JP2001095563A - イオン交換クロマトグラフィーによって血液凝固第ｖｉｉ因子を活性化するプロテアーゼ、そのプロ酵素または両タンパク質の混合物を純粋形態で調製する方法 - Google Patents
イオン交換クロマトグラフィーによって血液凝固第ｖｉｉ因子を活性化するプロテアーゼ、そのプロ酵素または両タンパク質の混合物を純粋形態で調製する方法Info
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】 プロテアーゼ活性化血液凝固第VII因子、そ
のプロ酵素又は両タンパク質の混合物をイオン交換クロ
マトグラフィーにより純粋形態で調製する方法の提供。 【解決手段】 ａ）単離すべきタンパク質の等電点より
も低いｐＨにおけるアニオン及び／又はカチオン交換ク
ロマトグラフィーによるか、又はｂ）アニオン又はカチ
オン交換クロマトグラフィーをアフィニティークロマト
グラフィー及び／又はｐＨ２.５〜９.０、好ましくはｐ
Ｈ２.５〜７.２における分画沈殿法と組み合わせたもの
（ここでアフィニティークロマトグラフィー分離は、・
リン酸カルシウム／ヒドロキシアパタイト・疎水性マト
リックス・キレートマトリックス・単離すべきタンパク
質に対する固定化モノクローナル抗体もしくはポリクロ
ーナル抗体、又はそのＦ(ａｂ)もしくはＦ(ａｂ)2断片
で被覆されたマトリックスを用いて実施される）によ
り、純粋形態で調製される方法。
のプロ酵素又は両タンパク質の混合物をイオン交換クロ
マトグラフィーにより純粋形態で調製する方法の提供。 【解決手段】 ａ）単離すべきタンパク質の等電点より
も低いｐＨにおけるアニオン及び／又はカチオン交換ク
ロマトグラフィーによるか、又はｂ）アニオン又はカチ
オン交換クロマトグラフィーをアフィニティークロマト
グラフィー及び／又はｐＨ２.５〜９.０、好ましくはｐ
Ｈ２.５〜７.２における分画沈殿法と組み合わせたもの
（ここでアフィニティークロマトグラフィー分離は、・
リン酸カルシウム／ヒドロキシアパタイト・疎水性マト
リックス・キレートマトリックス・単離すべきタンパク
質に対する固定化モノクローナル抗体もしくはポリクロ
ーナル抗体、又はそのＦ(ａｂ)もしくはＦ(ａｂ)2断片
で被覆されたマトリックスを用いて実施される）によ
り、純粋形態で調製される方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、血液凝固第VII因
子を活性化するプロテアーゼ、そのプロ酵素または両タ
ンパク質の混合物を純粋形態で調製する方法、および個
々または混合物として前記タンパク質を含有する医薬製
剤に関する。
子を活性化するプロテアーゼ、そのプロ酵素または両タ
ンパク質の混合物を純粋形態で調製する方法、および個
々または混合物として前記タンパク質を含有する医薬製
剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】ドイツ国特許出願第19903693.4号は、既
に血液凝固第VII因子を活性化するためのプロテアー
ゼ、その製造方法、その検出方法および不活化方法、並
びにこのプロテアーゼを含有する医薬製剤を開示してい
る。このプロテアーゼは、まず血漿から単離され、「プ
ロ酵素」と称される非活性型と一緒に存在する。プロテ
アーゼは血液凝固第VII因子を活性化し、そして多くの
実験によって示されているように凝固を促進する。セリ
ンプロテアーゼとして同定されている、このタンパク質
の生物学的特性についての他の研究では、プロウロキナ
ーゼなどの単一鎖プラスミノーゲン活性化剤もまた効率
的に活性化されることが明らかになっている。さらに、
インビトロにおいて第V因子および第VIII因子の不活化
が観察されている。ドイツ国特許出願第19903693.4号に
既に記載されている配列決定された領域に加えて、プロ
テアーゼ画分のＮ−末端の配列決定が実施された。次の
アミノ酸配列： IYGGFKSTAGKHP； LLESLDPDXTPD； EFHEQSFRVEKI； SKFTXAXPXQFK； （Ｘは未同定を意味する）がFVII活性化プロテアーゼを
特徴付けるものである。前述のプロテアーゼの配列は、
Choi-Miura（Choi-Miura等 J. Biochem. 1996年;119: 1
157〜1165）により公表されたプロテアーゼの配列と１
００％一致することまでを明らかにしている。
に血液凝固第VII因子を活性化するためのプロテアー
ゼ、その製造方法、その検出方法および不活化方法、並
びにこのプロテアーゼを含有する医薬製剤を開示してい
る。このプロテアーゼは、まず血漿から単離され、「プ
ロ酵素」と称される非活性型と一緒に存在する。プロテ
アーゼは血液凝固第VII因子を活性化し、そして多くの
実験によって示されているように凝固を促進する。セリ
ンプロテアーゼとして同定されている、このタンパク質
の生物学的特性についての他の研究では、プロウロキナ
ーゼなどの単一鎖プラスミノーゲン活性化剤もまた効率
的に活性化されることが明らかになっている。さらに、
インビトロにおいて第V因子および第VIII因子の不活化
が観察されている。ドイツ国特許出願第19903693.4号に
既に記載されている配列決定された領域に加えて、プロ
テアーゼ画分のＮ−末端の配列決定が実施された。次の
アミノ酸配列： IYGGFKSTAGKHP； LLESLDPDXTPD； EFHEQSFRVEKI； SKFTXAXPXQFK； （Ｘは未同定を意味する）がFVII活性化プロテアーゼを
特徴付けるものである。前述のプロテアーゼの配列は、
Choi-Miura（Choi-Miura等 J. Biochem. 1996年;119: 1
157〜1165）により公表されたプロテアーゼの配列と１
００％一致することまでを明らかにしている。
【０００３】今日までの研究は、特にその活性化型のプ
ロテアーゼに集中している。血漿中にプロ酵素として存
在するプロテアーゼの不活性型は、試料の還元後にＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥにおいてタンパク質のバンドのパターンに
よってつい最近見い出された。プロテーゼの活性化にお
いて、開裂、ついで活性化はセリンプロテアーゼについ
て典型的な第一構造の部位にて開始されるため、２つま
たはそれ以上のバンドが電気泳動において観察される。
