CN111032134B - 电喷雾导管 - Google Patents

Abstract

一种包括导管的装置，电极以及使用该装置将分子递送至真核细胞的方法。所述导管限定流体通道并具有远端开口。电极在流体通道内并且与导管的远端开口间隔开一定距离。导管布置成防止装置的任何电极与组织之间直接接触。本文还描述了相关的装置、系统、技术和物品。

Description

电喷雾导管

相关申请的交叉引用

本申请要求于2017年6月30日提交的美国临时申请号62/527,989的优先权，其公开内容通过引用全文明确地并入本文。

技术领域

本文描述的主题涉及的是电喷雾导管和使用所述电喷雾导管的流体的靶向输送。

背景技术

尽管近年来化学疗法取得了进步，但肺癌却是导致全球癌症死亡人数最多的原因，存活率很低。大幅提高生存率的最有效方法是在早期阶段诊断肺癌，这时治疗可能更有效。

与其他类型的癌症相比，肺癌的预后仍然很差。迄今为止，已经有三项研究报告显示，亚甲基蓝染色对恶性和癌前病变的鉴别诊断具有前瞻性。在这些研究中，使用常规喷雾导管将相对大量的亚甲基蓝送入气道。Ovchinnikov的第一项研究(Ovvhinnikov AA，Dianov VV，Lukomosky GI，支气管镜在支气管肿瘤的诊断中的应用，内窥镜检查，1980；12:147 -150)使用支气管镜雾化器递送2ml的0.2-0.4％亚甲基蓝，并报告化生/肿瘤与正常组织的成功差异染色。Varoli的第二项研究(Varoli F，Mariani C，Fasceanella A，Cosentino F，在纤维支气管镜中进行重要染色，内窥镜检查，1986；18：142-143)使用喷雾导管递送了0.7％的亚甲基蓝(未报道其体积)，并报告正常的支气管粘膜未染色，而恶性肿瘤组织则被深色染色，鳞状化生区域被轻微染色。Zirlik最近进行的第三项研究(ZirlikS，Hildner KM，Neurath MF，Fuchs FS，亚甲基蓝辅助在纤支镜检查中中央气道的体内染色，《科学世界杂志》，2012；2012:625867(doi：10.1100/2012/625867)使用喷雾导管递送了10ml的0.1％的亚甲基蓝。他们报告说，虽然亚甲基蓝是用于支气管镜检查的合适染料，并且在局部肺部应用有足够的经验，但他们使用的技术对早期发现支气管系统的恶性或癌前病变没有帮助。据推测，这些研究中使用的大量亚甲基蓝，以及不允许控制性靶向给药的喷雾导管的使用，对不可再现性造成了重大影响。

发明内容

在一方面，装置包括导管和电极。所述导管限定流体通道并具有远端开口。所述电极在流体通道内并且与导管的远端开口间隔开一定距离。所述导管布置成防止装置的任何电极与组织之间直接接触。

任何一种可行的组合都可以包括以下一个或多个特征。例如，所述导管的外部可包括导电护套并且其可配置用于接地。所述导管可以将流体通道和导电护套间隔开。可以包括生物相容性覆盖物，其在生物相容性覆盖物和导管之间包围导电护套。所述生物相容性覆盖物可以延伸小于导管的整个长度，并且导管的远端可以是暴露的。所述导管可具有约0.5mm的内径和约1.4mm的外径。所述电极和远端开口之间的距离可以是大约100mm。所述生物相容性覆盖物可具有约2.05mm的外径。所述导管可以在所述远端处延伸超过生物相容性覆盖物约50mm。

可以包括延伸穿过导管长度的一部分并且在所述流体通道内的导线。所述导线可包括绝缘层和暴露的远端部分。所述暴露的远端部分可以形成电极。电极在携带电荷时可以将电荷传递给流经流体通道的流体。所述电荷可以在流体通道内被传递，使得当带电流体到达导管的远端开口附近的流体/空气界面时，带电流体形成分散的带电液滴。

所述导管可包括设置在流体通道内的多孔尖端。所述多孔尖端可以包括毛毡材料和/或纤维材料。所述多孔尖端可包括锥形几何形状。所述导管可包括设置在导管的远端开口附近并围绕导管的外表面的突起；以及热塑性塑料包裹物，其包围所述突起，以提供密封和电绝缘。

在另一方面，系统可包括泵、电源、导管和电极。所述导管耦合至泵，限定流体通道，并具有远端开口。所述电极在流体通道内电耦合至电源，并且与导管的远端开口间隔开一定距离。所述导管可防止系统的任何电极与组织直接接触。

任何一种可行的组合都可以包含以下一个或多个特征。例如，每次启动泵时，泵可以向流体通道计量1到10微升的流体。每次启动泵时，泵可以向流体通道计量5至500微升的流体。所述电源向电极充电至3千瓦至10千瓦之间。所述电源可以向电极提供大于160纳安和小于25微安的电荷。

在导管的外部可以包括导电护套，并且所述导电护套可以配置用于接地。所述导管可以将流体通道和导电护套分开。可以包括生物相容性覆盖物，其包围在所述生物相容性覆盖物和导管之间的导电护套。所述生物相容性覆盖物可以延伸小于导管的整个长度，并且导管的远端可以暴露。所述导管可具有约0.5mm的内径和约1.4mm的外径。所述电极和远端开口之间的距离可以是大约100mm。所述生物相容性覆盖物可具有约2.05mm的外径。所述导管可以在远端延伸超过生物相容性覆盖物约50mm。

可以包括导线，其延伸穿过导管长度的一部分并且在流体通道内。所述导线可包括绝缘层和暴露的远端部分。所述暴露的远端部分可以形成电极。电极在携带电荷时可以将电荷传递给流经流体通道的流体。所述电荷可以在流体通道内被传递，使得当带电流体到达导管的远端开口附近的流体/空气界面时，带电流体形成分散的带电液滴。

在另一方面，由具有远端开口的导管限定的流体通道内的电极被充电。电极与远端开口间隔开一定距离。所述导管布置用于防止任何电极与组织之间直接接触。定量的流体被供应到流体通道以将流体输送到目标。

任何一种可行的组合都可以包含以下一个或多个特征。电极在携带电荷时，可以将电荷传递给给流过流体通道的流体，该电荷在流体通道内传递，这样，当带电流体到达导管远端开口附近的流体/空气界面时，带电流体形成分散的带电液滴。所述流体可包括亚甲基蓝。可以将导管插入患者的气道中以将流体输送到目标肺组织。导管可插入以下一项或多项：胃肠道、口腔、中央气道、近端气道、小肠和结肠。可以将流体输送至所述目标，所述目标包括以下一项或多项的一部分：肠组织、甲状旁腺、前哨淋巴结、黑色素瘤、口腔组织和小肠组织。所述导管可以插入支气管镜。

所述流体可以包含脱氧核糖核酸(DNA)、信使核糖核酸(mRNA)，小干扰核糖核酸(siRNA)和/或蛋白质，上述物质会被输送至所述目标。所述流体可以包含信使核糖核酸(mRNA)。

在导管的外部可以包括导电护套，其配置为接地。所述导管可以将流体通道和导电护套分开。可以包括生物相容性覆盖物，其包围所述生物相容性覆盖物和导管之间的所述导电护套。生物相容性覆盖物可以延伸小于导管的整个长度，并且导管的远端可以暴露。所述导管可具有约0.5mm的内径和约1.4mm的外径。电极和远端开口之间的距离可以是大约100mm。生物相容性覆盖物可具有约2.05mm的外径。导管可以在远端延伸超过生物相容性覆盖物约50mm。

可以包括导线，其延伸穿过导管的一部分长度并且在流体通道内。所述导线可包括绝缘层和暴露的远端部分。所述暴露的远端部分可以形成电极。电极在携带电荷时可以将电荷传递给流经流体通道的流体。所述电荷可以在流体通道内时传递，使得当带电流体到达导管的远端开口附近的流体/空气界面时，带电流体形成分散的带电液滴。

所述流体可以包含浓度大于5％的乙醇。所述流体可以包含浓度为5-75％的乙醇。所述流体可包含约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70或75％的乙醇。大约可以在10％，5％，4％，3％，2％或1％之内。例如，输送的流体中的乙醇浓度大于5％且小于80％，75％，70％，65％，60％，55％，50％，45％，40％，35％，30％或25％的乙醇。示例性输送流体包含乙醇、生理学上可接受的缓冲溶液和要输送到活的哺乳动物细胞中的目的分子，例如人细胞。待递送的分子包含核酸，例如信使RNA或小(或短)干扰RNA(siRNA)或蛋白质。

所述导管的远端可置于距组织表面约15mm。

流体输送到所述目标的时间可以为0.1秒至10分钟。流体输送至所述目标可以为约0.1秒、0.2秒、1秒、10秒、1分钟、2分钟、3分钟、4分钟或10分钟。可以通过一次喷雾将流体输送到所述目标。流体输送至所述目标可以以约每分钟0.1μl、每分钟3μl、每分钟4.8μ1、每分钟10μl、每分钟100μl或每分钟1ml的流速执行。

充电可以达到3kV至5kV之间的电压。充电可以达到约3kV的电压，其中约在10％以内。所述的远端开口可以是22、23、25、27、30或32ga规格(gauge)。远端开口可以是32ga规格。可以使用正模式电喷雾。

当前主题包括一个平台，用于将诊断和治疗剂定向递送至解剖学位置或器官，所述解剖学位置或器官包括内腔，例如导管穿过的内腔。实施例包括肺组织(包括肺、支气管和细支气管)、食道、膀胱(包括尿道)、胃、肠、心血管组织以及其他组织。在某些方面，当前的主题包括喷雾递送平台技术，该喷雾递送平台技术使诊断和治疗分子能够以靶向和可控制的方式直接输送到体内的部位。与一些排出导管相比，所输送的流体体积可以很小，并且可以通过多样化喷雾来输送流体。

通过说明的方式，本文对猪进行了体内实验并对其进行了描述，这支持了当前主题的有效性和安全性。此外，还进行了使用体外肺癌组织以显示与健康组织相比癌症中亚甲基蓝染料摄取差异的实验，并在本文中进行了描述。本文所述的离体模型代表用于体内应用和治疗的本领域公认的模型。

在实施例实施方式中，所述平台包括设计用于体内肺部的“电喷雾”导管装置，可将诊断和治疗分子直接递送至体内组织。可以使用常规的柔性内窥镜来部署导管。从事癌症、靶向药物递送、基因治疗和诊断的医生可以使用导管。这种喷雾导管方法的基本原理是，有针对性的物理输送方式可以使临床医生通过以下方式增强患者的护理能力：(A)采用新颖的诊断方法，(B)输送现有输送方式无法轻易输送的药物，和(C)规避与气溶胶介导的、病毒和脂质体载体递送相关的问题和局限性。

本文描述的主题提供许多技术优势。例如，当前的主题可以递送少量的流体(例如，在1和10微升之间)，其可以覆盖体内的显微镜可见区域。受控递送允许更好地靶向组织给药，减少对组织的创伤，对组织或封闭区域(例如血管或管腔)施加很少或没有局部压力。改进的局部递送允许靶向特定组织(例如病变)，附带损伤最小，同时将更多的有效载荷递送至目标。当前的主题限制了患者和目标组织暴露于电荷，从而仅有暴露于患者和/或组织的唯一电荷通过流体，这导致流体在离开导管远端时扩散。

在一些实施方式中，可以实现分子的无载体递送。所述分子不仅可以递送到组织上，而且可以递送到组织中。

与人类正常的“健康”组织相比，当前的主题可以对肺癌进行不同的染色。这允许在支气管镜检查期间提高肺活检的靶向性。这提高了活组织检查在提供早期肺癌诊断中的敏感性，并且避免了患者进行进一步的更具侵入性的过程来确认诊断的需要。

所述平台可以加强患者的护理，为临床医生提供一种额外的策略来诊断和治疗肺部疾病，以补充现有静脉注射和雾化疗法。特别是，当前的主题可以使临床医生能够在肺部疾病的背景下递送分子，例如DNA和siRNA，并解决肺部以外的多种其他疾病。

待递送到真核细胞的分子被纯化，例如哺乳动物细胞，如人类细胞。如本文所用，“分离的”或“纯化的”核苷酸或多肽(例如核苷酸或多肽)基本上不含天然存在货物分子(cargo molecule)的其他核苷酸和多肽。化学合成时，纯化的核苷酸和多肽也不含细胞物质或其他化学物质。纯化的化合物为目标化合物的至少60重量％(干重)。优选地，所述制备物为目标化合物重量的至少75％，更优选至少90％，最优选至少99％。例如，纯化的核苷酸和多肽，例如趋化因子、细胞因子或化学因子，是按照重量计至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、98％、99％或100％(w/w)的所需寡糖重量的一种。纯度可通过任何适当的标准方法进行测量，例如，通过柱色谱法、薄层色谱法或高性能液体色谱(HPLC)分析。纯化要递送至真核细胞的核苷酸和多肽并用于递送至人类以及动物，例如伴侣动物(狗、猫)以及家畜(牛、马、绵羊、山羊或猪等动物，以及家禽)。“纯化的”还定义了对人类受试者给药安全的无菌程度，例如，缺乏传染性或毒性试剂。

在附图和以下描述中阐述了本文描述的主题的一个或多个变型的细节。从说明书和附图以及权利要求书中，本文描述的主题的其他特征和优点将是显而易见的。

附图说明

图1是根据示例性实施方式的递送平台的剖视图。

图2是示出了输送系统的系统框图，该输送系统包括用于将流体，例如染料，靶向输送到体内组织的输送平台。

图3是示出示例性电射流连接的截面图。

图4是示出递送系统的示例性实施方式的图片，其中示例性递送平台(a)处于台式装置中，而(b)处于医疗推车中。

图5是示出示例性递送平台中的羽流扩散的图片。

图6是比较用于递送分子例如DNA、siRNA和蛋白质的载体的特性的表。

图7包括两个图像，分别显示了通过滴液(左)和电喷雾(右)施加亚甲基蓝染色的猪气管，电喷雾的染料使组织染色，而滴加染色却很容易地被洗掉，显示出电喷雾是将染料递送到细胞中的可行载体。

图8示出了在电喷雾过程之前和之后针对亚甲基蓝记录的光谱的叠加，表明染料的化学结构的变化可忽略不计或没有变化。

图9示出了亚甲基蓝的光催化分解。

图10示出了电喷雾之前和之后的亚甲基蓝的质子核磁共振(1H NMR)谱。

图11示出了建议的亚甲基蓝的结构。

图12示出了用亚甲基蓝对口腔癌的染色。

图13说明了粘蛋白中硫酸盐基团的电离及其随后与亚甲基蓝的结合。

图14包括示出了图4所示的示例性实施方式的组件的图片。

图15示出了将质粒DNA电喷雾递送至移植的猪肺组织。(a)与阴性对照(pGLuc)相比，pEGFP转染后绿色荧光蛋白(GFP)表达的代表性图像。(b)与阴性对照(pEGFP)相比，pGLuc转染后高斯荧光素酶表达的定量。n＝21。***p<0.001。

图16示出了mRNA的电喷雾递送至移植的猪肺组织。(a)显示了与仅缓冲液的对照相比，绿色荧光蛋白(GFP)在GFP mRNA转染后表达的代表性图像。显示了荧光图像以及具有叠加的荧光图像的相应明场图像，放大了10倍。(b)与仅使用缓冲液的对照相比，荧光素酶mRNA转染后荧光素酶表达的定量。n＝9。*p<0.05。

图17示出了将siRNA电喷雾递送至移植的猪肺组织。显示了与仅缓冲液的对照相比，siRNA-FITC递送后FITC(递送分子模型)定位的代表性荧光显微图像。可视化(a)显微解剖(b)冷冻切片，显示荧光图像以及相应的明场图像和叠加的荧光图像，放大20倍。

图18示出了体外经支气管镜电喷雾递送mRNA和siRNA至猪肺的过程。(a)与仅缓冲液的对照相比，荧光素酶mRNA转染后荧光素酶表达的定量。n＝3。***P＜0.001。(b)与仅缓冲液对照相比，siRNA-FITC递送后FITC定位的代表性荧光显微镜图像。显示了荧光图像以及相应的明场图像，其中叠加了荧光图像(放大20倍)。

