CN109952374A - 用于从人类血浆开始的纤溶酶原纯化的工艺 - Google Patents

用于从人类血浆开始的纤溶酶原纯化的工艺 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种用于从人类血浆或其分离中间体开始来产生人类纤溶酶原的工艺。该工艺的主要阶段是：病毒灭活的步骤，其中使人类血浆与溶剂/洗涤剂混合物接触；单亲和色谱步骤；以及病毒去除纳米过滤步骤。此工艺可被放大至工业水平，并且在不添加任何蛋白酶抑制剂的情况下，该工艺提供功能化且完整的最终产品，所述最终产品适合于被施用用于治疗由于遗传性纤溶酶原缺乏症引起的人类疾病。

Description

用于从人类血浆开始的纤溶酶原纯化的工艺
发明领域
本发明涉及血液产品的领域，特别地涉及人类纤溶酶原的纯化和生产。
现有技术
纤溶酶原(Plasminogen)(Pg)作为血浆酶原被合成，并且通过生理活化剂尿激酶(physiological activators urokinase)(uPA)或组织纤溶酶原活化剂(tissueplasminogen activator)(tPA)被转化成丝氨酸蛋白酶纤溶酶(Pm)，这造成纤溶系统的活化。事实上，Pm的主要体内功能是通过降解含纤维蛋白的血栓来调节血管效力(vascularpotency)。
合成纤溶酶原的主要组织是肝，然而其他来源已经被确定；它们包括肾上腺、肾、脑、睾丸、心脏、肺、子宫、脾、胸腺以及肠道。纤溶酶原作为810个氨基酸多肽被合成；纤溶酶原的天然形式具有NH2-末端谷氨酸，并且它被称为Glu-Pg。纤溶酶原(791个氨基酸)的成熟形式是由于在分泌期间19个氨基酸前导肽(amino acid leader peptide)的裂解(cleavage)。人类纤溶酶原转化成纤溶酶涉及Arg561-Val562键的裂解，这导致Glu-Pm的产生，Glu-Pm包含561个氨基酸的N-末端重链和230个氨基酸的二硫连接的羧基末端(disulfide-linked carboxy-terminal)轻链。纤溶酶催化77位的N-末端Glu1-Pg的水解，这将Glu1-Pg转化成被称为Lys78-Pg的另一种纤溶酶原形式。此转化对于细胞表面上的Glu-Pg活化的最大增强是重要的。
25年前，首次记录在案的异常人类纤溶酶原在对于具有血栓形成事件的历史的纤溶酶原缺乏(plasminogen deficiency)杂合的患者中被报告。纤溶酶原基因中的纯合突变或复合杂合突变(compound heterozygous mutation)引发严重的炎症，当影响被称为木质样结膜炎(ligneous conjunctivitis)或伪膜性疾病的角膜时威胁视力功能，并且在某些情况下引发闭塞性脑积水。
先前已经描述了若干种与纤溶酶原纯化相关的方法。
Deutsch D.G.和Mertz E.(Science 1970,170,1095-1096)描述了基于使用赖氨酸-琼脂糖4B树脂(Lysine-Sepharose 4B resin)的亲和色谱法从人类血浆中的纤溶酶原纯化的方法。使340mL的体积的血浆(用水稀释至640mL)穿过150mL的树脂，用0.3M磷酸盐缓冲液和3mM EDTA洗涤，并且纤溶酶原的洗脱用0.2Mε-氨基己酸进行，ε-氨基己酸在冷中通过Sephadex G-25柱除去。