ジスルフィド架橋によって連結した鎖の還元について、
個々のバンドはその低分子量に基づいて認識可能とな
り、プロ酵素は大きい１つの鎖として残る。これはま
た、より複合した溶液において、タンパク質を膜に転移
させ、次に適切な抗体を使用するウェスタンブロッティ
ングの後に明確になる。
ロテアーゼに集中している。血漿中にプロ酵素として存
在するプロテアーゼの不活性型は、試料の還元後にＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥにおいてタンパク質のバンドのパターンに
よってつい最近見い出された。プロテーゼの活性化にお
いて、開裂、ついで活性化はセリンプロテアーゼについ
て典型的な第一構造の部位にて開始されるため、２つま
たはそれ以上のバンドが電気泳動において観察される。
ジスルフィド架橋によって連結した鎖の還元について、
個々のバンドはその低分子量に基づいて認識可能とな
り、プロ酵素は大きい１つの鎖として残る。これはま
た、より複合した溶液において、タンパク質を膜に転移
させ、次に適切な抗体を使用するウェスタンブロッティ
ングの後に明確になる。
【０００４】治療上の理由に対して、前述の２つのタン
パク質の混合物に加えて、その活性化型およびプロ酵素
について両方のプロテアーゼが入手可能となることが現
在期待されている。活性化したプロテアーゼは血液凝固
第VII因子または単一鎖プラスミノーゲン活性化剤の迅
速な活性化に使用して急性症候群に影響を及ぼすことが
できるのに対して、プロテアーゼのプロ酵素型は、先天
性もしくは後天性欠損状態の中−長期予防もしくは治療
のためまたは生理的範囲を超えた血漿レベルを増加させ
るための好ましい薬剤として特に選択されるべきであ
る。しかし、活性化したプロテアーゼの安定化は、例え
ば自己分解が開始するかまたは分子がその構造条件のた
めに不安定になりうるために困難であることは考慮すべ
きである。先の研究は、第VII因子を活性化するプロテ
アーゼは、特別な環境下においてのみ単離してそのプロ
酵素型に安定化させ得ることを示している。
パク質の混合物に加えて、その活性化型およびプロ酵素
について両方のプロテアーゼが入手可能となることが現
在期待されている。活性化したプロテアーゼは血液凝固
第VII因子または単一鎖プラスミノーゲン活性化剤の迅
速な活性化に使用して急性症候群に影響を及ぼすことが
できるのに対して、プロテアーゼのプロ酵素型は、先天
性もしくは後天性欠損状態の中−長期予防もしくは治療
のためまたは生理的範囲を超えた血漿レベルを増加させ
るための好ましい薬剤として特に選択されるべきであ
る。しかし、活性化したプロテアーゼの安定化は、例え
ば自己分解が開始するかまたは分子がその構造条件のた
めに不安定になりうるために困難であることは考慮すべ
きである。先の研究は、第VII因子を活性化するプロテ
アーゼは、特別な環境下においてのみ単離してそのプロ
酵素型に安定化させ得ることを示している。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】先の研究は、このプロ
テアーゼの生物活性をカルシウムおよび／またはヘパリ
ンもしくは後者に関連する物質によって増加させ得るこ
とを示している。この特徴は、既に前に使用されてプロ
テアーゼを固定化ヘパリンに吸着させ、濃縮画分が得ら
れている。さらに、アニオン交換クロマトグラフィーが
プロテアーゼの精製に適することも既に知られている。
両方の精製工程の組み合わせは、濃縮形態でのプロテア
ーゼの入手に適している。アプロチニンマトリックスの
使用もまた活性化プロテアーゼの純粋形態での調製に使
用することができる。
テアーゼの生物活性をカルシウムおよび／またはヘパリ
ンもしくは後者に関連する物質によって増加させ得るこ
とを示している。この特徴は、既に前に使用されてプロ
テアーゼを固定化ヘパリンに吸着させ、濃縮画分が得ら
れている。さらに、アニオン交換クロマトグラフィーが
プロテアーゼの精製に適することも既に知られている。
両方の精製工程の組み合わせは、濃縮形態でのプロテア
ーゼの入手に適している。アプロチニンマトリックスの
使用もまた活性化プロテアーゼの純粋形態での調製に使
用することができる。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明は生物液体から得
られるかまたは遺伝子工学によって調製される場合には
そのものから得られる、血液凝固第VII因子を活性化す
るプロテアーゼおよび／またはそのプロ酵素が、 ａ）単離すべきタンパク質の等電点よりも低いｐＨにお
けるアニオンおよび／またはカチオン交換クロマトグラ
フィーによるか、または ｂ）アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィーを
アフィニティークロマトグラフィーおよび／またはｐＨ
２.５〜９.０、好ましくはｐＨ２.５〜７.２における分
画沈殿法と組み合わせたもの（なおここでアフィニティ
ークロマトグラフィー分離は、 ・リン酸カルシウム／ヒドロキシアパタイト ・疎水性マトリックス ・キレートマトリックス ・単離すべきタンパク質に対する固定化モノクローナル
抗体もしくはポリクローナル抗体、またはそのＦ(ａｂ)
もしくはＦ(ａｂ)2断片で被覆されたマトリックスを用
いて実施する） ことにより純粋形態で調製され、且つ同時に安定化され
る方法に係る。
られるかまたは遺伝子工学によって調製される場合には
そのものから得られる、血液凝固第VII因子を活性化す
るプロテアーゼおよび／またはそのプロ酵素が、 ａ）単離すべきタンパク質の等電点よりも低いｐＨにお
けるアニオンおよび／またはカチオン交換クロマトグラ
フィーによるか、または ｂ）アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィーを
アフィニティークロマトグラフィーおよび／またはｐＨ
２.５〜９.０、好ましくはｐＨ２.５〜７.２における分
画沈殿法と組み合わせたもの（なおここでアフィニティ
ークロマトグラフィー分離は、 ・リン酸カルシウム／ヒドロキシアパタイト ・疎水性マトリックス ・キレートマトリックス ・単離すべきタンパク質に対する固定化モノクローナル
抗体もしくはポリクローナル抗体、またはそのＦ(ａｂ)
もしくはＦ(ａｂ)2断片で被覆されたマトリックスを用
