成しうる。
表 ６
ＧＡＴＯＴＧＴ ＧＧＯＴＯＴ ＧＴＡ ＡＧＴ ＴＧ
Ｇ ＧＧＴωＴ ＡｃｅＧＯＧ ＧＡＴ ０００ ＧＧ
Ｇ ＧＡＴ ＯＯＧ ＯＧＯＡＴＧ ＡｃＴ ０ＴＧＴ
ｏ（３ＧＡＧ ＡＡＡ ＴＧＴ ＴＧＣＯＡＧ ＧＴＴ
ＧＧＴ ＴＧＴ ＡＴＯＫｃｏＲエエ ＯＧＴ ＡＡＡ ＧＡＣＡＴＴ ＧＯＴ ＯＧＴ ＣＴ
Ｇ ＴＧＴ ＴＡＡ ＧＢａｎＨ工 表 ７ ■ 表 ８ 構成したあとの、ニュクレオチドのオリゴマーブロック
は既知の方法で雑種化しそして連結する（たとえば、Ａ
ｇａｒＷａｌ 、等１ （１９７０）ｌ Ｎａｔｕｒｅ
、２２７゜２７−５４ ）。
Ｇ ＧＧＴωＴ ＡｃｅＧＯＧ ＧＡＴ ０００ ＧＧ
Ｇ ＧＡＴ ＯＯＧ ＯＧＯＡＴＧ ＡｃＴ ０ＴＧＴ
ｏ（３ＧＡＧ ＡＡＡ ＴＧＴ ＴＧＣＯＡＧ ＧＴＴ
ＧＧＴ ＴＧＴ ＡＴＯＫｃｏＲエエ ＯＧＴ ＡＡＡ ＧＡＣＡＴＴ ＧＯＴ ＯＧＴ ＣＴ
Ｇ ＴＧＴ ＴＡＡ ＧＢａｎＨ工 表 ７ ■ 表 ８ 構成したあとの、ニュクレオチドのオリゴマーブロック
は既知の方法で雑種化しそして連結する（たとえば、Ａ
ｇａｒＷａｌ 、等１ （１９７０）ｌ Ｎａｔｕｒｅ
、２２７゜２７−５４ ）。
従って、本発明のさらに別の具体例は、いくつかのオリ
ゴニュクレオチドをあわせそして連結することを包含す
る、そのような合成遺伝子の製造方法に関する。
ゴニュクレオチドをあわせそして連結することを包含す
る、そのような合成遺伝子の製造方法に関する。
つぎの段階は、適当な組み換えプラスミドを製造しそし
て、望む発現を得ようとして適当な細胞を形質転換する
ことである。
て、望む発現を得ようとして適当な細胞を形質転換する
ことである。
従って、本発明の別の具体例は、挿入サイトに上記のよ
うな合成遺伝子を有し、挿入遺伝子を発現するように正
しい枠で読み取られ、そして挿入サイトの上流にそれと
隣接して軸間性プロモーターを有するプラスミドベクタ
ーを含有する組み換えプラスミドに関する。
うな合成遺伝子を有し、挿入遺伝子を発現するように正
しい枠で読み取られ、そして挿入サイトの上流にそれと
隣接して軸間性プロモーターを有するプラスミドベクタ
ーを含有する組み換えプラスミドに関する。
さらに別の具体的として、本発明は、そのような合成遺
伝子を適当なプラスミドベクター中に挿入することを包
含する上記のような組み換えＤＮＡの製造方法に関する
。
伝子を適当なプラスミドベクター中に挿入することを包
含する上記のような組み換えＤＮＡの製造方法に関する
。
さらに本発明の別の具体例は、そのような合成遺伝子ま
たはそのような組み換えシラスミドの挿入された形質転
換細胞に関する。
たはそのような組み換えシラスミドの挿入された形質転
換細胞に関する。
さらに具体的に、本発明は、そのような合成遺伝子また
はそのような組み換えシラスミドを適当な細胞に挿入す
ることを包含するそのような細胞の製造方法に関する。
はそのような組み換えシラスミドを適当な細胞に挿入す
ることを包含するそのような細胞の製造方法に関する。
より詳細には、本発明は、遺伝子Ａは、Ｐｃ ｏＲＩお
よびＨ１ｒｏｌエエ稿理し小型の制限フラグメントを除
去したあとの、ｐＷＴ ５７１の大きなフラグメントに
遺伝子Ａを連結した。ＦｉｃｏＲＩで処理しそして１重
鎖末端をＳＬニュクレアーゼで処理してフラッシュ末端
とすることにより、レラクシンＡ遺伝子を発現のための
ＡＴＧコドンのつぎに存在させたプラスミドとする。そ
の場合、フラッシュ末端は再連結させた。Ｂ遺伝子は、
まずｐＡＴ １５３に、Ｏ１ａ工およびＢａｍ Ｈニー
まずクロン化し、複製に用いた。発現のためには、Ｂ遺
伝子を切り出し、Ｓ１ニユクレアーゼを用いてＯ１ａ工
においてフラッシュ末端とし、ＨｌｎｄＩＩＩで切断し
、Ｓ１ニユクレアーゼでフラッシュ末端とした発現シラ
スミドに挿入した。連結の前に８１ニユクレアーゼで部
分的に消化すると、やや異なるリポゾーム結合サイトを
有するシラスミドを提供する。別様には、Ｂ遺伝子をク
ロン化するひとつの方法は、フラッシュ５′末端を有す
る遺伝子を製造しくオリゴマー０ＧＡＴＧＯＡＧＴＯを
５′末端において２塩基短かくすることによる）、これ
を、フラッシュ末端化Ｈ１ｎｄＩ１１サイトを有する、
Ｈ１ｎｄＩＩＩ／ Ｂａｎ Ｈ１消化ｐＷＴ ５５１
に連結した。雑種Ｂ−０−Ａ は、すてにＢを発現する
遺伝子を含有するＩ” ５５１に、ＢｇｌＩＩおよびＢ
ａｍ Ｈ工で制限処理したあとにクロン化する。
よびＨ１ｒｏｌエエ稿理し小型の制限フラグメントを除
去したあとの、ｐＷＴ ５７１の大きなフラグメントに
遺伝子Ａを連結した。ＦｉｃｏＲＩで処理しそして１重
鎖末端をＳＬニュクレアーゼで処理してフラッシュ末端
とすることにより、レラクシンＡ遺伝子を発現のための
ＡＴＧコドンのつぎに存在させたプラスミドとする。そ
の場合、フラッシュ末端は再連結させた。Ｂ遺伝子は、
まずｐＡＴ １５３に、Ｏ１ａ工およびＢａｍ Ｈニー
まずクロン化し、複製に用いた。発現のためには、Ｂ遺
伝子を切り出し、Ｓ１ニユクレアーゼを用いてＯ１ａ工
においてフラッシュ末端とし、ＨｌｎｄＩＩＩで切断し
、Ｓ１ニユクレアーゼでフラッシュ末端とした発現シラ
スミドに挿入した。連結の前に８１ニユクレアーゼで部
分的に消化すると、やや異なるリポゾーム結合サイトを
有するシラスミドを提供する。別様には、Ｂ遺伝子をク
ロン化するひとつの方法は、フラッシュ５′末端を有す
る遺伝子を製造しくオリゴマー０ＧＡＴＧＯＡＧＴＯを
５′末端において２塩基短かくすることによる）、これ
を、フラッシュ末端化Ｈ１ｎｄＩ１１サイトを有する、
Ｈ１ｎｄＩＩＩ／ Ｂａｎ Ｈ１消化ｐＷＴ ５５１
に連結した。雑種Ｂ−０−Ａ は、すてにＢを発現する
遺伝子を含有するＩ” ５５１に、ＢｇｌＩＩおよびＢ
ａｍ Ｈ工で制限処理したあとにクロン化する。
上記プラスミドに挿入しＥ、 ｃｏｌｉ 中でクロン
化し℃から、ＡおよびＢ遺伝子を発現させ（たとえは、
ＴａｃＯｎ、 Ｗ、Ｃ０Ａ、、等、 （１９８０）、
Ｍｏ１ｅｃ、Ｇｅｎ。
化し℃から、ＡおよびＢ遺伝子を発現させ（たとえは、
ＴａｃＯｎ、 Ｗ、Ｃ０Ａ、、等、 （１９８０）、
Ｍｏ１ｅｃ、Ｇｅｎ。
Ｇｏｎｅｔ、 、 １７７、４２７ ヲｈ ヨ）、Ａお
よびＢ鎖＋’！、Ｍ園より抽出し稍↓し、再併合して活
性レラクシンとなしうる。それには、ます、１００℃で
処理してＢ鎖の末端グルタミンをピログルタミン酸に変
え、ついでジスルファイド架橋を形成させる。
よびＢ鎖＋’！、Ｍ園より抽出し稍↓し、再併合して活
性レラクシンとなしうる。それには、ます、１００℃で
処理してＢ鎖の末端グルタミンをピログルタミン酸に変
え、ついでジスルファイド架橋を形成させる。
（たとえば、Ｋａｔｓｏｙａｎｎｉａ、 Ｐ、Ｇ、、等
