JPS584800A - インスリンｃ−鎖遺伝子類縁体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、正確なりＮＡｍ伝子配列の合成おＪ：び、そ
の合成遺伝子を複製しうるり［ｌン化ビヒクルに結合す
ることに関する。特に問題とするのは、ヒ１〜一様、プ
ロインスリン遺伝子類縁体の全合成、該遺伝子類縁体の
り［ｌン化ビヒクル中への挿入、該雑種ＤＮＡ分子の宿
主細胞中への導入、そのようにして特異的ヒト様プロイ
ンスリン蛋白質を生成しうる能ツノを有する形質転換細
胞に関する。

ＤＮＡのトリミングのためのいくつかのアダプター、特
にＣ−鎖ＤＮＡを望む長さに１〜リミングする方法の使
用についても記載する。

従来法について説明する。近年、つぎに列挙する方法が
開発された（　”　ｌｙｌ　ｏｌｅｃｕｌａｒ　　Ｃｌ
ｏｎｉｎｇｏｆ　　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　　Ｄ　Ｎ
　Ａ　　組換えＤＮＡの分子的クロニング”　　Ｗ、　
Ａ、３ｃｏｔｔ　　おにびＲ３Ｗ　ｅｒｎｅｒ編、Ａ　
ｃａｄｅｍｉｃ　　　Ｐ　ｒｅｓｓ社、１９７７）。

（１）　クロン化しようとするＤＮＡ断片をクロン化ど
ヒクル（独立して複製しつるＤＮＡ）にＤＮＡリガーゼ
により一？＞　　ビトロ−で結合する。

（２）　その雑種ＤＮＡ分子（組換えＤＮＡ）を適当な
宿主細胞に導入する。

（３）　望む雑種ＤＮＡ　（雑種ＤＮＡとしてクロン化
されたＤＮＡ）を有する形質転換細胞を選択しそして同
定する。

（４）　形質転換細胞中で望むクロン化ＤＮＡを増殖さ
せる。

そして、（５）クロン化ＤＮＡを蛋白質生成物として発
現させる。もつともよく報告されている場合では、細胞
またはウィルスより分離されたＤＮＡ分子を制限酵素消
化または物理的せん断ま５− 一〇り たはメツセンジャーのＣＤＮＡへの逆転写コピーにより
、クロニングする前に断片とする。

マウスに由来する導入ＤＮＡを青写真として細菌中で蛋
白質を合成することは、ＣＩ＋ａｎｇ等（Ｃｅｌｌ　　
６，２３１−２４４．．１９７５）により示されている
。天然の異物ＤＮＡをクロン化するさらに別の例が最近
記載された（　Ｇ　ｏｅｄｄｅｌ等、Ｎａｔｕｒｅ　　
２８１，５４４−５４８．１９７９等）２０ニユクレオ
チド長までのオリゴデオキシニュクレオヂドの全化学的
合成の方法は、ホスホジエステル法（Ｈ，Ｇ、　Ｋｈｏ
ｒａｎａ、　Ｊ、　ＭＯ＋。

Ｂｉｏｌ　、７２，２０９．１９７２）または改良ホス
ホトリエステル法（Ｉ」、　Ｍ、　ｌ−１ｓｉｕｎｏ　
ｌヨ（ｆＳ、　Ａ、　Ｎａｒａｎｇ、　Ｎｕｃｌｅｉｃ
　　Ａｃ１ｄｓ　　Ｒｅｓ、　６゜１３７１．１９７９
；Ｓ、Ａ、Ｎａｒａｎａ等。

Ｍｅｔｈｏｄｓ　　ｉｎ　　Ｅｎｚｙｎ＋ｏｌｏｑｙ　
、　Ｖｏｌ、　６５゜６１０．１９８０　　および　Ｖ
ｏｌ、６８．９０゜１９７９＞を用いて確立されている
。後者は、迅速で、収量が良くそして生成物の純度が良
い点で、現在良い方法であり、より鎖の長い明確なりＮ
Ａ６− − 配列の製造に用いられた。

いくつかの化学的に合成されたＤＮＡ配列たとえばラフ
１〜−ズオペレーター（Ｍａｒｉａｎｓ、　Ｗｕ等。

Ｎａｔｕｒｅ　　２６３，７４４．１９７６＞およびチ
ロシンｔ　ＲＮＡ遺伝子（Ｋ　ｈｏｒａｎａ、　３　ｃ
ｉｅｎｃｅ２０３．６１４．１９７９）が旦、剪旦に具
合よくクロン化され、そして引続く培養物中にクロン化
されたＤＮＡの弁環が検出された。最近の報告によれば
、ヒト脳ホルモンソマトスタチン（Ｉ　ｔａｋｕｒａ等
、５ｃｉｅｎｃｅ　　１９８，１０５６゜１９７７）お
よびヒト生長ホルモン（Ｇ　ｏｅｄｄｅｌ等、Ｎａｔｕ
ｒｅ　　２８１，５４４．１９７９）が導入された合成
遺伝子を有する形質転換細胞宿主中に生成された。

動物すい臓では、プロインスリン（Ｓ、Ｊ。

Ｃｈａｎおよびり、　Ｆ、　５ｔｅｉｎｅｒ、　Ｐｒｏ
ｃ　、　Ｎａｔ。

Ａｃａｄ　、Ｓｃｉ、７３．１９６４．１９７６）がイ
ンスリンのプリカーサ−として合成されている。

プロインスリンの一般的構造は、ＮＨ２−Ｂ鎖−（Ｃ鎖
）−Ａ鎖−ｃｏｏｔ−ｔＴ：ある。これは、すい厳島組
織中のペプチダーゼの作用でインスリンに変換されるが
、それによると、ヒ１ヘプロインスリンの式１中に示し
た２つの矢印の位置において切断することににすＣ−鎖
が除かれる。（Ｏｖｅｒ等。

