CN112375742B - 一种提高骨髓间充质干细胞成骨能力的方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于骨组织工程技术领域，具体涉及一种提高骨髓间充质干细胞成骨能力的方法及应用，本发明利用间充质干细胞的成骨能力，建立了一种基于蛋白质翻译后修饰靶点开发的一种提高骨髓间充质干细胞成骨能力的方法，即往骨髓间充质干细胞中导入去2‑羟基异丁酰化的醛缩酶A，该方法可以应用于构建用于治疗骨缺损的成骨材料中，为骨缺损修复再生提供了新的治疗方案。

Description

一种提高骨髓间充质干细胞成骨能力的方法及应用
技术领域
本发明属于骨组织工程技术领域，具体涉及一种提高骨髓间充质干细胞成骨能力的方法及应用。
背景技术
日常生活中，有许多原因可以导致骨缺损，例如骨肿瘤疾病，意外创伤，年龄增长等。而这些常见而又难以解决的骨缺损疾病严重影响了患者的运动和工作能力，给他们的生活带来诸多不便，对于临床修复材料需求也日渐增加。目前，骨缺损的治疗方法包括骨移植、二次手术内固定以及骨组织工程，但由于骨移植中自体骨的供应有限、异体骨易造成免疫排斥，以及二次手术内固定治疗后并发症较多等缺点，使得应用骨组织工程进行骨再生修复研究逐渐成为了治疗骨缺损这一世界性难题的优选方案。
间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)是一种成体干细胞，能够自我更新，具有较强的多向分化潜能，在适当的诱导条件下可以定向分化为软骨、成骨、肌肉、脂肪、神经等多种组织的细胞。MSCs广泛存在于脊髓、脂肪、脐带血等组织，来源充足，成为细胞及组织再生修复的理想候选种子细胞，被广泛地应用于骨、软骨、神经系统、心血管疾病的临床研究与治疗。其中，骨髓间充质干细胞是一种具有自我更新和多向分化潜能的干细胞，能定向分化为成骨细胞，成软骨细胞。目前，其凭借来源广泛、多向分化、低免疫原性、易于培养扩增等独特优势被广泛应用于骨缺损的重建和再生,通过其构建的复合支架材料能够促进骨缺损修复。因此骨髓间充质干细胞成为治疗骨缺损的最佳种子细胞。
目前，关于如何高效精准诱导间充质干细胞成骨分化，构建安全有效的成骨材料，并将其应用于骨组织再生修复治疗的研究仍存在许多挑战。因此，寻找骨再生修复的新治疗方法具有重要的应用价值。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足，本发明提出了一种提高骨髓间充质干细胞成骨能力的方法，通过以蛋白质翻译后修饰为靶点结合低免疫原性的骨髓间充质干细胞构建成骨材料治疗骨缺损，为骨缺损修复再生提供了新的治疗方案。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
本发明提供一种提高骨髓间充质干细胞成骨能力的方法，即往骨髓间充质干细胞中导入去2-羟基异丁酰化的醛缩酶A。
优选地，该提高骨髓间充质干细胞成骨能力的方法为：首先制作去2-羟基异丁酰化的醛缩酶A，然后将醛缩酶A导入质粒中，最后将质粒转化到骨髓间充质干细胞中。
在间充质干细胞(MSC)成骨过程中，醛缩酶A(ALDOA)的2-羟基异丁酰化修饰水平明显降低。为此，本发明通过将去2-羟基异丁酰化的ALDOA转入质粒，再将该质粒转化到骨髓间充质干细胞中，最后皮下植入至8周雌性裸鼠中，发现骨髓间充质干细胞的成骨能力显著增强。
优选地，所述醛缩酶A去2-羟基异丁酰化的靶点为第140位和第147位(K140/K147)的赖氨酸。
进一步地，所述醛缩酶A的去2-羟基异丁酰化为将醛缩酶A第140位和第147位上的赖氨酸突变为精氨酸。
本发明还提供了采用上述的一种提高骨髓间充质干细胞成骨能力的方法在构建用于治疗骨缺损的成骨材料中的应用。
本发明还提供了一种用于治疗骨缺损的成骨材料的制备方法，即以含去2-羟基异丁酰化的醛缩酶A的骨髓间充质干细胞为种子细胞，与生物相容性良好的骨诱导磷酸钙陶瓷支架载体共孵化。
优选地，所述骨诱导磷酸钙陶瓷支架载体为羟基磷灰石/β-磷酸三钙支架(HA/TCP支架)。