、（１９６７） 。
、（１９６７） 。
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、 ６．２６４２をみよ）。
Ｂ −０−Ａ遺伝子を発現させたあと、ペプチド生成物
は低い−で水解して切断しうる（たとえば、ＬＯｎｄＯ
ｎ、 ｍ、、 （１９７７）、 ノ上記引用の文献ヲミ
ヨ）。
は低い−で水解して切断しうる（たとえば、ＬＯｎｄＯ
ｎ、 ｍ、、 （１９７７）、 ノ上記引用の文献ヲミ
ヨ）。
Ｂ鎖を製造する別法はつぎのようである。Ｂ鎖は発現性
のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の末端に連結させうる。
のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の末端に連結させうる。
そして、β−ガラクトシダーゼとの融合ポリペプチドと
して製造しうる。Ｂ鎖の５′末端でコードされるメチオ
ニンにおいてシアノジエンブロマイド切断すると、Ｂ鎖
と同じペプチドが放出される（たとえば、０ａａａｂａ
ｄａｎ、 Ｍ、 Ｊ。
して製造しうる。Ｂ鎖の５′末端でコードされるメチオ
ニンにおいてシアノジエンブロマイド切断すると、Ｂ鎖
と同じペプチドが放出される（たとえば、０ａａａｂａ
ｄａｎ、 Ｍ、 Ｊ。
（１９８０）、 Ｊ、 ＢａＱｔ、、 １４３．９７１
：およびＧｏｅｄｄｅｌ。
：およびＧｏｅｄｄｅｌ。
Ｄ、Ｖ、、等（ｉ９７９）、 Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、
Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、Ｕ、８゜Ａ、、ユ、 １０６−１
１０をみよ）。
Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、Ｕ、８゜Ａ、、ユ、 １０６−１
１０をみよ）。
従って、本発明の別の具体例は、そのような細胞を培養
することを包含する、ブタレラクシンの少なくとも１個
の鎖を製造することに関する。
することを包含する、ブタレラクシンの少なくとも１個
の鎖を製造することに関する。
本発明のさらに別の具体例は、そのような方法で製造さ
れたレラクシンのＡおよびＢ鎖をジスルファイド架橋で
結びつけることを包含する、グタレラクシンの製造方法
に関する。
れたレラクシンのＡおよびＢ鎖をジスルファイド架橋で
結びつけることを包含する、グタレラクシンの製造方法
に関する。
さらに別の具体例として、本発明は、そのような方法で
製造されたブタレラクシンを低い−で切断することを包
含する、ブタのレラクシンの製造方法に関する。
製造されたブタレラクシンを低い−で切断することを包
含する、ブタのレラクシンの製造方法に関する。
つぎに本発明を例により説明する。
トリデカニュクレオチドＴｐＯｐＯｐＧｐＴｐＡｐＡｐ
ＡｐＧｐＡｐＯｐＡｐＴの合成 表１０に示すように完全に保護されたトリデヵニュクレ
オチドを合成する。便宜上、保挿基は示さない。表中で
矢印で示した反応は、っぎの操作で実施する。
ＡｐＧｐＡｐＯｐＡｐＴの合成 表１０に示すように完全に保護されたトリデヵニュクレ
オチドを合成する。便宜上、保挿基は示さない。表中で
矢印で示した反応は、っぎの操作で実施する。
表 １０
Ｔ十■
ｃｐ＋Ａｐ ↓
↓
０ｐＡｐ ＋ Ｔ −■
Ｇｐ＋Ａｐ ↓
↓
ＧｐＡｐ −１−０ｐＡｐＴ −［Ｆ］Ａｐ−）−Ａｐ
↓ ↓ ＡｐＡｐ −１−ＧｐＡｐＯｐＡｐＴ−［Ｆ］↓ ＴｐＯｐＯｐＧｐＴｐＡｐＡｐＡｐＧｐＡｐＣｐＡｐＴ
−■市販の、クロルメデ−ル化、１％架橋ポリスチレン
（０，５２ｍｅ’（Ｌ ＯＶ＆） を既知の方法でア
ミノメチル型（■）に変えた。（たとえば、Ｍｉｔｃｈ
ｅｌｌ 。
↓ ↓ ＡｐＡｐ −１−ＧｐＡｐＯｐＡｐＴ−［Ｆ］↓ ＴｐＯｐＯｐＧｐＴｐＡｐＡｐＡｐＧｐＡｐＣｐＡｐＴ
−■市販の、クロルメデ−ル化、１％架橋ポリスチレン
（０，５２ｍｅ’（Ｌ ＯＶ＆） を既知の方法でア
ミノメチル型（■）に変えた。（たとえば、Ｍｉｔｃｈ
ｅｌｌ 。
％ 、（ｉ９７（５）、ＴｅｔｒａｈｅｄｒＯｎ Ｌｅ
ｔｔｅｒｓ ４４２．３７９５−６７９８ ）。５′−
ジメトキシトリチルチミジン６′−０−サクシネートを
既知の方法でアミド結合を紅白してポリスチレンに連結
した（たとえば、Ｍｉｙｏｓｈｉ 、等、 （１９８
０）、 Ｎｕｃｌ、 Ａｃ１ｄ Ｒｅｓ、、
８． ５５０７−５５１７）。
ｔｔｅｒｓ ４４２．３７９５−６７９８ ）。５′−
ジメトキシトリチルチミジン６′−０−サクシネートを
既知の方法でアミド結合を紅白してポリスチレンに連結
した（たとえば、Ｍｉｙｏｓｈｉ 、等、 （１９８
０）、 Ｎｕｃｌ、 Ａｃ１ｄ Ｒｅｓ、、
８． ５５０７−５５１７）。
ジニュクレオチドの製造は、表１１に、を例とする操作
で実施した。
で実施した。
６ミリモルの
と、１００Ｍの２ｃｓ（Ｗ／ｖ）ヘンセンセルホン酸ト
をジクロルメタン／メタノール（７二３ ｖ／ｖ ）中
で５分間０℃で反応させる。５４ ＮａＨＯＯ３水溶液
で抽出したあとジクロルメタン層を乾燥し減圧で蒸発さ
せて油状とした。生成物（１）は、１Ｑ ％ ＭｅＯＨ
／ジクロルメタンにジクロルメタンを加えるグラジェン
トを用いるシリカ上のクロマトグラフィーにより精製し
た。
をジクロルメタン／メタノール（７二３ ｖ／ｖ ）中
で５分間０℃で反応させる。５４ ＮａＨＯＯ３水溶液
で抽出したあとジクロルメタン層を乾燥し減圧で蒸発さ
せて油状とした。生成物（１）は、１Ｑ ％ ＭｅＯＨ
／ジクロルメタンにジクロルメタンを加えるグラジェン
トを用いるシリカ上のクロマトグラフィーにより精製し
た。
６．１５ミリモルの
をｇｔ３ｈＶピリジン（１：１ｖ／／ｖ）と６時間室温
で反応させて減圧で浴媒を留去し油状とした。生成物で
ある は、８ミリモルのメシチレンスルホニルニトロトリアゾ
ール（ＭＳＮＴ） の８ミリモルの存在で１時間、無
水ビリシン中で で処理縮合させた。５ ％ （Ｗ／Ｖ）重炭酸ナトリウ
ム水溶液で反応を止め、ジクロルメタンで抽出した。
で反応させて減圧で浴媒を留去し油状とした。生成物で
ある は、８ミリモルのメシチレンスルホニルニトロトリアゾ
ール（ＭＳＮＴ） の８ミリモルの存在で１時間、無
水ビリシン中で で処理縮合させた。５ ％ （Ｗ／Ｖ）重炭酸ナトリウ
ム水溶液で反応を止め、ジクロルメタンで抽出した。
抽出物は減圧で蒸発させ油状とした。１Ｑ ％ Ｍｏｏ
ｎ／ジクロルメタンにジクロルメタンを加えるグラジェ
ントを用いシリカ上でクロマトグラフィ′−シて生成物
を精製した。生成物（Ｖ）はｌ！１ｔ３Ｈ／ピリジン（
