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Diese Erfindung bezieht sich auf Methoden zum Nachweis niedriger
Konzentrationen von Isothiazolonverbindungen unter Verwendung von
Immunoassays.
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Isothiazolonverbindungen werden häufig als Biocide verwendet, vor allem
bei Anwendungen, bei denen Wasser oder Feuchtigkeit anwesend ist. Bei
vielen dieser Anwendungen ist es nötig, die genaue Dosierung und
Stabilität des Isothiazolon in dem System zu bestimmen. Der gegenwärtige
Stand der Technik ist die Anwendung von analytischen HPLC-Methoden (High
Pressure Liquid Chromatographie), die zeitaufwendig, kompliziert und
teuer sind. In EP 260 829 A offenbart Westinghouse Electric Corporation
monoklonale Antikörper. die mit chlorierten Phenolen reagieren,
insbesondere Pentachlorphenol, und Hybridomas, die solche Antikörper
produzieren, außerdem einen Immunoassay für solche chlorierten Phenole.
Obwohl Nachweismethoden für viele Komponenten durch die Entwicklung von
Immunoassays beträchtlich verbessert würden, sind passende Zellinien
sehr schwierig herzustellen.
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U.S. 4.865,972 von Hunter offenbart einen auf einem Antikörper
basierenden Assay für enzyminduzierende Chemikalien (wie z.B. Dibenzodioxine).
Isothiazolone sind keine enzyminduzierenden Verbindungen.
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Kohler und Milstein haben in Nature 265:495 (1975) erstmals beschrieben,
wie monoklonale Antikörper gegen rote Blutzellen von Schafen durch
Fusion eines spezifischen Antikörper-produzierenden B-Lymphozyten mit einer
Tumorzelle hergestellt werden. wobei die Fusion zu einem "unsterblichen"
selbst-reproduzierenden Hybriddone (oder "Hybridoma") führt, der in
einer
Zellkultur (in vitro) oder einem Tier (in vitro) einen einzelnen
monoklonalen Antikörper herstellen kann.
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Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Entwicklung einer
weiteren Methode zum Nachweis von Isothiazolonverbindungen.
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Es wurden neue Antikörper entdeckt, die einer Anzahl von kritischen
Anforderungen genügen, die durch die bestehende analytische Technologie
nicht erfüllt werden. Solche Antikörper erlauben den Nachweis von
Isothiazolon durch verschiedene schnelle einfache und kosteneffektive
Immunoassaytechniken. Die neuen Antikörper sind besonders nützlich für
die Analyse der Isothiazolonverbindung in Wasser, da das Isothiazolon
nicht zuerst extrahiert werden muß.
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Demgemäß umfaßt die vorliegende Erfindung ein Hybridoma, das alle
identifizierenden Merkmale der ATCC Patenthinterlegung B9-147EH9-IIIH6
aufweist, und durch dieses produzierte monoklonale oder polyklonale
Antikörper. Sie umfaßt auch eine geeignetes Verfahren zur Herstellung eines
immunogenen Konjugats eines Isothiazolons mit einem molekularen Träger
durch kovalente Bindung eines makromolekularen Trägers an ein eine
reaktive Gruppe enthaltendes Isothiazolon, bevorzugt über einen chemischen
Linker, sowie die Immunisierung eines Tieres mit dem besagten
immunogenen Konjugat, die dadurch erhaltenen Antikörper-produzierenden Zellen
von diesem Tier, wie auch die Fusion dieser Zellen mit Tumorzellen, um
Hybridomas herzustellen, die Selektion wenigstens eines Hybridoma aus
diesen Hybridomas, das Antikorper herstellt, die in der Lage sind,
besagte Isothiazolone spezifisch zu binden, wie auch die Gewinnung dieser
hergestellten Antikörper aus dem ausgesuchten Hybridoma.