Ｊ、Ｂｉｏｌ　、Ｃｈｅｍ　、、２４６．１３７５゜１
９７１）。インスリンのＢ−鎖と八−鎖とは、プロイン
スリンの段階で正しい位置に形成される２つのジスルフ
ァイドの架橋により相互に保持される。

生物的方法により、ｊＪ　１ｌｒｉｃｈ等（Ｓ　Ｃ１ｅ
ｌ’１ＣＧ１９６，１３１３．１９７７）およびｖｉｌ
ｌａ−Ｋ　ｏｍｏｒｏｆ’ｆ等（ｐｒｏｃ　、　Ｎａｔ
、　Ａｃａｄ　、　３ｃｉ。

７５．３７２７．１９７８）は、クツ１ヘプロインスリ
ンＩのコード領域をクロン化づることに成功した。イン
スリンへ−鎖遺伝子およびＢ−鎖遺伝子を別々に、Ｃｒ
ｅａ等（ｐｒｏｃ　、Ｎａｔ、Ａｃａｄ　。

３ｃｉ、　７テ、５７６５．１９７８）は化学的に合成
し、そしテＧ　ｏｅｄｄｅｌ等（ｐｒｏｃ　、　Ｎａｔ
、　Ａｃａｄ。

３ｃｉ、　７咋、１０６．１９７９）はクロン化した。

これらの合成遺伝子に選択された］トンは任意的で、天
然ヒトＤＮＡ配列とはまったく異なっている。培養する
と、細菌はインスリンへ−鎖蛋白質およびＢ−鏡型白質
を生成した。それらは、別々に処理され余分のβ−ガラ
ク１〜シダーゼおよびメチオニンが除かれた。

Ｒ，Ｗｕ等による、１９７７年１０月１９日提出Ｕ、Ｓ
、特許願シリースＮｏ　、　８４．３．４．２２および
Ｓ、　Ａ、　Ｎａｒａｎｇ等による１９８０年３月２７
日提出Ｕ、Ｓ、特許願シリースＮＯ。

１２９．８８０に、合成インスリンＡ−鎖およびＢ−鎖
遺伝子のようなりＮＡ配列の末端に、それらをクロン化
ビヒクルまたは他のＤＮＡに結合さすだめの合成アダプ
ター分子が記載された。これらのアダプターは、制限エ
ンドニユクレア−げによる認識→ノイ１へである特定の
ニュクレオヂド断片を有するＤＮＡ　に）リゴニュクレ
オヂド）配列およびコドントリプレツ１〜を含有した。

これらのアダプターはまた、二重鎖ＤＮＡ配列上の酵素
認識サイトを提供するかまたはひとつの型の１ノーイト
を他の型の１ノ−イ１〜に変えるのに用いられる。

つぎに本発明を要約１−る。本発明は、インスリンＣ−
鎖遺伝子（ＤＮＡ）のための新規コドン配列を提供する
。プロインスリンの類縁体を形成さずのに、より短かい
またはミニー〇−鎖が開発されそして用いられた。開裂
し、そしてＤＮＡ情報配列を挿入覆ることを容易にする
ために、選択された位置において適当なコドンを選択す
ることにより、これらのＣ鎖中に制限酵素認識部位を入
れこんだ。

本発明は、選択されたＡ−１Ｂ−およびＣ−鎖を合イＪ
１シて、新規のプロインスリン遺伝子とし、これらの遺
伝子を複製しうるクロン化ビヒクルに連結し、生ずる雑
種を宿主細胞に導入することを包含する。特に、たとえ
ば、合成に１〜様プロインスリン遺伝子（式２）を化学
的および酵素的方法を用いて合成した。開始シグナル（
ΔＴ　Ｇ　）およびＬ恨ＲＴ接着末端（５′ΔＡＴＴ＞
を、遺伝子の５′末端（左手末端）におぎ、停車シグナ
ル（ＴＧＡ＞およびＷｕ１−１１　）ビ着末端（５′Ｇ
ＡＴＣ）を遺伝子の３′末端においた。このアダプター
イ４ぎプロインスリン遺伝子を、細胞中に入り得る、複
製しうるクロン化ビヒクルに結合さゼ、クロン化ビヒク
ルとあ４つぜて複製さｔ！け。転換された宿主細胞の子
孫は、ＤＮＡ配列の分析より、正確な入れこまれたプロ
インスリン遺伝子を含有することが分った。ラフ１〜−
スプロモーターを含有しそして細胞当たり数百のプロイ
ンスリン遺伝子コピーを生成するブラスミドクロニング
ビヒクルが構成された。

１２− １８１　　　　　　　　　　　　　　１１９６２４１ ３’　　ＡＧＧ　　ＧＡＧ　　ＡＴＧ　　ＧＴＩ　　Ｇ
ＡＣＣＴＣＴＴＧ　　、ＡＴＧ１６− ＧＡＧ　　ＣＡＧ　　ＴＧＣＴＧＣＡＣＣＡＧＣＡＴＧ
　　ＴＧＣＣＴＣＧＴＣＡＣＧ　　ＡＣＧ　　ＴＧＧ　
　ＴＣＧ　　ＴＡＧ　　ＡＣＧＴＧＣＡＡＣＴＧ△　Ｇ
　　　　　　　３’５８ ＡＣＧ　　ＴＴＧ　　ＡＣＴ　　Ｃ優り旦　　５′３ａ
ｍＨ１ザイ［〜 詳細な記載および有利な具体例 Ａ、　　ＤＮＡをトリミングするためのアダプターこの
型のトリミング（ｔｒｉｍｎｌｉｎ！］）アダプターの
背後にある原則は、ある種のエンドニュクレアーゼたと
えばｌ−ｌ　ｐｈ　Ｉ　Ｊ５　Ｊ：びＭｂｏｌｌは、そ
れらの認識配列より８ニユクレオチド隔ったＤＮＡを切
断するという知識にもとづいている（Ｒ，Ｊ、　Ｒｏｂ
ｅｒｔｓ、　Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　　Ｅｎｚｙｍｏｌ。