Grant A.J.(Biochem.Int.1990,20(3),519-527)描述了在类似于Deutsch和Mertz的条件下，基于双亲和色谱法(double affinity chromatography)的方法。该工艺在4℃，通过在每个纯化步骤中添加蛋白酶抑制剂来进行，以便防止通过血浆中存在的活化剂，纤溶酶原自发活化成纤溶酶。
US3943245描述了通过使用琼脂糖-L-赖氨酸与高离子强度缓冲溶液的改性的亲和色谱法，从人类和非人类血浆或Cohn级分III中纯化纤溶酶原，如在离子交换色谱法中一样。
EP0638314描述了从Cohn的级分II+III开始来纯化纤溶酶原，在赖氨酸-琼脂糖柱上的亲和色谱步骤前，使Cohn的级分II+III经历溶剂/洗涤剂(S/D)病毒灭活步骤，该赖氨酸-琼脂糖柱用包含0.9％氯化钠的0.9％甘氨酸溶液(pH 7.2)和500mL的包含1M氯化钠的0.9％甘氨酸溶液(pH 7.2)洗涤，并且吸附的纤溶酶原的洗脱用包含0.25M赖氨酸的0.9％甘氨酸溶液(pH 7.2)进行。使由此冻干的纤溶酶原制剂在60℃至80℃经历干燥热处理持续72小时或更长，以产生含Lys型纤溶酶原的组合物，其中病毒被除去或灭活。
本发明的目的是提供用于获得纯化的且病毒安全的纤溶酶原的可放大至工业水平的工艺，所述纤溶酶原适合于被施用至人类用于治疗目的。
发明概述
本发明的主题是从人类血浆或其分离中间体(fractionation intermediate)开始来纯化纤溶酶原的工艺；所述工艺包括：
ii)病毒灭活的步骤，其中使人类血浆与溶剂/洗涤剂混合物接触；
v)在L-赖氨酸固定的交联的琼脂糖树脂上的单亲和色谱步骤；以及
ix)病毒去除纳米过滤步骤；
其中所述病毒灭活(ii)在亲和色谱法的上游进行，并且所述纳米过滤(ix)在亲和色谱法的下游进行。
为了确保适合于人类中治疗的成品产品，除了确保产品安全免受包膜病毒的溶剂/洗涤剂处理(ii)之外，本发明还包括纳米过滤步骤(ix)，所述纳米过滤步骤(ix)保护制剂免受小的包膜病毒和非包膜的病毒诸如例如HAV。
本发明的工艺不需要蛋白酶抑制剂的任何添加。如先前所报道的，用于纯化纤溶酶原的传统工艺建议使用蛋白酶抑制剂(例如抑肽酶(aprotinin)、PMSF和大豆胰蛋白酶抑制剂)，以防止通过血浆中的活化剂，纤溶酶原自发活化成纤溶酶。相反地，在本方法中，不添加防腐剂，并且在完全不存在任何蛋白酶抑制剂下，获得全功能纤溶酶原(fullyfunctional plasminogen)。
根据本发明，从人类血浆或从其分离中间体开始来获得病毒灭活的且高度纯的纤溶酶原制剂。此处描述的纯化方法是有效的、可再现的，并且可放大至工业水平，这允许在不添加任何蛋白酶抑制剂作为防腐剂的情况下，产生功能性且完整的Glu-纤溶酶原。
由于树脂和靶蛋白之间的特异性相互作用，本发明提供了基于单一色谱法的方法，该方法足以获得高度纯的纤溶酶原制剂。高的纯度水平使得这样的纤溶酶原组合物适合于在治疗由于遗传性纤溶酶原缺乏症引起的人类疾病中使用。
发明详述
本发明的方法的框图概述在图1中被充分地描述。
根据本发明，起始材料可以是人类血浆或其分离中间体，其中分离中间体意指低温沉淀物(cryoprecipitate)、Cohn级分III或Cohn级分II+III。根据一个特定且优选的方面，用于纤溶酶原纯化的起始材料是冷冻的血浆来源。优选地，在生产的初始步骤中，在连续搅拌下，将人类冷冻的血浆解冻直到达到20±1℃的温度并且用加压的CO2或N2将pH调节至7.0-8.0。