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Die polyklonalen Antikörper werden hergestellt durch das Erhalten eines
immunogenen Konjugats wie oben beschrieben, die Immunisierung eines
Tieres mit dem besagten Konjugat, anschließender Blutabnahme von diesem
Tier, gefolgt von der Abtrennung des Serums aus dem Blut und der
Gewinnung der polyklonalen Antikörper aus diesem Serum.
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Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein
Verfahren zur Bestimmung des Vorhandenseins oder der Konzentration von
Isothiazolonen in einer Zusammensetzung, wobei ein Immunoassay verwendet
wird, der als Reagens einen von dem ausgewählten Hybridoma hergestellten
monoklonalen oder polyklonalen Antikörper enthält. Eine weitere
Ausführungsform ist ein Verfahren zur Isolierung oder Entfernung von
Isothiazolonen aus einer Zusammensetzung durch Inberührungbringen einer Probe
dieser Zusammensetzung mit dem von dem ausgewählten Hybridoma
produzierten Antikörper für eine gewisse Zeit und nachfolgender Messung der
Konzentration des Antigens in dieser Probe durch Bestimmung der Menge des
aufgrund des Kontakts entstandenen Antigen-Antikörperkomplexes.
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Die Erfindung richtet sich auf die Antikörper, analytische,
diagnostische. Untersuchungs-, Trennungs- und andere Verfahren der Verwendung der
Antikörper. wie auch Zusammensetzungen, die diese Antikörper für solche
Verwendungen enthalten. Außerdem richtet sich die Erfindung auf
Hybridomas, die die monoklonalen Antikörper produzieren.
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Figur 1 zeigt in einem Diagramm die prozentuale Inhibition der Bindung
von vier unterschiedlichen Arten von Isothiazolonen in einem
erfindungsgemäßen Immunoassay.
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Die Isothiazolone sind als Klasse sehr reaktive Elektrophile, die eine
Reaktionsgeschwindigkeitskonstante erster Ordnung für die Reaktion mit
Thiolen von 1,053 x 10³ mol/sek. aufweisen (P.J. Collier et al., J. Appl.
Bacteriol., 69:578-584, 1991). Außerdem hat 5-Chloro-2-methyl-3-
isothiazolon die Fähigkeit, nach der Ringöffnungsreaktion mit Thiolen
weiterzureagieren. Es ist allgemein bekannt, daß Blutseren und rote
Blutzellen einen hohen Gehalt an Glutathion haben, welches eine
reduzierte Thiolverbindung
ist. Unmittelbar nach der Zugabe von
Isothiazobnen zu Rinderserum sind die Isothiazolone weder mit Hilfe eines
Bioassays noch mittels UV-Spektroskopie oder HPLC (Proclin 300
Productbeschreibung der Rohm and Haas Company, Philadelphia, PA) nachweisbar, was
auf eine Reaktion des Isothiazolon mit einem Nudeophilen und die
Zerstörung der intakten Ringstruktur schließen läßt. Diese gezeigte
schnelle Reaktion von Isothiazolonen mit Nucleophilen, von denen bekannt ist,
daß sie Seren vorkommen, würde einen zu der Voraussage bringen, daß ein
intaktes Isothiazolon, das in ein Tier eingebracht wird mit dem Ziel,
die Antikörperherstellung zu induzieren, nicht lang genug in intaktem
Zustand überleben würde, um mit den entsprechenden Elementen des
Immunsystems zu interagieren. Aus diesem Grund ist es ziemlich unerwartet,
daß Antikörper gegen Isothiazolone induziert werden können.
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Die Verwendung von polyklonalen Antikörpern ist möglich, jedoch ist die
Verwendung von monoklonalen Antikörpern besonders bevorzugt. Monoklonale
Antikörper werden von einem einzelnen B-Lymphozytklon ("Hybridoma")
erhalten, der diese hoch spezifisch und homogen herstellt. Solch ein
Hybridoma ist tatsächlich eine sich selbst reproduzierende Zell-"Fabrik",
die einen potentiell unbegrenzten Nachschub eines Antikörpers mit einer
einzelnen, vordefinierten Spezifität herstellen kann.
