CN111154718B - 一种人间充质干细胞体外快速扩增用添加剂及扩增方法 - Google Patents

一种人间充质干细胞体外快速扩增用添加剂及扩增方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物制药技术领域，具体涉及一种人间充质干细胞体外快速扩增用添加剂及扩增方法。本发明添加剂中没食子酸、烟酰胺、丙戊酸、P57抑制剂等相互协同作用，增加人间充质干细胞在细胞发生时发生细胞周期的合成周期（S期）的百分比，以促进细胞快速分裂和增殖，同时保持干细胞多功能分化的潜力；增加人间充质干细胞的端粒酶逆转录酶，以延长端粒还原至的时间，延缓细胞衰老，延长细胞寿命，获得至少2至3倍含量的生长因子。

Description

一种人间充质干细胞体外快速扩增用添加剂及扩增方法
技术领域
本发明涉及生物制药技术领域，具体涉及一种人间充质干细胞体外快速扩增用培养基及扩增方法。
背景技术
目前，科学界对“干细胞”及其性质进行了如下定义。 干细胞是指具有自我更新和增殖能力以及长期保持未分化状态的性质的细胞， 适当诱导和模拟细胞后，可分化为不同谱系的细胞群，实现具有特定功能的组织的多重分化。间充质干细胞首先在学术上被定义为成纤维细胞的集落形成单位（CFU-Fs）。
在培养过程中，单层间充质干细胞以类似于成纤维细胞的形式和纺锤形附着在塑料培养皿的表面上。 这种干细胞将在体外迅速增殖形成集落，并具有分化为成骨细胞，脂肪细胞和软骨细胞的潜力。 近年来，研究表明该细胞可以分化为肝细胞，心肌细胞，神经细胞，胰岛细胞等。
间充质干细胞的来源来自人体各种不同组织的分离。 例如，直接手术切除或吸脂获得的脂肪组织是干细胞的丰富来源，而脂肪组织衍生的干细胞（ADSCs）具有以下优点：低侵入性，对人体的伤害小，高产量一次的数量，以及体外的增殖和培养等 此外，脂肪组织干细胞还具有分化为骨骼，肌肉和脂肪细胞的潜力，因此脂肪组织干细胞被认为是干细胞之一。具有高发展潜力的细胞。
不管基础医学研究或临床治疗如何，干细胞的研究和应用都需要足够数量的细胞和适当条件下的培养物，包括刺激物（例如适当的微环境或生长因子）以防止干细胞在细胞生长之前老化。增殖和培养过程，丧失活性或分化为其他细胞。 但是，包括细胞分离技术，生长培养基和培养条件在内的差异导致干细胞的增殖和分化能力发生显着差异。 另外，许多期刊报道了在培养和增殖过程中存在间充质干细胞衰老的趋势。 因此，干细胞增殖中细胞的性能和衰老的差异可能阻碍了间充质干细胞的临床使用。
快速有效地培养干细胞并扩增其数量，同时保持未分化状态并减少衰老现象，并具有多功能特性，是科学家的主要课题。 专利US201331366专利提供了一种体外无血清的人体干细胞培养细胞，以及一种在无血清干细胞培养中富含血浆的生长因子（PRGF）的方法。液体以在人的人类干细胞中进行初次培养和继代培养，并且将通过这种方法培养的人的人类干细胞继代培养数次后，人的人类干细胞仍保持基本未分化的状态。 然而，通过这种培养方法获得的干细胞的数量大约等于55,000个细胞/ cm 2，然后将细胞继代培养至第三代（P3）。 如果有必要获得更多的干细胞，则需要更多的培养天数和更多的传代传代，因此，对于更多数量的继代培养，干细胞更容易受到污染。
US201231087公开了一种间充质干细胞的培养方法，所述方法包括以下步骤：取出健康脂肪；将预定量的溶剂混合到脂肪组织中以清洁脂肪组织；将预定剂量的试剂添加到预定体积的脂肪组织中并进行离心分离；将产生并分离的脂肪组织与预定剂量的酶混合到微量离心管中，以使微量离心管振动。产生用于细胞培养的沉淀以产生体细胞；在获得体细胞后，通过上述培养方法制得的细胞培养液中含有用于细胞分泌的生长因子（例如VEGF，HGF，b-FGF，TGF和IGF），以完成高性能的原料。但是，该培养方法是将体细胞放入含有10％胎牛血清（10％FBS）的基本培养基DMEM（Dulbecco改良Eagle培养基）中进行培养，并且体细胞的增殖速度缓慢，因此分泌的生长因子的数量相对较少。 如果必须获得大量的生长因子，则必须需要更多的培养天数和更多次传代传代，因此干细胞在更多次传代培养中面临更大的污染风险。