根据本发明，解冻的血浆优选地通过在1μm过滤器上的过滤步骤(i)来澄清，并且随后使其经受病毒灭活步骤(ii)，使溶液与溶剂/洗涤剂(S/D)的混合物接触。此步骤(ii)预期确保成品产品安全免受包膜的病毒。对于一个优选的方面，S/D混合物具有以下组成：1％w/w Triton X-100和1％w/w三-(正丁基)磷酸酯(TnBP)。优选地，混合物在30℃±1℃被添加至血浆中并且搅拌持续30分钟。S/D处理在28℃±1℃进行持续至少6小时；在处理期间，监测pH值，并且最终将pH调节至7.0-8.0。
为了有助于S/D混合物与血浆的分离，在病毒灭活步骤(ii)结束时，优选地包括蓖麻油添加步骤(iii)。在优选的实施方案中，蓖麻油浓度是S/D血浆的3％-5％；蓖麻油在20℃±1℃被添加并且搅拌持续60分钟，然后，溶液被保持静置持续至少1小时，目的是将S/D相与血浆相分离。蓖麻油的添加预期血浆过滤性的改进，这降低在随后的色谱法期间S/D加载到柱上的风险，从而保存树脂的完整性。
在上述的步骤(iii)结束时，优选地，使血浆经历过滤步骤(iv)，并且因此通过3.00μm-0.5μm深度过滤器过滤。
随后的亲和色谱法步骤(v)优选地在亲和树脂ECH-赖氨酸琼脂糖4Fast Flow(ECH-Lysine琼脂糖4Fast Flow)上进行，亲和树脂ECH-赖氨酸琼脂糖4Fast Flow基于高度交联的4％琼脂糖并且使得能够迅速处理大的样品体积。不同于不适合于纤溶酶原的工业生产的先前使用的赖氨酸琼脂糖4B，ECH-赖氨酸琼脂糖4Fast Flow树脂可以用许多常用剂经受若干清洁循环，因此确保成品产品的安全性，而不影响树脂本身的完整性和功能性，也在工业水平上。
使用ECH-赖氨酸琼脂糖4Fast Flow的优点是，所述树脂基于高度交联的4％琼脂糖，从而使得能够迅速处理适于工业生产的大的样品体积。将L-赖氨酸共价地结合至被附接在琼脂糖4Fast Flow上的长的亲水性间隔臂(参见方案1)的稳定的醚键还允许使树脂经受若干清洁循环，而不损失其完整性和功能性。
方案1-ECH-赖氨酸琼脂糖4fast Flow的部分结构
作为被设计成在人类中施用的纤溶酶原，在每次产生后，树脂的清洁对于成品产品的安全性是重要的并且它避免交叉污染。关于这一点，本发明中描述的亲和色谱法代表先前使用的赖氨酸琼脂糖4B树脂的改进，赖氨酸琼脂糖4B树脂的记录在案的对清洁剂的不稳定性使得所述树脂不适合于纤溶酶原的工业生产。长期稳定性研究示出，ECH-赖氨酸琼脂糖4Fast Flow可以用许多常用的清洁剂来处理，而在配体浓度和纤溶酶原结合能力方面都没有任何显著的变化，除了在强碱性条件下长时间暴露。
对于该方法的工业可放大性，树脂的高结合能力是重要的，以便最大化成品产品的收率。如实验部分中示出的，多达38个柱体积(CV)的灭活的血浆可以被加载到ECH-赖氨酸琼脂糖4Fast Flow树脂上。因此，在优选的实施方案中，30CV-35CV代表获得高的纤溶酶原收率的最优负载量，这避免树脂饱和。根据一个特定的方面，起始材料以150cm/h-250cm/h的线性流速被加载到柱上，其中压力值≤0.1MPa。较小的流速值需要长的加载时间，这确实不适合于该方法的工业放大。
在优选的实施方案中，用于ECH-赖氨酸琼脂糖4Fast Flow树脂上的亲和色谱法的缓冲液如下：
用于树脂平衡的磷酸钠0.05M，氯化钠0.1M，pH 7.4；
用于树脂洗涤的磷酸钠0.05M，氯化钠0.1M pH 7.4；
用于纤溶酶原洗脱的磷酸钠0.05M，ε-氨基己酸0.05M，氯化钠0.1M pH 7.4。
如实验部分中示出的，与其他测试的缓冲液(即缓冲液组合物A)相比，上文在亲和色谱法步骤中使用的缓冲液(即缓冲液组合物B)允许获得较高的纤溶酶原收率。
