JP2002517191A - ヒトプロテインｃポリペプチド - Google Patents

ヒトプロテインｃポリペプチド

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ラルフ・メリディス・リッギン
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Abstract

(57)【要約】 短縮された重鎖を持つ、単離されたヒトプロテインＣポリペプチドが記載される。単離されたポリペプチドは、野生型ヒトプロテインＣの生物学的活性を保持する。このポリペプチドは血管閉塞疾患、凝固性亢進状態、血栓症疾患、及び、血栓症の素因を作る疾病状態の処置において有用であろう。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明はヒト医薬の分野に属する。具体的には、短縮された重鎖を持つ単離さ
れたヒトプロテインＣポリペプチド、このヒトプロテインＣポリペプチドを使用
する方法、及び、このヒトプロテインＣポリペプチドの医薬組成物に関する。
【０００２】 プロテインＣは、ビタミンＫ依存性セリンプロテアーゼ、そして、天然に存在
する抗凝固物質であり、凝固カスケード中の第Va因子及び第VIIIa因子を不活性
化することにより血管の恒常性の調節に役割を果たす。ヒトプロテインＣは主と
して肝臓において、461個のアミノ酸残基からなる一本鎖ポリペプチドとして作
られる。この前駆体分子は、 1)42個のアミノ酸からなるシグナル配列の切断； 2)分子の2本鎖形を形成するための、一本鎖酵素前駆体からの156位のリジン残
基及び157位のアルギニン残基のタンパク質分解性除去(即ち、155アミノ酸残基
からなる軽鎖がジスルフィド結合を介して、262アミノ酸残基のセリンプロテア
ーゼを含む重鎖に結合)； 3)軽鎖の最初の42個のアミノ酸中に集中する9つのグルタミン酸残基のビタミ
ンＫ依存性カルボキシル化。それにより9個のγ-カルボキシグルタミン酸残基が
生じる；そして、 4)4つの部位での炭水化物付加(1つは軽鎖中、3つは重鎖中で）； を含む複数の翻訳後修飾を受ける。最終的に、循環する2本鎖酵素前駆体は、活
性化プロテインＣ(ａＰＣ)を産生する循環する酵素前駆体の活性化ペプチド(残
基158から169)を切断するトロンビン/トロンボモジュリン複合体の作用により活
性化される。
【０００３】 他のタンパク質と共に、ａＰＣは血液凝固の恐らく最も重要なダウンレギュレ
ーターとして機能する。従って、プロテインＣ酵素系は、抗凝固の主要な生理的
機能を表す。
【０００４】 プロテインＣの恒常性の調節における重大な役割は、異型接合欠損、プロテイ
ンＣ耐性(例えば、ありふれた第Ｖ因子Leiden変異)、及び、未処置の同型接合体
プロテインＣ欠損の致命的な結末における血栓症の割合の増加において例示され
る。血漿由来、及び、組換えの両方のヒト活性化プロテインＣが静脈性、及び、
動脈性血栓症の両方の種々の動物モデルにおいて、有効で、安全な抗血栓剤であ
ることが示された。近頃の臨床試験におけるプロテインＣは、敗血症に伴う播種
性血管内凝固等のプロテインＣ欠損、及び、微小血管血栓症の処置を含むヒトの
血栓症疾病において有効であることが示された。
【０００５】 残念なことに、プロテインＣの活性化の間、重鎖のＣ末端が切断され、それに
より蛋白質の構造が変化し、それによって、より精密でも簡潔でもない医薬製剤
となるかもしれない。発明者らは、このａＰＣの短縮された形体が、生物学的に
活性であることを発見した。従って、本発明は短縮された重鎖を有する単離され
たａＰＣポリペプチド、このポリペプチドを優先的に調製する方法、及び、その