いて実施する） ことにより純粋形態で調製され、且つ同時に安定化され
る方法に係る。
【０００７】プロテアーゼおよび／またはそのプロ酵素
の純粋形態での調製に特に適する方法は、アニオン−お
よび／またはカチオン−交換クロマトグラフィーであ
る。活性化プロテアーゼを純粋形態で調製するこれらの
方法の使用は明らかに以前から提案されていたが、しか
し先に使用されていた方法条件は完全に満足できる結果
を与えなかった。これは主に、マトリックスの表面との
接触においてプロ酵素の活性化の危険性が非常に高いた
めである。故に課題は、純粋で且つ安定な形態で活性化
プロテアーゼおよびプロ酵素の調製を可能にする方法を
開発することである。
の純粋形態での調製に特に適する方法は、アニオン−お
よび／またはカチオン−交換クロマトグラフィーであ
る。活性化プロテアーゼを純粋形態で調製するこれらの
方法の使用は明らかに以前から提案されていたが、しか
し先に使用されていた方法条件は完全に満足できる結果
を与えなかった。これは主に、マトリックスの表面との
接触においてプロ酵素の活性化の危険性が非常に高いた
めである。故に課題は、純粋で且つ安定な形態で活性化
プロテアーゼおよびプロ酵素の調製を可能にする方法を
開発することである。
【０００８】驚くべきことに、非常に低いｐＨ、特にｐ
Ｈ２.５〜７.２の間ではプロテーゼの活性型もプロ酵素
も損傷を受けず、故に吸着および溶出において良好な結
果のために用いることができることが示された。これに
より、血漿中を循環する大部分の他のプロテアーゼは酸
性媒体中において活性がないかまたは非常に活性が低
く、故にタンパク質分解による活性化の危険性を最小限
にするため、第VII因子を活性化するプロテアーゼのほ
とんど問題のない操作を可能にする。プロテアーゼの自
己分解の危険性もこの方法において減少する。知られて
いるように、極度の酸性ｐＨは変性の危険性を包含し、
故にプロテアーゼの活性の損失をもたらすために、強酸
媒体から得たプロテアーゼの活性を、例えば発色性基質
を作用させた場合に生じる消失を光度測定によって測定
した。この場合、プロテアーゼおよびそのプロ酵素の両
方が、短時間ならばｐＨ２.０まで活性を損失すること
なく操作可能であることが示された。ｐＨ２.５〜約ｐ
Ｈ７.２において、プロテアーゼおよびそのプロ酵素を
数ヶ月保存することができ、最も高い安定性はｐＨ６.
５未満で観察される。
Ｈ２.５〜７.２の間ではプロテーゼの活性型もプロ酵素
も損傷を受けず、故に吸着および溶出において良好な結
果のために用いることができることが示された。これに
より、血漿中を循環する大部分の他のプロテアーゼは酸
性媒体中において活性がないかまたは非常に活性が低
く、故にタンパク質分解による活性化の危険性を最小限
にするため、第VII因子を活性化するプロテアーゼのほ
とんど問題のない操作を可能にする。プロテアーゼの自
己分解の危険性もこの方法において減少する。知られて
いるように、極度の酸性ｐＨは変性の危険性を包含し、
故にプロテアーゼの活性の損失をもたらすために、強酸
媒体から得たプロテアーゼの活性を、例えば発色性基質
を作用させた場合に生じる消失を光度測定によって測定
した。この場合、プロテアーゼおよびそのプロ酵素の両
方が、短時間ならばｐＨ２.０まで活性を損失すること
なく操作可能であることが示された。ｐＨ２.５〜約ｐ
Ｈ７.２において、プロテアーゼおよびそのプロ酵素を
数ヶ月保存することができ、最も高い安定性はｐＨ６.
５未満で観察される。
【０００９】この場合、驚くべきことに、前述の低ｐＨ
でのアニオン−および／またはカチオン−交換クロマト
グラフィーをプロテアーゼおよびプロ酵素の精製に用い
ることができることが見出された。この場合における吸
着がプロテアーゼまたはプロ酵素の等電点より低いｐＨ
での交換マトリックスにおいて可能であるため、これは
注目すべきである。
でのアニオン−および／またはカチオン−交換クロマト
グラフィーをプロテアーゼおよびプロ酵素の精製に用い
ることができることが見出された。この場合における吸
着がプロテアーゼまたはプロ酵素の等電点より低いｐＨ
での交換マトリックスにおいて可能であるため、これは
注目すべきである。
【００１０】今日まで、この吸着に基づく相互作用の科
学的説明は為されていない。しかし、酸性媒体中におけ
るこの吸着によって、これらのｐＨではマトリックスに
結合しない多くの不純物の除去が可能になる。故に、マ
トリックスにおけるプロテアーゼの相当の濃縮が達成さ
れる。マトリックスの洗浄後、プロテアーゼおよび／ま
たはプロ酵素は、イオン強度を増加させることによって
溶出することができる。
学的説明は為されていない。しかし、酸性媒体中におけ
るこの吸着によって、これらのｐＨではマトリックスに
結合しない多くの不純物の除去が可能になる。故に、マ
トリックスにおけるプロテアーゼの相当の濃縮が達成さ
れる。マトリックスの洗浄後、プロテアーゼおよび／ま
たはプロ酵素は、イオン強度を増加させることによって
溶出することができる。
【００１１】前記タンパク質を純粋形態で調製するため
に、アニオン−および／またはカチオン−交換クロマト
グラフィーを、アフィニティークロマトグラフィーおよ
び／または分画沈殿法と組み合わせることができる。上
述の精製法を単独でまたはいずれの所望の組合わせで用
いるかとは無関係に、追加的に全ての工程にプロテアー
ゼ阻害剤を添加して、プロ酵素が活性化プロテアーゼに
開裂するのを阻止することが推奨される。この場合に添
加するのに適するタンパク質安定剤は、 ・可溶化剤、好ましくはヒドロキシプロリン、 ・界面活性剤、好ましくはトゥイーン(R)またはトリト
ン(R)、 ・タンパク質、好ましくはアルブミン、ゼラチン、フィ
ブロネクチン、ビトロネクチンまたは類似するタンパク
質、 ・還元剤、好ましくはジチオスレイトール、メルカプト
エタノールまたはシステイン、および／または ・アプロチニン、α−２−抗プラスミン、Ｃ１−エステ
ラーゼ阻害剤、インター−α−トリプシン阻害剤、アン
チトロンビンIII／ヘパリンもしくは合成阻害剤などの
プロテイナーゼ阻害剤である。
に、アニオン−および／またはカチオン−交換クロマト
グラフィーを、アフィニティークロマトグラフィーおよ
び／または分画沈殿法と組み合わせることができる。上
述の精製法を単独でまたはいずれの所望の組合わせで用