图19示出了用于体外将核酸电喷雾递送至猪肺组织片段的装置。(a)电喷雾装置。(b)在递送至组织期间用激光可视化的电喷雾羽状物。(c)泰勒锥和电喷雾羽流的放大图像。

图20示出了使用EVLP台式模型的支气管镜下电喷雾将siRNA和mRNA递送至离体猪肺：(a，b)电喷雾装置；(c，d)支气管镜工作端口的电喷雾导管；(e，f)体外肺灌注回路，包括无创呼吸机、蠕动泵和温控水浴；(g)支气管镜工作端口中的电喷雾导管，带有突起和热塑性塑料包裹物，用于密封和隔离。

图21示出了电喷雾溶液组成对质粒DNA缺口的影响。(a)溶液在没有施加电压的情况下形成液滴。(b)当施加电压时，具有羽流的典型电喷雾锥喷射模式。(c)用凝胶电泳法分析了低盐、1％乙醇和20％乙醇中电喷雾DNA溶液(喷雾)的超螺旋(sc)和开环(oc)结构的发生率。在电喷雾的低盐样品中，开环DNA的增加很明显。在将溶液放置在发射器之前(“之前”)，在将电压施加到发射器中的溶液之前(“滴液”)以及在移除电压后从发射器上采集对照样品(“发射器”)。显示了来自三个独立实验的代表性凝胶。

图22示出了流速和发射器尺寸对质粒DNA缺口的影响。(a)质粒DNA在低盐溶液中以不同的流速通过不同的发射器进行电喷雾。通过凝胶电泳和光密度测定法分析了超螺旋(sc)与开环(oc)结构的比值。在将溶液放入发射器之前(“之前”)和移除电压后从发射器(“发射器”)中取出对照样品。虽然条件之间没有统计学差异，但有一个趋势是32ga发射器在所有流速下都保持最高水平的超螺旋质粒。(b)记录了产生稳定电喷雾所需的电压，发现电压随着发射器规格的增加而降低。N＝3个独立实验，ga＝规格。

图23示出了电压对质粒DNA缺口的影响。(a)质粒DNA在低盐溶液中以60μl/min或15μl/min的速度通过32ga发射器电喷雾，并通过凝胶电泳分析DNA缺口。与超螺旋(sc)相比，增加的电压导致开环(oc)结构的发生率增加。(b)发射器规格不影响开环结构的入射角。(c)以变化的电压(发射器大小32ga，流速60μl/min)对GFP DNA进行电喷雾，并用脂质体2000转染A549细胞。GFP转染的效率随电压增加而降低。

图24示出了质粒DNA到猪气管外植体的电喷雾递送。(a)在递送到组织的过程中，用激光观察到的电喷雾羽流展示了发射器、电喷雾羽流、组织外植体和接地收集器。(b)与阴性对照(pEGFP)相比，pGLuc转染后高斯荧光素酶活性的定量。n＝21。***p<0.001。

图25示出了将RNA电喷雾递送至猪气管外植体。(a)与仅缓冲液对照相比，荧光素酶mRNA转染后荧光素酶活性的定量。n＝9。*p<0.05。与仅缓冲液的对照相比较，siRNA-FITC递送后FITC定位的代表性荧光显微图像显示(b)显微切割的上皮层和(c)横切面冷冻切片的气管节段放大20倍。

图26示出了体外mRNA的支气管镜电喷雾至整个猪肺。与仅缓冲液对照相比，荧光素酶mRNA转染后荧光素酶活性的定量。n＝3。***P＜0.001。

图27是示出了各种参数对眼睛观察到的喷雾模式的影响的表，例如电压、流速、针的规格等。

图28示出了使用书写工具的示例性多孔尖端来测试电喷雾形成的设置。

图29示出了使用77％乙醇在示例性多孔尖端处形成的稳定的锥形喷射模式喷雾。

图30示出了使用两个电源在多孔尖端处的电喷雾形成。

图31示出了在不同电源下，使用77％的乙醇在示例性多孔尖端处的电喷雾形成，所述尖端到板的距离为6mm。

图32示出了在不同电源下，使用77％的乙醇在示例性多孔尖端处的电喷雾形成，所述尖端到板的距离为26mm。

图33示出了在电极板上的电喷雾图案，所述图案分别通过使用多孔尖端进行无喷雾、尖端到板的距离为6mm以及尖端到板的距离为26mm而获得。

图34示出了使用示例性多孔尖端(标准细刷)用100％乙醇进行的电喷雾形成。

图35示出了在4.4kV的去离子水下使用示例性多孔尖端的电喷雾形成，比较了存在电极板和不存在电极板的情况。存在电极板时，会有一条没有羽流的射流韧带。

图36示出了使用示例性多孔尖端的电喷雾形成，该多孔尖端具有0.25％的亚甲基蓝和0.01％的乙酸铵，比较了锁定和断开的脚踏开关。

图37示出了使用具有0.25％亚甲基蓝和1％乙醇的示例性多孔尖端的电喷雾形成。

图38示出了用于测试具有示例性多孔尖端的电喷雾导管的台式装置。(a)台式导管设置，(b)多孔尖端区域的特写，以及(c)支气管镜中的导管。

图39示出了(a)具有示例性多孔尖端的电喷雾导管和(b)对离体通风的猪肺的亚甲基蓝喷雾测试。

图40示出了具有封口膜的示例性电喷雾导管，该封口膜覆盖了多孔尖端的金属罩，并经离体通风的猪肺部测试。

各个附图中相似的参考符号指示相似的元件。

具体实施方式

当前的主题利用带电的喷雾或“电喷雾”将流体，例如燃料，输送到体内组织。输送平台可包括导管，所述导管具有电极或充电元件，其位于导管内靠近导管的远端开口。作为通过导管的流量计的精确体积，电极将电荷传递给流体。当带电的流体到达导管远端开口处的流体/空气界面时，会产生精细的流体电喷雾。因为电极嵌入导管内，所以电极与组织隔离，以防止对患者和/或目标组织产生电危害。当前主题的一些实施方式可以输送少量的流体(例如，在1和10微升之间)，其可以覆盖体内的微观可见区域。受控递送允许更好地靶向组织以进行递送，减少对组织的创伤，并且在组织或封闭区域(例如，血管或内腔)上很小或没有局部压力。

术语“电喷雾”是指这样的过程，其中微小的、受控的和安全量的电荷转移到流体上，以产生非常精细的流体电喷雾。与气雾剂不同，气雾剂是由气体机械地和外部地驱动的，而排斥力则是由内部驱动的电喷雾作用于同样带电的喷雾胶体。电喷雾也比气雾剂更精细，而且速度明显更快。在一些实施方式中，所述装置还采用流体充电方法，以通过将输送平台的任何和所有电极与目标组织和/或患者屏蔽来防止对目标组织的电危害。染料的电喷雾递送的目的可包括在体内区分癌细胞和正常细胞，使得该技术可用于通过对电喷雾后的早期肿瘤上皮变化进行染色来检测气管支气管树内的早期肺癌变化。

图1是根据示例性实施方式的输送平台100的截面图。图1中所示的尺寸和材料是示例性的。输送平台100包括具有近端106和远端107的导管105。在图1以放大图示出了近端106和远端107。导管105具有限定流体通道110的内径。在导管105的远端107处是远端开口115。导线120延伸穿过导管105的长度并在流体通道110内。导线120包括绝缘层122和电极124(例如，导线的暴露部分，也称为充电元件)。电极124(例如，暴露部分或充电元件)在远端开口115附近，但是与开口115间隔开一定距离，以防止电极124与目标组织和/或患者之间直接接触，从而防止对目标组织和/或患者的电气危害。绝缘层可以由尼龙制成。

导电护套125围绕导管105的外部，并且可以接地，例如在近端接地。导电护套125可以接地并且可以充当电极124与患者和/或组织之间的屏蔽。导电护套125可以包括金属编织物，如图1所示。

生物相容性覆盖物130围绕并包围导电护套125的至少一部分。生物相容性覆盖物130可以是光滑且润滑的，以易于通过内腔，例如支气管镜工具通道。生物相容性覆盖物130可以由生物相容性材料形成，例如，聚醚嵌段酰胺(PEBA)。

如图1所示，生物相容性覆盖物130的延伸小于导管的整个长度。特别地，导管105的远端暴露并延伸超过生物相容性覆盖物130。还可以想到的是，导电护套125可以沿着导管105的长度向下延伸得比导线120更长，但是小于在输送平台100的远端处的导管107。这样的配置可以保护患者面授电气危害，同时防止带电流体接地，这将阻止或防止泰勒锥的形成。因此，在输送平台100内使用的能量基本上或全部用于粉碎输送平台100内的流体柱。输送平台100的能量输入和输出没有显着变化，因为能量不旨在传导至身体以供装置工作。

图2是示出了输送系统200的系统框图，所述输送系统200包括输送平台100，所述输送平台100用于将流体，例如燃料，输送至体内组织。输送系统200包括输送平台100，其可以插入支气管镜205中。支气管镜205可以在医疗过程中插入患者的气道或其他内腔。输送平台100通过电射流接头220连接到电源210和泵215。流体，包括输送材料，例如燃料，可以从储存器225供应到泵215。开关，例如脚踏开关230，可以同时启动电源210和泵215。图3是示出示例性电射流接头220的截面图。

再次参考图2，泵215是计量流体供应源，其能够在指定时间内移动精确体积的流体，从而提供精确的流速。(以精确可调的流速输送流体可称为计量。)在示例性实施方式中，泵215可在每次启动时供应1至500微升的流体。例如，泵215可在每次启动时供应1至10微升或5至500微升的流体。在一些实施方式中，泵215每次启动提供4微升的流体。泵215(直接或间接)耦合到导管105，以使流体从泵215流向并通过流体通道110。在一些实施方式中，泵215可以具有高的切换时间，即，快速达到稳态流量并快速终止流量。

电源210是高压低电流电源。源210可以通过导线120直接或间接地电耦合到电极124。电源210还可以提供接地并直接或间接地电耦合至导电护套125，尽管在某些情况下，在一些实施方式中，导电护套125可以经由另一连接部件耦合至地面。在一些实施方式中，电源210能够提供3到10千伏电压，最大电流供应小于25微安但大于160纳安。

在操作中，流体通道可以被流体灌注。支气管镜205可插入患者，例如患者的气道中。然后输送平台100可插入支气管镜205中，并朝向要输送精确体积的流体的目标组织。在启动开关230时，电源210可以将电极124(和导线120)充电到3至10千伏之间。泵215可以将定量的流体提供给流体通道110。电极124在携带电荷时，将电荷传递或传递给通过流体通道110的流体。由于输送平台100的配置，电荷在导管105的远端附近但在流体通道内被施加(与在流体通道外部施加电荷相比)，使得当带电荷的流体到达导管105的远端开口附近的流体/空气界面时，带电的流体形成带电的液滴，其分散并形成泰勒锥。

因此，流体在流体通道内充电(与在流体/空气界面处相比)，并且远端开口保持恒定(例如，远端开口不是喷嘴，其可以机械地调节喷雾特性，如在雾化器中或喷雾剂)。此外，流体的输送高度局部化，并且每次启动可以输送到直径约5mm至50mm的区域，从而限制了流体对非目标组织的暴露并减少了附带和不良影响。此外，已经证明，通过带电喷雾的递送具有优于其他方法的有利性质，以及改善的组织渗透性和对流体和材料的吸收，例如亚甲基蓝染料。图6是比较用于递送分子(例如DNA，siRNA和蛋白质)的载体的性质的表。

在一些实施方式中，电喷雾装置可包括如图38和39所示的多孔尖端，所述多孔尖端在输送平台100的远端107处的流体通道110内。在一些实施方式中，多孔尖端可以由吸收性材料制成，该吸收性材料可以保留流体并且具有足够的多孔性以允许保留的流体通过电场被抽吸通过多孔尖端。在某些实施方案中，基于体积，多孔尖端的孔隙率可在约45％至约70％的范围内。对于非限制性实施例，可以使用毛毡材料、纤维材料或滤纸形成锥形。多孔尖端也可以由柔软的非织造织物制成，该柔软的非织造织物可以吸收液体并且允许保留的液体通过电场被吸出。

如上所述，多孔尖端可包括来自合成纤维的材料，例如基于石油的丙烯酸或丙烯腈；或基于木浆的人造丝。混合纤维也是可能的。例如，多孔尖端可以由一种或多种聚合物形成，例如聚丙烯腈(例如85％或更高的丙烯腈单体)、聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚氯乙烯、合成橡胶、酚醛树脂(或贝克莱特酚醛树脂)、氯丁橡胶、尼龙、硅酮等。

多孔尖端可包括纤维材料，其中纤维束的直径可为1微米至50微米之间。例如，多孔尖端可以包括形成为具有约1微米、约5微米、约10微米、约20微米、约30微米、约40微米或约50微米的直径的股中的纤维材料。

多孔尖端内的孔的尺寸范围可以从0.1微米到100微米或更大。例如，多孔尖端可以包括被布置为形成孔的纤维材料，所述孔的直径为大约0.1微米、大约0.5微米、大约1微米、大约10微米、大约50微米、大约75微米和/或大约100微米。其他尺寸是可能的。

多孔尖端可以形成多种形状，包括锥形。在一些实施方式中，多孔尖端可以呈泰勒锥的形状，这可以改善电喷雾泰勒锥的形成。一般来说，发射器头部的形状可能会影响电喷雾模式。在一些实施方式中，多孔尖端的尺寸为直径在约0.03mm至3mm之间。例如，直径可以是大约0.03mm、大约0.1mm、大约0.5mm、大约1.0mm、大约1.5mm、大约2.0mm、大约2.5mm或大约3.0mm，其中大约为在10％以内。尖端的长度以及因此呈现给样品的总流体阻力会影响非连续馈送应用的最大可实现流速，在非连续馈送应用中，流体通过电场从尖端吸出。对于通过注射泵或恒定压力供应的连续馈送应用，尖端的长度可能影响较小，并且流体可能会被强制通过系统，而不是通过电场抽出。可以选择多孔尖端的孔隙率，以足以促进经由施加的电场通过尖端抽吸流体。

在操作中，多孔尖端可以吸收流体，提供更好的流体处理，并且可以在不需要泵送动作的情况下帮助建立稳定的锥形喷射模式喷雾。此外，如图20(g)，电喷雾装置可包括设置在围绕导管的外表面的导管的远端开口附近的突起2001和包围突起2001的热塑性包裹物2002。当电喷雾导管用于支气管镜205的工作端口时，突起2001和热塑性包裹物可以提供密封和绝缘。

在一些实施方式中，多孔尖端可以抑制、减少和/或消除电喷雾导管的流体通道内的蠕动力的影响，该蠕动力可以导致流体移动通过流体通道。当在过程中移动电喷雾导管时，由流体通道和连接的管道的运动产生的蠕动力会迫使流体通道内的流体向前移动，这可能导致多余的流体或溶液意外地离开导管尖端。通过包括多孔尖端，多孔尖端可以起到抑制或减少从电喷雾导管无意中排出流体的作用。

在一些实施方式中，多孔尖端可以对电喷雾装置的操作参数提供更大的控制和/或灵活性。例如，增加一个多孔尖端可以允许较低的工作电压，同时仍然产生泰勒锥。使用较低的电压可能是有利的，因为输送溶液中的有效载荷可能对高压敏感。因此，多孔尖端有助于维持有效载荷材料的完整性。作为另一个实施例，利用多孔尖端可以降低流速，同时仍然形成泰勒锥。使用较低的流速可能是有利的，因为限制每次启动的流体量对于需要精确地输送流体量的应用(例如，出于治疗目的而输送某些化合物的情况)在临床上可能很重要。而且，较低的流速可能需要较低的电能，例如形成稳定喷雾所需的电压，以及较低的电流，从安全的角度来看这可能是有益的。降低电压的另一种方法是减小发射器到集电器的距离，因为较小的距离可能需要较低的电压。另外，较小的距离可以产生较小的沉积轮廓，因此可以通过缩短发射器和集电器之间的距离来实现更有针对性的沉积。