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Obwohl der monoklonale Antikörper der vorliegenden Erfindung gegen 5-
Chlor-2-methyl-3-isothiazolon ("651") entwickelt wurde, zeigt er Kreuz-
Reaktivität mit anderen Isothiazolonen, z.B. 2-Methyl-3-isothiazolon
("573"), 4,5-Dichlor-2n-octyl-3-isothiazolon ("287") und 2n-octyl-3-
isothiazolon ("893"). wie in Figur 1 gezeigt ist.
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Die mit dieser Erfindung bevorzugt verwendbaren Isothiazolone haben
folgende Formel
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worin R¹ und R² unabhängig voneinander jeweils Wasserstoff, ein Halogen
oder eine (C&sub1;-C&sub4;) Alkyl Gruppe sein können, oder alternativ dazu
miteinander verbunden sein können, so daß sie einen gesättigten. ungesättigten
oder aromatischen 5- oder 6-gliedrigen carbocyclischen Ring bilden. Y
kann Wasserstoff, eine unsubstituierte oder halogen-substituierte (C&sub1;-
C&sub1;&sub8;) Alkylgruppe, eine unsubstitierte oder halogen-substituierte
Alkenyloder Alkynylgruppe mit 2 bis 8 Kohlenstoffen, eine unsubstituierte oder
halogen-substituierte (C&sub3;-C&sub8;) Cycloalkyl, eine (C&sub7;-C&sub1;&sub0;)Aralkyl oder halo-
,(C&sub1;-C&sub4;) alkyl-, oder (C&sub1;-C&sub4;) alkoxy-substituierte (C&sub7;-C&sub1;&sub0;)Aralkyl oder
eine Arylgruppe, oder halo-,(C&sub1;-C&sub4;)) alkyl-, oder (C&sub1;-C&sub4;)
alkoxy-substituierte Arylgruppe von bis zu 10 Kohlenstoffatomen sein.
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Typische Vertreter für Y Substituenten schließen Methyl, Ethyl, Propyl,
Isopropyl, Butyl, Hexyl, Octyl, Cyclohexyl, 4-Methoxyphenyl, 4-
Chlorphenyl, 3,4-Dichlorphenyl, Benzyl, 4-Methoxybenzyl, 4-Chlorbenzyl,
Phenethyl, 4-Phenylbutyl, Chlormethyl, Chlorpropyl, Wasserstoff und
ähnliche ein.
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Das besonders bevorzugte Isothiazolon ist
5-Chlor-2-methyl-3-isothiazolon.
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Die monoklonalen Antikörper werden gemacht, indem ein immunogenes
Konjugat der Isothiazolone und eines makromolekularen Trägers hergestellt
wird, ein Tier mit diesem Konjugat immunisiert wird, Antikörper
produzierende
Zellen von diesem Tier erhalten werden, die Zellen mit
Tumorzellen fusioniert werden, um Hybridomas herzustellen, aus diesen
Hybridomas wenigstens eines ausgewählt wird, das Antikörper herstellt, die
mit Isothiazolonen reagieren, und schließlich die hergestellten
Antikörper aus diesem ausgewählten Hybridoma gewonnen werden.
Eine in vivo Methode zur Herstellung monoklonaler Antikörper, die mit
Isothiazolonen reagieren, beinhaltet die intraperitoneale Plazierung
eines Hybridoma, das solche Antikörper produziert, in einen
zellkompatiblen oder immunsupprimierten Wirt, und die Gewinnung der hergestellten
Antikörper aus der Bauchwasser-Flüssigkeit des Wirtes. Eine
kontinuierliche Zellinie, die monoklonale Antikörper gegen Isothiazolone
produziert, wird durch folgenden Ablauf hergestellt: Zunächst wird ein
immunogenes Konjugat des Isothiazolons mit einem makromolekularen Träger
hergestellt, ein Tier mit diesem Konjugat immunisiert, die Antikörper
produzierenden Zellen aus diesem Tier erhalten, die Antikörper
produzierenden Zelle mit Tumorzellen fusioniert, um Hybridomas herzustellen, aus
diesen Hybridomas ein Hybridoma ausgewählt, das Antikörper produziert,
die mit Isothiazolonen reagieren, und dieses ausgewählte Hybridoma durch
Klonierung zu einer Zellinie vermehrt. Die Antikörper, die durch die
ausgewählte kontinuierliche Zellinie hergestellt werden, werden als
"Anti-651"-Antikörper bezeichnet.