综上所述，需要对现有的干细胞体外培养方法进行创新改进，可以保持干细胞的多功能性，以迅速有效增殖人间充质干细胞。
发明内容
为了克服现有技术的缺陷，本发明的目的之一在于提供一种人间充质干细胞体外快速扩增用添加剂，实现快速有效扩增人间充质干细胞，避免污染，获得有效的生长因子。
同时本发明还在于提供一种人间充质干细胞体外快速扩增方法。
一种人间充质干细胞体外快速扩增用添加剂，用于添加于干细胞体外扩增用培养基中，该添加剂由以下有效成分组成：没食子酸、生长因子FGF-2、烟酰胺、丙戊酸、鞘氨醇-1-磷酸、吡格列酮、4-[2-（苄基氨基）-2-氧代乙酰基]-N-（2,3-二甲基苯基）苯甲酰胺、P57抑制剂。
可选的，上述添加剂在培养基中的质量浓度用量为：没食子酸1~2ng/L、生长因子FGF-2 10~20ng/L、烟酰胺2~3ng/l、丙戊酸1.5~3ng/L、鞘氨醇-1-磷酸1~2ng/L、吡格列酮3~4ng/L、4-[2-（苄基氨基）-2-氧代乙酰基]-N-（2,3-二甲基苯基）苯甲酰胺12~15ng/L、P57抑制剂8~10ng/L。
进一步优选的，上述添加剂在培养基中的质量浓度用量为：没食子酸1.5ng/L、生长因子FGF-2 15ng/L、烟酰胺2.5ng/L、丙戊酸2ng/L、鞘氨醇-1-磷酸1.5ng/L、吡格列酮3.5ng/L、4-[2-（苄基氨基）-2-氧代乙酰基]-N-（2,3-二甲基苯基）苯甲酰胺13ng/L、P57抑制剂9ng/L。
一种人间充质干细胞体外快速扩增方法，包括以下操作步骤：
1）将体外分离的人间充质干细胞，在胶原包被的板上预培养约24小时；
2）取扩增用培养基，在扩增用培养基中加入上述添加剂，形成改性的扩增用培养基，在改性的扩增用培养基中接种步骤1）中完成预培养的人间充质干细胞，每隔3天更换新的改性的扩增用培养基，在37℃的温度、5％的二氧化碳分压、饱和湿度的环境下持续培养7天，即完成。
可选的，上述步骤2）中扩增用培养基为添加了10％的胎牛血清和2 mM L-谷氨酰胺的L-DMEM基础培养基。
可选的，上述人间充质干细胞来源为脂肪组织。
本发明有益效果如下：
1. 快速增殖：将本发明的用于人间充质干细胞体外快速增殖的添加剂加入到培养基中，添加剂中的有效成分发挥协同作用，尤其是没食子酸、烟酰胺、丙戊酸、P57抑制剂发挥协同增效作用，以增加人间充质干细胞在细胞发生时发生细胞周期的合成周期（S期）的百分比，以促进细胞快速分裂和增殖，同时保持干细胞多功能分化的潜力。
2. 减少细胞老化：将本发明的用于体外人间充质干细胞快速增殖的添加剂加入培养基中，以增强人间充质干细胞的端粒酶逆转录酶的活性，以延长端粒还原至的时间，延缓细胞衰老，延长细胞寿命。
3. 快速收获大量生长因子：将本发明的用于体外人间充质干细胞快速增殖的添加剂加入培养基中，以获得至少2至3倍含量的生长因子。
附图说明
图1是不同扩增方法培养的人间充质干细胞的细胞密度对比图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。
下述实施例干细胞来源为按照本领域技术人员已知的方法从脂肪组织中分离出人间充质干细胞，下述实施例主要用于证明对人间充质干细胞增殖培养的方法的可行性和有益效果，对人间充质干细胞的来源和体外分离方法无关，采用了本领域技术人员已知的任意方法体外分离获得的人间充质干细胞都可应用于下述实施例，产生几乎等同的增殖效果。