薬剤としての使用を提供する。
【０００６】 本発明は軽鎖、及び、短縮された重鎖を含む、単離されたヒトプロテインＣポ
リペプチドであって、該ポリペプチドが配列番号１であるものを提供する。
【０００７】 本発明はさらに、短縮された重鎖を有する単離されたヒトプロテインＣポリペ
プチドをコードする組換えＤＮＡ分子であって、該ＤＮＡ分子が配列番号２であ
るものを提供する。
【０００８】 本発明はさらに、処置を必要とする患者における血栓症疾病を処置する方法で
あって、該患者に短縮された重鎖を有する単離されたヒトプロテインＣポリペプ
チドの医薬的に有効な量を投与することを含む方法を提供する。
【０００９】 短縮された重鎖を有する単離されたヒトプロテインＣポリペプチドを製造する
方法、及び、態様もまた本発明の態様である。
【００１０】 開示され、特許請求されるように、本発明の目的のため、以下の用語は次のよ
うに定義される。
【００１１】 組換え、若しくは、血漿由来のａＰＣ、または、活性化プロテインＣ： ａＰ
Ｃは好ましくはヒトプロテインＣであるが、ａＰＣにはまた、プロテインＣの蛋
白質分解性、アミド分解性、エステル分解性、及び、生物学的(抗凝血、または
、前繊維素溶解)活性を有する他の種、または、誘導体が含まれ得る。プロテイ
ンＣ誘導体の例は、米国特許第5,453,373号、及び、米国特許第5,516,650号に記
載されており、該特許文献の全内容が本明細書の一部を構成する。
【００１２】 ＡＰＴＴ： 活性化部分トロンボプラスチン時間。
【００１３】 ＨＰＣ： ヒトプロテインＣ酵素前駆体。
【００１４】 ｒ-ｈＰＣ： 原核細胞、真核細胞、または、トランスジェニック動物で産生
された組換えヒトプロテインＣ酵素前駆体。
【００１５】 ｒ-ａＰＣ： ｒ-ｈＰＣをイン・ヴィトロで活性化することにより、または、
原核細胞、真核細胞、若しくは、トランスジェニック動物[ＷＯ第97/20043号]か
らの活性化形体のプロテインＣの直接の分泌により、産生される組換えヒト活性
化プロテインＣであり、例えば、ヒト腎臓２９３細胞からの酵素前駆体としての
分泌後、米国特許第4,981,952号で説明される当業者に周知の技術により精製、
及び、活性化されることを含む。米国特許第4,981,952号に教示される全内容が
本明細書の一部を構成する。
【００１６】 酵素前駆体： 該用語は分泌された、不活性の形体の、1本鎖、または、2本鎖
のプロテインＣを指す。
【００１７】 短縮された重鎖： 4個のＣ末端アミノ酸が切断されたプロテインＣの重鎖を
指す。ヒト活性化プロテインＣでは、短縮された重鎖には、配列番号１に示され
るように、アミノ酸残基170〜415が含まれる。
【００１８】 軽鎖： プロテインＣの軽鎖を指す。ヒト活性化プロテインＣには、軽鎖はア
ミノ酸残基1〜155、または、Ｃ末端から1個、若しくは、それ以上のアミノ酸が
欠失されたポリペプチドが含まれる。
【００１９】 血栓症疾患： 血管内の血塊の形成、若しくは、存在に関連する、または、そ
れにより起こる疾患。血栓症疾患には、これらに限定されるわけではないが、卒
中、心筋梗塞、不安定狭心症、血管形成術、若しくは、ステント配置(stent pla
cement)に続く突然の閉鎖、及び、末梢血管手術の結果としての血栓症を含む。
【００２０】 血管閉塞疾患、及び、凝固性亢進状態： これらに限定されるわけではないが
、敗血症、播種性血管内凝固、電撃性紫斑病、重篤な外傷、生命の危険を伴う手
術、火傷、成人呼吸障害症候群、移殖、深静脈血栓症、ヘパリン誘導血小板減少
症、鎌状赤血球疾病、サラセミア、ウイルス性出血熱、血栓症血小板減少紫斑病
、及び、溶血性尿毒症症候群の疾患が含まれる。
【００２１】 医薬製剤： 医薬剤として、投薬するのに適する製剤、または、溶剤。