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Um die Anwesenheit oder die Konzentrationen von Isothiazolonen in einer
Probe nachzuweisen, werden monoklonale Antikörper, die mit den
Isothiazolonen reagieren. zu der Probe zugegeben, und die Anwesenheit oder die
Konzentrationen der Isothiazolone durch ein Immunoassay bestimmt, worin
die monoklonalen Antikörper als Reagenzien benützt werden.
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Die monoklonalen Antikörper werden bevorzugt in einem passenden Behälter
zur Verfügung gestellt.
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Der Anti-651-Antikörper kann an das Enzym Meerrettich-Peroxidase ("HRP")
gemäß Standardverfahren gekoppelt werden. Dieser enzymgekoppelte
Antikörper kann als ein immunologischer Farbstoff verwendet werden, um das
örtliche Vorkommen von Isothiazolonen in festen Matrizes wie z.B. Holz,
Leder und Plastik zu bestimmen. Die zu bestimmende Matrix wird mittels
einer geeigneten Methode in dünne Scheiben geschnitten und anschließend
mit dem enzymgekoppelten Antikörper für eine gewisse Zeit inkubiert,
während der dieser mit dem Isothiazolon oder den Isothiazolonen
reagiert. Nach der Inkubation wird ungebundener Enzymantikörper durch Wa
schen mit Puffer, wie z.B. PBS-Tween entfernt. Anschließend wird das
behandelte Matrixmaterial mit einem Substrat des Enzyms inkubiert, von
denen einen Anzahl farbgebender Substanzen kommerziell erhältlich sind.
Die Matrix wird mit solch einem Volumen an Substrat behandelt, daß das
farbige Produkt nicht von der Stelle, an der die Reaktion stattfindet,
wegdifundiert. Alternativ dazu kann das Substrat in eine Membran
eingelagert sein, die über die behandelte Matrix gelegt wird. Ein Beispiel
für solch ein Produkt ist das "Enzygraphic Web" von International
Biotechnologies Inc. ("IBZ"). Das Isothiazolon wird durch visuelle oder
mikroskopische Untersuchungen der Matrix oder der substrat-imprägnierten
Membran lokalisiert.
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Eine Alternative zur Verwendung eines enzymgekoppelten Antikörpers ist
die Verwendung von ferritin- oder goldmarkierten Antikörpern, oder die
Verwendung von radioaktiv markierten Antikörpern. Radioaktiv markierte
Antikörper erfordern die Exposition der behandelten Matrix gegenüber
einem fotografischen Film.
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Die Antikörper können auch dafür verwendet werden, die Anwesenheit und
Konzentration von Isothiazolonen in festen Matrizes wie z.B. Holz,
Plastik oder Leder zu bestimmen. Die feste Matrix kann auf Anwesenheit von
Isothiazolon getestet werden durch Tränken von Lagen der Matrix in einer
Lösung eines Protein-blockierenden Agens, wie z.B. Magermilch oder
Rinder
Serum Albumim ("BSA"), für 30-60 Minuten. Die Lagen werden dann kurz
mit PBS-Tween (PBS-T)-Puffer abgespült, und dem Anti-651-Antikörper, der
kovalent an Meerrettich-Peroxidase gebunden ist, für 15 Minuten
ausgesetzt. Die Lagen werden dann zweimal jeweils für eine gewisse Zeit in
PBS-T-Puffer gewaschen. Der gebundene Anti-651-HRP-Komplex kann durch
Überführen der Lagen in einen Behälter, der HRP-Substrat enthält, z.B.