在一些实施方式中，多孔尖端可以应用于非导管的电喷雾装置和平台。例如，多孔尖端可用于能够在微米、亚微米和纳米范围内生成颗粒的台式电喷雾系统中。作为另一个实施例，多孔尖端可用于将具有有效载荷和渗透剂(例如，乙醇)的溶液喷雾到细胞单层，以用于有效载荷的细胞内递送。在另一示例性实施方式中，多孔尖端可以在质谱仪中使用。其他实施例包括通用表面涂层，例如用于印刷电路板，以及自适应电喷雾，例如(工程水纳米结构)EWNS，用于杀死水果和蔬菜上的微生物。

在一些实施方式中，多孔尖端可以形成有中央轴向通道，该中央轴向通道形成同轴的电喷雾尖端，并应用于药物或细胞封装中。多孔尖端(例如，纤维锥)可包括不同的密度，其中中央通道填充有不同的材料和/或不同密度的纤维材料。在一些实施方式中，多孔尖端可用于静电纺丝，产生纤维而不是液滴。这样的应用可以包括用于局部伤口愈合或通过芯-护套纤维在体内包装药物的输送。在一些实施方式中，多孔尖端可以使导电聚合物能够以纤维的形式输送。静电纺丝同样使用纤维尖端，以改善纤维的一致性，用于储能设备，包括电容器和电池。其他实施方式也是可能的。

尽管上面已经详细描述了一些变体，但是其他修改或添加也是可能的。例如，流体可以包括亚甲基蓝染料(MBD)。所述流体可包含DNA、siRNA和/或蛋白质，其可直接递送至组织。导管105可插入以下中的一种或多种：胃肠道、口腔、中央气道、近端气道、小肠和结肠。流体可被输送至以下一种或多种组织的一部分：肠组织、甲状旁腺、前哨淋巴结、黑色素瘤、口腔组织和小肠组织。

其他实施方式也是可能的。通过实施例和说明的方式，下面描述实施例平台的详细信息及其使用。

亚甲基蓝递送平台和系统的示例性实施方式

在示例性实施方式中，导管105是长度为1350mm的柔性氟化乙烯丙烯(FEP)管，其外径为1.33mm(4French)，内腔为直径0.5mm。导电护套125是编织轴，该编织轴沿导管105的长度延伸，终止于距远端导管尖端50mm的地方。导管105的内腔用作流体通道110并容纳导线120，导线120是0.2032mm(AWG32)的单股银导线，其涂覆有全氟烷氧基(PFA)，最终外径为0.254±0.012mm，形成绝缘层122。导管105的近端106终止于鲁尔锁接头，用于连接到三通射流接头220，以允许PFA涂层导线120与泵215的组合。镀银导体(例如，电极124)自导管105的远端出口115的100mm终止，并且在最后的2mm上未镀银(例如，暴露)以允许与流体的电连接。

示例性输送平台的长度(1350mm)允许支气管镜不受阻碍地进行操作，而没有过度松脱的导管，并且外径为2.0mm，可以轻松地插入支气管镜入口。示例性输送平台的最小弯曲半径为8mm，以允许在支气管镜检查过程中进行操作而不会造成损坏，并且示例性输送平台在超过100个周期内不会因这种严重程度的弯曲而损坏。如果示例性输送平台过度弯曲并发生故障，则染料从内腔的任何泄漏都会被控制以防止给患者和/或操作员带来麻烦。示例性输送平台可在10℃至60℃的温度范围内运行，而性能不会发生变化，并且不适用于高压或低压环境。示例性输送平台的外部光滑且润滑，易于通过支气管镜工具通道。所述示例性输送平台的配置中使用的所有材料均已获得美国食品和药物管理局的许可，可用于II类医疗设备。

图4是示出具有示例性递送平台的递送系统400的示例性实施方式的图片。图14是示出图4中所示的示例性实施方式的组件的图片。图4(a)显示了这些组件的台式设置，图4(b)示出了医疗推车中的示例性实施方式。医用推车可以包括可锁定的防静电脚轮。示例性输送系统400经由带电的喷雾将可调节的、受控量的染料输送至肺部。示例性输送系统400在0至10千瓦之间的电源电压下使用时，不会对操作者或患者造成电击的危险。在使用过程中，在带电喷雾开始之前或终止后，不应在导管末端出现染料。示例性递送系统400可以由单个用户操作，并且可以通过单按脚踏开关装置来激活。操作员踩下脚踏开关与开始电喷雾之间的延迟最小，并且在所有情况下均小于1秒。

示例性递送系统400在50次电喷雾终没有显示滞后现象，从而允许在单一诊断干预中准确地递送重复剂量。所述示例性输送平台旨在在一次诊断干预中输送多达50次电喷雾，停留时间持续不超过20分钟。因此，根据ISO 10993，根据设计分类规则5，示例性输送平台被分类为“有限接触(<24小时)”或“临时使用”。示例性递送平台是一次性的，并且不旨在多个患者中进行重新灭菌或重复使用。

当脚踏开关装置被启动时，银导线通过高压低电流源充电至3到10kV之间，进而对导管内的染料充电。带电的染料通过计量泵输送到导管出口，在导管出口处形成染料/空气界面。染料中的电荷迁移到该界面并互相排斥，直接抵抗表面张力并导致形成称为泰勒锥的锥形扩张。一旦染料带有足够的电荷，泰勒锥便会在其顶点处洗脱，形成一束带电的液滴，这些液滴彼此分离并形成羽流分散。图5是示出示例性递送平台中的羽流分散的图片。这种喷射和分散用于将染料输送到肺部，并通过反转分配过程中使用的计量泵将染料抽入导管来终止。

导管组件由氟化乙烯丙烯(FEP)制成，完全符合USP VI级和所有当前的ISO标准，并且完全无细胞毒性、非致热性和无溶血作用。此外，FEP显示出具有良好的颗粒脱落特性，可最大程度地减少肺内潜在的碎屑沉积。导管内的载压导线是全氟烷氧基(PFA)涂层的银，可最大程度地提高生物相容性。

在图4所示的实施例中，包括以下组件：

1)计量染料分配系统，能够精确输送剂量体积；

-IVEK有限公司DigiSpense 3020执行器和控制器；或带有v5软件的Smiths/>3500注射泵；

-Beckton Dickinson-无菌一次性注射器60ml Plastilok，带有50mm鲁尔锁

2)用于流体充电的超低电流，高压直流电源；

-Spraybase/Spellman有限公司；

3)脚踏开关开始输送；

-Schaltgeraete GmbH&Co.KG。

4)医用管

-Smiths医疗无菌扩展套件。

以下示出了用于准备患者的示例性过程。

1.在开始之前，在中等镇静状态下，验证患者是否适合进行支气管镜检查。

2.为患者准备支气管镜检查。根据人员配备、培训以及针对支气管镜检查的各个机构的检查政策和指南，遵循患者管理规程。

3.通过鼻子或嘴适当地引入柔性支气管镜。

4.将支气管镜导航到目标部位，定位支气管镜使目标部位处于支气管镜视图中。

5.用0.9％生理盐水(+/-粘液溶解剂)冲洗气道，并抽吸清除任何粘液或分泌物。

下面示出了使用示例性递送平台和系统的示例性过程。

1.在将导管插入支气管镜之前，确保已从远端移除保护套

2.使导管穿过支气管镜，直到在支气管镜下看到导管轴远端的标记带(marketband)。如果装置在插入过程中遇到很大阻力，请不要用力过大。在特别弯曲的解剖结构中，可能需要放松支气管镜的偏转机制，直到装置顺利通过为止。

3.将导管移至支气管镜下的目标部位。不要将导管推入支气管镜下看不到导管的支气管中。在这种情况下推进导管可能会导致气胸或对患者造成其他伤害。

4.切勿在导管伸出支气管镜远端的情况下重新放置支气管镜，因为这可能会对患者造成伤害。

5.将导管放置在气道中靠近目标区域的位置。避免用导管末端接触支气管壁，因为这可能会损害导管功能。

6.按下并释放脚踏开关一次，将亚甲基蓝输送至目标区域。控制模块将根据预设的时间、电压和电流参数自动提供能量。

7.一旦完成该过程并且在操作支气管镜之前，将导管抽出支气管镜大约10cm，使电极阵列靠近支气管镜远端的弯曲处。

8.治疗完成后，从支气管镜中取出导管。断开导管与控制器的连接，并按照生物危害程序处置用过的导管。

如果粘液在气道中积聚并使视觉模糊，请从支气管镜中取出导管，用无菌生理盐水冲洗，然后从气道中抽吸产生的液体。如果没有喷出喷雾，请从支气管镜中取出导管。用干燥的无菌棉签清洁导管的远端。确认导管已灌注，并按下脚踏开关以目测确认导管功能正常。如果无法正常工作，请更换导管并继续执行该步骤。

实验1-体外和体内大型动物

离体

临床前研究使用的是新鲜切除的猪肺的离体模型。使用与Bench研究相同的流体和电源设备，将0.05％的亚甲基蓝溶液通过电喷雾输送到肺内的不同部位，包括大小气道。图7包括两个图像，分别显示了通过滴液(左)和电喷雾(右)施加亚甲基蓝染色的猪气管，电喷雾的染料使组织染色，而滴注染色很容易被洗掉，显示出电喷雾是将染料递送到细胞中的可行载体。

通过将不同浓度的亚甲基蓝电喷雾到正常猪肺和解剖的气道组织上来进行剂量反应。电喷雾到分离的猪气道组织上时产生最小染色的亚甲基蓝浓度是WFI中的0.03-0.05％亚甲基蓝。

动物研究期间评估的标准如下：火花的形成，电喷雾液滴的大小，对操作员的电感觉/电击，支气管镜/导管粘液的污染的影响，导管与目标的距离的影响，目标区域的特异性，脚踏开关启动后电喷雾的延迟，在相同条件下电喷雾的可重复性。

该装置的主要功能是通过电喷雾在肺和气道内安全地粉碎或雾化少量流体。进行了消除或减轻风险的计算，并确保产生电喷雾。通过实验证实了有关电喷雾羽流的计算。相对于与标准视频支气管镜一起使用的要求，进行了有关设备外形尺寸的计算。在设计该装置时，通过实验验证了一些计算结果，并且通过计算归纳了一些实验获得的电喷雾参数。

(i)计算导管材料的介电常数，以便在所有情况下使中心导体与患者和操作员隔离。

(ii)计算在导管轴的整个长度上编织的接地屏蔽的长度(1250mm)

(iii)计算最小静容积以确定泵的灌注体积(960uL)

(iv)计算理想的kV伏特值，以使用选定的流体(通常为亚甲基蓝)从装置产生电喷雾。(4.5千伏)

(v)计算整个导管的理想长度。(1350毫米)

(vi)计算导管的最小弯曲半径(8mm)

(vii)计算导管的最大宽度(2mm)(～6French)

(viii)使用泰勒/梅尔彻模型(160nA)计算/预测产生电喷雾所需的最大电流

(ix)必须计算分配时间和体积流速，以在最短时间内输送剂量。该计算的限制条件包括最大流速以保持最佳的喷雾模式。

(200uL/分钟)

体外试验目的：进行体外试验，其中将新鲜分离的猪气道组织离体用亚甲基蓝电喷雾。这些测试的目的是：(i)确定亚甲基蓝能够成功电喷雾的参数；(ii)进行剂量反应，观察在一定范围的亚甲基蓝浓度下产生的染色现象；以及(iii)优化通过电喷雾将亚甲基蓝输送到正常气道组织上的方案，以使染色最少。

方法：切下约1cm²的气道组织切片，并放入组织培养板中。配制一定浓度范围的亚甲基蓝溶液(0.008％、0.015％、0.031％、0.04％、0.05％、0.063％)并将其电喷雾到分离的气道组织上。为了确定哪一组条件有利于产生稳定的电喷雾，在电喷雾过程中改变电压和流速。漂洗之前，将染料留在组织上的时间长度有所不同(15、30、60秒)。喷雾后，用盐溶液冲洗组织，以观察喷雾后组织的染色强度。

结果：确定了参数(电压和流速)，在该参数下，亚甲基蓝可以在体外成功地电喷雾到猪气道组织上。剂量反应研究确定，在15秒的最短培养时间内可观察到染色的最低浓度为0.05％亚甲基蓝。浓度低于0.05％时，在15秒的时间点未观察到染色。

结论：通过改变使用的电压和流速，可以成功地对多种亚甲基蓝浓度进行电喷雾。0.05％的亚甲基蓝溶液似乎是截止水平，低于此水平，正常气道组织在15秒的最短培养时间内看不到染色。这一时间被认为与临床从输送染料到冲洗所需的时间相似。

机械和电气实验：建立了电气测量电路以在设计阶段执行实验测量。测试的参数包括：

(1)中心导体电势(4.5kV)；

(2)从洗脱点到沉积基质/组织的电喷雾羽流内的潜在(反向)梯度(>5kV/mm)；

(3)电流(离子电流+流体胶体上的电荷)(50nA+100nA)；

(4)绝缘介质耐压测试(PFA、FEP)(>80kV/mm)；

(5)泄漏电流以及防护和屏蔽效果实验(<<噪声层)；和

(6)装置产生的电流：

a.外部偏置电流(<<噪声层)；

b.摩擦电效应(<<噪声层)；

C.压电(<<噪声层)和存储的电荷效应(能量包括HV的先断后接地，产生～0的存储电荷效应)。

使用静电计(Keithley 6517B型)进行一系列测试，以确定装置的特性。在通电过程中，沿着导管的外部轴，流体或电气连接均未检测到泄漏电流。在8mm的弯曲半径上进行了机械弯曲测试(100个周期)，以目测/显微镜检查对研究性导管装置的机械磨损。没有观察到磨损。

所述的试验装置用于离体猪肺模型。所述装置与Olympus EVIS Exera BF-1T160支气管镜配合使用，实验目的是向近端猪气道中的不同区域可靠地提供10次重复的20uL喷雾。

将数据记录在示波器的视频卡上，并进行了重复管理。将实验重复20次，包括连续几天。

性能测试。通过IVEK Digispense 3020计量输送系统输送0.05％亚甲基蓝溶液对样机进行测试，并通过控制单元实现高压供电。高压电源可用电涌保护器保护以防止产生火花，控制单元可装有静电计。在Olympus EVIS Exera BF-1T160支气管镜内以0至10kV的电压测试了导管装置的电喷雾形成。在测试过程中，评估标准如下：火花的形成、电喷雾液滴的大小、对操作员的电感应/电击、支气管镜/导管被润滑剂污染的影响、导管尖端与电喷雾目标之间的分离作用、脚踏开关启动后电喷雾的延迟等。

电喷雾递送0.05％的亚甲基蓝溶液的最佳参数是6kV电压、10μl/秒的递送速率和从装置到目标区域的21mm距离。施加的6kV电压是实现10μl亚甲基蓝的扩散电喷雾递送所需的最小电压。在进行的测试中，对10mm和21mm的距离进行了评估，并且都使用0.05％的亚甲基蓝溶液进行了类似的电喷雾。然而，从大型动物研究中确定21mm的距离是体内将亚甲基蓝靶向递送至气道壁的最佳工作距离。

生物安全性评估。该示例性递送平台被设计为在内窥镜检查过程中进入肺，并与肺的粘膜接触<24小时。因此，建议按照ISO 10993推荐的对受限接触装置进行生物相容性测试。导管组件由氟化乙烯丙烯(FEP)制成，完全符合USP VI级和所有现行的ISO标准，并且完全无细胞毒性、非致热性和无溶血作用。此外，显示FEP具有出色的颗粒脱落特性，可最大程度地减少肺内潜在的碎屑沉积。导管内的载压导线是全氟烷氧基(PFA)涂层的银，可最大程度地提高生物相容性。

体内

将十六(16)头正常的猪用作急性大型动物模型，以证实装置设计的体内有效性。每头猪接受3次亚甲基蓝喷雾，每次喷雾持续1秒。

在原理研究证明中，示例性递送平台已成功用于向猪气道递送染料-亚甲基蓝。随后，进行体内实验。这些实验涉及接受了支气管镜检查的麻醉的猪。这种支气管镜检查使研究人员能够检查表面解剖结构，收集支气管肺泡液和电喷雾亚甲基蓝的样品。电喷雾施用亚甲基蓝4天后，在气道外观或支气管肺泡灌洗结果中均未发现不良反应。