【００２２】 本明細書中の医薬的に有効な量は、哺乳動物における血栓症疾患を阻害するこ
とができる本発明の化合物の量を表す。本発明に基づき投与される化合物の特定
の用量はもちろん、投与される化合物、処置される特定の症状、及び、同様の考
慮すべき事柄を含む、その症例を取り巻く特定の状況により決定される。
【００２３】 ＨＰＣの構造は翻訳後修飾の数のため、どちらかといえば複雑である。ＨＰＣ
構造は軽鎖(残基1〜155)、及び、重鎖(残基158〜419)からなる。ＨＰＣ分子は元
来419個のアミノ酸のポリペプチドとして発現されるが、細胞からの分泌前に蛋
白質のほとんどが、位置156〜157のＬｙｓ-Ａｒｇジペプチドの除去によりヘテ
ロダイマー形体に変換される。
【００２４】 組換えヒトプロテインＣ(ｒ-ｈＰＣ)はその構造、及び、その複雑さの点でＨ
ＰＣに類似している。ｒ-ｈＰＣのｒ-ａＰＣへの転換の間に、トロンビンが選択
的に活性化ドデカペプチド(残基158〜169)を切断する。しかしながら、発明者ら
は重鎖のＣ末端からまた、テトラペプチド(残基416〜419)も切断され、デス416
〜419ａＰＣポリペプチドが形成される条件を発見した。発明者らはさらに、こ
のａＰＣの形体が生物学的に活性である(実施例１の表１参照)ことを発見し、そ
の単独、または、天然ａＰＣと組み合せた医薬としての使用が導かれた。従って
、本発明は単離されたデス(416〜419)ａＰＣ、選択的にデス(416〜419)ａＰＣを
製造する方法、及び、その薬剤としての使用を提供する。
【００２５】 本発明はまた、短縮された重鎖を有するプロテインＣを製造するのに使用する
ＤＮＡ化合物を提供する。これらのＤＮＡ化合物は、野生型酵素前駆体プロテイ
ンＣのプレプロペプチド配列とすぐ隣接して、その下流に、及び、それと同じ翻
訳リーディングフレーム内に位置して、ヒトプロテインＣの軽鎖のコード配列を
含む。ＤＮＡ配列はまた、プロテインＣ分子、活性化ペプチド、及び、プロテイ
ンＣ分子の短縮した重鎖の成熟の間にプロセスされるＬｙｓ-Ａｒｇジペプチド
をコードする。
【００２６】 当業者は、遺伝子暗号の縮合のため、多様なＤＮＡ化合物が活性化プロテイン
Ｃポリペプチドをコードすることができることを認識するであろう。米国特許第
4,775,624号(該特許文献に教示される全内容が本明細書の一部を構成する)には
、野生型のヒトプロテインＣ分子をコードするＤＮＡ配列が開示、及び、特許請
求される。本明細書に記載されるポリペプチドを正確にコードする他のＤＮＡ配
列を構築するのに、どのようなＤＮＡ配列における変化を用いることができるか
を当業者であれば容易に決定することができるが、本発明は特定のＤＮＡ配列に
限定されない。従って、以下に記載される本発明の好ましいＤＮＡ化合物、ベク
ター、及び、形質転換体は単なる例示であって、発明の範囲を限定するものでは
ない。
【００２７】 本発明のＤＮＡ化合物は、ヒトプロテインＣ遺伝子の部位特異的突然変異誘導
により製造することができる。培養物を得、プラスミドを慣用の技術を用いて単
離した後、直接、短縮された重鎖を有するプロテインＣの産生のため、真核宿主
細胞にトランスフェクトすることができる。ＧＢＭＴ転写調節単位に見られるＢ
Ｋエンハンサーが、Ｅ１Ａの存在下で最も効率的に発現を増幅するように機能す
るので、プラスミドをアデノウイルスＥ１Ａ極初期遺伝子産物を発現する宿主細
胞へトランスフェクトすることが好ましい。ＧＢＭＴ転写調節単位は、米国特許
第5,573,938号、及び、欧州特許公開第91301451.0号により完全に記載される。
該特許文献に開示される全内容は本明細書の一部を構成する。当業者であれば、
巨大なＤＮＡウイルスの極初期遺伝子産物を多数の宿主細胞が発現すること、ま