１：１ｖ／ｖ）で処理し、シアノエチル保護基をはづし
た。減圧で蒸発させて固体泡状物（Ｖｌ）を得た。全収
率７５ｑｂ０ 固型物はマイナス２０℃で貯蔵したがオリゴニュクレオ
チド合成に使用しうる。
ｎ／ジクロルメタンにジクロルメタンを加えるグラジェ
ントを用いシリカ上でクロマトグラフィ′−シて生成物
を精製した。生成物（Ｖ）はｌ！１ｔ３Ｈ／ピリジン（
１：１ｖ／ｖ）で処理し、シアノエチル保護基をはづし
た。減圧で蒸発させて固体泡状物（Ｖｌ）を得た。全収
率７５ｑｂ０ 固型物はマイナス２０℃で貯蔵したがオリゴニュクレオ
チド合成に使用しうる。
ＤＭＴｒＴを付着させた１合体支持体の１００■を、つ
ぎの物質で順次処理した。
ぎの物質で順次処理した。
（１）ジクロルメタン／ブタノール（７：３）中２％牛
血清アルブミン（ＢＳＡ） で５分（２） ジクロ
ルメタン／ブタノール（７：３）ｘ（３） 乾燥ピリ
ジン×５ （Ｊ Ｏ，５ｍの乾燥ピリジン中１００〜のゾニュク
レオチドおよび１００ｍｇ（ＩＦ） ＭＳＮＴ、 ４５
分（５）乾燥ピリジン×２ １６１１０％無水酢酸／ピリジン１０分（７）乾燥ピリ
ジン×２ （８）ジクロルメタン／ブタノール（７：３）ｘｍ当な
ジニュクレオチドを用いてこのサイクルを反復し、オリ
ゴニュクレオチド鎖を完結させた。
血清アルブミン（ＢＳＡ） で５分（２） ジクロ
ルメタン／ブタノール（７：３）ｘ（３） 乾燥ピリ
ジン×５ （Ｊ Ｏ，５ｍの乾燥ピリジン中１００〜のゾニュク
レオチドおよび１００ｍｇ（ＩＦ） ＭＳＮＴ、 ４５
分（５）乾燥ピリジン×２ １６１１０％無水酢酸／ピリジン１０分（７）乾燥ピリ
ジン×２ （８）ジクロルメタン／ブタノール（７：３）ｘｍ当な
ジニュクレオチドを用いてこのサイクルを反復し、オリ
ゴニュクレオチド鎖を完結させた。
各段階のカップリングの効率は、遊静ジメトキシトリチ
ルアルコールを５０４ ｎｍで分光分析して測定した。
ルアルコールを５０４ ｎｍで分光分析して測定した。
合成を完了したら１、オリゴニュクレオチドを１合体担
体より坂り出し、０．５Ｍの１．１．３．３−テトラメ
チルグアニジウムｐ−ニトロベンズアルドキシムで室温
４８時間、濃アンモニヤ７０’Ｃで５時間、そして８０
％酢酸で６０分室温で処理した。脱保護したオリゴニュ
クレオチドはイオン交換高速液体クロマトグラフィーで
精製した。
体より坂り出し、０．５Ｍの１．１．３．３−テトラメ
チルグアニジウムｐ−ニトロベンズアルドキシムで室温
４８時間、濃アンモニヤ７０’Ｃで５時間、そして８０
％酢酸で６０分室温で処理した。脱保護したオリゴニュ
クレオチドはイオン交換高速液体クロマトグラフィーで
精製した。
オリゴマー二ュ夛しオチドブロックのバイブリド形成お
よび連結 Ｂ２重鎖構成の１連の段階は、表１２に示しである。
よび連結 Ｂ２重鎖構成の１連の段階は、表１２に示しである。
０．２５ ｆｆ１ＭのＡＴＰおよび５００ μｏｉのγ
−〔３２Ｐ〕−ＡＴＰ ／ｄ （ｐＨ９，４の５ Ｑ
ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＯｌつまりトリス（ヒドロキシメチ
ル）アミノメタン塩酸塩）、−１３ｍＭ ＭｇＯ１２，
５ｍＭジチオスレイト−＃（ＤＴＴ）中に、１につき１
００から１５０μｇのオリゴニュクレオチドおよび−に
ついて１／２５単位（１単位は、Ｒｌｃｈａｒｄｓｏｎ
、 Ｏ，Ｏｏ、 （１９７２）、Ｐｒｏｇｒｅｓｓ １
ｎＮｕｑｌｅｉｃ Ａｃｌ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ ’ｌ、
８ｉ５に従い６７℃で６０分インキュベートしたあと
ｉ ｎｍｏｌＧの酸不溶性３２Ｐの生成を触媒する触媒
する量）のＴ４ポリニュクレオチドキナーゼ（ｌＣａ
２．７．１．７８ ）を含有する溶液でリン酸化した。
−〔３２Ｐ〕−ＡＴＰ ／ｄ （ｐＨ９，４の５ Ｑ
ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＯｌつまりトリス（ヒドロキシメチ
ル）アミノメタン塩酸塩）、−１３ｍＭ ＭｇＯ１２，
５ｍＭジチオスレイト−＃（ＤＴＴ）中に、１につき１
００から１５０μｇのオリゴニュクレオチドおよび−に
ついて１／２５単位（１単位は、Ｒｌｃｈａｒｄｓｏｎ
、 Ｏ，Ｏｏ、 （１９７２）、Ｐｒｏｇｒｅｓｓ １
ｎＮｕｑｌｅｉｃ Ａｃｌ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ ’ｌ、
８ｉ５に従い６７℃で６０分インキュベートしたあと
ｉ ｎｍｏｌＧの酸不溶性３２Ｐの生成を触媒する触媒
する量）のＴ４ポリニュクレオチドキナーゼ（ｌＣａ
２．７．１．７８ ）を含有する溶液でリン酸化した。
リン酸化されたオリフニュクレオチドはエタノールで沈
殿させ変性条件で２０％（φ）ポリアクリルアミドデル
で精製した。
殿させ変性条件で２０％（φ）ポリアクリルアミドデル
で精製した。
ゲルから溶出したあと、０ｅｒｅｎｋｏｖカウンテイン
グで収量を測定した。
グで収量を測定した。
たとえば、ブロック１１および１６の連結はつぎのよう
にした。
にした。
１２．５ ｐｍｏｌｅの５′−〇五しラクシン１１．１
０ｐｍｏｌｅｓの５／ ａｌｐ−レラキシン１５および
１０ｐｍｏｌｅの５’ −ＯＨレラクシン１２を５０
ｔｔＬの水中において１００℃に加熱してアニーリング
し、ゆっくりと室温に戻した。混合物は凍結乾燥し、２
００単位（１単位は、Ｗｅｉｓｓ、 Ｂ、、等、 （１
９６８）。
０ｐｍｏｌｅｓの５／ ａｌｐ−レラキシン１５および
１０ｐｍｏｌｅの５’ −ＯＨレラクシン１２を５０
ｔｔＬの水中において１００℃に加熱してアニーリング
し、ゆっくりと室温に戻した。混合物は凍結乾燥し、２
００単位（１単位は、Ｗｅｉｓｓ、 Ｂ、、等、 （１
９６８）。
Ｊ、 Ｂｉｏｘ、Ｏｈｅｍ、、 ２４３．４５４５に従
い１μｍｏ］Ｊの３２ＰＰｉを６７℃で２０分で（α／
β３２Ｆ ） −Ａ’ｌ’Ｐ変える量である）のＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼ（Ｅ Ｏ６，５，１，１）を含有する２０
μｍのリガーゼ溶液（５Ｑ ｍＭ Ｔｒｉ８− Ｈｏｗ
ｌ Ｐ）（７，６、ｌＱ ｍＭ ＭｇＯ１２，２Ｑ ｍ
Ｍ ＤＴＴおよび２５０ ＩＩｘｎＡＴＰ ）に取った
。２２℃で１８時間経過したら、２０μｍ０４Ｍ酢酸ア
ンモニウム、１０μ９のｔＲＮＡおよび６倍容量のエタ
ノールを加えて反応を止めた。沈殿後の生成物は、変性
条件で１５チポリアクリルアミドデル上で精製した。
い１μｍｏ］Ｊの３２ＰＰｉを６７℃で２０分で（α／