ABTS (2,2'-Azino-bis-3-ethylbenthiazolin-6-Sulfonsäure), sichtbar
gemacht werden. Alternativ dazu kann das Enzymsubstrat auf die Oberfläche
des Holzes aufgebracht werden, entweder als Lösung oder als an einen
festen Träger fixiertes Substrat, wie es z.B. als Enzygraphic Web (IBI)
kommerziell erhältlich ist. Das Entstehen einer Farbe zeigt die
Anwesenheit von Isothiazolon an, und die Intensität der Farbe steht in Relation
zu der Konzentration des Isothiazolons.
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Ein immunologisches Verfahren auf Basis einer selektiven immunologischen
Reaktion, in der ein monoklonaler, gegen Isothiazolone reaktiver
Antikörper als der Antikörper verwendet wird, kann für die Isolierung oder
das Entfernen von Isothiazolonen aus einem Gemisch verwendet werden.
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Eine Zusammensetzung zur Isolierung oder Entfernung einer
Isothiazolonkomponente aus einem Gemisch, das diese Komponente enthält, enthält eine
effektive Menge eines monoklonalen Antikörpers, der mit der
Isothiazolonkomponente reagiert, wobei der Antikörper auf einer Matrix
immobilisiert oder in Mischung mit einem Träger vorliegt.
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Polyklonale Antikörper, die mit der Isothiazolonkomponente reagieren.
werden hergestellt, indem ein immunogenes Konjugat des Isothiazolons mit
einem makromolekularen Träger hergestellt wird, ein Tier mit diesem
Konjugat immunisiert wird, dem Tier Blut abgenommen wird, das Serum von dem
Blut getrennt wird und die Antikörper aus diesem Serum gewonnen werden.
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Ein immunogenes Konjugat, das eine Isothiazolonkomponente enthält, die
kovalent an einen makromolekularen Träger gebunden ist, wird durch
kovalente Verknüpfung eines chemischen Linkers an den makromolekularen
Träger und kovalente Verknüpfung eines Derivats des Isothiazolons, welches
eine reaktive Gruppe enthält, mit dem chemischen Linker hergestellt,
wobei das immunogene Konjugat gebildet wird.
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In einer besonders bevorzugten Ausführungsform haben die monoklonalen
Antikörper der vorliegenden Erfindung die Charakteristika der monoklona
len Antikörper, wie sie durch die Hybridoma-Zellinie ATCC HB 11435 oder
Mutanten oder Varianten dieser Linie hergestellt werden. ATCC HB 11435
ist eine biologisch reine Kultur, erhältlich von der ständigen Sammlung
der "American Type Culture Collection (ATCC)", 12301 Parklawn Drive,
Rockville, Maryland USA 20852 und wurde am 14. Mai 1991 hinterlegt. ATCC
HB 11435 wurde durch Fusion eines Maus-B-Lymphozyten und einer
Mausplasmacytomazelle hergestellt. Die von diesen Hybridomas hergestellten
Immunglobuline (Antikörper) sind von der IgG-Klasse. Die Monoklonalität
der von ATCC HB 11435 hergestellten Antikörper wurde durch Reklonierung
der Hybridoma, die diese produzieren, abgesichert.
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Die von ATCC HB 11435 hergestellten monoklonalen Antikörper verhindern,
daß andere monoklonale Antikörper, die durch andere Hybridomas
hergestellt worden sind und auf andere Art und Weise mit 5-Chlor-2-methyl-3-
isothiazolon reagieren würden, diese Reaktion eingehen können.