选择模型的理由。这个广泛项目的目的是将技术转化为肺癌的“首例”诊断。对于这项工作，由于多种原因，不可能使用大型的肺癌动物模型。一般来说，动物中自发性肺癌的发生率较低。Jaagsiekte绵羊逆转录病毒(JSRV)是一种引起绵羊传染性肺肿瘤的病原体，而这种病原体在爱尔兰没有发现。与兽医协商后发现，获得狗主人许可使用患有肺癌的狗的可能性极低。用化学物质诱发的肺癌的小型实验动物模型不适用于这些支气管镜检查研究。因此，正常猪或绵羊是该项目大型动物模型的选择，以证实装置设计的体内安全性和有效性。之所以选择猪作为模型，是因为与绵羊不同，全年都有特定大小的幼畜可供选择，以确保模型的一致性。

研究目标。体内大型动物研究的目的是：

(i)证实该装置对临床医生的实用性；

(ii)确定该装置在体内将染料直接递送到大型动物气道中特定部位(即靶向递送)的有效性；

(iii)基于正常呼吸道的以下特征，选择适合用作肿瘤鉴别染色剂的染料：

-在目标区域上的期望扩展性；

-冲洗后目标区域的残留染色极少；

(iv)设计一种方案，以使非肿瘤区域的染色最小；

(v)进一步完善装置的设计，以优化协议；

结论：

(i)证明该装置对临床医生的实用性

-临床医生直接参与了所有研究，并提供反馈意见，以改进装置和染料输送方案

(ii)确定该装置在体内将染料直接递送到大型动物气道中特定部位(即靶向递送)的有效性；

-证实了该装置能够将染料直接递送到有生命和呼吸的大型动物的气道内的特定部位，而不会因空气流动而遇到任何困难。

(iii)基于正常呼吸道的以下特征，选择适合用作肿瘤鉴别染色剂的染料：

在目标区域上的理想扩散性-目标区域的最小残留染色在冲洗后得到确认

(iv)设计一种方案，以使非肿瘤区域的染色最小；

设计了一个协议

(v)进一步完善装置的设计，以优化协议；

在一系列动物研究中，该装置都以迭代的方式进一步完善。

改进措施包括：

去除远端2.4mm的塑料护套，该护套延伸超出导管尖端5mm，因为这会导致染料在护套的内半径和导管尖端之间汇聚。去除塑料护套解决了这个问题。

引入接地的编织轴，延长了导管的长度，并在距离导管尖端50mm处结束，以加固和保护导管轴，并在绝缘故障的情况下保护患者免受中心导体的伤害。

在导管尖端使用较软的塑料，以减少局部肺部损伤的风险。

在距尖端10mm处引入标记带，以帮助操作人员定位导管相对于范围端部的推进距离。

将内部流体通道内腔的直径从800微米减小到500微米。由于支气管镜弯曲，减小的内径使局部蠕动流量最小化。这样的流动既不明显也不成问题。

实验2-体外人类肺组织(切除的人类肺肿瘤)

在Mater Misericordiae大学医院进行了使用离体人类肺癌组织的进一步研究。结论是在正常组织和肺癌之间获得差异性亚甲基蓝染色。本研究于2012年4月至2013年7月期间招募了11名患者。这些患者已确诊为肺癌，并通过外科手术切除了肿瘤(肺叶切除术)。胸腔手术后，对不需要诊断的健康组织和癌组织切片进行评估。这样可以确定亚甲基蓝的最佳浓度范围，该浓度范围将在肺癌和正常组织之间获得差异性染色(使用电喷雾时)。

电喷雾到人肺癌组织上时能产生最佳差异性染色的亚甲基蓝浓度在WFI中为0.03-0.05％亚甲基蓝。

表征电喷雾中的亚甲基蓝

在示例性递送平台和系统中使用的电喷雾技术发现了它的第一个也是最广泛的应用，是在质谱法中产生离子的一种手段(Santos LS，在反应中间体中电喷雾质谱法涉及的机理的简要概述：溶液中的质谱研究，2009年，Wiley-VCH Verlag GmbH&Co.和Le Gac S，范登伯格A，微型化和质谱学，S，2008，RCS出版)。电喷雾电离(ESI)被定义为一种软电离技术，因为它可用于电离大分子(例如聚合物、蛋白质、多肽和核酸等)而不会使其破碎。在电离过程中，分子获得了足够的能量以转移到气相中，但是能量仍然很低，不会引起任何碎裂。

亚甲基蓝染料已在许多研究中进行了ESI研究，许多出版物报道了亚甲基蓝的ESI质谱图(杨F，夏S，刘Z，陈J，林Y，邱B&陈B，毛细管电泳/电喷雾电离质谱法分析血液中的亚甲基蓝及其代谢物，电泳2011，32，659-664和Nogueiraa F，Lopesa JH，Silvaa AC，Goncalvesa M，Anastacioa AS，Sapagb K，Oliveira L，通过ESI-MS研究在蒙脱石上反应吸附亚甲基蓝，应用粘土科学，2009，43(2)，190-195)。为了验证电喷雾技术不会改变亚甲基蓝的化学结构，进行了紫外可见光谱和1H NMR(核磁共振)分析。

紫外可见光谱分析。据默克指数报道，亚甲基蓝在668和609nm处有吸收峰。比较了电喷雾前后亚甲基蓝样品的吸光度分布。根据比尔-朗伯定律，吸收强度与浓度成正比。如果亚甲基蓝通过电喷雾工艺降解，则其在668和609nm处的吸收曲线将相对于相同的亚甲基蓝样品在电喷雾之前的吸光度发生变化。

图8所示的光谱证明了在电喷雾过程之前和之后对于亚甲基蓝记录的光谱的良好覆盖，表明染料的化学结构的变化可忽略不计或没有变化。在图8中，在电喷雾之前(-)和之后(-，-)，可见光光谱为0.05％的亚甲基蓝溶液。电喷雾设置：距离发射器-集电器3.5cm，向发射器施加6.5kV电压，流速0.5ml/min。插图中的图表示光谱的放大倍数。

作为参考，图9显示了在公开访问的在线科学期刊《科学报告》上刊登的一张图表(刘H，高N，廖M&方X，六角形Nb205高性能的基于纳米板的光电探测器和光催化剂，2015年1月12日，《科学报告》5：7716，DOI 10.1038/srep07716)显示了亚甲基蓝的降解。图9示出了亚甲基蓝的光催化分解。通过紫外-可见光谱监测亚甲基蓝随时间的降解。黑色痕迹表示未经处理的亚甲基蓝样品。着色痕迹的较低吸收强度是由于暴露于降解剂Nb205不同时间的染料分解所致。

图10示出了电喷雾之前和之后的亚甲基蓝的1H NMR光谱。核磁共振技术是评估材料纯度的非常灵敏的技术，因为它能够检测非常少量的杂质。在这种特定情况下，如果由于目标化合物的降解而在不同的化学环境中存在质子，则会出现其他峰。由图10可知，两个样品的峰具有相同的多重性和化学位移。这一特征以及在喷雾样品中不存在新峰的情况表明，在电喷雾过程中保留了亚甲基蓝的结构。在图10中，电喷雾0.06％亚甲基蓝和0.06％亚甲基蓝的1H NMR。电喷雾设置：距离发射器/集电器3.5cm，向发射器施加6.5kV电压，流速0.5ml/min。注意：使用丙酮冲洗仪器的管道，以除去因丙酮而导致管线处于2.2ppm的水的痕迹。

结论：所述示例性递送平台和系统是基于电喷雾技术的，这是一种使材料离子化的柔和技术。根据上面的数据，UV-Vis和1H NMR光谱提供了这一过程不会改变或降解亚甲基蓝的证据。

亚甲基蓝和肺癌诊断

亚甲基蓝作为染料和染色剂广泛应用于临床。亚甲基蓝输注被认为是一种安全有效的定位异常甲状旁腺的方法。对于乳腺癌患者前哨淋巴结定位，亚甲基蓝是异硫丹蓝染料的一种有效且便宜的替代品。亚甲基蓝染色技术最初于1933年由日本研究人员提出，用于提高早期胃癌的诊断。如今，在内窥镜检查期间用亚甲基蓝进行肠胃病学染色是一种行之有效的方法，可以高度特异性地预测肿瘤性和非肿瘤性病变。亚甲基蓝染色也用于黑色素瘤和口腔癌的非侵入性诊断。与其他类型的癌症相比，肺癌的预后仍然很差，尽管灵活的支气管镜对各种肺部疾病的诊断价值已得到公认，但白光支气管镜(彩色支气管镜)检查过程中的染色到目前为止尚未被纳入肺内镜的诊断范围。关于亚甲基蓝染色以前瞻性方式鉴定恶性和恶变前病变的功效，已经报道了三项研究，但结果混杂。所有三组均未报告不良安全性结果，并建议在支气管镜检查下对肺部疾病进行进一步研究。下面将讨论亚甲基蓝在癌症诊断中的临床应用、建议的作用机理和安全性。

用于癌症诊断的重要染色

有许多可用于癌症诊断的诊断辅助工具。细胞学方法、组织染色技术和分子方法被广泛应用。在恶性病变的早期诊断中，超活体染色(supravital staining)一直被用作辅助手段。在20世纪20/30年代，席勒(Schiller，W.宫颈癌的早期诊断，妇科医生，Obstet，56(1933)。210)首次报道了卢戈尔碘溶液在宫颈癌中的用途。在阴道镜检查中，体内染色已广泛应用于检测宫颈的恶性变化。该技术已经在口腔环境中应用了30多年，主要应用于甲苯胺蓝(TB)染色(Kerawala CJ，Beale V，Reed M，Martin IC，活体组织染色在口腔鳞状细胞癌边缘控制中的作用，Int J Oral Maxillofac Surg，2000；29：32-5)。除结核病外，还尝试了其他染色剂，例如亚甲基蓝、卢戈尔碘和乙酸，用于诊断癌性病变。

亚甲基蓝属于吩噻嗪化合物家族。它是一种阳离子物种，是碱性染料(图11)。亚甲基蓝被广泛用作染料或染色剂，以使某些体液和组织在外科手术或X射线或其他诊断检查中更易于观察。图11示出了建议的亚甲基蓝的结构。A和B中所示的两种结构均已针对MB+提出；然而大多数化学家都认为MB+的结构是结构A。

亚甲基蓝在癌症诊断中的临床应用

巴雷特食管

巴雷特食管(Barrett’s oesophagus)被认为是一种癌前病变，在接受上消化道(GI)内镜检查以发现胃食管反流病(GORD)症状的患者中占10-20％。正常的鳞状上皮被一种特殊的柱状上皮所代替，称为肠上皮化生。肠上皮化生可以按照明确的化生-不典型增生-癌序列演变为腺癌。高度不典型增生或恶性的巴雷特食管与亚甲基蓝有不同的染色。异质性增加和亚甲基蓝染色强度降低是高度不典型增生和/或癌症的显著独立预测因子(Canto MI，Setrakian S，Willis JE，Chak A，Petras RE，Sivak MV，发育不良和非发育异常的巴雷特食管的亚甲基蓝染色：体内和离体研究，内窥镜检查，2001 5月；33(5)：391-400)。据报道，靶向活检可能会受到限制，因为亚甲基蓝只能染色非增生性巴雷特氏粘膜，而不染色增生性巴雷特氏粘膜。然而，许多补充研究并未同意这一建议(Amano Y.Nihon Rinsho，内窥镜诊断巴雷特食管，2005年8月；63(8)：1416-9)。有关巴雷特食管中的内窥镜检查的视频，请参阅Dave Project 2004(http://daveproject.org/esophagus-chromoendoscopy- of-barretts-ep ithelium/2004-01-15/)。

肠癌监测

IBD的肿瘤性病变可能表现为散发性腺瘤、腺瘤样肿块(ALM)、异常增生相关的病变或肿块(DALM)、低度和高度异常增生或腺癌。内窥镜检查是用于更好地定义浅表胃肠道粘膜的最古老的方法。它利用了生物相容性着色剂，该着色剂在标准白光内窥镜检查过程中通过专门的喷雾导管或水冲洗系统局部施用于粘膜。使用不同的染色剂，并将其分类为吸收剂或造影剂。吸收剂包括亚甲基蓝(0.1-0.5％)和甲酚紫(0.2％)。它们通过利用不同程度的活性粘膜染色吸收来增强病变的表层结构，从而证明了不同的细胞类型。例如靛蓝胭脂红(0.2-0.4％)之类的造影剂通过染料在结肠隐窝之间的凹槽中以及在结肠息肉的凹坑和隆起中的聚集而突出了这种结构。

使用亚甲基蓝作为重要染色剂的染色内窥镜检查包括小肠和结肠上皮对染料的主动粘膜吸收(Trivedi PJ，Braden B，染色内窥镜的适应症、染色剂和技术，QMJ，DOI：http：//dx.doi.org/10.1093/qjmed/hcsl86首次在线发布：2012年10月24日)。染色不被非吸收性粘膜如鳞状或胃上皮吸收。靶向活检应针对异质染色或未染色区域，因为高度不典型增生(HGD)和早期癌症由于杯状细胞丢失和细胞质减少而使染料吸收程度较低。

亚甲基蓝染色内窥镜检查要求事先从粘膜表面去除粘液，以确保上消化道上皮细胞对染料的均匀吸收。这可以通过在施加0.5％的亚甲基蓝之前，将10％的N-乙酰半胱氨酸溶液作为粘液溶解剂喷雾到粘膜表面上来获得。用清水仔细地冲洗掉多于的染料，直到染色图案稳定为止。

泛结肠染料染色时，一次喷洒并评估20-30cm结肠段。使用喷雾导管将稍低浓度(0.1％)的亚甲基蓝涂在结肠粘膜上。在约1分钟的染色时间后，通过抽吸去除过多的染料。有关溃疡性结肠炎的内窥镜检查视频，请参阅(DNATube)。

在关于炎症性肠病的异常增生的监视和管理的国际共识声明中，(Laine，L.，Kaltenbach，T.，Barkun，A.，McQuaid，K.，SCENIC关于炎症性肠病的异常增生的监视和管理的国际共识声明，胃肠道内窥镜检查，2015；81(3)：489)，作者讨论了涉及将染料应用于结肠粘膜的染色内窥镜检查，从而提供对比度增强以改善上皮表面细节的可视化。亚甲基蓝和靛蓝胭脂红被认为是最常用的药物，并通过导管或结肠镜活检或喷水通道(部分)应用于结肠粘膜。据称息肉样病变更容易发现。一旦发现可疑病变，就直接从60毫升注射器中通过活检通道选择性地向该区域喷洒更浓的染料(靛蓝胭脂红0.13％或亚甲基蓝0.2％)。共识声明建议使用以下剂量的亚甲基蓝：250ml的0.04 -0.1％MB用于一般检查(喷水)，如果发现任何可疑的病变，则进一步30ml 0.2％MB(用于注射器喷雾应用)。

染色异常的甲状旁腺

亚甲基蓝染色异常的甲状旁腺。然而，据报道假阳性染色发生在正常的甲状旁腺、淋巴结、甲状腺组织、胸腺囊肿和脂肪组织中。亚甲基蓝已被证明是有效的，增大的甲状旁腺染色率接近100％(Patel HP，Chadwick DR，Harrison BJ，Balasubramanian SP，在甲状旁腺手术中静脉注射亚甲基蓝的系统评价，Br J Surg，2012年10月；99(10)：1345-51)。

甲状旁腺对亚甲基蓝染色的机制尚不清楚，但是一般来说，噻嗪类染料(亚甲基蓝、甲苯二甲蓝、硫氨酸、天青A)一般优先在人体的某些组织中使用，并以不同的速率清除。这种染色似乎确实与甲状旁腺的大小有关，并且主细胞和嗜氧细胞都容易被染色，但是新陈代谢活动或脂肪含量不足或两者都是可能的因素(Orloff LA，亚甲基蓝和西司他比：甲状旁腺定位的辅助工具，喉镜，2001年11月；11(Ptl)：1901-4)。