下述实施例提供的人间充质干细胞体外快速扩增方法中，在培养基中添加使用本发明实施例提供的添加剂，其有效成分组成为：没食子酸、生长因子FGF-2、烟酰胺、丙戊酸、鞘氨醇-1-磷酸、吡格列酮、4-[2-（苄基氨基）-2-氧代乙酰基]-N-（2,3-二甲基苯基）苯甲酰胺和P57抑制剂。
下述实施例和对比例中扩增用培养基为添加了10％的胎牛血清和2 mM L-谷氨酰胺的GIBCO-Invitrogen培养基。
实施例1
一种人间充质干细胞体外快速扩增方法，包括以下操作步骤：
1）将体外分离的人间充质干细胞，在胶原包被的板上预培养约24小时；
2）取扩增用培养基，在扩增用培养基中加入添加剂，使培养基中含有没食子酸1.5ng/L、生长因子FGF-2 15ng/L、烟酰胺2.5ng/L、丙戊酸2ng/L、鞘氨醇-1-磷酸1.5ng/L、吡格列酮3.5ng/L、4-[2-（苄基氨基）-2-氧代乙酰基]-N-（2,3-二甲基苯基）苯甲酰胺13ng/L、P57抑制剂9ng/L，形成改性的扩增用培养基，用改性的扩增用培养基继续培养步骤1）中完成预培养的人间充质干细胞，每隔3天更换新的改性的扩增用培养基，在37℃的温度、5％的二氧化碳分压、饱和湿度的环境下持续培养7天，即完成。
实施例2
一种人间充质干细胞体外快速扩增方法，包括以下操作步骤：
1）将体外分离的人间充质干细胞，在胶原包被的板上预培养约24小时；
2）取扩增用培养基，在扩增用培养基中加入添加剂，使培养基中含有没食子酸1ng/L、生长因子FGF-2 10ng/L、烟酰胺2ng/L、丙戊酸1.5ng/L、鞘氨醇-1-磷酸1ng/L、吡格列酮3ng/L、4-[2-（苄基氨基）-2-氧代乙酰基]-N-（2,3-二甲基苯基）苯甲酰胺12ng/L、P57抑制剂8ng/L，形成改性的扩增用培养基，用改性的扩增用培养基继续培养步骤1）中完成预培养的人间充质干细胞，每隔3天更换新的改性的扩增用培养基，在37℃的温度、5％的二氧化碳分压、饱和湿度的环境下持续培养7天，即完成。
实施例3
一种人间充质干细胞体外快速扩增方法，包括以下操作步骤：
1）将体外分离的人间充质干细胞，在胶原包被的板上预培养约24小时；
2）取扩增用培养基，在扩增用培养基中加入添加剂，使培养基中含有没食子酸2ng/L、生长因子FGF-2 20ng/L、烟酰胺3ng/L、丙戊酸3ng/L、鞘氨醇-1-磷酸2ng/L、吡格列酮4ng/L、4-[2-（苄基氨基）-2-氧代乙酰基]-N-（2,3-二甲基苯基）苯甲酰胺15ng/L、P57抑制剂10ng/L，形成改性的扩增用培养基，用改性的扩增用培养基继续培养步骤1）中完成预培养的人间充质干细胞，每隔3天更换新的改性的扩增用培养基，在37℃的温度、5％的二氧化碳分压、饱和湿度的环境下持续培养7天，即完成。
对比例1
本对比例人间充质干细胞体外扩增方法与实施例1的不同之处在于，改变添加剂的有效成分，采用P21抑制剂替换P57抑制剂，其他同实施例1。
对比例2
本对比例人间充质干细胞体外扩增方法与实施例1的不同之处在于，改变添加剂的有效成分，采用P27抑制剂替换P57抑制剂，其他同实施例1。
对比例3
本对比例人间充质干细胞体外扩增方法与实施例1的不同之处在于，改变添加剂的有效成分，采用ASA2P L-抗坏血酸-2-磷酸酯替换没食子酸，其他同实施例1。
对比例4
本对比例人间充质干细胞体外扩增方法与实施例1的不同之处在于，改变添加剂的有效成分，省去丙戊酸，调整烟酰胺的用量为4.5ng/L，其他同实施例1。
对比例5
本对比例人间充质干细胞体外扩增方法与实施例1的不同之处在于，改变添加剂的有效成分，省去烟酰胺，调整丙戊酸的用量为4.5ng/L，其他同实施例1。
试验例1 细胞生长密度比较
试验方法：对实施例1、对比例1~5完成体外扩增培养的干细胞密度按照下述方法进行统计；