６８．２７．１９８０＞。式３で、上側に線を付した５
個のニュクレオチドが認識部位で、Ｎは任意のニュクレ
オチドを表わす。

→　　　　　　　　　　　　　→ Ｚ　　　　　　　　　　　Ｚ ｚｚｚ ｚ　　　　ｚ　　　　　　ｚ　　　　ｚｚｚ　　　　　
　　ｚｚ ｚｚ　　　　　　　ｚｚ ｚｚｚ ｚｚｚ ＋ゴ 我々は、対称アダプターとして、ＤＮＡを１へリミング
Ｊ”るためのアダプターを考案し、合成した。式３に基
づく非ス・１称アダプターも使用しうる。

１６− １７− この型のＤＮＡ１〜リミング用アダプターは、任意のＤ
ＮＡに平滑末端連結さけうる。ぞれにり末端の８ニユク
レＡチドを除去しつる。たとえばＭｂｏｌＩアダプター
を用いて、タロン化インスリンＡ〜鎖遺伝子の末端より
８個のニュクレオチドＮＮＮＮＮＮＮＮを除去Ｊる。

１８− ｄ　Ｘ　１−　Ｐは、り［ｌン化されたＡ−鎖遺伝子の
３′末端におりる　Ｎ　に隣接覆るニコクレΔヂドに同
じにｉｔ＆ぶ。つまり、ニュクレオヂド１１　Ｘ　ＩＩ
がＣなら（ｌ　ＣＴ　Ｐを用いる。

原則として、■肌［Ｉまた【ま几暉すル２識ザイ１〜を
超えて１から７個までの追加のニュクレオヂドを含有す
るこの型のＤＮＡ１〜リミングアダプターは、任意のＤ
ＮＡ二重鎖末端から７から１　ｆｌｌｌｌまでの塩基を
１〜リミング除去するのに用いうる（　Ｎ　ａｒａｎｇ
等、　Ｎ　ｕｃｌｅｉｃ　　Ａ　ａｉｄｓ　　Ｒｅｓ。

Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　　３ｅｒｉｅｓ　Ｎｏ　、　７　
、３７７　。

１８９０）。この技術は、インスリンＣ−鎖の変型に用
いた。

Ｂ、　ヒｊ〜プロインスリン遺伝子の配夕１ノを構成す
るデオキシリ小オリゴニュクレオチド断片の化学合成 式２のようなヒ１〜プロインスリンＤＮＡの配列および
種々のアダプターを構成するすべてのデオキシリボオリ
ゴニュクレオヂドの化学的合成は、１９７３汗に我々の
実験室のうちのびとつにおいて開発された変型ホスホト
リエステル法で達成された（Ｃａｎ、　Ｊ、　Ｃ１１に
ｍ　、　５１　。

３６／Ｉ９，１９７３　：Ｓ、Ｎａｒａｍｇ　９゜Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ　　ｏｆ　　Ｅ　ｎｚｙｍ０１’００ｙ　　
６５　、６１０　。

１９８０　；　Ｓ、　Ｎａｒａｎｑ等、　Ｍｃｔｈｏｄ
ｓ　　ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏ（ＩＶ　　６Ｂ、　９０．
１９７９）。我々のアブ［１−チの主要な特徴はつきの
Ｊ、うである。

（ｉ）　　出発物質として５５′−ツメ１ヘキシトリデ
ルーデオキシリボ［ノニコクレＡヂド３′−ホスホ１〜
すＴスプル（４１吊体）を用いる； （ｉ　＋　）　　５　ｒ　−ラメ１〜４−シトリデルー
デー、１−１−シリボモノニＥ１クレＡシト３′　−小
スホジ］ニスチルと５５′−ヒト「１４−シ含右成分と
を縮合させて、ジュクレＡヂドとする。これは、分離の
ための従来法によるイｊ１５１ｆ化学技術のづ−べてを
用いうる、１１１１種どしてのニコクレオヂド間小スホ
１ヘリ二「スプル結合を含有する； （ｉｉｉ　）　　副生成物が存在しイＴいゆえの、望む
生成物の高収量での生成。

づべてのデオキシリボオリゴマー （１０から２０単位）の合成は、１６種の可能な２徂体
ブロックＪ：り組立てられた。それぞれのカップリング
反応は、カップリング試剤と１ノでのメシチレンスルボ
ニルテ１〜ラゾールの存在で、各成分のほとんど化学量
論的量を用いて室温で ３０から／１５分間実施した。処理したあと、望む生成
物を、Ｈ，Ｍ　、　ｌ−Ｉ　５ｉｕｌｌｏ等の開発した
方法（Ｎ　ｕｃｌｅｉｃ　　Ａ　ｃｉｄＲｅｓ、６．１
３７１．１９７９）である逆相クロマトグラフ法で分離
した。合成完了後、クロ［１ボルム−メタノール中２％
ベンゼンスルホン酸溶液ＬＪ。