感知节点映射

前哨淋巴结是原发肿瘤引流淋巴液时遇到的第一个淋巴结。术中单独或联合使用活体染料或淋巴显像术可实现对前哨淋巴结的检测。这些方法取决于在乳房和腋窝淋巴管中是否携带活体染料(专利蓝V、异硫丹蓝或亚甲基蓝)和/或放射性纳米胶体(例如，纳米胶体中的锝-99m)。每种定位剂的吸收动力学是不同的，但是两者的功能均是定位前哨淋巴结。有人认为，纳米胶体通过其微粒大小的函数(纳米胶体的较大流体动力学直径为50-100nm，需要通常超过1h的传递时间)而陷于前哨淋巴结内，或由于白细胞吞噬作用而迁移至并保留在引流淋巴结内。这些包裹过程不可能相互排斥，也可能存在其他机制，但是最终结果是纳米胶体在前哨淋巴结内的定位，而不是扩散至次级淋巴结。相反，专利蓝染料与间质白蛋白结合并被局部淋巴组织吸收。活性染料将淋巴管转化为亮蓝色通道的效率反映出它们较小的流体动力学直径、快速分散的能力，甚至易于穿过前哨淋巴结而前进的能力。

黑色素瘤

众所周知，亚甲基蓝对黑色素具有很高的亲和力，黑色素是存在于黑色素瘤细胞中的一种色素(Sobal G，Rodrigues M，Sinzinger H.，放射性碘亚甲基蓝——一种有前途的黑色素瘤闪烁显像剂：标记、稳定性和黑色素瘤细胞的体温吸收，抗癌研究28：3691-3696(2008)。亚甲基蓝与黑色素形成一种强烈的复合物，可能提供向黑色素瘤细胞选择性递送放射性核素的方法，可用于非侵入性诊断以及散播疾病的治疗。亚甲基蓝对肿瘤没有直接毒性，并在黑色素瘤组织中积累，显示出高浓度的黑色素，这一事实允许使用合适的放射性核素对肿瘤成像。

口腔癌

大多数口腔恶性肿瘤是鳞状细胞癌。许多OSCC是由癌前病变和口腔状况引起的。上皮组织摄取亚甲基蓝的确切机制可能类似于甲苯胺蓝，表现为有异常核酸浓度的细胞的嗜酸特性，导致正常/良性和高度增生/恶性细胞之间的差异摄取。

定期对口腔进行临床检查是早期发现口腔癌的主要手段。研究表明，高危人群中，它可将口腔癌死亡率降低32％。另外，使用辅助剂如甲苯胺蓝(也称为氯托洛宁)以提高大规模筛查口腔癌诊断的有效性。但是，如果吞咽会很危险，并且被证明对成纤维细胞有毒性。亚甲基蓝具有与甲苯胺蓝相似的化学结构，并具有相似的理化性质，但对人体的毒性较小。在评估口腔恶性或癌前病变中，以亚甲基蓝作为诊断佐剂的体内染色的敏感性和可靠性已得到评估，并且在以社区为基础的大型口腔癌筛查中，亚甲基蓝已被证明是有用的诊断佐剂针对高风险个人的计划(Ya-Wei Chen,Jiun-Sheng Lin,Cheng-Hsien Wu,Man-TienLui,Shou-Yen Kao,Yao Fong，亚甲基蓝体内染色技术在口腔鳞癌及癌前病变早期检测和筛查中的应用，中国医学协会，2007，70:497-503)。

在此过程中，用纱布和强力空气喷雾将目标区域的粘膜轻轻擦干，以确保病变不被唾液污染。染料(1％亚甲基蓝)首先在棉球的帮助下直接用于病变部位，然后用作漱口水。患者用1％亚甲基蓝漱口30秒；然后排痰。然后，患者再次用1％乳酸冲洗30秒，以洗去多余的染料。通过在病灶上的染色保持力的强度来评估染料保持的规律(图12)(Riaz A，Shreedhar B，Kamboj M和Nataarajan S，亚甲基蓝，作为口腔癌前病变和癌症的早期诊断指标，SpringerPlus 2013，2:95doi：10.1186/2193-1801-2-95)。

肺癌

已发表3篇关于在支气管镜检查中使用亚甲基蓝作为潜在的肺癌诊断工具的报道。这些结果是相互矛盾的，20世纪80年代的2个病例系列报告了潜在的益处，而最近的一项研究未能证实这些先前的结果。

支气管镜在支气管肿瘤诊断中的应用(Ovvhinnikov AA，Dianov VV，LukomoskyGI，支气管镜在支气管肿瘤诊断中的应用，内窥镜检查，1980；12:147-150)

方案：使用Friedel支气管镜在全身麻醉下进行刚性支气管镜。将要染色的支气管区域用5％碳酸钠(或生理盐水)和未指定体积的胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶洗涤两次。使用支气管镜雾化器将2ml的0.2-0.4％亚甲基蓝溶液输送到目标区域。1分钟后，用生理盐水冲洗该区域。然后对染色区域进行拍照和活组织检查。

结果：140名患者被纳入研究。根据活检结果，有76例患者被诊断为非小细胞肺癌(NSCLC)。在所有76名肺癌患者中，报告出了亚甲基蓝可选择性地染色肺癌。这种染色被描述为“深蓝色”，“与未受影响区域的粉红色粘膜形成鲜明对比”。鳞状细胞癌被认为比其他形式的NSCLC染色更强烈。良性支气管肿瘤未染色。16/60无癌症的患者被亚甲基蓝染色，但这被描述为“强度不如肺癌”。这些假阳性结果发生在感染性或炎症性疾病患者中(活检结果显示这些患者中有10/16发生了化生改变)。

光纤支气管镜的活体染色(Varoli F，Mariani C，Fasceanella A，Cosentino F，光纤支气管镜的活体染色，内窥镜检查，1986；18:142 -143.)

方案：清醒镇静下的柔性支气管镜检查。支气管树的目标区域用粘液溶解溶液(盐酸氨溴索)、5％碳酸钠和生理盐水洗涤。使用喷雾导管将未指定体积的0.7％亚甲基蓝或0.5％甲苯胺蓝施加到目标区域。1分钟后，用生理盐水洗涤目标区域。活检取自视觉识别的外生性肿瘤，无论是否染色，以及视觉正常粘膜的染色区域。

结果：28名患者被纳入研究。亚甲基蓝用于18例。在21例患者的支气管镜检查过程中目视确认了肺癌，并经活检证实。在17/21例中报告了肺癌的选择性染色。在这些患者中有6名在视觉正常区域中发现了其他“轻微”染色区域。活检显示鳞状上皮化生(5/6例)和严重的异型增生。在没有外生性肿瘤生长的7/28位患者中，有4位患者显示阳性染色。这些区域的活检显示表皮样癌(1/4)和鳞状上皮化生(3/4)。鳞状化生区域的染色被描述为“强度不如肿瘤区域”。

亚甲基蓝辅助在柔性支气管镜检查过程中对中央气道进行体内染色(Zirlik S，Hildner KM，Neurath MF，Fuchs FS，亚甲基蓝辅助在柔性支气管镜检查过程中对体内气道的染色，科学世界杂志，2012；2012:625867，doi：10.1100/2012/625867)

方案：清醒镇静下的柔性支气管镜检查。使用白光支气管镜检查气管支气管树，以识别异常粘膜的宏观区域。在施加亚甲基蓝之前，用5ml的5％乙酰半胱氨酸(粘液溶解)、10ml的0.9％氯化钠和抽吸分泌物来制备气道。然后使用喷雾导管施用10ml的0.1％亚甲基蓝。1分钟后，用生理盐水洗涤目标区域。活检取材于被限制或明显吸收染料的区域，以及在白光支气管镜检查中被鉴定为可能是恶性的区域。

结果：26例患者被纳入本研究。在所有患者中，均注意到整个支气管树的微弱的、非特异性染色。在白光支气管镜检查中可见的11例外生性肺癌患者中，未报告有优先的亚甲基蓝染色。这项研究报告显示，在通过肺活检诊断出患有癌症的19名患者中，只有1名发现了亚甲基蓝的大量摄入。在1例中，正常粘膜被染成蓝色，但肺癌仍未染色。在所有患者中，在支气管镜检查或24小时的随访期间均未发生染色过程的副作用。

亚甲基蓝活体染色：建议的作用机制

亚甲基蓝在几种诊断情况下用作对比染色剂。在某些组织中，亚甲基蓝染色正常上皮，但不染色化生/癌细胞；而在其他组织中，亚甲基蓝不染色正常上皮，但染色化生/癌细胞(Fennerty MB，Sampliner RE，McGee DL，Hixon LJ，Garewal HS，通过选择性粘膜染色技术鉴定胃的肠上皮化生，Gastrointest Endosc1992；38：696-698和Fennerty MB，组织染色，北美临床Gastrointest Endosc 1994；4：297-311)。例如，通过主动吸收诸如小肠和结肠上皮的组织来吸收亚甲基蓝。它已被用来突出小肠(例如腹腔疾病)和结肠(扁平腺瘤和癌)的粘膜的细微变化。它不会染色非吸收性上皮，例如鳞状或胃粘膜。因此，它可以在阳性染色的十二指肠粘膜的背景下对胃中的增生性吸收性上皮(例如肠型上皮化生)染色阳性，或者对不吸收性的上皮(例如异位胃上皮化生)染色。

因此，正常上皮的亚甲基蓝染色归因于某些组织中正常的活性吸收过程，并且与化生/癌细胞的对比是明显的，而相比而言，化生/癌细胞似乎是未染色的。在不完全吸收组织的组织中，例如口腔和气道上皮，亚甲基蓝不会染色正常的上皮。亚甲基蓝染色这些组织中的化生/癌细胞的机制尚不完全清楚。当癌细胞膜中发生细胞膜结构改变时，亚甲基蓝可进入细胞。或者，在核酸浓度异常增加的细胞的嗜酸特性中，上皮细胞摄取亚甲基蓝的机制可能与甲苯胺蓝相似，从而导致正常/良性和高度增生/恶性细胞的摄取差异。Chen和他的同事在2006年发表了一项研究，评估了亚甲基蓝在口腔癌和癌前病变早期检测中的诊断辅助作用(Chen等人，亚甲基蓝在口腔癌和癌前病变早期检测中的诊断辅助作用，英国口腔颌面外科杂志，第45卷，第7期，2007年10月，第590-591页)。灵敏度与使用甲苯胺蓝染色报道的灵敏度相当。阳离子染料通常称为碱性染料，因此用此类染料染色的物质称为嗜碱性。结合碱性染料的物质包括核酸和酸性粘蛋白。带正电荷的亚甲基蓝离子将与组织阴离子结合，例如羧酸、硫酸和磷酸基团。这些基团需要被离子化以结合染料(图13)。

安全性

急性毒性作用：

1.据报道，在人类中，大剂量(500mg)静脉注射会引起恶心、腹痛和胸痛、紫绀、高铁血红蛋白血症、出汗、头晕、头痛和神志不清。

2.亚甲基蓝的皮内和皮下注射可引起皮肤红斑、浅表溃疡和组织坏死。

3.3例报告对亚甲基蓝的过敏反应：

2005年：宫腔内滴注1％亚甲基蓝

2008年:乳房内SLN定位。

2010年:乳房内SLN定位，2ml皮下亚甲基蓝

安全性数据

1.比异硫丹(Lympazurin)安全

Bezu C等人，外科肿瘤学，2011年。

胃肠道肿瘤的SLN定位，Soni M等人，Ann SurgOncol，2009年。

2.预期可安全用于妊娠，胎儿风险最小

Pruthi S等人，Amer J Surg，2011年。

3.亚甲基蓝可安全地用于儿童以区分耳前窦(PASs)和鳃窦和瘘管(BSF)。

Dickson JM等人，耳鼻喉头颈外科杂志，2009年。

不良装置影响

对肺癌等疾病的早期诊断的技术提出了迫切的需求。肺癌仍然是全世界癌症死亡的最大原因。尽管近年来化疗取得了进步，但肺癌仍是全球癌症死亡人数最多的原因。大幅提高生存率的最有效方法是在早期阶段诊断肺癌，这时治疗可能更有效。当前的电喷雾平台可能允许一种新颖的诊断测试，其将提高侵入性测试(支气管双歧)的准确性。

与支气管镜检查有关的标准风险很少见，包括活检部位出血过多，由于镇静作用而导致的低氧水平和心律不齐。有时，患者可能会在手术后抱怨喉咙痛或发烧。

在肺部使用少量局部亚甲基蓝的风险不太可能产生任何明显的副作用，并且在1分钟内已经使用喷雾导管以未指定体积的0.7％亚甲基蓝的剂量将其应用于肺部，未报告不良事件(Zirlik S，Hildner KM，Neurath MF，Fuchs FS，亚甲基蓝辅助在柔性支气管镜检查过程中对中央气道进行体内染色，科学世界杂志，2012；2012:625867.doi：10.1100/2012/625867)。另外，静脉注射亚甲基蓝通常用于治疗高铁血红蛋白症和甲状旁腺手术的视觉辅助。

关于支气管镜电喷雾的风险，这是一种尚未在人体中进行的新颖方法。因此，不良影响是未知的。该平台是一种低能耗系统，被认为与患者风险无关。然而，为了雾化亚甲基蓝，在溶液中施加电流。与此相关的潜在风险包括装置故障、电击、烧伤肺组织和心律失常。

在这项研究中使用的少量局部亚甲基蓝不太可能产生任何明显的副作用，静脉注射亚甲基蓝的副作用包括：

最常见的不良反应是恶心、腹痛和胸痛、头痛、头晕、震颤、焦虑、精神错乱、呼吸困难、心动过速、高血压、血红蛋白血症和多汗症。

它可能使尿液呈蓝绿色，使皮肤呈蓝色。

重复剂量的氯化甲硫铵可能会加剧亨氏体形成和溶血性贫血(总累积剂量不应超过4mg/kg)

接受增强血清素能传递的药物的患者，包括SSRI(选择性5-羟色胺再摄取抑制剂)、安非他酮、丁螺环酮、氯米帕明、米拉西平和文拉法辛，应避免使用氯化甲硫铵。

电喷雾介导的核酸向离体猪肺转移的示例性实施方式

尽管基于核酸的疗法有潜力在广泛的肺部疾病中提供临床上有意义的益处，但体内递送仍然是一个挑战。电喷雾雾化是一种产生溶液细小液滴的方法。在这里，我们研究了使用电喷雾将核酸递送至已移植的猪肺组织和整个肺部的可行性。通过电喷雾将表达绿色荧光蛋白和荧光素酶的报告基因质粒DNA和mRNA，以及FITC标记的siRNA通过电喷雾在20％乙醇溶液中递送至在气液界面培养的气管组织外植体。与对照组相比，在递送pEGFP、GFPmRNA和siRNA-FITC后，外植体中荧光增强。与对照组相比，电喷雾转染pGLuc(p<0.005)和荧光素酶mRNA(p<0.05)后，外植体培养上清液中的荧光素酶水平显着增加。荧光素酶mRNA和siRNA-FITC的溶液也通过支气管镜使用电喷雾导管递送到猪离体全肺模型中。观察到支气管镜下电喷雾成功释放荧光素酶mRNA(p<0.005)和siRNA-FITC。综上所述，我们报道了通过电喷雾技术将核酸成功地离体递送至外植体的猪肺组织。另外，我们描述了支气管镜电喷雾将核算递送至离体猪全肺。

基于核酸的疗法有可能在广泛的肺部疾病中提供临床上有意义的益处。然而，迄今为止，实现有效递送的挑战限制了该疗法的成功。尽管已经对病毒载体进行了肺基因治疗的深入检查，但气道粘液凝胶层仍然是吸入的病毒和非病毒载体¹的重要屏障。基因传递的非病毒方法，包括基因传递的化学和物理方法，比病毒传递更具优势，因为它们的免疫原性较低，可以传递的DNA大小限制较小，并且在体内使用时具有较少的调节障碍。但是，由于缺乏成功的涉及非病毒载体的商业疗法，这表明这些方法仍面临进一步的挑战。