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Die Hybridomas und kontinuierliche Zellinien können folgendermaßen
hergestellt werden:
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(a) Herstellung eines immunogenen Konjugats eines makromolekularen
Trägers und dem speziellen Isothiazolon, gegen das ein monoklonaler
Antikörper gesucht wird,
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(b) Immunisierung eines Tieres mit diesem Konjugat,
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(c) der Erhalt von Antikörper produzierenden Zellen aus diesem Tier,
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(d) Fusion der Antikörper produzierenden Zellen mit Tumorzellen, um
Hybridomas herzustellen,
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(e) das Heraussuchen eines Hybridoma unter den Hybridomas, das
Antikörper produziert, die mit dem immunogenen Konjugat reagieren, welches
oben unter (a) hergestellt wurde,
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und um eine Zellinie herzustellen:
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(f) das Heraussuchen eines Hybridoma unter den Hybridomas, das
Antikörper produziert, die mit freien Isothiazolonen reagieren, und
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(g) die Klonierung.
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Die monoklonalen Antikörper können aus dem herausgesuchten Hybridoma
oder den Hybridomas gewonnen werden, bevor oder nachdem diese durch
Klonierung in eine kontinuierliche Zellinie vermehrt worden sind.
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Es können als Alternative auch andere Zellen als Milzzellen für die
Herstellung von Antikörpern gegen Isothiazolone verwendet werden. Die
Hybridomas, die gemäß dieser Ausführungsform hergestellt wurden, können
für die Herstellung der erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper
verwendet werden, indem sie in einem passenden Medium kultiviert werden und
die Antikörper aus diesem Medium gewonnen werden.
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Substanzen mit Molekulargewichten von ungefähr 1.000 oder weniger, wie
z.B. 5-Chlor-2-methyl-3-isothiazolon (Molekulargewicht 152), induzieren
gewöhnlich nicht die Herstellung von Antikörpern, da sie nicht immunogen
sind. Jedoch können solche Substanzen häufig auf chemischem Wege an
größere, immunogene Trägermoleküle angebunden werden, wie z.B. ein
Kohlenhydrat oder ein Protein, um die Herstellung der Antikörper gegen die
kleinere Substanz zu induzieren, die in dieser Anordnung als "Hapten"
bezeichnet wird. Die üblichen Techniken zur Herstellung eines
immunogenen Konjugates aus einem Hapten und einem makromolekularen Träger sind
dem Fachmann bekannt. Siehe zum Beispiel US 4,456,691 von Stark,
veröffentlicht
am 26. Juni 1984 und Albro et al., Toxicol Appl. Pharmacol.
50. 137-146 (1979).
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Die Methoden von Albro et al. und Stark beinhalten die kovalente
Binddung des Haptens an einen makromolekularen Träger über eine chemische
Brücke oder einen Linker. Der chemische Linker ist ein bifunktionelles
Molekül, das reaktive Gruppen an den sich gegenüber liegenden Enden
enthält. Die reaktiven Gruppen erlauben dem chemischen Linker mit reaktiven
Gruppen auf dem Makromolekül und dem Hapten zu reagieren, so daß das
eine Ende des chemischen Linkers kovalent an das Hapten gebunden ist. Der
chemische Linker wird zunächst an das Hapten angehängt und die
entstehende Zusammensetzung wird dann über die reaktive Gruppe auf der anderen
Seite des chemischen Linkers an den makromolekularen Träger gebunden.
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Es ist bekannt, daß Antikörper, die gegen an Trägerproteine gekoppelte
kleine chemische Verbindungen entwickelt wurden, dazu neigen, nicht nur
die Struktur der Chemikalie zu erkennen, sondern auch die Strukturen des
Linkers zwischen dem der Chemikalie und dem Protein, und sogar die
Strukturen auf dem Protein, die an die Verknüpfungsstelle mit dem Linker
angrenzen. Die Ergebnisse dieser Erkennung von untergeordneten
Strukturen ist die Unfähigkeit oder zumindest die verringerte Fähigkeit eines
Antikörpers, an die freie Chemikalie zu binden. Dies ist insbesondere
ein Problem bei monoklonalen Antikörpern. Dieses Problem muß überwunden
werden, wenn monoklonale Antikörper gegen Chemikalien für die
quantitative Analyse verwendet werden sollen. Überraschenderweise wurden hier
Antikörper entdeckt, die diese Funktion mit Isothiazolonverbindungen
erfüllen, wodurch ein seit langem empfundener Mangel an technischer
Fähigkeit behoben wurde.