３　ｔａｗｉｎｓｋｉ等、　　Ｎｕｃｌｅｉｃ　　Ａｃ
１ｄ　　　Ｒｅｓ。

上、３５３．’１９７７）を用いて５′−ジメ１〜」−
２１〜リヂル基を除いた。他の保護基はり一ベて、２段
階淵アンモニヤ処理（Ｉｔ　、　Ｍ　、　ｌ−１ｓｉｕ
ｎｇ等、　Ｎ　ｕｃｌｅｉｃ２２− Ａｃｉｄ　　　Ｒｅｓ、８，５７５３．１９８０）で除
いＩ〔。未保ＩＪリゴマーのそれぞれはＰＥ１−口Ｃブ
レー１〜」二で）１１′ｌ！ＩＩＪシ、七ビリティーシ
フト法（Ｃ，Ｄ、Ｔｌ）等、△ｎａｌ　、　Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ、　７　／Ｉ　、　７３　。

１９７６）で配列を定めた。各フラグメン１〜の配列を
確かめぞしてそれらのオートラジオグラフを報告した（
ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ　　　　Ｒｅｓ、　　６．　　
１３７１．　　１９７９ニア、２１９９，１９７９：８
，５７５３゜１９８０）。

０、　　プロインスリン渭伝子の合成おにびり［１ン化
我々の製造したヒ１〜様プロインスリン渭伝子は式２に
示しである。この］１〜ン配り１１〈１がら２５８まで
のＦ基対）は我々が）′Ｊ１択した。そして、式１に示
す構造のヒ１へ様ブ「１インスリンを」−ドする。」−
ド配列（ｉＷ伝伝記配列は、アミノ酸がＪｌｉ通であれ
ば、刀へて、クツ１〜プ［１インスリン（ｔＪｌｌｒｉ
ｃｌ）等、　３　ｃｉｅｎｃｃ　　１９　Ｃｉ　。

１３１３．１９７７）のぞれを１．（礎としている。

２３− ヒトプロインスリンの３．９，３０，３４゜３７，４０
．４２．４９．５２．５５゜６０゜６１．６２および６
９のアミノ酸はラツｌ−とは異なっているので、これら
の位置での］−ド配列は、ヒトプロインスリンのそれら
を選んだ。

式２で、ニュクレオヂド１−９０．９１−１９５および
１９６−２５８は、ヒトプロインスリン鎖Ｂ、鎮Ｃおよ
び鎖Ａをそれぞれコードする。我々の選んだ］トンは、
独自の組合わけを形成づる。

ヒト様プロインスリンは、つぎのように構成した。Ｂ−
鎖のコード遺伝子およびＣ鎖の大部分の］−ド遺伝子を
あわけて１単位として構成した。これは、開始シグナル
（Ｂ−１８およびＢ−１９７ラグメン１へ）および］−
ド配列（式２の下方鋼のニュクレオチド１−１７８およ
び下方鋼のニュクレオチド１−１８２）を含有した。こ
の合成りＮＡは長さで１０から１３ニユクレオチドの合
成フラグメン１〜３２個より構成した。４から６個のフ
ラグメンＩ〜をまず、ＤＮＡリガーげを用いて平滑末端
連結で相互に結合させ、６フラグメン１〜群（弐〇中の
ａ−ｆ）とした。各フラグメンｌ−の配列は式２に示し
である。他のプロインスリン′！Ｉｎ縁体にも類似のス
キームを用いうる。

フラグメントより各グループを構成するには、各合成フ
ラグメン）・（４から６個のフラグメント）の約８００
　ｐｍｏｌを、その５′−末端において３２ｐで、ポリ
ニュクレオチドキナーゼでリン酸化した。リン酸化フラ
グメントは２０％ポリアクリルアミドゲル上で精製した
。精製フラグメントのそれぞれの約５　Ｑ　ｐｍｏｌを
、６５℃で３０μＩ容量中でアニーリングし、ゆっくり
と０℃に冷却した。１ｌｉｆｌＤＮＡリガーゼ緩衝液を
添加して、５０ｍ　ＭＴｒｉｓ　−ＨＣｌ　　（ｐ　Ｈ
７，６）、１０ｍＭＭ！＋　ＣＩ　２．１０ｍＭジチオ
スレイトール、１００μＭＡＴＰの最終濃度とした。

Ｔ４ボリニュクレオチドリガーゼ（０，４単位）を加え
、混合物を１２℃で２４から３６時間インキュベートし
た。連結生成物は１５％ポリアクリルアミドゲル上で精
製した（変性条件）。

各グループ（ａからｆ）に入れこまれたフラグメントの
収量は、１２０から２５０　ｐｍｏｌに変動した。

ついでひとつのグループを隣りのグループ（つまりａか
らｂへ）に平滑末端連結で結合し、６個すべてのグルー
プを結合して、弐〇の構造Ｉとした。連結条件は、上記
パラグラフに示したのと同じである。構造Ｉの収量は約
２０　ｐｍｏｌであった。

クロン化されたヒト様インスリンＡ−鎖遺伝子はＳ　、
　Ａ　、　Ｎ　ａｒａｎ（］およびＲ，Ｊ、Ｗｕにより
１９８０年３月２７日提出Ｕ、Ｓ、特許願Ｎｏ　、１２
９，８８０に記載されているので、これを本明細書で、
参考文献に引用する。インスリンへ−鎖遺伝子は、ＥＣ
０ＲＩ制限酵素によりクロンより再生（回収）された。