たは、多数の宿主細胞をそれを発現するようにすることができることを認識する
であろう。本発明のヒトプロテインＣ誘導体の発現に最も好ましいセルラインは
、米国特許第4,992,373号に開示されるヒト腎２９３セルラインである。該特許
文献に教示される全内容が本明細書の一部を構成する。セルラインにおける発現
の後、誘導体を細胞培養物上清から、米国特許第4,981,952号の方法を用いて精
製する。該特許文献に教示される全内容が本明細書の一部を構成する。
【００２８】 本発明のＤＮＡ配列は化学的に、または、制限断片を結合することにより、ま
たは、当分野において公知の技術の組合わせにより合成することができる。ＤＮ
Ａ合成装置が利用可能であり、本発明のＤＮＡ化合物を構築するのに用いること
ができる。
【００２９】 本発明の例示的なベクターは、コード配列の転写をアデノウイルス後期プロモ
ーターにより刺激するように、ＧＢＭＴ転写ユニットを位置させることを含む。
当業者は多数の真核性プロモーター、エンハンサー、及び、発現ベクターが当分
野において公知であり、本発明のプロテインＣ誘導体を産生するのに使用できる
ことを理解する。当業者はまた、真核性発現ベクターが、エンハンサー要素なし
で機能することができることを理解する。本発明の主要な局面は、新規ＤＮＡ配
列、及び、これらの配列から作られる対応する短縮された重鎖を有するａＰＣに
帰する。
【００３０】 代りに、本明細書中の活性化プロテインＣポリペプチドは、活性化プロテイン
Ｃを、重鎖のＣ末端からテトラペプチド(残基416〜419)を切断するために、トロ
ンビンと反応させることにより製造してもよい。付加的な切断は、ａＰＣを一般
に10分から3〜5時間の延長された時間、当分野において認められる条件下でトロ
ンビンに曝露することにより達成される。ｒ-ａＰＣをトロンビンで処置するこ
とにより、または、真核細胞からの直接発現によって製造されるａＰＣポリペプ
チドは、ａＰＣと類似の活性を有する。従って、短縮された重鎖を有するａＰＣ
は、敗血症、播種性血管内凝固、電撃性紫斑病、重篤な外傷、生命の危険を伴う
外科手術、火傷、成人呼吸障害症候群、移殖、深血管血栓症、ヘパリン誘導血小
板減少、鎌状赤血球疾病、サラセシア、ウイルス性出血熱、血栓性血小板減少紫
斑病、及び、溶血性尿毒症、同じく、心筋梗塞、及び、卒中等の血栓症が素因と
なる血栓症疾患、並びに、疾病状態を含むプロテインＣ欠損、血管閉塞疾患、及
び、凝固性亢進状態を短縮された重鎖を有する単離されたヒトプロテインＣポリ
ペプチドを投与することにより処置する代償療法において有効である。
【００３１】 本発明の別の態様は、血栓症疾患を処置する方法であって、処置を必要とする
患者に医薬的に有効な量の、短縮された重鎖を持つ単離されたヒトプロテインＣ
ポリペプチドを、抗血小板剤と組み合わせて投与することを含む方法である。
【００３２】 本発明の別の態様は、敗血症を処置する方法であって、処置を必要とする患者
に医薬的に有効な量の、短縮された重鎖を持つ単離されたヒトプロテインＣポリ
ペプチドを、細菌への浸透を増加する蛋白質と組み合わせて投与することを含む
方法である。
【００３３】 短縮された重鎖を持つ単離されたヒトプロテインＣポリペプチドを、ａＰＣと
同様の方法により、医薬的に許容される希釈剤と共に製剤することができる。好
ましくはショ糖等の糖、塩、及び、クエン酸緩衝液を含む。好ましくは、ａＰＣ
は5.5〜6.5のｐＨで調製する。一般に、本明細書中に記載のａＰＣ誘導体の医薬
的用量は天然ａＰＣと同等であり、好ましくは0.01ｍｇ/ｋｇ/時間から0.05ｍｇ
/ｋｇ/時間である。
【００３４】 以下の製造例、及び、実施例は単なる例示である。当業者であれば、組換えプ