细胞密度统计方法：每组干细胞用磷酸盐缓冲溶液（PBS）清洗一次，然后与胰蛋白酶-EDTA溶液在37摄氏度下反应3~5分钟，然后2倍体积含有胎牛血清的培养基用于中和胰蛋白酶的酶活性。 细胞数量通过细胞计数器（Vi-CELL AS，贝克曼库尔特公司）测量。 通过使用0.4％的台盼蓝（GIBCO-Invitrogen）将存活的细胞与死亡的细胞区分开。 在计算中，用于确定间充质干细胞存活率的参数设置包括100张图像，10-30微米大小，75％的斑点亮度和5％的斑点面积。 每组实验数据进行三次测量，结果以平均值±标准差表示。
结果如图1所示：细胞密度实施例1＞对比例5＞对比例4＞对比例2＞对比例3＞对比例1，结果表明，采用本发明添加剂，添加剂中的各组分发挥协同增效作用，提高人间质干细胞的提高扩增速率。
试验例2 细胞生长因子分泌量比较
试验方法：对实施例1、对比例1~5完成干细胞培养的培养基上清液中的生长因子进行分析。采用人类细胞因子阵列分析试剂盒（Cat＃AAH-GF-1，RayBiotech，Norcross，GA），对生长因子VEGF、HGF、EGF、PIGF的分泌量进行比较分析，分析试剂盒的具体使用方法请参见RayBiotech的目录（Cat＃AAH-GF-1）。
试验结果：VEGF的分泌量，实施例1分别是对比例1的2倍，对比例2的3倍，对比例3的1.5倍，对比例4的1.5倍，对比例5的1.5倍；
HGF、EGF分泌量，实施例1分别是对比例1的1.5倍，对比例2的4倍，对比例3的3倍，对比例4的2倍，对比例5的3倍；
PIGF分泌量，实施例1分别是对比例1的3倍，对比例2的4倍，对比例3的2倍，对比例4的5倍，对比例5的3倍。
由上述结果可知，人间充质干细胞体外培养过程中添加本发明添加剂，添加剂中的各组分发挥协同增效作用，成倍的提高细胞分泌生长因子的性能。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (3)

1.一种人间充质干细胞体外快速扩增用添加剂，用于添加于干细胞体外扩增用培养基中，该添加剂由以下有效成分组成：没食子酸、生长因子FGF-2、烟酰胺、丙戊酸、鞘氨醇-1-磷酸、吡格列酮、4-[2-(苄基氨基)-2-氧代乙酰基]-N-(2,3-二甲基苯基)苯甲酰胺、P57抑制剂；
所述添加剂在培养基中的质量浓度用量为：没食子酸1～2ng/L、生长因子FGF-210～20ng/L、烟酰胺2～3ng/l、丙戊酸1.5～3ng/L、鞘氨醇-1-磷酸1～2ng/L、吡格列酮3～4ng/L、4-[2-(苄基氨基)-2-氧代乙酰基]-N-(2,3-二甲基苯基)苯甲酰胺12～15ng/L、P57抑制剂8～10ng/L。
2.如权利要求1所述的人间充质干细胞体外快速扩增用添加剂，其特征在于，所述添加剂在培养基中的质量浓度用量为：没食子酸1.5ng/L、生长因子FGF-2 15ng/L、烟酰胺2.5ng/L、丙戊酸2ng/L、鞘氨醇-1-磷酸1.5ng/L、吡格列酮3.5ng/L、4-[2-(苄基氨基)-2-氧代乙酰基]-N-(2,3-二甲基苯基)苯甲酰胺13ng/L、P57抑制剂9ng/L。
3.一种人间充质干细胞体外快速扩增方法，其特征在于，包括以下操作步骤：
1)将体外分离的人间充质干细胞，在胶原包被的板上预培养约24小时，所述人间充质干细胞来源为脂肪组织；
2)取扩增用培养基，所述扩增用培养基为添加了10％的胎牛血清和2mM L-谷氨酰胺的L-DMEM基础培养基，在扩增用培养基中加入权利要求1～2任一项所述的添加剂，形成改性的扩增用培养基，在改性的扩增用培养基中接种步骤1)中完成预培养的人间充质干细胞，每隔3天更换新的改性的扩增用培养基，在37℃的温度、5％的二氧化碳分压、饱和湿度的环境下持续培养7天，即完成。
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