β３２Ｆ ） −Ａ’ｌ’Ｐ変える量である）のＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼ（Ｅ Ｏ６，５，１，１）を含有する２０
μｍのリガーゼ溶液（５Ｑ ｍＭ Ｔｒｉ８− Ｈｏｗ
ｌ Ｐ）（７，６、ｌＱ ｍＭ ＭｇＯ１２，２Ｑ ｍ
Ｍ ＤＴＴおよび２５０ ＩＩｘｎＡＴＰ ）に取った
。２２℃で１８時間経過したら、２０μｍ０４Ｍ酢酸ア
ンモニウム、１０μ９のｔＲＮＡおよび６倍容量のエタ
ノールを加えて反応を止めた。沈殿後の生成物は、変性
条件で１５チポリアクリルアミドデル上で精製した。
Ａ遺伝子のｐＷＴ ５７１中でのクロン化はつきのよう
に実施した。
に実施した。
ｐＷＴ ５７１ ヲ、制限エンドニュクレアーゼＥｃｏ
Ｒ工（ｗａ ６．１．４．５２ ）およびＨ１ｎｄ４Ｈ
（ｇｃ ５．１．２３゜２１）を、製造者（Ｎｅｗ Ｅ
ｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、 １ｖ４Ｃ。
Ｒ工（ｗａ ６．１．４．５２ ）およびＨ１ｎｄ４Ｈ
（ｇｃ ５．１．２３゜２１）を、製造者（Ｎｅｗ Ｅ
ｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、 １ｖ４Ｃ。
Ｂｅｖｅｒｌｅｙ ＭＤ、 ＵＥＩＡ ）の指示に従っ
て用いて、切鵬した。５６２８ ｂｐフラグメントを、
低デル化温度アガロース（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅ５ｅ
ａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉ−ｅ８．工ｎｃ、 Ｇ
ａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、 ＭＤ、 ＵＳＡ ）を０．
０９ ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐｉ（８，５，２，５ｍＭ
ＢＤＴＡナトリウム、０．０８９Ｍホウ酸中１％含有
アガロースｒル寛気泳動で精製した。大きなバンドは、
アガロース片を６５°Ｃで融解させ、フェノ−／ｌ／
／ ｃａａ１３（１：ｉ ｖ／ｖ）で抽出し、二Ｊノー
ルで沈殿さすことで取り出した。
て用いて、切鵬した。５６２８ ｂｐフラグメントを、
低デル化温度アガロース（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅ５ｅ
ａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉ−ｅ８．工ｎｃ、 Ｇ
ａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、 ＭＤ、 ＵＳＡ ）を０．
０９ ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐｉ（８，５，２，５ｍＭ
ＢＤＴＡナトリウム、０．０８９Ｍホウ酸中１％含有
アガロースｒル寛気泳動で精製した。大きなバンドは、
アガロース片を６５°Ｃで融解させ、フェノ−／ｌ／
／ ｃａａ１３（１：ｉ ｖ／ｖ）で抽出し、二Ｊノー
ルで沈殿さすことで取り出した。
１０ ｔｔｌのＡ鎖遺伝子、２０μｇのＢｅ ｏＲ工／
Ｈ１ｎｄＩＩＩによるｐＷＴ ５７１の大型フラグメン
ト、５ＱｍＭの−７，８のＴｒｉｍ −Ｈｏｅ、 １Ｑ
ｍＭのＭ、９０’１２．１ｍＭのＡＴＰ 、 ２０
ｍＭのＤＴＴ、 ２００単位のＴ４ ＤＮＡりが一ゼ（
Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａ’ｂｓ、工ｎａ
）を含有する２０μを混合物を１８時間１５℃でインキ
ュベートして一ム遺伝子をシラスミドに連結した。連結
生成物は、既知の方法（たとえば０ｏｈｅｎ、等、 （
１９７２）。
Ｈ１ｎｄＩＩＩによるｐＷＴ ５７１の大型フラグメン
ト、５ＱｍＭの−７，８のＴｒｉｍ −Ｈｏｅ、 １Ｑ
ｍＭのＭ、９０’１２．１ｍＭのＡＴＰ 、 ２０
ｍＭのＤＴＴ、 ２００単位のＴ４ ＤＮＡりが一ゼ（
Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａ’ｂｓ、工ｎａ
）を含有する２０μを混合物を１８時間１５℃でインキ
ュベートして一ム遺伝子をシラスミドに連結した。連結
生成物は、既知の方法（たとえば０ｏｈｅｎ、等、 （
１９７２）。
Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａａ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、６９
．２１１０−２１１４）を用いてＫ 、 ｃｏｌｉ Ｋ
１２ ＷＴ ２１７ （ａｒａ Ｄ１５９． Δ（ａｒ
ａ、 ｌｅｖ ） ７ｔ５９八ａｌａｃ Ｘ７４． ｇ
ａｐ Ｖ 、 ｇａｐｋ 、 ｈｓｒ 、 ｈｓｍ”、
ｓｔｒ Ａ、 ｒｅｃ Ａ３６）を形質転換するに用
いた。そして、１００μＥｌ／ＩＲＩのアンピシリンに
抵抗性の転換株を選んだ。いくつかの形質転換株をさら
にプラスミドＤＮＡの制限酵素切断で分析した。Ｋｃｏ
Ｒ工およびＨｌｎｄＩＩＩで切断して７０−８０ ｂｐ
挿入物を含有することを示され、この挿入物中に、Ａ遺
伝子中にあることの知れている■ｉｎｆ Ｘに対する制
限サイトを明らかに含有した転換株を選択した。
．２１１０−２１１４）を用いてＫ 、 ｃｏｌｉ Ｋ
１２ ＷＴ ２１７ （ａｒａ Ｄ１５９． Δ（ａｒ
ａ、 ｌｅｖ ） ７ｔ５９八ａｌａｃ Ｘ７４． ｇ
ａｐ Ｖ 、 ｇａｐｋ 、 ｈｓｒ 、 ｈｓｍ”、
ｓｔｒ Ａ、 ｒｅｃ Ａ３６）を形質転換するに用
いた。そして、１００μＥｌ／ＩＲＩのアンピシリンに
抵抗性の転換株を選んだ。いくつかの形質転換株をさら
にプラスミドＤＮＡの制限酵素切断で分析した。Ｋｃｏ
Ｒ工およびＨｌｎｄＩＩＩで切断して７０−８０ ｂｐ
挿入物を含有することを示され、この挿入物中に、Ａ遺
伝子中にあることの知れている■ｉｎｆ Ｘに対する制
限サイトを明らかに含有した転換株を選択した。
ｐＲＡ ４と称するこのシラスミドは、ついでＡ遺伝子
を発現するように改変した。プラスミドはＫｃｃＲ工で
切った。プラスミドのそれぞれの端の１重鎖ＤＮＡ ”
尾部１を８１ニユクレアーゼ（’ｎａ５゜１、４．２１
） で処理して除きフラッシュ末端とした。ＥｃＯ
Ｒ工切断プラスミドｐＲＡ ４の１．５μｇを７．５単
位（１単位は、Ｖｏｇｔ、 Ｖ、 ｕ、、（１９７３）
、 Ｂｕｒ。
を発現するように改変した。プラスミドはＫｃｃＲ工で
切った。プラスミドのそれぞれの端の１重鎖ＤＮＡ ”
尾部１を８１ニユクレアーゼ（’ｎａ５゜１、４．２１