ロテインＣのその他の製造方法、及び、活性化方法があることを認識するであろ
う。
【００３５】 製造例１ ヒトプロテインＣの製造 組換えヒトプロテインＣ(ｒ-ｈＰＣ)をヒト腎臓２９３細胞中で、例えば米国
特許第4,981,952号に述べられるような当業者に周知の技術により製造する。該
特許文献に教示される全内容が本明細書の一部を構成する。ヒトプロテインＣを
コードする遺伝子は米国特許第4,775,624号に開示され、特許請求されている。
該特許文献に教示される全内容が本明細書の一部を構成する。ヒトプロテインＣ
を２９３細胞において発現するのに用いたプラスミドは米国特許第4,992,373号
、及び、米国特許第5,661,002号に開示されているプラスミドｐＬＰＣである。
該特許文献に教示される全内容が本明細書の一部を構成する。プラスミドｐＬＰ
Ｃの構築はまた欧州特許公開第0445939号、及び、Grinnellら(1987年)Bio/Techn
ology、第5巻、第1189〜1192頁にも記載され、これらに教示される全内容も本明
細書の一部を構成する。簡単に言うと、該プラスミドを２９３細胞にトランスフ
ェクトした後、安定な形質転換体を同定し、無血清培地において二次培養し、生
育させる。培養後、細胞を含有しない培地をミクロフィルター濾過により得る。
【００３６】 ヒトプロテインＣは、米国特許第4,981,952号(教示される全内容が本明細書の
一部を構成する)の技術を適用することにより培養液より分離する。清澄化した
培地は、4ｍＭ ＥＤＴＡとした後、陰イオン交換樹脂(Fast-FlowQ,Pharmacia)に
吸着させる。4カラム容量の20ｍＭ Ｔｒｉｓ、200ｍＭ ＮａＣｌ(ｐＨ7.4)、及
び、2カラム容量の20ｍＭ Ｔｒｉｓ、150ｍＭ ＮａＣｌ(ｐＨ7.4)で洗浄した後
、結合した組換えヒトプロテインＣ酵素前駆体を20ｍＭ Ｔｒｉｓ、150ｍＭ Ｎ
ａＣｌ、10ｍＭ ＣａＣｌ2(ｐＨ7.4)で溶出する。溶出されたタンパク質のＳＤ
Ｓ-ポリアクリルアミドゲル電気泳動による溶出後の純度は、95％より大きい。
【００３７】 さらなるタンパク質の精製は、タンパク質を3Ｍ ＮａＣｌとした後、20ｍＭ
Ｔｒｉｓ、3Ｍ ＮａＣｌ、10ｍＭ ＣａＣｌ2(ｐＨ7.4)で平衡化した疎水性相互
作用樹脂(Toyopearlフェニル650Ｍ,TosoHaas)に吸着させることにより達成する
。2カラム容量のＣａＣｌ2を含まない平衡化緩衝液で洗浄した後、組換えヒトプ
ロテインＣを20ｍＭ Ｔｒｉｓ(ｐＨ7.4)で溶出する。溶出したタンパク質から残
存カルシウムを除くことにより活性化に備える。組換えヒトプロテインＣを、カ
ルシウムを除くため金属アフィニティーカラム(Chelex-100,Bio-Rad)に通し、再
び陰イオン交換体(Fast FlowQ,Pharmacia)に吸着させる。これら両方のカラムは
連続して配置され、20ｍＭ Ｔｒｉｓ、150ｍＭ ＮａＣｌ、5ｍＭ ＥＤＴＡ(ｐＨ
6.5)で平衡化する。タンパク質を載せた後、Chelex-100カラムを系から外す前に
、1カラム容量の同じ緩衝液で洗浄する。陰イオン交換カラムを3カラム容量の平
衡緩衝液で洗浄した後、0.4Ｍ ＮａＣｌ、20ｍＭ Ｔｒｉｓ酢酸(ｐＨ6.5)で溶出
する。組換えヒトプロテインＣ、及び、組換え活性化プロテインＣ溶液のタンパ
ク質濃度をＵＶ280ｎｍ吸光度Ｅ0.1％＝各々、1.81または1.85で測定する。
【００３８】 製造例２ 組換えヒトプロテインＣの活性化 ウシトロンビンを、50ｍＭ ＨＥＰＥＳ(ｐＨ7.5)の存在下、4℃で活性化ＣＨ-
セファロース４Ｂ(Pharmacia)に結合する。結合反応は、前もってカラムに詰め