进一步地，所述羟基磷灰石和β-磷酸三钙的质量比为(2-4):(5-9)。具体地，所述羟基磷灰石和β-磷酸三钙的质量比为3:7。
本发明通过将去2-羟基异丁酰化的ALDOA转入质粒，再将该质粒转化到骨髓间充质干细胞中，最后将该骨髓间充质干细胞搭载羟基磷灰石(hydroxyapatite，HA)/β-磷酸三钙(β-tricalcium phosphate，TCP)支架(HA/TCP支架)，并将该支架材料皮下植入至8周雌性裸鼠中，发现HA/TCP支架中骨髓间充质干细胞的成骨能力显著增强。
优选地，共孵化时，每40mg骨诱导磷酸钙陶瓷支架载体中添加(4-6)×105个骨髓间充质干细胞。具体地，每40mg骨诱导磷酸钙陶瓷支架载体中添加5×105个骨髓间充质干细胞。
优选地，所述去2-羟基异丁酰化的醛缩酶A为第140位和第147位上的赖氨酸突变为精氨酸的醛缩酶A。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明利用间充质干细胞的成骨能力，建立了一种基于蛋白质翻译后修饰靶点开发一种提高骨髓间充质干细胞成骨能力的方法，即往骨髓间充质干细胞中导入去2-羟基异丁酰化的醛缩酶A，该方法可以应用于构建用于治疗骨缺损的成骨材料中，为骨缺损修复再生提供了新的治疗方案。
附图说明
图1为动物实验流程图；
图2为H&E染色和Masson三色染色的结果对比。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为可通过常规的商业途径购买得到的。
实施例1动物实验：醛缩酶Aldolase A(ALDOA)去2-羟基异丁酰化对骨髓间充质干细胞成骨能力的影响
动物实验流程如图1所示：
(1)成骨材料植入物的构建
分别构建空白质粒(vector，空载体)，野生型质粒(ALDOA wild-type，ALDOA WT，序列元件为：pSLenti-CMV ALDOA-3xFLAG-PGKPuro-WPRE)和突变质粒(包括K140T/K147T质粒和K140R/K147R质粒)。其中，K140T/K147T质粒(序列元件为：pSLenti-CMV ALDOA(K140T)-3xFLAG-PGKPuro-WPRE)为将ALDOA编码蛋白区域的第418-420位碱基(K140靶点)由AAG突变为ACC(命名为K140T，即赖氨酸突变为苏氨酸)、第439-441位碱基(K147靶点)由AAG突变为ACC(命名为K147T，即赖氨酸突变为苏氨酸)；K140R/K147R质粒(序列元件为：pSLenti-CMV ALDOA(K140T)-3xFLAG-PGKPuro-WPRE)为将ALDOA编码蛋白区域的第418-420位碱基由AAG突变为AGA(命名为K140R，即赖氨酸突变为精氨酸)、第439-441位碱基由AAG突变为AGA(命名为K147R，即赖氨酸突变为精氨酸)。构建质粒时，载体均选择同一模版(GL119质粒，序列元件：pSLenti-CMV-MCS-PGK-Puro，GenBank ID为NM184041.3)，上述各种质粒的构建均由上海和元生物技术公司负责。
通过使用Lipofectamine 3000转染试剂盒(Invitrogen)进行转染，将上述4种质粒(1.5μg/孔)转入第3～4代骨髓间充质干细胞(0.5×105个/孔)中。36小时后，应用成骨诱导培养基[含1000mg/L葡萄糖的细胞培养基DMEM，10％胎牛血清，1％青霉素-链霉素(Gibco)，10mM max-甘油磷酸盐(Sigma-Aldrich)，0.1M地塞米松(MB1434，大连美仑生物技术有限公司)和50M抗坏血酸(Sigma-Aldrich)]进行成骨诱导7天。然后将骨髓间充质干细胞(5×105个细胞)与40mg骨诱导磷酸钙生物陶瓷支架[四川拜阿蒙生物活性材料公司，规格THL/φ9×2，羟基磷灰石(hydroxyapatite，HA)：β-磷酸三钙(β-tricalcium phosphate，TCP)＝3:7，即12mg的HA和28mg的TCP]于37℃培养箱共同孵化1小时，离心5分钟(1500rpm)，得到分别由含vector、ALDOA WT、K140T/K147T和K140R/K147R的骨髓间充质干细胞所构建的HA/TCP支架。