） で処理して除きフラッシュ末端とした。ＥｃＯ
Ｒ工切断プラスミドｐＲＡ ４の１．５μｇを７．５単
位（１単位は、Ｖｏｇｔ、 Ｖ、 ｕ、、（１９７３）
、 Ｂｕｒ。
、ｒ、 ＢＢｌｏｏｈｅ、Ｉ ５５＊ １９２に従い４
５℃で１０ ｐｇの核酸を可溶化する量）の８１ニユク
レアーゼと、２５０ ｍＭ塩化ナトリウム、３ ［］
ｍＭの−４，５酢酸ナトリウム、１ｍＭの硫酸亜鉛の５
０μを中１５°Ｃで０．５時間インキュベートした。生
成物はフェノール抽出し、エタノール沈殿させ、上記の
ように連結させた。ただし、フラッシュ末端の連結には
８００単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを用い温度を２５゛Ｃ
とするのが有利であった。そして連結生成物は、前記の
ように、Ｂ、 ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＷＴ ２１７を形質
転換するのに用いた。このようにして、シラスミドｐｌ
ＷＴ ５７１中のＦｉｃＯＲエサイトに隣るＡＴＧ （
イニシエーターメチオニンコドン）を、ｐＲＡ４に由来
するシラスミド中のｈｍ遺伝子の第１のコドンのつぎに
おいた。これは、ｐＲＡ ６５と称した。適当な条件下
でＡ＠遺伝子の発現かおこる。このように導ひかれたシ
ラスミドを富有するコロニーは、アンピシリン抵抗性に
関して選択し、シラスミドは、さらに、ＫｃｏＲ工処理
に非感受性であることを基礎にして選択した。元のＥｃ
ＯＲＩサイトに対し丁度上流で全ム遺伝子を含有する領
域のニュクレオチド配列は、既知の方法で決定した。（
たとえば、Ｍａｘａｍ、 Ａ、 Ｍ、、 ａｎｄ （）
ｉｌｂｅｒｔ、 Ｗ、 、 （１９７７）、 Ｐｒｏｃ
。
５℃で１０ ｐｇの核酸を可溶化する量）の８１ニユク
レアーゼと、２５０ ｍＭ塩化ナトリウム、３ ［］
ｍＭの−４，５酢酸ナトリウム、１ｍＭの硫酸亜鉛の５
０μを中１５°Ｃで０．５時間インキュベートした。生
成物はフェノール抽出し、エタノール沈殿させ、上記の
ように連結させた。ただし、フラッシュ末端の連結には
８００単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを用い温度を２５゛Ｃ
とするのが有利であった。そして連結生成物は、前記の
ように、Ｂ、 ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＷＴ ２１７を形質
転換するのに用いた。このようにして、シラスミドｐｌ
ＷＴ ５７１中のＦｉｃＯＲエサイトに隣るＡＴＧ （
イニシエーターメチオニンコドン）を、ｐＲＡ４に由来
するシラスミド中のｈｍ遺伝子の第１のコドンのつぎに
おいた。これは、ｐＲＡ ６５と称した。適当な条件下
でＡ＠遺伝子の発現かおこる。このように導ひかれたシ
ラスミドを富有するコロニーは、アンピシリン抵抗性に
関して選択し、シラスミドは、さらに、ＫｃｏＲ工処理
に非感受性であることを基礎にして選択した。元のＥｃ
ＯＲＩサイトに対し丁度上流で全ム遺伝子を含有する領
域のニュクレオチド配列は、既知の方法で決定した。（
たとえば、Ｍａｘａｍ、 Ａ、 Ｍ、、 ａｎｄ （）
ｉｌｂｅｒｔ、 Ｗ、 、 （１９７７）、 Ｐｒｏｃ
。
Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、Ｕ、８．Ａ、、２４
．５６０ ）。
．５６０ ）。
Ａ遺伝子の発現
１リツトルについて、６ｇのＮａ２ＨＰＯ４，３ｇのｘ
ｉ２ｐｏ４．０．５９のＮａ１ｌ、 １ ｇのＮＨ，Ｃ
＋１．０．２５ ＆のＭｇＳＯ３−７Ｈ２０，０，０２
１１の０ａＯ１２Ｈ６Ｈ２０，５１１のカブミノ酸不含
トリプトファン（Ｄｉｆｃｏ ）、５ ｇのグルコース
、１■のチアミンおよび１００■のカルベニシリン（α
−カルボキシベンジルペニシリン；Ｂｅｅｃｈａｍ ）
を含有するＭ９培地中に細胞を０．４のＡ６ＱＱｎｍま
で発育させてレラクシンＡを発現させた。６−β−イン
ドールアクリル酸を２０即／リツトルまで添加し、６７
℃で４時間インキュベートした。これらの条件で、最大
トリプトファンプロモーター活性が生ずることが知られ
ており、それゆえにム鎖が発現される（たとえば、公告
Ｇ。
ｉ２ｐｏ４．０．５９のＮａ１ｌ、 １ ｇのＮＨ，Ｃ
＋１．０．２５ ＆のＭｇＳＯ３−７Ｈ２０，０，０２
１１の０ａＯ１２Ｈ６Ｈ２０，５１１のカブミノ酸不含
トリプトファン（Ｄｉｆｃｏ ）、５ ｇのグルコース
、１■のチアミンおよび１００■のカルベニシリン（α
−カルボキシベンジルペニシリン；Ｂｅｅｃｈａｍ ）
を含有するＭ９培地中に細胞を０．４のＡ６ＱＱｎｍま
で発育させてレラクシンＡを発現させた。６−β−イン
ドールアクリル酸を２０即／リツトルまで添加し、６７
℃で４時間インキュベートした。これらの条件で、最大
トリプトファンプロモーター活性が生ずることが知られ
ており、それゆえにム鎖が発現される（たとえば、公告
Ｇ。
Ｂ、、特許Ｍ＊ ２．０６８．９７０をみよ）。
（ＢおよびＢ−０−Ａ遺伝子も同様に発現された）。
ｐＷＴ ５５１中でのＢ３ＩＬ伝子のクロン化まず、遺
伝子をｐＡＴ １５３に挿入しクロン化した。
伝子をｐＡＴ １５３に挿入しクロン化した。
ＰＡＴ １５りを制限エンドニュクレアーゼＣ１ａ工お
よびＢａｍ Ｈ工（ＰＣ６，１，２３，６） （Ｂｅｔ
ｈｅｓｄａＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｖｉｅ
ｓ ）で処理し、生ずる大型フラグメントを、ゲル化温
度の低いアガロース上の電気泳動で精製し、前記のよう
に抽出した。Ｂ遺伝子はこのシラスミドフラグメントに
連結し、連結生成物を用いてＩＣ０ｃｏｌｉ Ｋ１２
ＷＴ ２１７を転換し、アンピ＼シリン抵抗性により転
換株を選ぶことは前記のようである。いくつかの転換株
は、８ａｌ Ｘ （Ｈ１ｎｄエエ）、Ｈ１ｎｄエエエ、
Ｂｇ１工１． Ｒｓａ Ｉ Ｋ対する制限サイトを含有
し、０ＩＩＬ工およびＢａｎ Ｈ工に対するサイトで境
界されている１ ００ ｂｐ挿入物の存在を雉かめるた
めに、プラスミ、ｙＤＮムの制限酵素切断で分析した。
よびＢａｍ Ｈ工（ＰＣ６，１，２３，６） （Ｂｅｔ
ｈｅｓｄａＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｖｉｅ
ｓ ）で処理し、生ずる大型フラグメントを、ゲル化温
度の低いアガロース上の電気泳動で精製し、前記のよう
に抽出した。Ｂ遺伝子はこのシラスミドフラグメントに
連結し、連結生成物を用いてＩＣ０ｃｏｌｉ Ｋ１２
ＷＴ ２１７を転換し、アンピ＼シリン抵抗性により転
換株を選ぶことは前記のようである。いくつかの転換株