ここで、式７に示すように、Ａ−鎖遺伝子より８ニユク
レオチド隔てて、旦ｃｏＲＩサイ１〜が露出している。

２９− この段階でクロン化された八−鎖遺伝子の３′末端（右
手側末＠）がなお停止アダプターおよび１）ＢＲ３２２
プラスミドクロニングビヒクルに連結されていることに
留意されたい。インスリンへ−鎖遺伝子の５′末端（左
手側）における８個の余分のニュクレオヂド（開始シグ
ナルを含む）は、Ｍｂｏｌｌｔ−リミングアダプターを
用いて除去された。式７中のＤＮＡは、まずＡＭＶ逆転
写酵素の存在でｄ　ＡＴＰおよびｄ　ＴＴＰを用いてま
ず対を再形成させた。

ＤＮＡをトリミングするためのデカニュクレオヂドＭｂ
ｏｌｌアダプターを、対を再形成させた末端に平滑末端
連結させて ３０− に８　　対を再形成したクロン化へ−鎖遺伝子に連結さ
せたＭｂＯＩＩアダブー３１− ター とした。

平滑末端連結は、５０ｍＭの１ｒｉｓ　−ＨＣＩ（ｐ　
Ｈ７，６）、１０ｍＭのＭ（ｌ　Ｃｌ　２．１０１１１
Ｍのジチオスレイトール、１００μＭのＡＴＰ、１００
１００ｐの自己相補性ＭｂＯＩＩアダプター、３Ｑｐｎ
ｌＯ＋のクロン化Ａ−鎖遺伝子および０．３単位のＴ４
ボリニュクレオチドキナーゼを用いた。インキュベーシ
ョンは１２℃で４０時間であった。

弐８に示したＤＮＡをＭｂＯＩＩ制限酵素（これは、認
識配列ＧＡＡＧＡより８ニユクレＡヂド隔った、矢印を
示した場所でＤＮＡを切断する）で切断し、ついでＦ、
ｃｏロー　ポリメラーゼ１　（ＤＮＡの末端がフラッシ
ュされていることを確実にするために３２Ｐ　　ｄＣＴ
Ｐまたはコールドｄ　ＣＴＰを存在さす）で処理すると
、Ａ−鎖遺伝子より８個の余分の塩基対が除かれる。

再生されたＡ−鎖遺伝子はついでＢａｍ）ＩＩ制限酵素
で切断する。これはつぎの構造を与える。

３２− 曵１　再インスリンＡ−鎖遺伝子 再生されたインスリンＡ−鎖遺伝子はついでＣ−８およ
びＣ−１７セグメン１〜に平滑末端連結させて構造ＩＩ
どする。

３３− −６４− 構造ＩＩは、ついで、ノラグメン１〜の各グループに示
したと同じ条イ！ｉ下で接着末端連結に」；りそれらの
５ａｕ３Ａリ−イ１〜において（ず４造Ｉに結合させて
、式１０の下方部分に示したよう４′ｒプロインスリン
（Ｂ　十〇　＋Ａ鎖）〕真イ云了どする１、これと同じ
合成戦客は、他のプロインスリン遺伝子類縁体の調製に
応用（）うる。

３５− 指摘けねばならぬことどして、ヒＩへ様プ［１インスリ
ンは、Ｂ十〇鎖の同じ３２）−ノブメン１へと再生され
たＡ−鎖遺伝子とをいくつかの異なる様式で結合さけて
も構成しつる。

天然のヒ１〜プロインスリンは３５アミノ酸より成立つ
Ｃ＝鎖を含有Ｊる。ペプヂダーＵでＣ鎖を除去し生物的
に活性のあるインスリン（１３十Ａ鎖）を生成さす効率
はＣ−鎖の艮ざで影響される。でれで、異なる長さの０
−鎖を有するプロインスリン類縁体にみちびりにうにＣ
−鎖遺伝子の長さを変えることににす、ブ１］インスリ
ンを生産するいくつかの方法をプリ゛インした。

それらプロインスリン類縁体のひとつまたはいくつかは
、生物的に活性のあるインスリンを高収量で与え、イし
て恐らくは変型されたＣ−鎖の生理的副作用がより少な
いという点で、天然のプロインスリンＪ：りすぐれてい
ることがありうる。

（ａ　）　　ひとつの方法どして、Ｃ−鎖渭伝子（ふつ
うは３５アミノ酸Ｘ　３−１０５塩基３７一 対）を、２つまたはそれ以上のフラグメントを除き、９
３．８４または７２だ（ブの塩基対をそれぞれ与えるだ
りににり構成しうる。それは、弐６におりると同じ様に
Ｂ＋Ｃ鎖を構成することで達成しつるが、ただし、フラ
グメン１−〇−５おにびＣ−１３を除去し１２塩基り＝
１１ごけう１口かいＣ−鎖く式１１をみＪ：）を与える
ようにグループｄ。

ｅ、「を再デザインした（式１１をみよ）。

同様にして、Ｃ−３，Ｃ−／１．Ｃ−１１およびＣ−１
２のフラグメン１〜を除去すると、２１塩阜対だ（Ｊ短
かいＣ−鎖を！ｊえたし、または、Ｃ−３，Ｃ−４，Ｃ
−５，Ｃ−１１、Ｃ−１２およびＣ−１３７ラグメン１
〜を除去するど３３塩基対だり短かいＣ−鎖を与えた。