いるかとは無関係に、追加的に全ての工程にプロテアー
ゼ阻害剤を添加して、プロ酵素が活性化プロテアーゼに
開裂するのを阻止することが推奨される。この場合に添
加するのに適するタンパク質安定剤は、 ・可溶化剤、好ましくはヒドロキシプロリン、 ・界面活性剤、好ましくはトゥイーン(R)またはトリト
ン(R)、 ・タンパク質、好ましくはアルブミン、ゼラチン、フィ
ブロネクチン、ビトロネクチンまたは類似するタンパク
質、 ・還元剤、好ましくはジチオスレイトール、メルカプト
エタノールまたはシステイン、および／または ・アプロチニン、α−２−抗プラスミン、Ｃ１−エステ
ラーゼ阻害剤、インター−α−トリプシン阻害剤、アン
チトロンビンIII／ヘパリンもしくは合成阻害剤などの
プロテイナーゼ阻害剤である。
【００１２】特に良好な安定化は、プロテアーゼおよび
プロ酵素の純粋形態での調製の間に、別のタンパク質安
定剤として、 ・２価イオンの錯化剤、好ましくはＥＧＴＡ、ＥＤＴＡ
もしくはクエン酸塩、および／または ・２価イオン、好ましくはカルシウムイオン、および／
または ・アミノ酸、好ましくはグルタミン酸塩、アルギニン、
リジンもしくはグリシン、および／または ・糖類、好ましくはグルコース、アラビノース、マンノ
ースもしくはマンニトール、および／または ・アルコール、好ましくはエチレングリコールもしくは
ポリエチレングリコール を添加する場合に達成することができる。上述の方法工
程はさらに、 ・少なくとも１０重量％の濃度からのポリエチレングリ
コール、または ・少なくとも１５重量％の濃度からの硫酸アンモニウム を添加することにより実施する、プロテアーゼおよび／
またはそのプロ酵素のその溶液からの分画沈殿法と組合
わせることができる。
プロ酵素の純粋形態での調製の間に、別のタンパク質安
定剤として、 ・２価イオンの錯化剤、好ましくはＥＧＴＡ、ＥＤＴＡ
もしくはクエン酸塩、および／または ・２価イオン、好ましくはカルシウムイオン、および／
または ・アミノ酸、好ましくはグルタミン酸塩、アルギニン、
リジンもしくはグリシン、および／または ・糖類、好ましくはグルコース、アラビノース、マンノ
ースもしくはマンニトール、および／または ・アルコール、好ましくはエチレングリコールもしくは
ポリエチレングリコール を添加する場合に達成することができる。上述の方法工
程はさらに、 ・少なくとも１０重量％の濃度からのポリエチレングリ
コール、または ・少なくとも１５重量％の濃度からの硫酸アンモニウム を添加することにより実施する、プロテアーゼおよび／
またはそのプロ酵素のその溶液からの分画沈殿法と組合
わせることができる。
【００１３】特に注目に値することは、上記した方法に
おいて、プロテアーゼのプロ酵素型もまた純粋形態で得
ることができることである。実際、特にプロ酵素を含有
する溶液を用いる前記酸性条件下でのイオン交換クロマ
トグラフィーは、全くプロ酵素のみまたは少なくとも非
常に濃縮された量でプロ酵素を含有する溶出液をもたら
す。故にこの場合、得られたプロ酵素の活性は、ドイツ
国特許出願第19626531.3号明細書に記載された活性試験
の１つ、例えば発色性基質を作用させた場合に生じる消
失を光度測定によってまたはＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ウェス
タンブロッティングで検出しうる、試料を還元した後に
生じる単一鎖形成によって測定することができる。これ
は、本発明によるとプロ酵素の調製が迅速且つ効率的
に、そして高収率で可能となることを示す。
おいて、プロテアーゼのプロ酵素型もまた純粋形態で得
ることができることである。実際、特にプロ酵素を含有
する溶液を用いる前記酸性条件下でのイオン交換クロマ
トグラフィーは、全くプロ酵素のみまたは少なくとも非
常に濃縮された量でプロ酵素を含有する溶出液をもたら
す。故にこの場合、得られたプロ酵素の活性は、ドイツ
国特許出願第19626531.3号明細書に記載された活性試験
の１つ、例えば発色性基質を作用させた場合に生じる消
失を光度測定によってまたはＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ウェス
タンブロッティングで検出しうる、試料を還元した後に
生じる単一鎖形成によって測定することができる。これ
は、本発明によるとプロ酵素の調製が迅速且つ効率的
に、そして高収率で可能となることを示す。
【００１４】従って、上述の処理工程を使用すると、第
VII因子を活性化する精製プロテアーゼ、そのプロ酵素
の両方または活性化プロテアーゼおよびプロ酵素の混合
物を得ることが可能となる。特に純粋な活性化プロテア
ーゼを調製するための殊に価値ある提案の経路は、支持
体材料に固定され、一方ではプロテアーゼに対して、他
方ではプロ酵素に対して異なる結合強度を有する物質を
用いる段階的溶出により、第VII因子を活性化するプロ
テアーゼをそのプロ酵素からクロマトグラフ分離するこ
とからなる。故に、活性化プロテアーゼまたはプロ酵素
のみを含有する異なる溶出液が得られる。
VII因子を活性化する精製プロテアーゼ、そのプロ酵素
の両方または活性化プロテアーゼおよびプロ酵素の混合
物を得ることが可能となる。特に純粋な活性化プロテア
ーゼを調製するための殊に価値ある提案の経路は、支持
体材料に固定され、一方ではプロテアーゼに対して、他
方ではプロ酵素に対して異なる結合強度を有する物質を
用いる段階的溶出により、第VII因子を活性化するプロ
テアーゼをそのプロ酵素からクロマトグラフ分離するこ
とからなる。故に、活性化プロテアーゼまたはプロ酵素
のみを含有する異なる溶出液が得られる。
【００１５】プロ酵素を得るために、この場合は活性化
プロテアーゼに対して強力な親和性を有する阻害剤をマ
トリックス上に固定する。セリンプロテアーゼ阻害剤、
特にＣ１エステラーゼ阻害剤、Δ−２抗プラスミン、ア
ンチトロンビンIII（適用溶液とするためのヘパリンと
の混合物）または合成品である低分子量、高親和性阻害
剤がこれに特に適する。マトリックスに結合しないかま
たはあまり強く結合しないプロ酵素は、カラムを貫流し
た溶液中に見出される。他方、活性化プロテアーゼを純
粋形態で調製するためには、弱い阻害性を有し、活性化
プロテアーゼに可逆的に結合する阻害剤をマトリックス
上に固定する。この場合、プロ酵素を洗い出した後に、
マトリックスに結合した活性化プロテアーゼを溶出し、