られた樹脂に対して、およそ5000ユニット トロンビン/ｍＬ樹脂を使用して行う
。トロンビン溶液をおよそ3時間カラムに循環させた後、ＭＥＡを0.6ｍｌ/ｌの
濃度で循環溶液に添加する。樹脂上の未反応アミンの完全なブロックを保証する
ため、ＭＥＡ含有溶液をさらに10〜12時間循環させる。ブロックに続いて、トロ
ンビン結合樹脂を10カラム容量の1Ｍ ＮａＣｌ、20ｍＭ Ｔｒｉｓ(ｐＨ6.5)で、
全ての非特異的結合タンパク質を除くため洗浄し、活性化緩衝液で平衡化した後
、活性化反応において使用する。
【００３９】 精製ｒ-ｈＰＣを5ｍＭ ＥＤＴＡとし(残存するカルシウムを全てキレート化す
るため)、20ｍＭ Ｔｒｉｓ(ｐＨ7.4)、または、20ｍＭ Ｔｒｉｓ酢酸(ｐＨ6.5)
で2ｍｇ/ｍｌの濃度に希釈する。この材料を、37℃で50ｍＭ ＮａＣｌ、及び、2
0ｍＭ Ｔｒｉｓ(ｐＨ7.4)、または、20ｍＭ Ｔｒｉｓ酢酸(ｐＨ6.5)の一方で平
衡化したトロンビンカラムに通す。流速は、ｒ-ｈＰＣとトロンビン樹脂の間の
接触時間がおよそ20分となるように設定する。流出物を集め、即座にアミド分解
性について分析する。もし材料が、確立された標準ａＰＣに匹敵する特異的活性
(アミド分解性)を有していなければ、完全にｒ-ｈＰＣを活性化するため、それ
を再度トロンビンカラムに循環させる。これに続いて、次の製造工程に進むまで
の間、ａＰＣをより低い濃度に保つため上述のように7.4〜6.0の間のいずれかの
値のｐＨを有する(自己消化を防ぐため、低いｐＨの方が好ましい)20ｍＭバッフ
ァーによる材料の1：1溶出を行う。
【００４０】 浸出したトロンビンのａＰＣ材料からの除去は、ａＰＣを150ｍＭ ＮａＣｌを
含む活性化バッファー(20ｍＭ Ｔｒｉｓ(ｐＨ7.4)または好ましくは20ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ酢酸(ｐＨ6.5)のどちらか一方)で平衡化した陰イオン交換樹脂(Fast-FlowQ,
Pharmacia)に結合することにより達成する。トロンビンはこの条件下で陰イオン
交換樹脂と反応せず、カラムを通過し、試料適用流出物中に出る。ａＰＣを一旦
、カラムに載せたら、2〜6カラム容量の20ｍＭ平衡化緩衝液で洗浄し、結合した
ａＰＣを、5ｍＭ Ｔｒｉｓ酢酸(ｐＨ6.5)または20ｍＭ Ｔｒｉｓ(ｐＨ7.4)のど
ちらかの0.4Ｍ ＮａＣｌ液を用いたステップ勾配で溶出する。より多い容量によ
るカラムの洗浄によって、より完全なドデカペプチドの除去が促進された。
【００４１】 活性化プロテインＣの抗凝血活性を、活性化部分トロンボプラスチン時間(Ａ
ＰＴＴ)凝固分析でその凝固時間の延長を測定することにより決定した。標準曲
線を、そのプロテインＣ濃度が125〜1000ｎｇ/ｍＬの範囲にわたる希釈緩衝液(1
ｍｇ/ｍＬ放射免疫分析グレードウシ血清アルブミン[ＢＳＡ]、20ｍＭ Ｔｒｉｓ
、ｐＨ7.4、150ｍＭ ＮａＣｌ、0.02％ＮａＮ3)を作成し、試料をこの濃度範囲
のいくつかの希釈度で用意した。各試料を含むキュベットに、50μＬの冷ウマ血
清、及び、50μＬの再構成活性化部分トロンボプラスチン時間試薬(ＡＰＴＴ試
薬、Sigma)を添加し、37℃で5分間インキュベートした。インキュベーション後
、50μＬの適当な試料、または、スタンダートを各キュベットに添加した。基礎
凝固時間を決定するため、試料またはスタンダートに代えて希釈緩衝液を使用し
た。fibrometer(CoA Screener Hemostasis Analyzer,American Labor)のタイマ
ーは、各試料またはスタンダートに37℃で、50μｌの30ｍＭ ＣａＣｌ2を添加す
ると同時にスタートさせた。試料中の活性化プロテインＣ濃度は、標準曲線の線