为了除去颗粒物，优选地，使步骤(v)的色谱产物经历通过0.22μm过滤器的过滤步骤(vi)，然后优选地，用超滤步骤(vii)进行纤溶酶原纯化，这使得可以获得适合于眼部施用的浓缩的且透析的蛋白质溶液。特别地，通过使用30,000道尔顿透析盒(dialysiscassette)，用20体积-25体积的盐水溶液(0.1M氯化钠)进行超滤(vii)，以除去ε-氨基己酸；然后，该系统用0.1M氯化钠洗涤，以实现0.7-1.3mg/mL蛋白质浓度。
在将pH调节至7.1±0.7后，优选地，使纤溶酶原溶液经历通过0.1μm过滤器的过滤步骤(viii)，并且随后经历病毒去除步骤(ix)，也就是纳米过滤。对于一个优选的方面，纳米过滤(ix)涉及通过20纳米病毒级过滤器的过滤。然后，优选地，使该制剂经受通过0.22μm过滤器的无菌过滤(x)，并且将由此获得的纤溶酶原本体(plasminogen bulk)保存在温度≤-20℃。
除了确保产品安全免受包膜病毒的溶剂/洗涤剂处理(ii)之外，纳米过滤步骤(ix)还保护免受小的包膜病毒和非包膜的病毒，诸如例如HAV。此病毒去除程序与文献中先前已经描述的相比确实允许纤溶酶原纯化工艺的改进。
如Grant所报道的，传统的纯化工艺建议使用蛋白酶抑制剂(例如抑肽酶、PMSF和大豆胰蛋白酶抑制剂)，以便确保成品产品中的纤溶酶原完整性并且防止其活化。相反地，本方法允许在不添加任何防腐剂的情况下，获得全功能纤溶酶原，从而避免其不利影响。纤溶酶原完全保持其完整性，并且如实验部分中所示出的，在有和没有抑肽酶的情况下获得的纤溶酶原之间的可比性研究展示在纤溶酶原抗原方面以及在其活性和收率方面都不存在差异。
对于另一个优选的方面，本文描述的纤溶酶原制剂主要呈Glu-Pg的形式，Glu-Pg的形式代表血浆中纤溶酶原的主要形式。Glu-Pg的循环半衰期(circulating half-life)大大地高于Lys-Pg，因此本发明提供了一种获得适合于人类中的疗法的纤溶酶原制剂的方法。
另外的描述细节在以下实施例中提供。所述实施例可用于澄清该方法并且不以任何方式限制该方法。
附图简述
图1示出了本发明的工艺的一个优选的实施方案的框图概述，从原材料至纤溶酶原成品产品的获得。
图2示出了ECH-赖氨酸琼脂糖4Fast Flow树脂的在柱体积(CV)方面的最大结合能力。血流(flow-through)中的纤溶酶原活性被评估，直到其达到在池血浆(pool plasma)中发现的原始活性的至少10％。
图3示出了通过如在表2中报告的缓冲液组合物A相对于缓冲液组合物B进行的色谱步骤的代表性SDS-PAGE。
图4示出了在抑肽酶的存在或不存在下，通过色谱法缓冲液组合物A相对于缓冲液组合物B获得的纤溶酶原的代表性蛋白印迹。
实验部分
实施例1-根据柱体积(CV)的树脂结合能力
可放大至工业水平的色谱法的最重要的方面之一是高的结合能力，目的是在不改变产品的功能性的情况下使收率最大化。
为了确定ECH-赖氨酸琼脂糖4Fast Flow的最大结合能力(被填充到16mm直径×15±1cm高度的柱中，其中1CV是30mL)，将经历蓖麻油添加并且然后通过3.00μm-0.5μm深度过滤器过滤的1.3Kg的S/D血浆以50cm/h加载到这样的树脂上；分析血流(FT)中的纤溶酶原活性，直到其达到池-血浆中发现原始活性的至少10％。如图2中示出的，在多达38CV的FT中，没有观察到纤溶酶原活性，而纤溶酶原活性从39CV开始记录。加载10CV或32CV进行的实验展示，无论是在纤溶酶原抗原方面还是在洗脱级分也就是PLG1的活性方面都没有发现任何显著的差异(表1)。因此，ECH-赖氨酸琼脂糖4Fast Flow的结合能力被确定为38CV，然而为确保高的纤溶酶原收率并避免树脂饱和，加载体积(loading volume)被设定在30CV和35CV之间。根据此实验，其产生在3mg/纤溶酶原/mL排出树脂和3.5mg/纤溶酶原/mL排出树脂之间的结合能力。