除了传统药物的输送外，长期以来，雾化一直被视为将基因输送到肺部的理想途径。溶液的雾化可以通过几种方法来实现。最常见的方法是使用喷嘴，使流体从中通过，并受到使液体雾化的机械力作用。为了递送到肺部，超声处理被广泛地使用，由此通过雾化器喷嘴板的高频振动产生小的液滴。然而，目前的气雾剂递送方法，例如喷射或超声雾化器，可能对DNA造成剪切应力，导致基因递送效率底下²，本发明之前的装置和方法的显着缺点克服了先前方法和装置的缺点。电喷雾，也称为静电喷雾，是使液体雾化的一种替代方法。为了产生电喷雾，当溶液导电发射器(例如针头3)时，向溶液施加高压。带电溶液和接地电极之间产生的电势差会产生电场，将液体吸引到接地电极。弯液面形成一个特征锥，称为“泰勒锥”，当电压阈值克服溶液的表面张力时，泰勒锥的尖端分离或雾化成液滴，形成射流、羽流或带电微滴的组合喷雾。使用其他喷雾产生方法，液滴在重力作用下落到表面上，但是通过电喷雾，在一定距离内，液滴加速流向表面⁴。此外，由于液滴带电，电喷雾比其他形式的喷雾更可控，这也是比先前的常识更大的优点。与先前的尝试不同，使用本文所述的装置和方法在气液界面处证实了所传递的分子的转染和这些分子在肺细胞中的功能。

通过电喷雾将DNA、mRNA和siRNA通过临床相关的空气接触界面递送至肺组织，例如，通过气液界面培养的猪气管外植体。然后，我们评估了在猪模型中通过支气管镜检查将电喷雾雾化用于将核酸直接递送至肺的可行性。

材料和方法

材料：质粒：pEGFP(克朗泰克实验室，美国加州山景城)和pGLuc(美国马萨诸塞州伊普斯威奇市新英格兰生物实验室)。GFP mRNA和荧光素酶mRNA(美国加利福尼亚州圣地亚哥的TriLink生物技术)。BLOCK-iT^TM荧光寡核苷酸(siRNA-FITC)(Thermo Fischer科学公司，美国麻省沃尔瑟姆)。

电喷雾输送

使用具有30G汉密尔顿针的Spraybase第1代电喷雾仪器(Avectas有限公司，梅努斯，爱尔兰)(图19)。发射器a位于接地的底板上方，距组织的上皮表面15mm。调节电压以达到稳定的泰勒锥和扩散羽流(图19b和19c)。根据环境条件(湿度/温度)、流速和溶液浓度，实现此目的所需的电压范围为3-5kV。将核酸重新悬浮在输送溶液中，该输送溶液是含有20％乙醇的水。将猪外植体上皮表面放置在基板中心，在电喷雾发射器下方，并在2-3分钟内以适合溶液的流速输送核酸溶液。对于涉及质粒DNA的实验，在连续三天中分三批递送总处理量(15μg)。在所有其他实验中，总治疗是一次喷雾。核酸递送后，将组织片段置于新鲜培养基中的琼脂糖塞上。

支气管镜电喷雾将核酸离体递送至猪肺

电喷雾导管系统由电喷雾导管、电源组件和注射泵(Avectas有限公司)(图20)组成。通过插管上腔静脉并用蠕动泵(Masterflex，Gelsenkirchen，德国)经过肺血管灌注补充有7％白蛋白和0.5％葡聚糖的培养基来制备猪心肺阻滞。使用NIPPY 2呼吸机(RespiCare有限公司，Swords，爱尔兰)将气管插管并通气(IPAP 14；EPAP 4；Fi02 21％)。滴入0.9％盐水的10毫升等分试样并抽吸，以清除肺部的碎屑。在支气管镜电喷雾递送之前，选择目标支气管内区域并用SPOT内窥镜标记物(GI Supply，Camp Hill，PA，USA)标记3个点以形成目标。

核酸表达分析

使用Olympus CKX41显微镜(Optika Vision Pro)和荧光模块(CoolLED pE-300white)分析荧光。将一些GFP mRNA和siRNA-FITC电喷雾的组织和对照组在OCT(Sigma-Aldrich)中冷冻并冷冻切片，然后通过荧光显微镜观察。对于pGLuc和荧光素酶mRNA的表达，在适当的培养期后，根据制造商的说明使用Biolux^TM高斯荧光素酶测定法分析上清液(新英格兰生物实验室)。

统计

使用针对Windows的Graphpad Prism版本7.03(GraphPad软件，La Jolla，CA，USA)，将两尾未配对的T检验用于统计分析。

结果

质粒DNA递送至肺外植体组织

在第1、2和3天用5000ng pEGFP质粒DNA(833ng/μl；流速3μl/min；持续时间2min)电喷雾猪气管外植体，然后再培养48小时。编码萤光素酶的pGLuc作为绿色荧光蛋白(GFP)荧光的阴性对照组。然后从气管和下层的结缔组织上分离上皮和粘膜下切片。将切片安装在载玻片上，并通过荧光显微镜观察。GFP表达在经peGFP处理的组织的组织切片中是明显的，但在pGLuc阴性对照中则没有表达(图15a)。

值得注意的是，肺组织中存在的高水平的内源性自体荧光会阻碍荧光报告的可视化。因此，pGLuc被用于进一步验证和量化电喷雾递送后的DNA表达。将5000ng pGLuc电喷雾于气管组织切片(833ng/μl；流速3μ1/min；持续时间2分钟)上连续3天，然后再培养组织48小时。peGFP作为阴性对照。从每个孔中取样20μl培养基，并量化荧光素酶的表达。与pEGFP电喷雾的对照组相比，在pGLuc电喷雾的组织的培养基中荧光素酶表达显着增加(p＝0.0002)(图15b)。

将mRNA递送至肺外植体组织

接下来，我们检查了编码GFP和荧光素酶的mRNA的传递。将2.4μgGFP mRNA电喷雾到气管外植体上(400ng/μl；流速3μl/min；持续时间2min)，并培养24小时。将不含mRNA的缓冲液作为阴性对照电喷雾。当通过荧光显微镜检查时，在气管组织的解剖上皮层中GFP表达是明显的(图16a)。将10μg荧光素酶mRNA电喷雾到气管外植体上(700ng/μl；流速4.8μl/min；持续时间3分钟)，并培养48小时。再次对不含mRNA的缓冲液电喷雾作为阴性对照。与对照外植体相比，荧光素酶表达的量化显示了在mRNA电喷雾的样品中发光表达的显著增加(p＝0.023)(图16b)。

siRNA递送至肺外植体组织

我们还对电喷雾实现siRNA分子递送的能力感兴趣。将20μl100μM siRNA-FITC递送至气管外植体(100uM；流速10ul/min；持续时间2min)，并与仅缓冲液的阴性对照组进行比较。递送后，对上皮层进行显微解剖，并在荧光显微镜下检查。FITC荧光在用siRNA电喷雾的组织中很明显，但在对照组织中却没有(图17a)。此外，在横切面上对气管进行冷冻切片，使组织内的siRNA可视化(图17b)。

支气管镜下将mRNA和siRNA体外递送至猪肺

在证明核酸成功地递送到移植的肺组织后，我们接下来检查了是否可以使用支气管镜和电喷雾导管实现电喷雾介导的向整个肺的递送。在支气管镜电喷雾递送之前，选择一个支气管内目标区域并用SPOT内窥镜标记物标记3个点以形成目标。然后将电喷雾导管插入支气管镜的工作端口，该支气管的位置距预先标记的靶标15mm，并且核酸被输送到点的中心。六份20μl的siRNA-FITC的等分试样(3.3μM溶液；流速100μl/sec；持续时间每等分0.2秒)和10μl(3μg)的MRNA-GLuc(300ng/μl；流速100μl/sec；持续时间0.1秒)被输送到目标地区。然后切除，如上所述清洗并在气液界面培养。在递送后48小时检测荧光素酶mRNA表达，并在递送后24小时观察siRNA-FITC。与仅缓冲液的对照组相比，在荧光素酶mRNA处理的样品中检测到荧光素酶表达的显著增加(p＜0.0001)，并且在siRNA-FITC递送后可见荧光显著(图18)。

猪气管外植体培养

猪肺是从当地屠宰场获得的。冷缺血时间限制为90分钟。将气管切成约20x 50mm的切片，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)冲洗，并在1：1RPMI 1640：DMEM，200单位/ml青霉素，200ug/ml链霉素，2.5ug/ml两性霉素，50ug/ml庆大霉素的溶液中进行3-4次洗涤循环(均为美国密苏里州圣路易斯的Sigma-Aldrich公司)。每个洗涤循环包括更换洗涤介质，在细胞振荡器上搅拌10分钟以及在37℃、5％CO₂下培养1小时。将气管切成10mm²的片段，包括上皮、粘膜和软骨。将组织片段(上皮层朝上)放置在12孔板的5mm高无菌琼脂糖(1％w/v)塞子上。加入培养基(洗涤培养基加10mM的L-谷氨酰胺和10％FBS(Sigma-Aldrich))，使得组织切片的基底被浸没。将外植体在加湿空气中于37℃、5％CO₂下培养过夜。

使用电喷雾导管的基于核酸的疗法

基于核酸的疗法具有显著的疾病改变潜力。因此，人们对开发能够在体内成功递送这些分子的技术非常感兴趣。本文所述的数据是使用本领域公认的人类临床或兽医临床治疗给药方式的模型产生的。多种病毒和非病毒载体已被用于这一目的，但是迄今为止成功仅限于此。细胞毒性、免疫原性和转染效率低下的挑战阻碍了进展。使用非病毒载体改善安全性已引起人们对这些技术的关注。然而，如果非病毒载体疗法具有临床意义，则需要提高转染效率的技术。在这项研究中，我们已经证明了使用电喷雾将核酸无载体地输送到组织中不仅可行，而且行之有效，从而降低了成本。此外，所递送的分子是功能性的，并且递送方式对所治疗的受试者是微创的。此外，使用本文所述的电喷雾导管，开发了一种允许腔内递送的技术，例如，支气管镜肺递送，证明了该技术在临床上的有效性。

这项研究报告了RNA、DNA、蛋白质或其他分子的电喷雾的成功递送至组织。鉴于猪肺在翻译研究中的广泛使用以及与人肺的接近程度可用于支气管镜干预^7，8，因此选择猪肺作为基因递送的目标。此外，肺的上皮表面为非侵入性(吸入)和半侵入性(支气管镜)的药物输送提供了一个可及的靶标。电喷雾雾化有可能被用作两种方式的药物输送平台。

电喷雾雾化过程涉及在带电溶液和接地集电器之间产生电场。随着电磁场克服了表面张力，溶液被分散成纳米尺寸的颗粒，并以高速向集电器移动。电喷雾产生的颗粒的特性-大小、电荷、速度和方向-通过解决降低核酸向组织的传递效率的因素，促进了药物的传递。电喷雾创造了这样的条件，在该条件下，颗粒通过动力而穿过细胞膜。这种效果也可以通过带电粒子与膜结合的电压门或离子通道的相互作用来实现。另外，与电喷雾相关的电场可在细胞膜内诱导孔的瞬时形成，称为电穿孔。

电喷雾电离是一种无载体的递送系统，具有克服与低效转染相关的多种障碍的潜力。这项技术已被报道成功地在体外转染了质粒DNA^12,13。这里我们报道了核酸的成功电喷雾递送，例如质粒DNA、mRNA和siRNA分子。转染后的蛋白表达被鉴定，表明在电喷雾过程中保持了核酸溶液的生物学完整性。

质粒DNA向组织的传递可能具有挑战性，因为这些分子的大尺寸会对细胞摄取产生负面影响。此外，细胞对DNA的摄取不能保证蛋白质的表达，因为在开始编码蛋白质之前必须发生核仁重新定位。较小的分子的传递，例如mRNA，可通过消除与分子大小和核糖体转录相关的障碍来提高蛋白质表达的效率。mRNA可能比DNA更具治疗优势，而瞬时蛋白表达等因素可能是药物开发中的重要考虑因素。与对照组相比，质粒DNA和mRNA均观察到荧光素酶表达增加2对数(2Log)。

siRNA分子对基因的调控以及对疾病的调控，在治疗癌症等疾病方面也具有巨大潜力¹⁴。我们已经证明，荧光标记的siRNA分子通过电喷雾传递到肺组织的上皮和粘膜层。siRNA功能的传递有助于下调疾病途径，如感染、炎症或肿瘤发生。

参考文献

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12.Ikemoto K,Sakata I,Sakai T.Collision of millimetredroplets inducesDNA and protein transfection into cells.Sci Rep2012；2:1-5.

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使用电喷雾将核酸电喷雾递送至离体猪气道的示例性实施方式

基于核酸的疗法有可能在广泛的肺部疾病中提供临床上有意义的益处。然而，体内递送仍然是一个挑战。在此我们研究了使用电喷雾将核酸递送至猪气管组织切片和离体全肺的可行性。

通过凝胶电泳分析超螺旋：开环结构比率，检查了电喷雾溶液、发射器规格、流速和电压对质粒DNA完整性的影响。采用最佳参数将萤光素酶DNA、mRNA及siRNA-FITC输送至气管组织切片。使用导管和支气管镜系统将萤光素酶mRNA离体递送至整个猪肺。荧光素酶活性和荧光分别通过光度法和显微镜分析。

与1％和20％的乙醇含盐溶液相比，在低盐无乙醇溶液中DNA质粒缺口的发生率最高。从一系列测试的发射器中，一个32规格的发射器产生了最佳的超螺旋：开环结构比率，这可能是因为用该发射器产生稳定的电喷雾所需的电压更低。较低的流速也显示出减少DNA缺口的趋势。与3kV和4kV相比，脂蛋白转染后的在5kV和6kV电喷雾的GFP DNA导致A549肺细胞中GFP表达水平较低。优化的参数包括20％的乙醇溶液、32ga发射器、低流速和3-5kV的电压，核酸分子成功地将荧光素酶DNA和mRNA以及siRNA-FITC递送至猪气管组织切片并通过支气管镜将荧光素酶mRNA递送至整个猪肺。总而言之，我们报告了通过电喷雾将核酸离体递送至猪肺组织和通过支气管镜电喷雾将核酸递送至离体猪肺模型。

基于核酸的疗法有潜力在广泛的肺部疾病中提供临床上有意义的益处。然而，尽管数十年来研究了将病毒和非病毒核酸递送至肺部的方法，但尚未批准任何疗法可用于临床。不利影响和递送效率的问题阻碍了进展，并且气道粘液凝胶层仍然是病毒和非病毒载体的重要障碍(Duncan GA，Jung J，Hanes J，Suk JS，吸入性基因疗法的粘液屏障，MolTher 2016；24：2043-2053)。除了长期的基因治疗策略(通过基因治疗替代缺陷基因或提供治疗效果)外，新兴的技术(例如基因编辑)有望作为新的治疗方法。对于这些技术，可能需要递送mRNA、短DNA序列和/或蛋白质。因此，需要新的递送策略来应对传统基因递送方法所面临的挑战，并确保新技术的进展可以转化为肺部。

基因传递的非病毒方法，包括化学方法和物理方法，都具有优势，因为它们的免疫原性低于病毒技术，并且在体内使用的调节障碍较少。然而，缺乏成功的涉及非病毒载体的基准疗法表明这些应用仍面临进一步的挑战。长期以来，雾化一直被认为是将基因传递到肺部的理想途径，并且可以通过多种方法来实现。最常见的方法是使用喷嘴，流体通过喷嘴，并受到使流体雾化的机械力作用。为了递送到肺部，超声处理被广泛地使用，通过雾化器喷嘴板的高频振动产生小的液滴。然而，由于药物是被吸入的，因此这是大量的药物损失和不良的靶向传递。此外，目前的物化输送方法，例如喷射或超声雾化器，可能会对DNA产生剪切应力，导致基因输送效率低下(Gomes dos Reis L，Svolos M，Hartwig B，Windhab N，Young PM，Traini D.吸入式基因输送：配方和输送方法，Expert Opin Drug Deliv，2017；14：319-330.1)。因此，以非病毒、靶向的方式将核酸药物以保持分子活性的方式递送至气道的能力是所需的。