形回帰方程式(linear regression equation)より計算する。ここで報告される凝
固時間は、標準曲線の試料も含めて、最低3回の実験の平均である。
【００４２】 実施例１ デス416〜419活性化プロテインＣの製造 ａＰＣをデス416〜419ａＰＣを製造するための出発材料として用いた。固定化
トロンビン樹脂(10ｍｇトロンビン/ｍｌ ＣＨ-セファロース４Ｂ樹脂)を使用し
た。Ｎ-グリコシダーゼＦをBoehringer Mannheimより得た。ウマ血清は、Animal
Technologies,Inc.(Tyler,TX)の製品である。活性化ＣＨセファロース(登録商
標)は、Pharmacia Biotechより購入した。その他の全ての製剤はＡＣＳ試薬グレ
ードであり、市販されていた。
【００４３】 6ｍＬ量の固定化トロンビン樹脂を0.2ミクロンフィルター上に載せた。樹脂を
およそ5×20ｍＬの40ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液(ｐＨ7.02)で洗浄した。洗浄した固定
化トロンビン樹脂を、50ｍＬのポリプロピレンバイアルに移し、12ｍＬの2.67ｍ
ｇ/ｍＬ ａＰＣ溶液(45ｍＬの40ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液(ｐＨ7.02)中の120ｍｇ ａ
ＰＣ)の部分標本をバイアルに添加し、懸濁液の最終容量をおよそ21ｍＬにＴｒ
ｉｓ緩衝液で調整した。懸濁液を環境温度で、不断に穏やかに攪拌しながらイン
キュベートした。10、25、50、100、160、及び、240分のインキュベーション時
間後に、3ｍＬの懸濁液の部分標本をバイアルから取った。これらの部分標本を2
000RPM(ICE CRU-5000遠心機)で1分間遠心し、上清を幾つかの1.5ｍLポリプロピ
レンバイアルに移した。これらのバイアルを直に、溶液を凍らせるために乾燥氷
冷槽に移した。同時に、固定化トロンビンを含まない脱活性化ＣＨ-セファロー
ス４Ｂ樹脂を用いて、コントロール試料を調製した。
【００４４】 蛋白質濃度分析。 試料溶液の部分標本(150ｍｃＬ)を、450ｍｃＬの40ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液(ｐＨ
7.02)または試薬水で希釈した。試料細胞を2回、試料溶液で洗浄し、溶液のＵＶ
吸収(λ＝280ｎｍにおける)を測定した。Ｔｒｉｓ緩衝液、または、試薬水をこ
の測定におけるブランクとして使用した。
【００４５】 蛋白質ポリペプチド分布のためのＬＣ/ＭＳ分析。 資料溶液のおよそ600ｍｃＬの部分標本を240ｍｇ尿素、88ｍｃＬの3Ｍ Ｔｒｉ
ｓ緩衝液(ｐＨ＝8.0)、及び、15ｍｃＬの50ｍｇ/ｍＬジチオトレイトール溶液と
混合し、37℃で30分間インキュベートした。50ｍｃＬの50ｍｇ/ｍＬヨードアセ
トアミド溶液を添加し、環境温度、暗中で30分間インキュベートすることにより
試料をアルキル化した。その後、試料を使い捨てのゲル濾過カラムで脱塩し、Ｎ
-グリコシダーゼＦで脱糖化し、ＬＣ/ＭＳで分析した。
【００４６】 ＲＰ-ＨＰＬＣ分析。 解凍した300〜400マイクロリットルの部分標本を十分量の0.1％ＴＦＡ溶液と
混合し、およそ1ｍｇ/ｍＬの溶液を得た。この溶液を高濃度試料として用いた。
低濃度試料は、高濃度試料の50ｍｃＬ部分標本を450ｍｃＬの0.1％ＴＦＡ溶液と
混合することにより調製した。高濃度試料、及び、低濃度試料の各100マイクロ
リットル部分標本をＨＰＬＣシステムに注入した。
【００４７】 ＡＰＴＴ分析 自動化活性化部分トロンボプラスチン時間(ＡＰＴＴ)CoaLab分析器で試料を分