次に純粋形態で得ることができる。本方法の変法に適す
る支持体は、例えばアプロチニンまたは合成品である低
分子量、可逆的阻害剤で処理したものである。
プロテアーゼに対して強力な親和性を有する阻害剤をマ
トリックス上に固定する。セリンプロテアーゼ阻害剤、
特にＣ１エステラーゼ阻害剤、Δ−２抗プラスミン、ア
ンチトロンビンIII（適用溶液とするためのヘパリンと
の混合物）または合成品である低分子量、高親和性阻害
剤がこれに特に適する。マトリックスに結合しないかま
たはあまり強く結合しないプロ酵素は、カラムを貫流し
た溶液中に見出される。他方、活性化プロテアーゼを純
粋形態で調製するためには、弱い阻害性を有し、活性化
プロテアーゼに可逆的に結合する阻害剤をマトリックス
上に固定する。この場合、プロ酵素を洗い出した後に、
マトリックスに結合した活性化プロテアーゼを溶出し、
次に純粋形態で得ることができる。本方法の変法に適す
る支持体は、例えばアプロチニンまたは合成品である低
分子量、可逆的阻害剤で処理したものである。
【００１６】勿論、活性化プロテアーゼとプロ酵素との
間で異なり得る抗体またはその断片もまた純粋形態での
前記タンパク質の調製に使用することができる。このた
めには、特にプロテアーゼの活性化後の「ネオエピトー
プ［neoepitope］」、即ち例えばタンパク質の活性化ま
たは開裂部位を認識しうるモノクローナル抗体を使用す
ることができる。
間で異なり得る抗体またはその断片もまた純粋形態での
前記タンパク質の調製に使用することができる。このた
めには、特にプロテアーゼの活性化後の「ネオエピトー
プ［neoepitope］」、即ち例えばタンパク質の活性化ま
たは開裂部位を認識しうるモノクローナル抗体を使用す
ることができる。
【００１７】本発明により使用されるべきアフィニティ
ークロマトグラフィーにおいては、リン酸カルシウム／
ヒロドキシアパタイト上への吸着は、プロテアーゼおよ
び／またはプロ酵素を濃縮するための単純且つ迅速な方
法として促進される。この場合、プロテアーゼおよびプ
ロ酵素を含有する溶液は、ｐＨ２.５〜９.０、好ましく
は２.５〜７.２の範囲のリン酸カルシウムと混合され
る。次いで、例えば遠心分離または濾過による沈殿法の
後、沈殿物は、必要により１回またはそれ以上緩衝溶液
中に再懸濁した後、例えば０.２Ｍクエン酸ナトリウム
を添加して溶出される。その結果、プロテアーゼおよび
プロ酵素は溶出液中に見出される。
ークロマトグラフィーにおいては、リン酸カルシウム／
ヒロドキシアパタイト上への吸着は、プロテアーゼおよ
び／またはプロ酵素を濃縮するための単純且つ迅速な方
法として促進される。この場合、プロテアーゼおよびプ
ロ酵素を含有する溶液は、ｐＨ２.５〜９.０、好ましく
は２.５〜７.２の範囲のリン酸カルシウムと混合され
る。次いで、例えば遠心分離または濾過による沈殿法の
後、沈殿物は、必要により１回またはそれ以上緩衝溶液
中に再懸濁した後、例えば０.２Ｍクエン酸ナトリウム
を添加して溶出される。その結果、プロテアーゼおよび
プロ酵素は溶出液中に見出される。
【００１８】疎水性マトリックスまたは適当なマトリッ
クスと結合した疎水性リガンド上におけるプロテアーゼ
の吸着もまた、本発明において用いることができる。例
えば、フェニル−もしくはオクチル−セファロース(R)
またはマトリックスに結合したフェニルアラニンであ
る。結合したタンパク質の溶出は、フェニルアラニン、
グリセロールまたはエチレングリコールを含有する低イ
オン強度の緩衝溶液を用いてそれ自体知られた方法で実
施することができる。
クスと結合した疎水性リガンド上におけるプロテアーゼ
の吸着もまた、本発明において用いることができる。例
えば、フェニル−もしくはオクチル−セファロース(R)
またはマトリックスに結合したフェニルアラニンであ
る。結合したタンパク質の溶出は、フェニルアラニン、
グリセロールまたはエチレングリコールを含有する低イ
オン強度の緩衝溶液を用いてそれ自体知られた方法で実
施することができる。
【００１９】プロテアーゼおよびプロ酵素はカチオン、
特にその存在下において活性の増加により確かめられて
いるカルシウムおよびマグネシウムイオンと相互作用す
るために、いわゆる「キレートマトリックス」によるク
ロマトグラフィーが対応する溶液からのそれらの濃縮の
ために提案される。この場合、亜鉛、銅またはニッケル
イオンとのキレート化合物が特に適する。プロテアーゼ
を負荷したマトリックスを洗浄した後、直線的勾配が適
する場合にはイミダゾール緩衝液もまた結合したタンパ
ク質の溶出に用いることができる。
特にその存在下において活性の増加により確かめられて
いるカルシウムおよびマグネシウムイオンと相互作用す
るために、いわゆる「キレートマトリックス」によるク
ロマトグラフィーが対応する溶液からのそれらの濃縮の
ために提案される。この場合、亜鉛、銅またはニッケル
イオンとのキレート化合物が特に適する。プロテアーゼ
を負荷したマトリックスを洗浄した後、直線的勾配が適
する場合にはイミダゾール緩衝液もまた結合したタンパ
ク質の溶出に用いることができる。
【００２０】本発明による方法はまた、使用される支持
体材料が、前記タンパク質に対するモノクローナルもし
くはポリクローナル抗体、またはそのＦ(ａｂ)もしくは
Ｆ(ａｂ)2断片または前記タンパク質の可逆的結合に適
する他の物質を固定したマトリックスである、アフィニ
ティークロマトグラフィー精製工程を含むことができ
る。
体材料が、前記タンパク質に対するモノクローナルもし
くはポリクローナル抗体、またはそのＦ(ａｂ)もしくは
Ｆ(ａｂ)2断片または前記タンパク質の可逆的結合に適
する他の物質を固定したマトリックスである、アフィニ
ティークロマトグラフィー精製工程を含むことができ
る。
【００２１】本発明の方法によって得られるプロテアー
ゼ、そのプロ酵素または両タンパク質の混合物は、約ｐ
Ｈ２.５〜７.２の範囲の酸性ｐＨにおいて活性を損失す
ることなく、付加的な安定剤を添加するか添加すること
なく保存することができるが、アルカリの範囲では安定
剤の添加が必要である。
ゼ、そのプロ酵素または両タンパク質の混合物は、約ｐ
Ｈ２.５〜７.２の範囲の酸性ｐＨにおいて活性を損失す
ることなく、付加的な安定剤を添加するか添加すること
なく保存することができるが、アルカリの範囲では安定
剤の添加が必要である。