实施例2-加载和洗脱条件优化
色谱法的加载样品步骤初始地以50cm/h进行。对于高的加载体积(30CV-35CV)，这样的流速需要长的色谱法持续时间，不适合于工业工艺。关于这一点，加载流速增加多达至200cm/h，这保持低的背压，因此将步长持续时间从7小时减少至小于2小时。在此条件下，观察到纤溶酶原收率从80.35％降低至70％(表1)，因此需要研究关于缓冲液的组成的进一步优化。
开始时使用的缓冲液的组合物，也就是组合物A，被组合物B替代，组合物B主要因不存在EDTA而不同(表2)；加载体积和流速不变。如表1中示出的，使用缓冲液组合物B减少纤溶酶原在洗涤级分中的损失，并且同时，它将洗脱级分中的纤溶酶原收率显著地改进多达90.40％。此结果通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析来证实(图3)：用缓冲液组合物A进行的洗涤步骤示出对应于纤溶酶原分子量的带，这展示在此步骤期间纤溶酶原的损失；这样的带在用缓冲液组合物B进行的洗涤步骤的情况下是不可见的。此外，缓冲液组合物B显著地增加洗涤步骤中的主要污染物白蛋白的去除，因此降低其在洗脱级分中的含量(表1)。
优化的色谱条件如下：30CV-35CV加载体积；200cm/h流速；缓冲液组合物B。
表1.在不同的加载体积、流速、缓冲液组合物、抑肽酶的存在或不存在的条件下进行的色谱法。结果被表示为来自以三份运行的三个单独的实验的平均值±SD
表2.两种不同的色谱缓冲液组合物，也就是组合物A和组合物B。
实施例3-蛋白酶抑制剂的存在或不存在
为了确定该方法是否允许在不存在任何防腐剂例如蛋白酶抑制剂的情况下获得全功能纤溶酶原，在进行1μm澄清过滤前，在添加和不添加牛抑肽酶(20KIU/mL)至解冻的血浆两者的情况下进行纯化。如表1中示出的，抑肽酶的不存在不改变纤溶酶原抗原、活性和收率；此外，尽管观察到洗脱级分中的白蛋白含量的增加，但不显著。图4示出了从蛋白印迹分析获得的结果，其相对于在抑肽酶的存在或不存在下通过缓冲液组合物A相对于缓冲液组合物B进行的色谱法：被分析的样品中没有一个示出对应于纤溶酶的活化带，这展示甚至在不存在抑肽酶的情况下，纤溶酶原完全保持其完整性。
实施例4–用于Glu-Pg的ELISA
熟知的是，在血浆中循环的Glu-Pg的半衰期大大地大于其他被称为Lys-Pg的纤溶酶原形式。为了研究在本发明中获得的纤溶酶原的形式，通过能够识别仅Glu-Pg形式的特异性抗体，在成品产品上进行酶联免疫吸附测定(ELISA)。如表3中示出的，这样的实验展示，在抑肽酶的存在和不存在两者的情况下，用缓冲液组合物B进行的色谱纯化提供成品产品，其中大于98％的纤溶酶原呈Glu-Pg的形式。
表3.用于Glu-PLG的ELISA。结果被表示为来自以三份运行的三个单独的实验的平均值±SD
实施例5-该工艺的最优实施方案