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Wenn das immunogene Konjugat einmal hergestellt ist, wird es unter
Anwendung bekannter Techniken für die Immunisierung eines tierischen
Wirtes verwendet. Solche Techniken beinhalten üblicherweise die Impfung,
aber sie können ebenso andere Arten der Darreichung beinhalten. Es wird
eine genügende Menge des Konjugats verabreicht, um eine immunogene
Antwort in dem tierischen Wirt auszulösen.
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Es kann jeder Wirt, der Antikörper gegen das Konjugat produzieren kann,
verwendet werden. Üblicherweise werden Tiere verwendet aus der Gruppe
Kaninchen und Nager wie z.B. Ratten oder Mäuse. Mäuse und Ratten werden
für die vorliegende Erfindung bevorzugt.
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Wenn das Tier einmal immunisiert ist und genügend Zeit vergangen ist.
daß es angefangen hat, Antikörper gegen das Konjugat herzustellen,
können polyklonale Antikörper durch dem Fachmann bekannte Techniken daraus
gewonnen werden. Die übliche Methode schließt die Blutabnahme von dem
Tier und das Abtrennen des Serums vom Blut ein. Das Serum, das Antikör
per gegen die Isothiazolone, die bei der Herstellung des Konjugats als
Kapten verwendet wurden, enthält, kann als ein Antiserum gegen die
Isothiazolone verwendet werden. Alternativ dazu können die Antikörper
aus dem Serum gewonnen werden. Affinitätsreinigung ist eine bevorzugte
Technik für die Gewinnung von gereinigten polyklonalen Antikörpern gegen
Isothiazolone aus dem Serum.
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Monoklonale Antikörper produzierende Zellen werden aus dem immunisierten
Tier gewonnen. Obwohl jegliche Antikörper produzierenden Zellen
verwendet werden können, werden die B-Lymphocyten, die aus der Milz des Tieres
erhalten werden, bevorzugt.
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Die Antikörper produzierenden Zellen werden mit Tumorzellen fusioniert,
um Hybridomas herzustellen. Der Begriff "Tumorzelle" wird hierbei für
jede Zelle verwendet, die zur Fusion mit einer Antikörper produzierenden
Zelle fähig ist, wodurch eine hybride "unsterbliche" Zelle erschaffen
wird, was bedeutet. daß diese fähig ist, kontinuierlich in vitro zu
wachsen. Bevorzugte Tumorzellen sind Antikörper produzierende Zellen,
die transformiert worden sind und ihre Fähigkeit zur
Immunglobulinherstellung verloren haben. Solche Zellen schließen Ratten-Myelomazellen
und Mäuse-Plasmacytomazellen ein. Besonders bevorzugt sind Mäuse-
Plasmacytomazellen oder Ratten-Myelomazellen. die in Bezug auf das Enzym
Hypoxanthinquaninphosphoribosyltransferase (HGPRT) Gen-negativ sind, da
diese die Selektion von Hybridomas gegenüber unfusionierten Antikörper
produzierenden Zellen oder Plasmacytoma- oder Myelomazellen erlauben,
wenn sie auf einem Medium gezogen werden, das Hypoxanthin, Aminopterin
und Thymidin enthält.
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Es sind verschiedene Tumorzellen, die für die Fusion mit Antikörper
produzierenden Zellen verwendbar sind, bekannt und fertig erhältlich. Eine
solche Art von Zelle ist die Maus-Plasmacytomazellinie P3-X63-Ag8.653.,
beschrieben in Kearney, Journal of Immunology, 123. 1548 (1979). Eine
andere Zellinie ist die Ratten-Myelomazellinie YB2.0, beschrieben in
Milstein, Journal of Cell Biology, 93:576-582 (1982). Diese Zellinien
sind von der amerikanischen Type Culture Collection, Rockville,
Maryland, erhältlich, worin diese mit den Kennzeichnungsnummern ATCC CRL
1580 bzw. ATCC CRL 1662 bezeichnet sind.