【００２２】治療上は、前記活性化プロテアーゼ、プロ
酵素または両化合物の混合物は、出血する傾向の場合、
内因性凝固ブランチの因子の欠如またはＦＥＩＢＡ（＝
第VIII因子をバイパスする活性(factor VIII bypassing
activity)）のような場合、さらにプロウロキナーゼも
しくは単一鎖ｔＰＡなどのプラスミノーゲン活性化剤の
内因性または外因性活性化のために、血液凝固を補助す
るために使用することができる。この活性はまた、血栓
塞栓性疾患の予防または治療のために前記タンパク質を
使用することによって、単一鎖もしくは二本鎖プラスミ
ノーゲン活性化剤または抗凝血剤との組合せにおいて用
いることができる。故に、心筋梗塞、狭心症、脳卒中ま
たは脚静脈血栓症などの血栓合併症に関連する症候群を
成功裏に治療することができる。
酵素または両化合物の混合物は、出血する傾向の場合、
内因性凝固ブランチの因子の欠如またはＦＥＩＢＡ（＝
第VIII因子をバイパスする活性(factor VIII bypassing
activity)）のような場合、さらにプロウロキナーゼも
しくは単一鎖ｔＰＡなどのプラスミノーゲン活性化剤の
内因性または外因性活性化のために、血液凝固を補助す
るために使用することができる。この活性はまた、血栓
塞栓性疾患の予防または治療のために前記タンパク質を
使用することによって、単一鎖もしくは二本鎖プラスミ
ノーゲン活性化剤または抗凝血剤との組合せにおいて用
いることができる。故に、心筋梗塞、狭心症、脳卒中ま
たは脚静脈血栓症などの血栓合併症に関連する症候群を
成功裏に治療することができる。
【００２３】従って、本発明の別の課題は、フィブリン
含有トロンビンを溶解するのに十分な量の血液凝固第VI
I因子を活性化するプロテアーゼおよび／またはそのプ
ロ酵素型を含有する医薬製剤である。この製剤は、さら
に単一鎖プラスミノーゲン活性化剤および／または抗凝
血剤を含有することもできる。便宜上、プロテイナーゼ
安定剤またはジチオスレイトール、メルカプトエタノー
ルもしくはシステインなどの還元剤を付加的に添加し
て、処理または貯蔵の間のポリマー形成の危険性を低減
させることができる。
含有トロンビンを溶解するのに十分な量の血液凝固第VI
I因子を活性化するプロテアーゼおよび／またはそのプ
ロ酵素型を含有する医薬製剤である。この製剤は、さら
に単一鎖プラスミノーゲン活性化剤および／または抗凝
血剤を含有することもできる。便宜上、プロテイナーゼ
安定剤またはジチオスレイトール、メルカプトエタノー
ルもしくはシステインなどの還元剤を付加的に添加し
て、処理または貯蔵の間のポリマー形成の危険性を低減
させることができる。
【００２４】繊溶法もまた、傷の治癒過程において役割
を果たしている。この場合、前記プロテアーゼおよび／
またはプロ酵素は、静脈内もしくは局所的、皮下、皮
内、筋肉内投与することができ、または怪我および傷の
場合にはフィブリン接着剤の成分としてもしくは別法で
局所的に、あるいは増殖因子と組み合わせるのが好都合
である場合には例えば膜もしくはパッチの形態の適切な
担体マトリックスに結合させて投与することができる。
一般的に、このタイプの医薬製剤は、液体または凍結乾
燥した形態で使用され、それ自体知られたタンパク質安
定剤、即ち例えば錯化剤、カルシウムなどの２価カチオ
ン、グルタミン酸、アルギニン、リジンもしくはグリシ
ンなどのアミノ酸および／またはグルコース、アラビノ
ース、マンノースもしくはマンニトールなどの糖類を添
加することができる。
を果たしている。この場合、前記プロテアーゼおよび／
またはプロ酵素は、静脈内もしくは局所的、皮下、皮
内、筋肉内投与することができ、または怪我および傷の
場合にはフィブリン接着剤の成分としてもしくは別法で
局所的に、あるいは増殖因子と組み合わせるのが好都合
である場合には例えば膜もしくはパッチの形態の適切な
担体マトリックスに結合させて投与することができる。
一般的に、このタイプの医薬製剤は、液体または凍結乾
燥した形態で使用され、それ自体知られたタンパク質安
定剤、即ち例えば錯化剤、カルシウムなどの２価カチオ
ン、グルタミン酸、アルギニン、リジンもしくはグリシ
ンなどのアミノ酸および／またはグルコース、アラビノ
ース、マンノースもしくはマンニトールなどの糖類を添
加することができる。
【００２５】さらに、プロテアーゼおよび／またはプロ
酵素は、体内に移植されるプラスチックまたは金属より
なる製品、例えば合成心臓弁、血管など、さらに血液採
取または人工栄養法のために挿入されるカニューレを被
覆するために使用することもできる。本発明を下記の実
施例を参照して説明する。
酵素は、体内に移植されるプラスチックまたは金属より
なる製品、例えば合成心臓弁、血管など、さらに血液採
取または人工栄養法のために挿入されるカニューレを被
覆するために使用することもできる。本発明を下記の実
施例を参照して説明する。
【００２６】
【実施例】実施例１ 固定化モノクローナル抗体による純粋形態での調製 第VII因子を活性化するプロテアーゼに対するモノクロ
ーナル抗体をＢｒＣＮ−セファロース(R)に結合させ
た。３０mlのこのｍＡｂマトリックスをカラムに充填
し、樹脂を５０mMクエン酸ナトリウム、０.１Ｍ塩化ナ
トリウム（ＮａＣｌ）、０.１Ｍアルギニン−ＨＣｌ、
ｐＨ６.０で平衡化した。１００mlのクエン酸血漿をカ
ラムに供給し、次いでマトリックスを５０mMクエン酸ナ
トリウム、１Ｍ ＮａＣｌ、０.１Ｍアルギニン−ＨＣ
ｌ、ｐＨ６.０で洗浄した。次にカラムを平衡化緩衝液
で再度洗浄した後、０.１Ｍグリシン、ｐＨ２.５で溶出
させた。溶出液（約３０ml）を攪拌しながら３mlの２０
０mMクエン酸ナトリウム溶液、ｐＨ５.５中に収集し、
ｐＨ４.５に調整した。溶出溶液を次の分析に用いた。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、ＰＶＤＦ膜に移し、非還元試
料および還元した試料を用いて第VII因子活性化剤のバ
ンドの検出を実施した。このようにして得られたタンパ
ク質の活性試験を、ドイツ国特許出願第19926531.3号明
細書に記載の方法に従って、即ちプロウロキナーゼおよ
び第VII因子の活性化を次のウロキナーゼまたは活性化
第VII因子の検出を用いて実施した。プロテアーゼ抗原
として測定され、この系において試験したプロテアーゼ