３８一 式１１　ヒ１〜一様プロインスリン逍伝子のよりう、０
かいＢ　十Ｃの構成のためのスキーム。グループａ）、
ｂ）Ｊ３よびＣ）は弐〇と同じで示してない ｄ）　　　　１３−８　　　　　　Ｃ−１０−２ｅ＞　
　　　　　　　Ｃ−３Ｇ−４ ＣＣＣ△□　−−−−−−−−− ｆ＞　　　　　　　　Ｃ−６（、−７ ＣＣＣＡ□−−−−−−−□ −６９−− これらの構成が可能なのは、除去されたフラグメン１〜
（Ｃ−２，（、−４おにびＣ＝５）の連結部にａ−３（
プるニュクレオヂド配列が同じで、すべて、上方鎖に３
′突突出列ｄ　　（Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｔ）を有するからであ
る（式２をみよ、アンタラインしたニュクレオヂド、お
よび式１１をみよ）。それで、我々は、上方鎖より１．
２または３個のレグメントを除去し、そしてなお、下方
鎖におりるｄ　　（（＞Ｃ−Ｃ−Ａ）配列とのアニーリ
ングを可能どして、異なる長さのＣ−鎖を与えつる。種
々に短かくしであるＣ−鎖をひとたび集めてみると、そ
れぞれ、弐〇のグループａ　）　、　ｌ）　）およびＣ
）に結合され、式１０の構造Ｉに類似するり１０かくさ
れたＢ　＋　Ｃ鎖遺伝子を与える。最後に、知かくされ
た構造Ｉを式１０の構造１■に結合さすと、正常の遺伝
子に類縁の、短かくなったプロインスリン遺伝子に与え
る。

（ｂ　）　　つぎに示Ｊように、Ｂ−３１１仏子の右手
４０− 末端とＡ−鎖遺伝子の左手末端のあいだにつぎに示す合
成フラグメンｉ〜を連結さすことにより、Ｃ−鎖渭伝子
は、１８塩基対た【ノ短かくしうる。

４１− 籾１２　ヒトプロインスリン遺伝子のミニー〇−鎖コー
ド配列　Ｃ ′Ｊ　Ｇ ４２− ９５０− 一一一］ ＧＴ、−一−＝−−−−−−− ＣＡＩ−−ｍ−−−−−−−−− Ａ−＠遺伝子 ５′末端（左端）に開始ジグノールを有しそして３′末
端（右端）に停止シグナルを有するヒ１〜様プロインス
リン週伝子（鎖Ｂ−Ｃ−Ａ）またはその類縁体はＦＣＯ
ＲＩ−おＪ：びＢａｍｌ−１１−消化ｐＢＲ３２２プラ
スミドに連結させ、生ずる雑種ＤＮＡで旦、姐且 （５３４６株）を形質転換する。この株および設備は、
現行の組換えＤＮＡの規制を満足する。望むクロンは、
３２ｐ−ラベルＣ−鎖フラグメント（１７−３２ニユク
レオヂド長）および３２ｐ−ラベルクロン化Ａ−鎖フラ
グメンｈを用い、コロニー雑種化（Ｇ　ｒｕｎｓｔｅｉ
ｎおよび　ｌ−１ｏｇ１−１ｏ、　ｐｒｏｃ　、　Ｎａ
ｔ、　Ａｃａｄ　。

Ｓｃｉ、７２．３９６１．１９７５）ににり同定された
。陽性のクロンのうら、いくつかのクロン化プロインス
リン遺伝子の正しい配列は、ＤＮＡ配列分析で決定され
た。

クロン化されたと］へ様プロインスリン遺伝子中のＣ−
鎖遺伝子は、また、つぎのようにしても短かくしうる。

つまり、クロン化されたヒト様プロインスリンを５ａｕ
３Ａ制限酵素で消化して、右手末端が上記構造Ｉに示し
たようで左手末端が８−鎖遺伝子のずべておよびクロン
化ビヒクルｐＢＲ３２２よりのＤＮＡの追加の３２５塩
基対を含有含有するＤＮＡ構造とする。この分子は、右
手末端より、２つの方法で短かくしうる。

（ｉ）Ｓｌニュクレアーゼ消化（ＶＯ（ｌｔ等。

Ｅ　ｕｒｏｐ、　Ｊ　、　Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ、　３３　
、１９２　。

１９７３）より４個の突出するニュクレオチド（５’　
ＧＡＴＣ）を除去し、そして平滑末端連結によりＭｂＯ
ＴＩ再生アダプターを結合させる。上記式５に示した段
階を実施したあとで、右手末端より８塩基対を除去して
、 Ｃ−鎖のこの部分を１２塩基対＜　４　＋８　）だけ短
かくしうる。１回または１回Ｊ：り多くのサイクルでＭ
ｂｏｌＩ再生アダプター操作（式５）を反復するが、つ
ぎに示すアダプター（式１３）を用いて、ずでに短かく
しであるＣ−鎖遺伝子の右手末端より、各サイクル毎に
６塩基対を除去しうる。

式１３　各末端に２つの追加の塩基対を含有する■αす
Ｉ再生アダプター （Ｎ、Ｎ’　は任意の相補的二コ−クレオチド）５’　
Ｎ　　Ｎ　　ＴＣＴＴＣＧＡＡＧＡ　　Ｎ’　Ｎ３’Ｎ
’Ｎ’　　ＡＧＡＡＧＣＴＴＣＴ　　ＮＮ上記の方法を
用いて、上記式２のニュ クレＡ゛ヂドＮ０．１８２より左方に、全体で１２．１
８．２４または３０塩基対だり、プロインスリンのＣ−
鎖遺伝子を短かくしうる。

（１１）　　■キソニュクレアーＬ’ｌｌｌおよびＳｔ
ニュクレアーげの組合わせでＤＮＡを消化する（Ｗ（１
等、　Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ、上ｉ。