は、８ａｌ Ｘ （Ｈ１ｎｄエエ）、Ｈ１ｎｄエエエ、
Ｂｇ１工１． Ｒｓａ Ｉ Ｋ対する制限サイトを含有
し、０ＩＩＬ工およびＢａｎ Ｈ工に対するサイトで境
界されている１ ００ ｂｐ挿入物の存在を雉かめるた
めに、プラスミ、ｙＤＮムの制限酵素切断で分析した。
ついで、Ｂ遺伝子はｐＡＴ １５６よりｐＷＴ ５５１
中の発現サイトに移した。Ｂ遺伝子を含有するｐＡＴ１
５６は制限酵素０１！Ｌ工で切断し、“前記のように８
１ニユクレアーゼで処理した。つまり、プラスミｌ’の
各端で単１鎖ＤＮＡを除くために、１０μｇプラスミド
ＤＮＡに１０単位の８１ニユクレアーゼを用いた。フラ
ッシュ末端を確実にするために、プラスミトハ、ＤＮＡ
ホ＋） ｌ ５− セｒ （Ｎｏ ２．７．７．７）
で処理した。１０μｇのＯｌａ 工、 ８１−処理プラ
スミドを２０単位（１単位は、Ｒ１ｃｈａｒ４ｓｏｎ、
Ｏ，Ｏ，。
中の発現サイトに移した。Ｂ遺伝子を含有するｐＡＴ１
５６は制限酵素０１！Ｌ工で切断し、“前記のように８
１ニユクレアーゼで処理した。つまり、プラスミｌ’の
各端で単１鎖ＤＮＡを除くために、１０μｇプラスミド
ＤＮＡに１０単位の８１ニユクレアーゼを用いた。フラ
ッシュ末端を確実にするために、プラスミトハ、ＤＮＡ
ホ＋） ｌ ５− セｒ （Ｎｏ ２．７．７．７）
で処理した。１０μｇのＯｌａ 工、 ８１−処理プラ
スミドを２０単位（１単位は、Ｒ１ｃｈａｒ４ｓｏｎ、
Ｏ，Ｏ，。
等、（１９６４）、 Ｊ、 Ｂ１１１． Ｏｈｅｍ、、
２５９．２２２により、ポリ−ｄ（ム−Ｔ）をプライ
マーに用い、６７℃で６０分で全ニュクレオチドで１Ｑ
ｎｍｏｌｅを酸沈酸性の分画に取り込ませる量である
）のＤＩムポリメラーゼＩ（大型フラグメント、Ｂｅｔ
ｈｓｓｄａ Ｒｔｓｅａｒ−ａｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｉｅｓ ）を用い、１００μを中１００ｍＭのＰ）１７
，４ Ｔｒｉｍ−Ｈ（！ｌ、 ｉＱｍＭのＭｇＯ１２，
４ｍＭのジチオスレイトール゛および各３．５ｍＭのｄ
ＡＴＰ 、 （１（ｊＴＰ 。
２５９．２２２により、ポリ−ｄ（ム−Ｔ）をプライ
マーに用い、６７℃で６０分で全ニュクレオチドで１Ｑ
ｎｍｏｌｅを酸沈酸性の分画に取り込ませる量である
）のＤＩムポリメラーゼＩ（大型フラグメント、Ｂｅｔ
ｈｓｓｄａ Ｒｔｓｅａｒ−ａｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｉｅｓ ）を用い、１００μを中１００ｍＭのＰ）１７
，４ Ｔｒｉｍ−Ｈ（！ｌ、 ｉＱｍＭのＭｇＯ１２，
４ｍＭのジチオスレイトール゛および各３．５ｍＭのｄ
ＡＴＰ 、 （１（ｊＴＰ 。
（ＬＧＴＰ、 （ＩＴＴＰを含有する溶液中で、１５°
０２０分インキュベートした。
０２０分インキュベートした。
ついでプラスミドは制限酵素Ａｖａ 工で切り、生ずる
より小型のフラグメントをアがロースデル電気泳動で精
製した。
より小型のフラグメントをアがロースデル電気泳動で精
製した。
ｐＷＴ ５５１は制限酵素Ｈ１ｎｄｘ１１で切り、Ｓ１
ニユクレアーゼで処理しそしてＤＮＡポリメラーゼエで
処理した。これは、前記したようで、シラスミドの単一
鎖末端を除くためである。生成物はＡｕａ Ｉで切り、
大きい方のフラグメントをアガロースデル電気泳動で精
製した。
ニユクレアーゼで処理しそしてＤＮＡポリメラーゼエで
処理した。これは、前記したようで、シラスミドの単一
鎖末端を除くためである。生成物はＡｕａ Ｉで切り、
大きい方のフラグメントをアガロースデル電気泳動で精
製した。
このように生成した２つのフラグメントは、フラッシュ
末端連結に有利な条件（前′記）でつなぎ、前記のより
に、Ｂ、 ａｏｘｔ ｘ１２ ＷＴ ２１７の形質転換
に用いた。
末端連結に有利な条件（前′記）でつなぎ、前記のより
に、Ｂ、 ａｏｘｔ ｘ１２ ＷＴ ２１７の形質転換
に用いた。
挿入Ｂ鎖を有するｐＷＴ ５５１を含有する組み換え生
成物は、インタクトシラスミドのサイズ、Ｂ遺伝子すに
制限サイトの存在そしてＢ遺伝子挿入物のサイズにより
検出した。Ｂ遺伝子そのものならびに遺伝子の５′末端
に接するプラミドの部分の存在の絶対的確証は、ニュク
レオチド鎖配列の決定で得られた。
成物は、インタクトシラスミドのサイズ、Ｂ遺伝子すに
制限サイトの存在そしてＢ遺伝子挿入物のサイズにより
検出した。Ｂ遺伝子そのものならびに遺伝子の５′末端
に接するプラミドの部分の存在の絶対的確証は、ニュク
レオチド鎖配列の決定で得られた。
上記したように、別様のアプローチ−としては、その構
成オリゴマー（表８中の０ＧＡＴＧＣＡＧＴＯに代えて
オリゴマーＡＴＧＯＡＧＴＯを使用）よりフラッシュ５
′末端を有するＢ遺伝子を製造し、これを、ｉｎｎ ｘ
ｘｍよびＢａｎ Ｈ工（Ｈｌｎｄ ’ｍｊＦ、端はＳ１
ニユクレアーゼでフラッシュ末端とする）で処理された
＼ ｐＷＴ ５５１中に挿入した。
成オリゴマー（表８中の０ＧＡＴＧＣＡＧＴＯに代えて
オリゴマーＡＴＧＯＡＧＴＯを使用）よりフラッシュ５
′末端を有するＢ遺伝子を製造し、これを、ｉｎｎ ｘ
ｘｍよびＢａｎ Ｈ工（Ｈｌｎｄ ’ｍｊＦ、端はＳ１
ニユクレアーゼでフラッシュ末端とする）で処理された
＼ ｐＷＴ ５５１中に挿入した。
ｓ１処理は、しはしば不完全であるかまたは過剰になる
ので、これら２つの方法では、Ｂ遺伝子＼ につづくすｌ’−ム結合サイトに対応する領域において
望むシラスミドより１から６塩基過剰か才たは少ない、
Ｂ遺伝子含有組み換え物を生ずる。
ので、これら２つの方法では、Ｂ遺伝子＼ につづくすｌ’−ム結合サイトに対応する領域において
望むシラスミドより１から６塩基過剰か才たは少ない、
Ｂ遺伝子含有組み換え物を生ずる。
Ｂ遺伝子の発現はこの領域の配列で影響される。
ハイデリドＢ−０−Ａ遺伝子のｐＷＴ ５５１へのクロ
ニング Ｔｒｐ 発現サイトにおいてＢ遺伝子を含有するＰＷ
Ｔ５５１を制限酵素Ｂｇｌ ＩＩおよ′びＢａｎ ＩＩ
テ処理し、大きいフラグメントをアガロースデル電気
泳動で処理した。このフラグメントにＢ−Ｃ−ム遺伝子
を連結し、上記のように１１． ｃｏｌｉ Ｋ１２
ＷＴ ２１７の転換に用いた。いくつかの転換株は、Ｒ
ｓａ工。
ニング Ｔｒｐ 発現サイトにおいてＢ遺伝子を含有するＰＷ
Ｔ５５１を制限酵素Ｂｇｌ ＩＩおよ′びＢａｎ ＩＩ
テ処理し、大きいフラグメントをアガロースデル電気
泳動で処理した。このフラグメントにＢ−Ｃ−ム遺伝子
を連結し、上記のように１１． ｃｏｌｉ Ｋ１２
ＷＴ ２１７の転換に用いた。いくつかの転換株は、Ｒ
ｓａ工。
Ｘｍａ Ｉ、 ）ｌｉｎｆ Ｉ、 Ｂａｔ Ｎ工に対す
る制限サイトを含有し Ｂｇｌ ｒｒお７よぴＢａｎ