析した。全ての試料を手動式ピペットで410ｎｇ、及び、420ｎｇ ａＰＣ/ｍＬの
間の最終濃度に希釈した。303Ｕ/ｍｇの一定の有効性のａＰＣ参考標準を、この
分析で使用した。上述のように産生したデス(416〜419)ａＰＣは、ＡＰＴＴ分析
による測定で、天然ａＰＣと同様な生物活性を有した。ＡＰＴＴ抗凝固活性と、
デス416〜419ａＰＣの割合の関係を表１に示す。デス416〜419ａＰＣの割合は68
％にも上っても、実質的に天然ａＰＣと同じ抗凝固活性を保持する。一般に、本
明細書中に記載の方法により製造されたａＰＣは約1％〜約25％のデス416〜419
ａＰＣを含む。 表１
【配列表】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 9/64 Ｚ 1/21 15/00 ＺＮＡＡ 5/10 Ａ６１Ｋ 37/02 9/64 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，Ｚ Ａ，ＺＷ

Claims (8)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 軽鎖、及び、短縮された重鎖を含む、単離されたヒトプロテ
    インＣポリペプチド。
  2. 【請求項２】 該ポリペプチドが配列番号１に記載のものである、請求項１
    に記載のポリペプチド。
  3. 【請求項３】 請求項１に記載のヒトプロテインＣポリペプチドをコードす
    る組換えＤＮＡ分子。
  4. 【請求項４】 該ＤＮＡ分子が配列番号２に記載のものである、請求項３に
    記載の組換えＤＮＡ分子。
  5. 【請求項５】 該ヒトプロテインＣポリペプチドが活性化されている、請求
    項１に記載の単離されたヒトプロテインＣポリペプチド。
  6. 【請求項６】 処置を必要とする患者における血栓症疾患、血管閉塞疾患、
    及び、凝固性亢進状態を処置する方法であって、該患者に医薬的に有効な量の請
    求項１に記載の短縮された重鎖を有する単離された活性化プロテインＣポリペプ
    チドを投与することを含む方法。
  7. 【請求項７】 請求項２に記載の核酸を含むベクター。
  8. 【請求項８】 請求項２に記載の単離された核酸を含む宿主細胞。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8821884B2 (en) * 2004-07-27 2014-09-02 The Regents Of The University Of California Compositions and methods using MD-2 mutants and chimeric proteins
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2728240B2 (ja) * 1988-07-26 1998-03-18 ヘキスト薬品工業株式会社 ヒトプロテインｃ変異体及びその製造方法
EP0506821B1 (en) * 1989-12-29 1998-02-04 Zymogenetics, Inc. Hybrid protein c
JPH05506354A (ja) * 1990-02-09 1993-09-22 ザイモジェネティクス，インコーポレイティド 端が切り取られた軽鎖を有する活性プロテインｃ
JPH0564588A (ja) * 1991-08-14 1993-03-19 Teijin Ltd 短い重鎖を有するヒトプロテインｃおよび活性化ヒトプロテインｃ

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