７３’１．１９７６：ｒでｏｂｃｒｔ等、ｐｒｏｃ。

Ｎａ口、Ａｃａｄ　、ｓｃｉ、７６．７６０゜１９７８
）またはＢＡＬ３１ 一／ｌ５− （Ｌ　ｅｇｅｒｓｋｉ等、　Ｎ　ｕｃｌｅｉｃ　　Ａｃ
１ｄｓ　　Ｒｅｓ、５．１４４５．１９７８： Ｔ　ａｌｍａｄ（ｌｅ等、Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ　　、　　Ａｃａｄ　　、　　Ｓｃｉ、　　７
７、　３３６９および　３９８８．１９８０＞でＤＮＡ
を消化する。この方法で、約６から８１塩基対を除去で
きる。そして、３塩基対の倍数（つまり、６，９．１２
．１５・・・８１）を除去されたＤＮＡ分子を、クロニ
ングしそしてＤＮＡ配列を分析したあとで選択しうる。

上記しＩＣように５ａｕ３Ａ制限酔索でクロン化された
ヒト一様プロインスリン遺伝子を消化しそして種々の長
さのＤＮＡフラグメン１−を挿入することによりＣ−鎖
遺伝子を延長しうる。たとえば、５′突出末端（５’　
ＧＣＴＡ）を、合成フラグメントＣ−１６の別の分子に
接着末端連結で結合さけ、ついでＣ−７を結合させつる
。４ｄＮＴＰおよびＡＭＶ逆転写４６− 酵素を用いて、対を再生するにうに合成り−ると、平滑
末端１）　Ｎ　Ａは１３塩基対長くなる。上記のＳに］
クレアーゼ消化 構造物ＴＩにこの分子を平滑末端連結すると、消化によ
り、１１ｊ牛されそして変型されたインスリンＡ−鎖遺
伝子Ｊζす４Ｊ福基え１が除かれるので、正味の結果と
して、プロインスリン遺伝子の０−末端に９塩基対〈さ
らに３個のアミノ酸を］−ドする）が付加Ｊ−る。同じ
操作を用いるがしかし、Ｃ−１６，Ｃ−７，Ｃ−１５お
よびＣ−６７ラグメン１〜をイ・１加して、最終的に２
１１Ｂ１対（７個の追加アミノ酸）が付加Ｊ−る。同様
に、３塩基対の他の倍数ｂイｑ加しうる３、 Ｂ−鎖遺伝子およびいくらかのｐＢＲ ３２２ＤＮＡになお付着しているＣ−鎖遺伝子を変型し
たあと、それは、左手末端において８１ニユクレアーげ
で４個の突出ニュクレオチド（Ｓａｕ３△−＋ノイ１〜
に４７− お（Ｊる５’　Ｇ△王Ｃ）を切断したあと（前記パラグ
ラフに記載）、再生されそして変型された遺伝子（上記
構造ＩＩ）に平滑末端連結さＶうる。この生成物につい
で、計則Ｒ１および比視１−ＩＩ制限酵素で消化し、短
縮プロインスリン遺伝子（１記式１０の下部に示した楔
構造に相当する）を放出させそして前記のようにＥＣ０
ＲＩ−おＪ：ぴＢ　ａｍｌ−１１−消化ｐＢＲ３２２プ
ラスミドに接着末端連結させそしてクロン化づる。

最大の発現を達成−づ−るためには、クロン化４１種プ
ラスミドＤＮＡｔＥｃｏＲＩおＪ：びＢａｍＨＩエンド
ニュクレアーゼで消化して、クロン化されたプロインス
リン遺伝子を切り出す。Ｓ　、　Ａ　、　Ｎ　ａｒａｎ
ｑおよび　Ｒ，Ｊ、Ｗｌｌによる、１９８０年３月２７
日付、Ｕ、Ｓ、特許願Ｎｏ。

、１２９，８８０の報告の型の旦刈Ｒ＞Ｂ　ａｌｎ＋−
１１変換アダプターを用いて、４８− Ｂ　ａｍｌ−１１末端をＥＣ０ＲＩ末端に変換しうる。

変換アダプターはつぎの構造を有する。

Ｋ１先　旦卯ＲＩ　−１３ａｍｌ−Ｉ　Ｉ　　変換アダ
プタ一旦鮒Ｒ１ １ナイ　１〜 ５’　　　　Ａ△−１丁　　ＣＴ　Ａ　Ａ　ＣＡ　Ｇ　
ｌ−Ｃ（：ｉ３’　　　　　　　　ＧＡＴＴＧＴＣＡＱ
ＯＣＴＡＧ［３ａｍｌ−Ｉ　　Ｅ　　１ナイ　１へ１１
する、アダプタ一つきの、各末端にＥｃｏＲＩす゛イｌ
−を有するプロインスリン遺伝子は、発現のための強力
なラクトースプロモーターに隣接して、ｌ）　ＢＧＰｌ
　２０　（Ｐｏ１ｉＳｋｙ等、　Ｐｒｏｃ　、Ｎａｔ。