电喷雾，也称为静电喷雾，是使液体雾化的替代方法，这种方法在包括软电离质谱在内的许多领域中都已得到了广泛的应用。当流体通过针头之类的导电发射器时，当向流体施加少量电荷时，就会发生电喷雾(Jaworek A，Sobczyk AT，纳米技术的电喷雾途径：综述，J Electrostal 2008；66：197-219)。带电溶液和接地电极之间产生的电势差会产生电场，将液体吸引到接地电极。产生的弯液面形成一个特征圆锥，称为“泰勒”锥。当电压阈值克服溶液的表面张力时，泰勒锥的尖端分离或雾化成液滴，形成喷射流或带电微滴的羽流。虽然其他喷雾产生方法利用重力和液滴形成后减速，但在一定距离内，电喷雾液滴会向表面加速(Rosell-Llompart J，Femandez de la MoraJ，从高导电性和粘性液体的带电锥形喷流中产生直径为0.3至4μm的单分散液滴，喷雾科学杂志，1994；25：1093-1119)。此外，由于液滴带电，电喷雾比其他形式的喷雾更可控，因此可用于靶向递送。这些特性使得一些研究人员将电喷雾作为一种基因传递方法进行了研究，尽管报道很少且不一致，可能是由于电喷雾的结构、溶液和参数之间存在显著差异。虽然已经报道了使用电喷雾在培养的A549肺细胞和小鼠皮肤中成功递送了质粒DNA，但Zeles-Hahn等人在气液界面培养的气管/支气管上皮细胞的研究中没有观察到荧光素酶质粒DNA的转染(Boehringer S，Ruzgys P，TamoL，Satkauskas S，Geiser T，Gazdhar A，Hradetzky D.，一种新的靶向基因传递的电喷雾方法，科学报告2018,；8：4031；和Zeles-Hahn MG，Lentz YK，Anchordoquy TJ，Lengsfeld CS，静电喷雾对人肺上皮细胞的影响，J Electrostat 2011；69：67-77)。另一种基于电喷雾的技术是“生物电喷雾”，即以靶向和受控的方式将细胞电喷雾到表面上，如细胞外基质样支架。首次报道是在2006年，生物电喷雾技术正被用于组织工程和再生医学等应用领域，我们先前已经报道了成功的人间充质干细胞生物电喷雾技术(McCrea，Z.Y.Arnanthigo，SA，Cryan，O'Dea，S，一种用于生物电喷雾间充质干细胞的新型方法维持分化、免疫调节和修复功能，医学与生物工程杂志，2017，https://doi.org/10.1007/s40846-017-0331-4)。

为了在电喷雾过程中形成稳定的泰勒锥和羽状流，溶液可以具有最佳的电导率、表面张力和粘度水平(Boehringer S，Ruzgys P，Tamo L，Satkauskas S，Geiser T，GazdharA，Hradetzky D.一种用于靶向基因递送的新的电喷雾方法，科学报告2018；8：4031)。因此，溶液通常包含低浓度的盐以及乙醇等溶剂。然而，尚未证实这些成分对电喷雾过程中DNA完整性的影响。本文报道了用低压电喷雾和台式仪器进行DNA溶液电喷雾参数的研究，以及质粒DNA、mRNA和siRNA在气液界面上成功地向猪气管外植体组织的递送的研究。随后，我们在猪离体肺模型中使用了基于导管的电喷雾装置，以评估通过电喷雾雾化以靶向方式通过支气管镜将核酸直接递送到肺的可行性。

材料和方法

细胞培养

A549人肺细胞系(Cat.No.86012804，爱尔兰威克洛的Sigma-Aldrich)在DMEM(Gibco，Thermo Fisher科技公司，爱尔兰都柏林)中进行常规培养，补充了5％的胎牛血清和2mM的L-谷氨酰胺(Gibco)。

电喷雾研究

电喷雾装置包括一个无声的空气压缩机、注射泵、激光器和用于泰勒锥和羽流可视化的照相机以及一个控制单元(Avectas，都柏林，爱尔兰)。为了进行DNA完整性研究，将pEGFP质粒(Clontech Laboratories，Saint-Germain-en-Laye France)溶液喷雾到包含接地电极的24孔细胞培养板(Costar，Sigma-Aldrich)中。在低盐溶液(137nM NaCl、1.47nMKH₂PO₄、8.10nM Na₂HP0₄、2.68nM KCl)、1％乙醇/H₂O或20％乙醇/H₂O中稀释DNA，所有化学品均来自Sigma-Aldrich。使用纳米滴剂(Thermo Fisher Scientific)进行DNA量化。DNA样品在1％电泳凝胶上电泳，用溴化乙锭染色，并使用Gel Doc^TMXRS系统和软件(英国沃特福德的Bio-Rad Laboratories)进行扫描。

脂质转染

根据制造商的说明，使用Lipofectamine 2000(Invitrogen，Thermo Fisher科技公司)将质粒DNA转染到A549细胞中。转染后24小时使用Accuri流式细胞仪(BDBiosciences，Wokingham，英国)确定GFP表达。

电喷雾输送至培养的猪气管外植体

猪肺是从当地屠宰场获得的。冷缺血时间限制为90分钟。将气管切成约20x 50mm的切片，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)冲洗，并在1：1RPMI 1640：DMEM中进行3-4次清洗循环，包括200单位/ml青霉素、200μg/ml链霉素、2.5μg/ml两性霉素、50μg/ml庆大霉素(均为Sigma-Aldrich)。每个清洗循环包括更换清洗介质、在细胞振荡器上搅拌10分钟以及在37℃、5％CO₂下培养1小时。将气管切成10mm²的片段，包括上皮、粘膜和软骨。将组织片段(上皮层朝上)放置在12孔板(Costar，Sigma-Aldrich)中的5mm高无菌琼脂糖(1％w/v)塞子上。加入培养基(洗涤培养基加上10mM的L-谷氨酰胺和10％FBS)，使得组织切片的基底被浸没。外植体在37℃、5％CO₂的加湿空气中培养过夜。为了递送，将电喷雾发射器放置在接地的基板上方，距组织的上皮表面15mm。根据环境条件(湿度/温度)，将电压调节在3-5kV之间，以获得稳定的泰勒锥和扩散羽流。将核酸重新悬浮于20％乙醇/H₂O的递送溶液中。将猪组织上皮表面向上放置在基板中心，在电喷雾发射器下方，并在2-3分钟内递送核酸溶液。对于pGLuc(美国马萨诸塞州，伊普斯维奇，新英格兰生物实验室)，连续三天分三次给药5μg。对于萤光素酶mRNA(TriLink生物技术，美国加利福尼亚州圣迭戈)和siRNA-FITC(赛默飞世尔科技公司)，用一次喷雾进行整体治疗。核酸递送后，将组织片段置于新鲜培养基中的琼脂糖塞上。对于pGLuc和荧光素酶mRNA活性，根据制造商的说明，使用Biolux^TM高斯荧光素酶测定法(New England Biolabs)。使用Olympus CKX41显微镜(Olympus，Stansfield，UK)分析荧光。

离体电喷雾递送至整个猪肺

猪心肺阻滞的制备方法是：插管上腔静脉并用蠕动泵(Masterflex，Gelsenkirchen，德国)通过肺血管灌注补充有7％白蛋白和0.5％葡聚糖的培养基。使用NIPPY 2呼吸机(RespiCare Ltd.，Swords，爱尔兰)将气管插管并通气(IPAP 14；EPAP 4；Fi02 21％)。通过注入10毫升0.9％盐水等分试样并抽吸，以清除肺部的碎屑。电喷雾导管系统由电喷雾导管、电源组件和注射泵(Avectas)组成。在支气管镜电喷雾递送之前，选择目标支气管内区域并用SPOT内窥镜标记物(GI Supply，Camp Hill，PA，USA)标记3个点以形成目标。

统计

使用适用于Windows的Graphpad Prism版本7.03(GraphPad Software，La Jolla，CA，美国)，将两尾未配对的T检验用于统计分析。

结果

电喷雾溶液组成对质粒DNA完整性的影响

Zeles-Hahn等人似乎使用了含有20ng/μl的GFP DNA的各种溶液，不含溶剂，相当于25ga发射器，流速为200μl/min，在距离地面25mm的负模式下施加电压3-7kV的电压(Zeles-Hahn MG，Lentz YK，Anchordoquy TJ，Lengsfeld CS，静电喷雾对人肺上皮细胞的影响，J Electrostal 2011；69：67-77)。他们报告了分别在-3kV、-6kV和-7kV时滴落，稳定的锥形喷射和搅动的锥形电喷雾曲线。Boehringer等人使用了含有100ng/μl的GFP DNA且无溶剂的蔗糖溶液，29ga发射器，流速为20μl/min，在3-6mm的距离上以正模式施加3kV的电压(McCrea，Z.，Arnanthigo，Y.，Cry an，SA.，O'Dea，S，一种用于生物电喷雾间充质干细胞并保持分化、免疫调节和修复功能的新方法，医学与生物工程杂志，2017.https://doi.org/10.1007/s40846-017-0331-4)。对于本研究，我们旨在进一步研究电喷雾参数对气道组织转染的影响，并分析这些参数对电喷雾模式和DNA完整性的影响。对于这些研究，我们使用正模式电喷雾，因为我们发现它比负模式更有利于形成稳定的喷雾(数据未显示)。对照非电喷雾样品是在装入电喷雾系统之前采集的，或者通过在不施加电荷的情况下使溶液滴落通过发射器滴定并收集在组织培养板中而产生的，从中取回样品进行分析(图21a)。当将电荷施加到发射器上时，DNA溶液形成典型的泰勒锥和羽状流，它们被称为“喷雾”样品(图21b)。

共价闭合的环状DNA将采用超螺旋拓扑。分子的一条链上的一个一次断裂将导致超螺旋形式释放为开环形式。对相反链上的另一次断裂将导致线性DNA形式。进一步的DNA缺口将导致DNA断裂。这些事件中的任何一个都可能导致转染效率降低。

选择了三种含有低浓度盐或乙醇的溶液，并确定了它们对电喷雾过程中DNA完整性的影响。将DNA(pEGFP，100ng/μl)重新悬浮于低盐溶液、1％乙醇/H₂O或20％乙醇/H₂O中。将溶液以5μl/min的流速递送至空的组织培养板中5分钟，并取回进行分析。所有溶液均达到羽状电喷雾模式，但是低盐和1％乙醇溶液通常需要约4kV的电压，而20％乙醇溶液则需要3kV的电压。我们还观察到，与20％乙醇溶液相比，低盐和1％乙醇溶液的羽流更窄，并且随着时间的推移稳定性较差。与乙醇溶液相比，低盐溶液中质粒的开环形式增加，表明在低盐溶液中单链缺口(SSN)增加(图21c)。

发射器规格和流量的影响

发射器规格和溶液流速是另外两个影响泰勒锥形成和产生稳定电喷雾能力的参数。因此，我们使用低盐溶液来检查这两个参数是否有助于DNA质粒中观察到的缺口。

低盐溶液中的质粒DNA以四中不同的流速(40μl/min、20μl/min、10μl/min和5μl/min)通过六个不同大小的发射器(22、23、25、27、30、32ga规格)。对于每个测试的发射器规格，将每个流速与相应的40ul/min滴注控制进行比较。尽管样品之间的超螺旋：开环比在统计学上没有显著差异，但有一种趋势是32ga规格的发射器在所有流速下都保持最高水平的超螺旋质粒(图22a)。

注意到为每个发射器形成稳定的锥形喷射电喷雾所需的电压，并且观察到与较窄的内径发射器(32ga)相比，宽内径发射器(22ga)需要更高的电压(图22b)。这些结果表明，虽然较大的内径发射器引起更多的质粒缺口，但这可能是由于实现泰勒锥和羽流电喷雾所需的电压更高。

高压的影响

接下来，我们研究了电压对DNA缺口的影响。在这些实验中，电阻保持恒定，电压增加，以评估电流对DNA缺口的影响。研究电压为3kV、4kV、5kV和6kV。测试了60和15μl/min的流速以及22ga和32ga的发射器规格。在低盐溶液中电喷雾质粒DNA。

首先，用肉眼观察这些参数对喷雾模式的影响(图23)。在3kV电压下，电势不足以在任何流速或任何一个发射器下产生喷雾。在4kV电压下，对于两种流速，都使用32ga发射器而不是22ga发射器产生喷雾，该喷雾仍处于滴落模式。在5kV下，对于两种流速，使用22ga发射器观察到的是一种不稳定喷雾，其在滴液和喷雾之间交替变化，而使用32ga发射器观察到稳定的喷雾。在6kV时，电势足够高，在发射器规格和两种流速中，都可以产生连续稳定的电喷雾。

接下来在每个电压、流速和发射器规格处检查DNA缺口。首先，使用32ga发射器，观察到质粒缺口在60和15μl/min流速下都随着电压的增加而增加，如开环质粒DNA水平的增加所示(图23a)。当流速保持恒定在60μl/min并增加电压时，22ga或32ga发射器之间的超螺旋：开环比率没有显著差异，表明发射器规格本身不影响DNA完整性(图23b)。然而，随着电压的增加，质粒缺口增加。与3kV相比，使用22ga发射器在6kV时质粒缺口显著增加(p＝0.0003)。与3kV相比，使用32ga发射器在5kV时质粒缺口也显著增加(p＝0.002)。这些结果表明，高压，或更具体地说，更高的电流是电喷雾过程中DNA缺口的原因。

为了确定质粒在DNA表达上产生缺口的后果，对编码绿色荧光蛋白(pGFP)的质粒进行电喷雾，然后通过脂质转染将其转染到A549肺上皮细胞中。将相同浓度的DNA脂质转染并确定转染效率。DNA缺口形成水平的增加与GFP表达水平的下降相关(图23c)。这表明高压诱导的质粒DNA单链缺口导致开环确认，并最终导致下游蛋白表达减少。

电喷雾将质粒DNA、mRNA和siRNA递送至培养的猪气管外植体

在研究了各种电喷雾参数对核酸完整性的影响后，我们接着评估了输送至气道组织的可行性。使用了两种离体模型系统：培养的猪气管外植体和整个猪肺。各种报道质粒已用于旨在开发用于气道疾病的基因治疗的载体的研究中。在囊性纤维化模型的基因转移的临床前研究中，已显示一种分泌的高斯荧光素酶(GLuc)报告基因是敏感的报告基因，因此该质粒(pGLuc)用于此处的研究(Griesenbach U,Vicente CC,Roberts MJ,Meng C,SoussiS,Xenariou S,Tennant P,Baker A,Baker E,Gordon C,Vrettou C,McCormick D,ColesR,Green AM,Lawton AE,Sumner-Jones SG,Cheng SH,Scheule RK,Hyde SC,Gill DR,Collie DD,McLachlan G,Alton EW，分泌的高斯荧光素酶作为一种敏感的报告基因用于体内和离体研究气道基因转移，生物材料，2011，32(10):2614-24)。基于上述结果，以下参数被认为是保持核酸分子的完整性的最佳参数：20％乙醇/H₂O作为输送溶液，32ga发射器和低流速。

用5000ng pGLuc(833ng/μl；流速3μ1/min；持续时间2分钟)对猪气管外植体进行电喷雾，连续3天每天电喷雾一次，然后再组织培养48小时(图24a)。从每个孔中取样20μl培养基，并定量荧光素酶活性。与来自电喷雾对照组的培养基相比，在pGLuc电喷雾的组织的培养基中荧光素酶活性显著增加(p＝0.0002)(图24b)。

接下来，我们评估了RNA分子的电喷雾递送。对猪气管组织进行了荧光素酶的mRNA编码。将萤光素酶mRNA(10μg)电喷雾到气管组织上(700ng/μl；流速4.8μl/min；持续时间3分钟)，并培养48小时。将不含mRNA的递送溶液电喷雾作为阴性对照。荧光素酶活性的定量显示，与对照外植体相比，mRNA电喷雾样品中发光表达显著增加(p＝0.023)(图25a)。

将siRNA-FITC(20μl，100μM)递送至气管外植体(100μM；流速100μl/min；持续时间2分钟)，并与仅递送溶液的阴性对照进行比较。递送后，将上皮层显微分离并在荧光显微镜下检查。FITC荧光在用siRNA电喷雾的组织中很明显，但在对照组织中却没有(图25b)。另外，在横切面上对气管片段进行冷冻切片，以使组织内的siRNA可视化(图25c)。