の量は期待される理論活性に相当し、そのため単離され
たプロテアーゼまたはプロ酵素は、生物活性について活
性を示した。
ーナル抗体をＢｒＣＮ−セファロース(R)に結合させ
た。３０mlのこのｍＡｂマトリックスをカラムに充填
し、樹脂を５０mMクエン酸ナトリウム、０.１Ｍ塩化ナ
トリウム（ＮａＣｌ）、０.１Ｍアルギニン−ＨＣｌ、
ｐＨ６.０で平衡化した。１００mlのクエン酸血漿をカ
ラムに供給し、次いでマトリックスを５０mMクエン酸ナ
トリウム、１Ｍ ＮａＣｌ、０.１Ｍアルギニン−ＨＣ
ｌ、ｐＨ６.０で洗浄した。次にカラムを平衡化緩衝液
で再度洗浄した後、０.１Ｍグリシン、ｐＨ２.５で溶出
させた。溶出液（約３０ml）を攪拌しながら３mlの２０
０mMクエン酸ナトリウム溶液、ｐＨ５.５中に収集し、
ｐＨ４.５に調整した。溶出溶液を次の分析に用いた。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、ＰＶＤＦ膜に移し、非還元試
料および還元した試料を用いて第VII因子活性化剤のバ
ンドの検出を実施した。このようにして得られたタンパ
ク質の活性試験を、ドイツ国特許出願第19926531.3号明
細書に記載の方法に従って、即ちプロウロキナーゼおよ
び第VII因子の活性化を次のウロキナーゼまたは活性化
第VII因子の検出を用いて実施した。プロテアーゼ抗原
として測定され、この系において試験したプロテアーゼ
の量は期待される理論活性に相当し、そのため単離され
たプロテアーゼまたはプロ酵素は、生物活性について活
性を示した。
【００２７】実施例２ アニオン−交換クロマトグラフィー まだ他のタンパク質による混入物を含んでいる、第VII
因子活性化プロテアーゼのプロ酵素型を含有する溶液
を、２０mM酢酸Ｎａ、０.１Ｍグリシン、ｐＨ４.５の緩
衝溶液中のＭｏｎｏＱセファロースに供給し、次いで上
述の緩衝液で洗浄した。通過した画分を収集した。結合
したタンパク質を、２０mM酢酸Ｎａ、２ＭＮａＣｌ、ｐ
Ｈ４.５を用いて溶出させた。溶出液は、５mMクエン酸
Ｎａ、５０mM ＮａＣｌ、ｐＨ６.０の緩衝液中にて希釈
し、実施例１で述べた試験系において調査した。アリコ
ートを４〜８℃で保存するか、または−２０℃で凍結さ
せた。６℃で数日間溶出溶液を貯蔵した後、試験を繰り
返したが、各場合における（解凍）試料の希釈は試験の
直前に実施した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ウェスタンブロッ
トは、プロテアーゼはそのプロ酵素型にて単離されたこ
とを確認した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクマシーブルー
によるタンパク質の染色後、プロテアーゼに加えて多く
の混入タンパク質は、通過した画分中でも見出されるは
ずであるが、出発溶液（クロマトグラフィー前）におい
て可視化された。プロテアーゼは、純粋形態でプロ酵素
型に相当するバンド（即ち還元した後でも）として示さ
れた。活性試験（実施例１参照）は、生物活性の保持と
いう意味でタンパク質の本来の性質が確認された。
因子活性化プロテアーゼのプロ酵素型を含有する溶液
を、２０mM酢酸Ｎａ、０.１Ｍグリシン、ｐＨ４.５の緩
衝溶液中のＭｏｎｏＱセファロースに供給し、次いで上
述の緩衝液で洗浄した。通過した画分を収集した。結合
したタンパク質を、２０mM酢酸Ｎａ、２ＭＮａＣｌ、ｐ
Ｈ４.５を用いて溶出させた。溶出液は、５mMクエン酸
Ｎａ、５０mM ＮａＣｌ、ｐＨ６.０の緩衝液中にて希釈
し、実施例１で述べた試験系において調査した。アリコ
ートを４〜８℃で保存するか、または−２０℃で凍結さ
せた。６℃で数日間溶出溶液を貯蔵した後、試験を繰り
返したが、各場合における（解凍）試料の希釈は試験の
直前に実施した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ウェスタンブロッ
トは、プロテアーゼはそのプロ酵素型にて単離されたこ
とを確認した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクマシーブルー
によるタンパク質の染色後、プロテアーゼに加えて多く
の混入タンパク質は、通過した画分中でも見出されるは
ずであるが、出発溶液（クロマトグラフィー前）におい
て可視化された。プロテアーゼは、純粋形態でプロ酵素
型に相当するバンド（即ち還元した後でも）として示さ
れた。活性試験（実施例１参照）は、生物活性の保持と
いう意味でタンパク質の本来の性質が確認された。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 47/12 Ａ６１Ｋ 47/20 47/18 47/22 47/20 47/26 47/22 47/34 47/26 47/42 47/34 Ａ６１Ｌ 27/00 Ｅ 47/42 Ａ６１Ｐ 7/04 Ａ６１Ｌ 27/00 9/10 33/00 Ｃ１２Ｎ 9/96 Ａ６１Ｐ 7/04 Ｇ０１Ｎ 30/02 Ｂ 9/10 30/48 Ｒ Ｃ１２Ｎ 9/96 33/531 Ｂ Ｇ０１Ｎ 30/02 Ｃ１２Ｑ 1/37 30/48 1/56 33/531 Ｇ０１Ｎ 33/573 Ａ // Ｃ１２Ｑ 1/37 Ａ６１Ｋ 37/465 1/56 37/54 Ｇ０１Ｎ 33/573 Ａ６１Ｌ 33/00 Ｚ (72)発明者 アネッテ・フォイスナー ドイツ連邦共和国デー−35043マルブルク. ランゲヴィーゼンヴェーク10 (72)発明者 ハンス−アルノルト・シュテール ドイツ連邦共和国デー−35093ヴェター. シュールシュトラーセ66
Claims (8)
- 【請求項１】 生物液体から得られるかまたは遺伝子工
学によって調製される場合にはそれから得られる、血液
凝固第VII因子を活性化するプロテアーゼおよび／また
はそのプロ酵素の純粋形態での調製方法であって、 ａ）単離すべきタンパク質の等電点よりも低いｐＨにお
けるアニオンおよび／またはカチオン交換クロマトグラ
フィーによるか、または ｂ）アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィーを
アフィニティークロマトグラフィーおよび／またはｐＨ
２.５〜９.０、好ましくはｐＨ２.５〜７.２における分
画沈殿法と組み合わせたもの（ここでアフィニティーク