(2)动物模型选择及分组
选择8周龄的雌性BALB/c裸鼠，分为4组(vector组、ALDOA WT组、K140T/K147T组和K140R/K147R组)，每组10只，并分别予以皮下植入上述由含vector、ALDOA WT、K140T/K147T和K140R/K147R的骨髓间充质干细胞所构建的HA/TCP支架(每个植入物组成均为5×105个细胞/40mg支架)。
(3)检测HA/TCP支架的成骨情况
待皮下注射由含vector、ALDOA WT、K140T/K147T和K140R/K147R的骨髓间充质干细胞所构建的HA/TCP支架8周后，将支架取出，用4％多聚甲醛固定，并用10％EDTA(pH 7.4)脱钙2周，然后用石蜡包埋并切片(5μm厚)，进行H&E染色及Masson三色染色。
(4)结果
在H&E染色中，紫蓝色为细胞核，红色为细胞质和细胞外基质(包括骨基质)。Masson染色中，蓝色为胶原纤维(骨基质的主要有机成分，黑色箭头所示)，黑色为细胞核，红色为细胞质、肌肉纤维和红细胞。
如图2的结果所示，ALDOA WT组与K140T/K147T组相比，WT组的H&E结果显示红色的骨质沉积较多、Masson染色显示蓝色的胶原纤维较多(黑色箭头)，故WT组较K140T/K147T组成骨能力强。类似的，ALDOA WT组与K140R/K147R组相比，K140R/K147R组成骨能力明显强于ALDOA WT组。而K140T/K147T组与K140R/K147R组相比，可见K140R/K147R组的成骨能力较强。Vector组、ALDOA WT组、K140T/K147T组与K140R/K147R组相比，可见K140R/K147R组的成骨能力较其余三组均增强。即模拟ALDOA的2-羟基异丁酰化导致MSCs成骨能力减弱，而去2-羟基异丁酰化修饰能增强MSCs的成骨能力。
另外，以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。

Claims (7)

1.一种提高骨髓间充质干细胞成骨能力的方法，其特征在于，在体外往骨髓间充质干细胞中导入去2-羟基异丁酰化的醛缩酶A，所述醛缩酶A的氨基酸序列的第140位和第147位为赖氨酸，醛缩酶A的去2-羟基异丁酰化为将醛缩酶A第140位和第147位上的赖氨酸突变为精氨酸。
2.根据权利要求1所述的提高骨髓间充质干细胞成骨能力的方法，其特征在于，首先制作去2-羟基异丁酰化的醛缩酶A，然后将醛缩酶A导入质粒中，最后将质粒转化到骨髓间充质干细胞中，所述醛缩酶A的氨基酸序列的第140位和第147位为赖氨酸，醛缩酶A的去2-羟基异丁酰化为将醛缩酶A第140位和第147位上的赖氨酸突变为精氨酸。
3.权利要求1或2所述的提高骨髓间充质干细胞成骨能力的方法在构建用于治疗骨缺损的成骨材料中的应用。
4.一种用于治疗骨缺损的成骨材料的制备方法，其特征在于，以含去2-羟基异丁酰化的醛缩酶A的骨髓间充质干细胞为种子细胞，与生物相容性良好的骨诱导磷酸钙陶瓷支架载体共孵化，所述醛缩酶A的氨基酸序列的第140位和第147位为赖氨酸，醛缩酶A的去2-羟基异丁酰化为将醛缩酶A第140位和第147位上的赖氨酸突变为精氨酸。
5.根据权利要求4所述的用于治疗骨缺损的成骨材料的制备方法，其特征在于，所述骨诱导磷酸钙陶瓷支架载体为羟基磷灰石/β-磷酸三钙支架。
6.根据权利要求5所述的用于治疗骨缺损的成骨材料的制备方法，其特征在于，所述羟基磷灰石和β-磷酸三钙的质量比为2-4:5-9。
7.根据权利要求4所述的用于治疗骨缺损的成骨材料的制备方法，其特征在于，共孵化时，每40mg骨诱导磷酸钙陶瓷支架载体中添加4×105-6×105个骨髓间充质干细胞。
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