Bronchoscopic electrospray delivery of mRNA to wholeporcine lung exvivo

支气管镜下将mRNA的电喷雾递送至整个猪肺

接下来，我们调查了电喷雾是否可用于将核酸递送至整个肺部的气道。如前所述，建立了一个包括导管、支气管镜和电喷雾装置组成的装置(图20)。获得解剖的肺，并且在支气管镜电喷雾递送之前，选择目标支气管内区域并使用SPOT内窥镜标记物标记3个点以形成目标。然后将电喷雾导管插入支气管镜的工作端口，放置在距预先标记的目标15mm的位置，并且将包含mRNA的溶液递送到点的中心。将10μl(3μg)mRNA-GLuc(300ng/μl；流速100μl/秒；持续时间0.1秒)递送至目标区域，然后在气液界面处将其切除、洗涤并培养。在递送后48小时测量荧光素酶活性。与对照组相比，在荧光素酶mRNA处理的样品中检测到荧光素酶活性的显著增加(p＜0.0001)(图26)。

讨论

基于核酸的疗法具有显著的疾病改变潜力。因此，人们对开发能够在体内成功递送这些分子的技术非常感兴趣。多种病毒和非病毒载体已被用于该目的，但是迄今为止成功仅限于此。细胞毒性、免疫原性和转染效率低下的挑战阻碍了进展。使用非病毒载体改善安全性已引起人们对这些技术的关注。但是，如果非病毒载体疗法具有临床意义，则需要提高转染效率的技术。据我们所知，这项研究是第一个报告成功将RNA或DNA分子电喷雾递送至肺组织的研究。鉴于猪肺在翻译研究中的广泛应用以及其与人肺的支气管镜介入非常接近(Rogers CS，Abraham WM，Brogden K a，Engelhardt JF，Fisher JT，McCray PB等人，猪肺是囊性纤维化的潜在模型，Am J生理学肺细胞生理学2008；295：L240-L263；以及udgeEP,Hughes JML,Egan JJ,Maguire M,Molloy EL,O’Dea S，猪肺的解剖和支气管镜检查：转化呼吸医学的模型，Am.J.Respir.Cell Mol.Biol，2014；51:334-343)，因此选择猪肺作为基因递送的目标。此外，肺的上皮表面为非侵入性(吸入)和半侵入性(支气管镜)药物输送提供了可接近的目标。电喷雾雾化有可能被用作两种方式的药物输送平台。

电喷雾电离是一种无载体的递送系统，具有克服与低效转染相关的多种障碍的潜力。以前已经报道过该技术成功地在体外和小鼠皮肤上转染了质粒DNA(Boehringer S，Ruzgys P，Tamo L，Satkauskas S，Geiser T，Gazdhar A，Hradetzky D，一种新的用于靶向基因递送的电喷雾方法，科学报告2018；8：4031；Ikemoto K，Sakata l，SakaiT，毫米液滴的碰撞诱导DNA和蛋白质转染到细胞中；Sci Rep 2012；2：1-5；以及Lee YH，Wu B，Zhuang WQ，Chen DR，Tang YJ，纳米粒子通过电喷雾过程促进基因传递给微生物，J MicrobiolMethods 2011；84：228-233)。本文报道了质粒DNA、mRNA和siRNA分子的体外电喷雾成功地递送。在这项研究中，鉴定了转染后的蛋白质表达，表明在电喷雾过程中核酸溶液的生物学完整性得以保持。

Zeles-Hahn等人未能将荧光素酶DNA以裸质粒DNA、脂质/DNA复合物、聚乙烯亚胺/DNA复合物和聚L-赖氨酸/DNA复合物的形式转染到人气道上皮细胞中(Zeles-Hahn MG，Lentz YK，Anchordoquy TJ，Lengsfeld CS，静电喷雾对人肺上皮细胞的影响，JElectrostat 2011；69：67-77)。他们似乎没有使用溶剂，这可能需要高压才能使溶液分解成喷雾。这样的电压可能会破坏DNA质粒的结构，并且它们报告在6kV和7kV时开环和片段化DNA增加。

电喷雾雾化过程涉及在带电溶液和接地集电器之间产生电场。随着电磁场克服了表面张力，溶液被分散成纳米尺寸的颗粒，并以高速向集电器移动。电喷雾产生的颗粒的特性-大小、电荷、速度和方向-通过解决降低核酸向组织的传递效率的因素，促进了药物的传递。电喷雾创造了这样的条件，在该条件下，颗粒通过动力而穿过细胞膜，就像“基因枪”一样(Zhang D,Das DB,Rielly CD，基因枪微针辅助微粒递送的潜力：综述，药物递送2013；7544:571-587)。这种效果也可以通过带电粒子与膜结合的电压门或离子通道的相互作用来实现。另外，与电喷雾相关的电场可在细胞膜内诱导孔的瞬时形成，称为电穿孔(Lambricht L，Lopes A，Kos S，Sersa G，Preat V，Vandermeulen G，用于基因治疗和DNA疫苗递送的电穿孔，Expert Opin Drug Deliv 2015；5247：295-310)。

质粒DNA向组织的传递可能具有挑战性，因为这些分子的大尺寸会对细胞摄取产生负面影响。此外，细胞对DNA的摄取不能保证蛋白质的表达，因为在开始编码蛋白质之前必须发生核仁的重新定位。我们假设较小的分子的传递，如mRNA，将通过消除与分子大小和核糖体转录相关的障碍来提高蛋白质表达的效率。mRNA可能比DNA更具治疗优势，而瞬时蛋白表达等因素可能是药物开发中的重要考虑因素。在我们的研究中，我们没有直接比较mRNA与质粒DNA的转染效率，但是与对照组相比，质粒DNA和mRNA荧光素酶活性均提高了2对数。

siRNA分子对基因的调控以及因此对疾病的调控在治疗癌症等疾病方面也具有巨大的潜力(Golan T，Khvalevsky EZ，Hubert A，Gabai RM，Hen N，Segal A等人，靶向KRAS的RNAi联合化疗治疗局部晚期胰腺癌患者，Oncotarget 2015；6：24560-24570)。我们已经表明，荧光标记的siRNA分子可以通过电喷雾传递到肺组织的上皮层和粘膜层。虽然研究中未评估siRNA功能，但这种治疗方法可能会在感染、炎症或肿瘤发生期间下调疾病途径(Zamora MR，Budev M，Rolfe M，Gottlieb J，Humar A，DeVincenzo J等人，呼吸道合胞病毒感染肺移植患者的RNA干扰治疗，Am J Respir Crit Care Med 2011；183：531-538；Lomas-Neira JL，Chung CS，Wesche DE，Perl M，Ayala A，MIP-2和KC的肺表达的体内基因沉默(含siRNA)对出血诱导的中性粒细胞介导的败血性急性肺损伤的影响不同，Leukoc Biol，2005；77：846-53；和Davis ME，Zuckerman JE，Choi CHJ，Seligson D，Tolcher A，Alabi CA等人，经由靶向纳米粒子系统注射siRNA的人类RNAi证据，自然2010；464：1067-1070)。

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实验3-多孔尖端发射器头部

为了研究使用多孔尖端的可行性，测试了书写工具(例如，Copic标记)的毡尖部分。用铜垫圈进行高压电气连接。测试装置包括带电源的电喷雾装置底座，安装在实验室插座上的平板反电极。为了进行性能诊断，在尖端附近放置VIMS示波器显微镜以提供照明。

为了进行实验，从书写工具的近端供应了77％的乙醇，如图28所示。图29和30示出了使用多孔尖端的电喷雾形成。实验结果表明，多孔尖端可以在2.0至2.9kV的供电电压下以尖端至板10至15mm的距离建立均匀而稳定的喷雾。在2.9kV以上，建立了观察到两个或更多不同射流的多射流模式。液体在对电极上的清晰沉积证明了喷雾的均匀性。将塑料插入件放置在平板集电器上，显示出与钢针观察到的行为相似，即，喷雾被插入物偏转并沉积在其周围。观察到一个环形沉积部分，表明电场线被塑料插入物偏转了。

在具有多孔尖端的输送平台的另一变型中，由于单色且准直光源可以提供更好的照明，因此可以使用2类激光光源来照射羽流。在另一个实验中，证明当注入100μL液体并经受2.7kV的供电电压下，当针尖到板的距离为6mm或针尖到板的距离为26mm时，电喷雾可以提供大约2分52秒或5分32秒的稳定锥形喷射模式喷雾。在针尖到板的距离为26mm时，从2.8kV到3.4kV观察到稳定的锥喷模式，而在3.7kV以上时，开始出现多射流模式。对电极板的观察表明，在针尖距电极板为26mm时，电极板的覆盖范围比在6mm时更大。未观察到喷雾覆盖。图31-33显示了使用多孔尖端与77％乙醇在不同尖端到板的距离下的各种电源电压的实验结果。

还测试了具有不同结构的多孔尖端。具体来说，测试了4种不同笔尖：标准超级笔、标准细笔、画笔和多线笔。画笔和多线笔笔尖具有金属连接，但是标准细笔和标准超级笔需要制作连接器。在测试的那些笔尖之中，标准细笔表现出稳定的射流形成。测试过程是将笔尖浸透并添加溶液以引起流动，然后将电压设置为约2.5kV，并拍照以观察响应。

在此实验中，测试了四种不同的溶液：a)100％乙醇，b)去离子水，c)0.25％的亚甲基蓝+0.01％的乙酸铵，和d)0.25％的亚甲基蓝+1％的乙醇。测试是在笔尖到板的恒定距离为11mm的情况下进行的。综上所述，乙醇如预期那样喷雾效果良好。去离子水在4.4kV处呈射流韧带，无羽流。但是，当移除反电极并将溶液喷洒到自由空间时，观察到了去离子水形成羽状流的迹象。乙醇和去离子水测试分别如图34和35所示。在2.8kV-3.1kV的电压范围内，0.25％的亚甲基蓝和0.01％的乙酸铵溶液表现出喷雾形成。观察到的喷雾模式是中心有韧带的羽流。低于2.8kV时，能量不足以抽吸溶液，也未观察到喷雾。高于3.1kV时，喷雾出现脉动或散发，没有稳定的羽流迹象。在喷雾电压范围内，可以通过脚踏开关控制喷雾的开启和关闭，如图36所示。踩下脚踏开关后，喷雾立即停止。当锁定时，系统会逐渐上升到设置电压，这会产生延迟。此外，喷雾范围受到反电极位置的敏感影响，例如，移动板的位置可能需要对电压进行小幅度调整以实现稳定的喷雾。此外，与去离子水不同，在没有反电极的情况下，未观察到亚甲基蓝的喷雾现象。0.25％的亚甲基蓝和1％的乙醇溶液更难喷雾。它显示出羽流的迹象，但如图37所示，有时不稳定并且脉动。此外，用超细笔测试了0.25％的亚甲基蓝和0.01％的乙酸铵溶液，但是该配置没有显示出稳定的喷雾

在另一个实验中，用亚甲基蓝测试了连接到多孔尖端发射器头部的导管，并证明在存在反电极的情况下在7.5kV电压下稳定的电喷雾。在支气管镜内在工作台上进行亚甲基蓝递送测试，并且在干湿条件下，针尖到板的距离为9至16mm，可以实现喷雾传递。图38示出了连接至多孔尖端发射器头部的导管的示例性台式测试装置。另外，对离体通风的猪肺进行了亚甲基蓝递送测试。图39和40示出了具有多孔尖端的导管对通风的猪肺的离体测试。为了实现稳定的喷雾，如图40所示，金属罩被石蜡膜覆盖。该实验使用的尖端到显微镜的距离为12mm。从该实验中观察到气管有效率为100％(4分之4)。

在另一个实验中，对离体通风的猪肺进行了亚甲基蓝递送测试，其尖端到显微镜的距离为3到13mm。在气管中达到了79％(37个中的29个)有效性，并且在所有尖端到范围内的距离上都获得了可比较的有效性。观察到的是，喷雾持续向前推动，没有壁的吸引力。还观察到良好的电隔离，并且没有产生超过100μA的电流。

在以上描述和权利要求中，可能出现诸如“至少一个”或“一个或多个”之类的短语，其后是元件或特征的组合列表。术语“和/或”也可以出现在两个或更多个元件或特征的列表中。除非使用该短语的上下文隐含或显着矛盾，否则该短语旨在表示单独列出的任何元件或特征，或者与其他任何引用的元件或特征组合使用。例如，短语“A和Β中的至少一个；”“A和Β中的一个或多个；”“A和/或B”分别意为“单独的A，单独的B或A和B一起。类似的解释也适用于包含三个或更多项目的列表。例如，短语“A，B和C中的至少一个；”“A，B和C中的一个或多个；”“A，B和/或C”分别意指“单独的A，单独的B，单独的C，A和B在一起，A和C在一起，B和C在一起，或A和B和C在一起”。另外，在上文以及在权利要求书中，术语“基于”的使用旨在表示“至少部分地基于”，从而也允许未引用的特征或元件。

根据期望的配置，本文描述的主题可以体现在系统、装置、方法和/或物品中。前述描述中阐述的实施方式并不代表与本文所述主题一致的所有实施方式。相反，它们仅是与所描述的主题有关的方面一致的一些实施例。尽管上面已经详细描述了一些变体，但是其他修改或添加是可能的。特别地，除了本文阐述的那些特征和/或变化之外，还可以提供其他特征和/或变化。例如，上述实施方式可以针对所公开的特征的各种组合和子组合和/或以上公开的若干其他特征的组合和子组合。另外，附图中描绘的和/或本文中描述的逻辑流程不一定需要所示的特定顺序或连续顺序来实现期望的结果。其他实施方式可以在所附权利要求的范围内。

Claims (8)

1.一种支气管镜装置，其包括：

导管，其限定流体通道并具有远端开口，其中所述流体通道配置用于接收计量体积的流体，并且其中所述流体含有浓度大于5％的乙醇；

电极，其在所述流体通道内并与所述导管的远端开口间隔一定距离；以及

多孔尖端，其用于形成泰勒锥并设置在所述流体通道内在所述导管的远端开口附近，其中所述多孔尖端包括吸收性材料，并且其中所述多孔尖端包括纤维材料，其形成锥形几何形状；

突起，设置在所述导管的远端开口附近并围绕所述导管的外部表面，和热塑性包裹物，其包围所述突起从而提供密封和电绝缘，所述电绝缘没有产生超过100μA的电流；

泵，其中所述泵与所述导管耦合，其中所述泵配置用于向所述流体通道提供所述计量体积的流体，其中所述流体的体积在每次启动所述泵时为1至10微升；

其中所述导管被布置用于防止所述装置的任何电极与组织之间的直接接触。

2.根据权利要求1所述的装置，进一步包括在所述导管外部的导电护套，其配置用于接地，所述导管将所述流体通道与所述导电护套分开。

3.根据权利要求2所述的装置，进一步包括生物相容性覆盖物，其将所述导电护套包围在所述生物相容性覆盖物和所述导管之间。

4.根据权利要求3所述的装置，其中所述生物相容性覆盖物延伸小于所述导管的整个长度，并且所述导管的远端是暴露的。

5.根据权利要求4所述的装置，其中所述导管具有的内径为大约0.5mm，外径为大约1.4mm；所述电极和远端开口之间的距离大约为100mm；所述生物相容性覆盖物具有的外径大约为2.05mm，以及所述导管在远端处延伸超过所述生物相容性覆盖物大约50mm。

6.根据权利要求1所述的装置，进一步包括导线，其延伸穿过所述导管的部分长度并在所述流体通道之内，所述导线包括绝缘层和暴露的远端部分，所述暴露的远端部分形成所述电极。

7.根据权利要求1所述的装置，其中所述电极在携带电荷时将所述电荷传递给行进通过所述流体通道的流体，所述电荷在所述流体通道内被传递，使得当带电流体到达所述导管的远端开口附近的流体/空气界面时，所述带电流体形成分散的带电液滴。

8.根据权利要求1所述的装置，其中所述多孔尖端包括毛毡材料。