ロマトグラフィー分離は、 ・リン酸カルシウム／ヒドロキシアパタイト ・疎水性マトリックス ・キレートマトリックス ・単離すべきタンパク質に対する固定化モノクローナル
抗体もしくはポリクローナル抗体、またはそのＦ(ａｂ)
もしくはＦ(ａｂ)2断片で被覆されたマトリックスを用
いて実施される）による、上記の調製方法。 - 【請求項２】 純粋形態での調製方法が、 ・可溶化剤、好ましくはヒドロキシプロリン、 ・界面活性剤、好ましくはトゥイーン(R)またはトリト
ン(R)、 ・タンパク質、好ましくはアルブミン、ゼラチン、フィ
ブロネクチン、ビトロネクチンまたは類似するタンパク
質、 ・還元剤、好ましくはジチオスレイトール、メルカプト
エタノールまたはシステイン、および／または ・α−２−抗プラスミン、Ｃ１−エステラーゼ阻害剤、
インター−α−トリプシン阻害剤、アンチトロンビンII
I／ヘパリンもしくは合成阻害剤などのプロテイナーゼ
阻害剤、からなる群から選択される１つまたはそれ以上
のタンパク質安定剤の存在下に実施される、請求項１に
記載の方法。 - 【請求項３】 純粋形態での調製において用いる別のタ
ンパク質安定剤が、 ・２価イオンの錯化剤、好ましくはＥＧＴＡ、ＥＤＴＡ
もしくはクエン酸塩、および／または ・２価イオン、好ましくはカルシウムイオン、および／
または ・アミノ酸、好ましくはグルタミン酸塩、アルギニン、
リジンもしくはグリシン、および／または ・糖類、好ましくはグルコース、アラビノース、マンノ
ースもしくはマンニトール、および／または ・アルコール、好ましくはエチレングリコールもしくは
ポリエチレングリコール である、請求項２に記載の方法。 - 【請求項４】 段階的溶出によって血液凝固第VII因子
を活性化するプロテアーゼをそのプロ酵素からクロマト
グラフィー分離するために、一方ではプロテアーゼに対
して、他方ではプロ酵素に対して異なる強度の結合を有
する物質を支持体材料に固定化し、次いで異なる溶出液
を別々に収集して、各々のタンパク質を単離する、請求
項１〜３のいずれかに記載の方法。 - 【請求項５】 プロテアーゼおよび／またはそのプロ酵
素の溶液からの分画沈殿を、 ・少なくとも１０重量％の濃度のポリエチレングリコー
ル または ・少なくとも１５重量％の濃度の硫酸アンモニウム を添加して実施する、請求項１〜４のいずれかに記載の
方法。 - 【請求項６】 出血する傾向がある場合またはＦＥＩＢ
Ａのような内在性血液凝固経路の因子が欠如している場
合に血液凝固を補助するため、またはプロテアーゼもし
くはそのプロ酵素の先天性もしくは後天性欠損状態にお
ける血栓合併症に関連する症候群を予防および／または
治療するため、単独でまたはフィブリン接着剤、膜の成
分としてもしくは成長因子と組み合わせて、皮下、筋肉
内、静脈内または局所的処置で傷の治癒を補助するため
に、血液凝固第VII因子を活性化するプロテアーゼおよ
び／またはそのプロ酵素と請求項２および３における１
つまたはそれ以上のタンパク質安定剤を含む医薬製剤。 - 【請求項７】 プラスチックもしくは金属よりなる、合
成心臓弁、血管などの身体に移植される製品の表面、ま
たは血液を採取するためもしくは人工栄養のために挿入
されるカニューレの表面を被覆するための請求項６に記
載の医薬製剤の使用。 - 【請求項８】 血液凝固第VII因子を活性化するプロテ
アーゼおよび／またはそのプロ酵素と請求項２および３
における１つまたはそれ以上のタンパク質安定剤を含
む、生物試験系において使用するためおよび抗原検出の
ための試薬。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19937219:5 | 1999-08-06 | ||
| DE19937219A DE19937219A1 (de) | 1999-08-06 | 1999-08-06 | Verfahren zur Reindarstellung der den Blutgerinnungsfaktor VII aktivierenden Protease, ihres Proenzyms oder eines Gemisches beider Proteine mittels Ionenaustauscherchromatographie |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001095563A true JP2001095563A (ja) | 2001-04-10 |
| JP2001095563A5 JP2001095563A5 (ja) | 2007-06-07 |
Family
ID=7917489
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000236804A Pending JP2001095563A (ja) | 1999-08-06 | 2000-08-04 | イオン交換クロマトグラフィーによって血液凝固第ｖｉｉ因子を活性化するプロテアーゼ、そのプロ酵素または両タンパク質の混合物を純粋形態で調製する方法 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US6677440B1 (ja) |
| EP (1) | EP1074616B1 (ja) |
| JP (1) | JP2001095563A (ja) |
| KR (1) | KR20010049988A (ja) |
| AT (1) | ATE386798T1 (ja) |
| CA (1) | CA2315306A1 (ja) |
| DE (2) | DE19937219A1 (ja) |
| ES (1) | ES2298110T3 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009002709A (ja) * | 2007-06-19 | 2009-01-08 | Univ Of Tsukuba | 蛋白質を含む液状組成物中における蛋白質の安定化方法 |
Families Citing this family (20)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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