Ｈ工に対するサイトで境界されているＭ’ １９ ｂｐ
挿入物を望む配向に有していることを確かめるために、
シラスミドＤＮＡの制限酵素切断で分析した。選択プラ
スタＰのニュクレオチド配列を測定して望む遺伝子が存
在することを確かめた。
る制限サイトを含有し Ｂｇｌ ｒｒお７よぴＢａｎ
Ｈ工に対するサイトで境界されているＭ’ １９ ｂｐ
挿入物を望む配向に有していることを確かめるために、
シラスミドＤＮＡの制限酵素切断で分析した。選択プラ
スタＰのニュクレオチド配列を測定して望む遺伝子が存
在することを確かめた。
代理人 浅 村 皓
□ 手続補正書（自発）
昭和５７年Ｓ 月１１日
特許庁長官殿
１、事件の表示
昭和５７年特許願第１０６６４５−号
３、補正をする者
事件との関係 特許出願人
゛ご所
氏名 ジー、ディ、サール アンＶ コン７々ニー
（名 称） ４、代理人・ 氏 名 （６６６９） 浅 村
皓−５、補正命令の困・」 昭和 年 月 口 明細書の浄書 （内容に変更なし）−
（名 称） ４、代理人・ 氏 名 （６６６９） 浅 村
皓−５、補正命令の困・」 昭和 年 月 口 明細書の浄書 （内容に変更なし）−
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 （１） 配列 ５ ’ ＯＧＯＡＴＧＡＣＴ ＯＴＧ Ｔｏｅ
ＧＡＧ ＡＡＡ ＴＧＴ ＴＧＣＧＡＧ
しＴＴ −６” ＧＯＧ Ｔ、ＡＯＴＧＡ ＧＡＣＡＧ
Ｇ ＣＴＣＴＴＴ ＡＣＡ ＡＣＧ ＧＴＯ０ＡＡ−Ｇ
ＧＴ ＴＧＴ ＡＴＯＯＧＴ ＡＡＡ ＧＡＣＡＴＴ
ＧＯＴ ＯＧＴ ＯＴＧ ＴＧＴ ３’００Ａ ＡＯＡ
ＴＡＧ ＧＯＡ ＴＴＴ ＣＴＧ ＴＡＡ ＯＧＡ
ＧＯＡ ＧＡＣＡＣＡ ５’を含有することを特徴とす
る、ブタレラクシンに一発現のための合成遺伝子。 （２）配列 ５’ ＡＡＴＴ ０ＧＣｊ ＡＴＧＡＯＴ ＯＴＧ
ＴＣＯＧＡＧＡＡＡ Ｔ（）Ｔ ＴＧＣ！ ０ＡＧ−５
’ ＧＯＧ ＴＡＣ！ ＴＧＡ ＧＡＯＡＧＧ
ＣＴＣＴＴＴ ＡＯＡ ＡＣＧ ＧＴＯ−ＧＴＴ ＧＧ
Ｔ ＴＧＴ ＡＴＯＯＧＴ ＡＡＡ （）ＡＯＡＴＴ
ＧＯＴ ＣＧＴ ＯＴＧ ＴＧＴ−ＯＡＡ ＣＯＡ Ａ
Ｃ！Ａ ＴＡＧ ＧＣＡ ＴＴＴ ＣＴＧ ＴＡＡ
ＣＧＡ ＧＯＡ ＧＡＯＡＣＡ−ＴＡ ５” ＡＴＴ ＯＧＡ ５’ を含有することを特徴とする、上記（１）項記載の合成
遺伝子。 （３）配列 ５ ’ ＧＡＧ ＴＯＧ ＡＯＣＡＡＯＧＡＴ ＴＴ
ＯＡＴＣＡＡＡ ＧＯＴ ＴＧＴ ＧＧＡ＝−５” Ｇ
ＴＧ ＡＧＯＴＧＧ ＴＴＧ ＣＴＡ ＡＡＧ ＴＡＪ
ＴＴＴ ＯＧＡ ＡＯＡ ０ＯＴ−ＯＧＴ ＧＡＧ
ＴＴＡ ＧＴＴ ＣＧＴ ＴＴＡ ＴＧＧ ＧＴＴ Ｇ
ＡＧ ＡＴＯＴＧＴ ＧＧＯ−ＧＯＡ ＣＴＣＡＡＴ
ＯＡＡ ＧＯＡ ＡＡＴ Ａｃｅ Ｏ晶０ＴＣＴＡＧ
ＡＯＡ ０ＣＧ−ＴＯＴ ＧＴＡ ＡＧＴ ＴＧＧ Ｇ
ＧＴ ＯＧＴ ＡＯＯＧＯＡ ３’ＡＧＡ ＣＡＴ Ｔ
ＯＡ ＡＣＧ！ ＣＯＡ ＧＯＡ Ｔ冊ＯＧＴ ５’を
含有することを特徴とする、ブタラレキシンＢ領発現の
ための合成遺伝子。 （４）配列 ５’ Ｃ１ＧＡＴＧ ＯＡＧ ＴＯＧ ＡＣｉＣＡＡ
ＣＧＡＴ ＴＴＯＡＴＯＡＡＡ ＧＯＴ−６’ Ｔ
ＡＯＧＴＯＡＧＯＴＧＧ ＴＴＧ ＯＴＡ ＡＡＧ Ｔ
ＡＧ ＴＴＴ ０ＧＡ−ＴＧＴ ＧＧＡ ＯＧＴ ＧＡ
Ｇ ＴＴＡ ＧＴＴ ＯＧＴ ＴＴＡ ＴＧＧ ＧＴ
Ｔ ＧＡＧ ＡＴＯ−ＡＣＡ ＣＯＴ ＧＯＡ ＣＴ
ＣＡＡＴ ＯＡＡ ＧＯＡ ＡＡＴ ＡＯＣＣＡＡ Ｃ
ＴＣＴＡＧ−ＴＧＴ ＧＧＯＴＯＴ ＧＴＡ ＡＧＴ
ＴＧＧ ＧＧＴ ＯＧＴ ＡＣＣＧＣＡ ＴＡＡ Ｇ
３’ＡＯＡ ＱＣ（） ＡＧＡ ＯＡＴ ＴＯＡ Ａ
ＯＯＯＣＡ ＧＯＡ ＴＧＧ ＣＧＴ ＡＴＴ ＣＣ′
ｍ ５’を含有する、上記（３）項記載の合成遺伝子。 （５） 配列 ５’ Ｃ＋ＡＴ ０００ ＧＧＧ ＧＡＴ ＯＯＧ
３’５” ＣＴＡ ＧＧＧ Ｃｏｏ ＯＴＡ （）Ｇ
Ｃ５’を含有することを特徴とする、Ｂ仙とｌｊｌとの
あいたにペプチド結合−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｓ
ｐ−Ｐｒｏ −ｆ有するブタレラクシンハイプリド発現
のための遺伝子。 （６） いくつかの数のオリゴニュクレオチドブロッ
クの集成および連結を包含することを特徴とする、上記
（１）から（５）項までのいずれかに記載の合成遺伝子
の製造方法。 （７）挿入部位に上Ｌ（１）から（５）項までのいずれ
かに記載の合成遺伝子が挿入され、挿入された遺伝子を
発現するための正しい読み枠を有し、そして、挿入サイ
トの上流にそれに隣接して細菌プロモーターを有するシ
ラスミドベクターを含有することを特徴とする、組み換
えプラスミド。 （８１適当なシラスミドに、上記（１）から（５）項ま
でのいずれかに記載の合成遺伝子を挿入することを特徴
とする、上記（７）項記載の組み換えプラスミドの製造
方法。 （９） 上記（１）から（５１ｔでのいずれかに記載
の合成遺伝子または上記（力項記載の組み換えプラスミ
ドを挿入することにより形質転換した細胞。 Ｑｔｌｌ 上記（１）から（５）項才でのいずれかに
記載の合成遺伝子または上記（７）項に記載の組み換え
シラスミドを適当な細胞に挿入することを包含すること
を特徴とする、上記（９）項記載の細胞の製造方法。 （ＩＩ）上記（９）項記載の細胞を培養することを特徴
とする少なくとも１糧類のブタレラクシンを製造する方
法。 ←４ 上記Ｕｕ項記載の方法で製造したレラクシンＡお
よびＢをゾスルファイド結合で結びつけることを包含す
ることを特徴とする、ブタラレラクシンの製造方法。 ０ 上記１１１項記載の方法で製造したブタレラクシン
を低い−で切断することを包含することを特徴とするブ
タレラクシ／の製造方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB8119138 | 1981-06-22 | ||
| GB8119138 | 1981-06-22 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5810600A true JPS5810600A (ja) | 1983-01-21 |
Family
ID=10522709
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57106645A Pending JPS5810600A (ja) | 1981-06-22 | 1982-06-21 | ブタレラクシン鎖発現のための合成遺伝子 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0068375A3 (ja) |