Ａｃａｄ　、Ｓｃｉ、７３．３９００゜１９７６）また
は１１　ｌ−，１７０（ｌ　ａｕ　　および　Ｗｌｌ、
未発表データ〉のようなプラスミドに連結さけうる。プ
ロインスリン遺伝子を右Ｊるこの再構成雑種プラス−／
Ｉ　９− ミドＤＮＡは、Ｅ、免ｏｌｉ−細胞を形質転換して、生
物的に活性のあるインスリンの天然ブリカー１ナーであ
るじ１〜プロインスリンを大量に合成するように指令す
るのに用いうる。別様には、クロン化されたプロインス
リンをラフ１−−スプロモーターに結合させついでプラ
スミドｐＫＮ４０２（Ｕｈｌｉｎ等、Ｇｅｎｅ　６，９
１゜１９７９＞またはそれの誘導体に結合させつる。こ
れは、旦−０りとロー細胞１個について、２００以上の
プラスミドのコピーを製造しうる。このプラスミドのコ
ピー数は、 ρＢＧＰ１２０またはＩＩＢＲ３２２の少なくとも７倍
である。それで、プロインスリン遺伝子のコピーが２０
０以上計重ｃｏｌｔ　　細胞１個あたりにＪ：り合成さ
れ、細胞１個により、プ［１インスリン蛋白質の５００
，０００コピーが製造されることになる。

５０− ［、ｃｏｌｔ　　プロインスリンクロンは、ｔｌ＋ｅ　
　［）　ｅｐａｒｔｍｅｎｔ　　ｏｆ３１ｏｃｌ＋ｅｍ
ｉｓｔｒｙ　、　ＣｏｒｎｅｌｌＩＪ　ｎ１ｕｅｒｓｉ
ｔｙ　、　　ｌ　ｔｈａｃａ　、　Ｎ　、　Ｙ　、に保
存されているので、必要に応じて入手しつる。

代理人　浅　　オ・１　　　皓 外４名 ５１−

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. （１）　正常の遺伝子長より、それぞれ、二］−クレオ
   ヂドを除去するかまたは４＝Ｊ加することにより、短縮
   されたかまたは延長された、インスリンＣ−鎖遺伝子類
   縁体。
2. （２）　３の倍数のニュクレＡヂドを除去するかまたは
   イ４加することにより、炉縮されたかまたは延長された
   、上記（１）項記載のインスリンＣ−鎖遺伝子類縁体。
3. （３）　正常遺伝子長が、本明細書中に記載する式２の
   二重鎖ニュクレオヂド９１−１９５である、上記（１）
   項記載のインスリンＣ−鎖遺伝子。
4. （４）　適当なアダプターを付したインスリンＡ−鎖お
   よびＢ−鎖遺伝子に連結づ−るに適当な、式２のＣ−１
   からＣ−７＋Ｃ−９からＣ−１６の二重鎖ＤＮＡ配夕１
   」を有する、−に記（３）項のようなインスリンＣ−鎖
   部分遺伝子。
5. （５）　フラグメン１〜Ｃ５ａ３Ｊ：びＣ−１３を除去
   することにより１２塩基対知かくした上記（３）項記載
   のインスリン遺伝子、。
6. （６）　フラグメントＣ−３，Ｃ／Ｉ、Ｃ−１１および
   Ｃ−１２を除くことにＪζす、２１　＋＝　ｇ＜対短か
   くした、上記（３）項に記載のインスリンＣ−鎖遺伝子
   。
7. （７）　フラグメン１−〇−３．Ｃ−１Ｉ　、　Ｃ−５
   ゜−Ｃ−１１，Ｃ−１２８よびＣ−１３を除去ηること
   により３３塩基対知かくした、−１記（３３）項記載の
   インスリンＣ−鎖遺伝子１゜
8. （８）　式２のニュクレオヂド１８２より左方へ、１２
   個、１８個、２４個、３０個：１、たはそれより多くの
   個数の塩基対のうらのいずれかだ（Ｊ短かくした、上記
   （３）項のインスリンＣ−鎖遺伝子。
9. （９）　式２のニュクレＡブト１Ｆ３２より左方へ、３
   の倍数である、６．９．’１２．１５から８１に至る個
   数だ（）短かくした一］二記〈３）項に記載のインスリ
   ンＣ−鎖遺伝子。
10. （１０）　　Ｃ−鎖遺伝子の３ａｌ１３Δリイｌ（５’
    ＧＡＴＣ）に、選んだ長さのＤＮＡフラグメントを連結
    することにより、３塩基対の倍数だけ延長した、上記（
    ３）項のインスリンＣ−鎖遺伝子。
11. （１１）式 ％式％ を有するインスリンＣ−鎖遺伝子類縁体。
12. （１２）　少なくとも１個の制限酵素認識サイトを形成
    するように選択したニュクレオチドを挿入含有するイン
    スリンＣ−鎖遺伝子。
13. （１３）　正常のＣ−鎖ＤＮＡを３の倍数だけニュクレ
    オチドを除去して短縮するかまたは付加して延長した、
    プロインスリン遺伝子類縁体。
14. （１４）　複製しうるクロン化ビヒクルに連結された上
    記（１３）項のプロインスリン遺伝子類縁体。
15. （１５）（ａ）　　下方のＤＮＡ鎖の遊離部分的Ｃ−鎖
    末端において影規３Ａ　（３’　ＣＴＡＧ５”）に対す
    る酵素認識サイトを有する、インスリンＢ＋部分的Ｃ鎖
    遺伝子類縁体の合併体を提供し、（ｂ）　　該Ｃ−鎖遺
    伝子類縁体の他の部分を有し、そして、該Ｃ−鎖遺伝子
    類縁体の残余の部分の上方ＤＮＡ鎖中の上流末端におい
    て、該酵素に対する相補的認識部位５　’　Ｇ　Ａ　Ｔ
    　Ｃ３’　を有する、インスリンへ−鎖遺伝了を１１？
    供し；（Ｃ）　２つの遺伝子（ａ　）おにび（ｂ）を、
    それらの５ａｕ３Ａ−！ｊイ１へにおいて連結して、完
    全なプロインスリン遺伝子をすることからなる、変型さ
    れたプロインスリン遺伝子の構成方法。