将人类冷冻血浆(1.88Kg)在连续搅拌下解冻直到温度达到20℃。将pH用CO2调节至7.5，并且在1μm过滤器上过滤后，使1.74Kg的解冻的血浆经历病毒灭活步骤：在30℃添加包含1％w/w Triton X-100(17.44g)和1％w/w TnBP(17.44g)的S/D混合物，并且搅拌持续30分钟。S/D处理在28℃进行持续6小时，并且在此时间结束时，在20℃，在搅拌条件下，添加65.8g的蓖麻油(S/D血浆的3.7％)持续60分钟；然后，将溶液保持静置持续1小时，以便将S/D相与血浆相分离。在通过3.00μm-0.5μm深度过滤器过滤后，将1.0Kg的S/D血浆加载到亲和树脂ECH-赖氨酸琼脂糖4Fast Flow(被填充到16mm直径×15cm高度的柱中)上。加载的血浆的量对应于33CV；线性流速是200cm/h，并且使用的缓冲液与表2中描述的相同(缓冲液组合物B)。
将色谱产物(0.035Kg)通过0.22μm过滤器过滤，以便除去ε-氨基己酸，通过使用30,000道尔顿透析盒，用20体积-25体积的盐水溶液(0.1M氯化钠)进行超滤。此后，该系统用0.1M氯化钠溶液洗涤，将蛋白质浓度调节至1.2mg/mL，并且由此获得的纤溶酶原溶液(0.07Kg)通过使用0.1μm过滤器过滤。随后，通过使溶液穿过20纳米病毒级纳米过滤器Planova 20N进行病毒去除步骤，并且在最终无菌过滤后，将纤溶酶原本体制剂(0.07Kg)保存在-20℃的温度。
获得的纤溶酶原的大于98％部分是Glu-Pg。

Claims (8)

1.一种用于从人类血浆或其分离中间体开始来纯化纤溶酶原的工艺；所述工艺包括：
ii)病毒灭活的步骤，其中使人类血浆与溶剂/洗涤剂混合物接触；
v)在L-赖氨酸固定的交联的琼脂糖树脂上的单亲和色谱步骤；以及
ix)病毒去除纳米过滤步骤；
其中所述病毒灭活(ii)在所述亲和色谱法的上游进行，并且所述纳米过滤(ix)在所述亲和色谱法的下游进行。
2.根据权利要求1所述的工艺，还包括蓖麻油添加步骤(iii)，所述蓖麻油添加步骤(iii)在所述病毒灭活步骤(ii)之后并且在所述亲和色谱法步骤(v)之前进行。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的工艺，还包括超滤步骤(vii)，所述超滤步骤(vii)在所述亲和色谱法(v)的下游和所述纳米过滤(ix)的上游进行。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的工艺，其中步骤(ii)中使用的所述溶剂洗涤剂混合物具有以下组成：1％w/w Triton X-100和1％w/w三-(正丁基)磷酸酯(TnBP)。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的工艺，其中亲和色谱法树脂是ECH-赖氨酸琼脂糖4Fast Flow。
6.根据权利要求5所述的工艺，其中用于ECH-赖氨酸琼脂糖4Fast Flow树脂上的亲和色谱法的缓冲液如下：
用于树脂平衡的磷酸钠0.05M，氯化钠0.1M，pH 7.4；
用于树脂洗涤的磷酸钠0.05M，氯化钠0.1M，pH 7.4；
用于纤溶酶原洗脱的磷酸钠0.05M，ε-氨基己酸0.05M，氯化钠0.1M pH 7.4。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的工艺，其中所述纳米过滤步骤(ix)通过20纳米病毒级过滤器进行。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的工艺，其中不是不使用蛋白酶抑制剂。
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