| JP (1) | JPS5810600A (ja) |
| AU (1) | AU8507282A (ja) |
| DK (1) | DK278682A (ja) |
| NO (1) | NO822063L (ja) |
| PT (1) | PT75093B (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60192900A (ja) * | 1984-02-06 | 1985-10-01 | ゼネラル・エレクトリツク・カンパニイ | 凹所を持つ圧縮機ケ−シング |
Families Citing this family (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IE55479B1 (en) * | 1982-02-12 | 1990-09-26 | Florey Howard Inst | Molecular cloning and characterization of the gene sequence coding for porcine relaxin |
| NZ206534A (en) * | 1982-12-13 | 1988-05-30 | Florey Howard Inst | Molecular cloning and characterisation of gene sequence coding for human relaxin |
| US5023321A (en) * | 1982-12-13 | 1991-06-11 | Howard Florey Institute Of Experimental Physiology & Medicine | Molecular cloning and characterization of a further gene sequence coding for human relaxin |
| WO1985000831A1 (en) * | 1983-08-10 | 1985-02-28 | Amgen | Microbial expression of insulin-like growth factor |
| WO1986001515A1 (en) * | 1984-08-29 | 1986-03-13 | Chiron Corporation | Expression of human connective tissue activator and related peptides |
| GB8723662D0 (en) * | 1987-10-08 | 1987-11-11 | British Bio Technology | Synthetic gene |
| CA2051375C (en) * | 1989-05-04 | 2000-09-12 | Dennis J. Henner | Process and compositions for the isolation of human relaxin |
| US6348327B1 (en) | 1991-12-06 | 2002-02-19 | Genentech, Inc. | Non-endocrine animal host cells capable of expressing variant proinsulin and processing the same to form active, mature insulin and methods of culturing such cells |
| DE69432704T2 (de) * | 1993-06-21 | 2004-02-26 | Genentech, Inc., South San Francisco | Verfahren zur Herstellung von humanen Relaxin |
| US7259232B1 (en) | 2000-10-27 | 2007-08-21 | Nymox Pharmaceutical Corporation | Preferred segments of neural thread protein |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| YU257078A (en) * | 1977-11-08 | 1983-12-31 | Genentech Inc | Process for obtaining the code of the structural gene for the microbial transcribing of polypeptides |
-
1982
- 1982-06-19 EP EP82105405A patent/EP0068375A3/en not_active Withdrawn
- 1982-06-21 AU AU85072/82A patent/AU8507282A/en not_active Abandoned
- 1982-06-21 JP JP57106645A patent/JPS5810600A/ja active Pending
- 1982-06-21 DK DK278682A patent/DK278682A/da not_active Application Discontinuation
- 1982-06-21 NO NO822063A patent/NO822063L/no unknown
- 1982-06-22 PT PT75093A patent/PT75093B/pt unknown
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60192900A (ja) * | 1984-02-06 | 1985-10-01 | ゼネラル・エレクトリツク・カンパニイ | 凹所を持つ圧縮機ケ−シング |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| NO822063L (no) | 1982-12-23 |
| EP0068375A3 (en) | 1983-04-13 |
| AU8507282A (en) | 1983-01-06 |
| PT75093A (en) | 1982-07-01 |
| EP0068375A2 (en) | 1983-01-05 |
| DK278682A (da) | 1982-12-23 |
| PT75093B (en) | 1983-12-28 |
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