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Es sollte angemerkt werden, daß die Antikörper produzierende Zelle und
die Tumorzelle von unterschiedlichen Tierspezies sein können. Als
Beispiel hierfür siehe Nowinski et al., Science, 210:537 (1980).
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Wie zuvor erwähnt, ist es nötig, wenn die Zellen einmal fusioniert sind,
die Hybridomas von den unfusionierten Zellen zu trennen. Die Antikörper
produzierenden Zellen sterben normalerweise nach ein paar Tagen in
Kultur, die Tumorzellen sind dagegen "unsterblich". Wendet man jedoch
Tumorzellen an, die HGPRT-negativ sind und läßt man die fusionierten
Zellen in einem Medium wachsen, das Hypoxanthin. Aminopterin und Thymidin
enthält, werden die Hybridomas auf natürliche Weise selektiert, da die
Tumorzellen nicht in der Lage sind, in solch einem Medium zu überleben.
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Es können allerdings auch andere bekannte Selektionstechniken verwendet
werden.
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Nachdem die Hybridomas selektiert sind&sub1; werden diese evaluiert, um zu
bestimmen, welche von ihnen Antikörper gegen die Isothiazolone
produzieren. Verschiedene dem Fachmann bekannte Immunoassays können verwendet
werden, um die Kulturüberstände der Hybridomas zu evaluieren. Es muß
viel Sorgfalt aufgewendet werden, um die Hybridomas zu identifizieren,
die monoklonale Antikörper ausschließlich gegen die Isothiazolone
herstellen, nicht gegen den Komplex Isothiazolon-makromolekularer Träger.
Dies ist nützlich für den Erhalt der monoklonalen Antikörper, die
gewünscht sind, und durch die vorliegende Erfindung werden solche
bereitgestellt, die mit freien, das heißt unkonjugierten oder ungebundenen
Isothiazolonen reagieren.
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Die bevorzugte Selektionstechnik ist ein erstes Durchsuchen ("Screen")
mit Hilfe eines Enzymimmunoassays (EIA), um die Hybridomas zu
identifizieren, die Antikörper gegen das Konjugat oder gegen die Isothiazolone
herstellen. Diese Hybridomas werden dann mit Hilfe eines Enzymimmunoas
says, der auf kompetitiver Inhibition beruht ("Competitive Inhibition
Enzyme Immunoassay CIEIA"), durchsucht, der die Fähigkeit eines freien
Isothiazolons, wie z.B. 5-Chloro-2-methyl-3-isothiazolon abschätzen
läßt, die Bindung des monoklonalen Antikörpers an das Isothiazolon/den
Proteinträger zu unterbinden. Der CIEIA wird entsprechend der Methode
durchgeführt, die in Hunter et al., FEBS lett. 149:147-151 (1982)
veröffentlicht ist.
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Wenn die monoklonalen Antikörper produzierenden Hybridomas einmal
selektiert sind, können die Antikörper von solchen Hybridomas durch bekannte
Techniken gewonnen werden. Generell ist es nützlich, eine oder mehrere
von den monoklonalen Antikörper produzierenden Hybridomas zu klonieren,
um sie in einer kontinuierlichen Zellinie zu vermehren, die dafür
verwendet
werden können, die monoklonalen Antikörper in quantitativen
Mengen zu produzieren.
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Die zuvor erwähnten Methoden der Herstellung von monoklonalen
Antikörpern sind in vitro Methoden. Ein in vivo Prozeß zur Herstellung
monoklonaler Antikörper gegen Isothiazolone schließt das Einbringen eines
Hybridoma, das die Antikörper intraperitoneal produziert, in einen
histocompatiblen oder immunosupprimierten Wirt ein. Diese veranlassen den
Wirt, Tumoren im Bauchwasser zu entwickeln, welche wiederum eine
Flüssigkeit produzieren, die die von dem Hybridoma hergestellten
monoklonalen Antikörper enthält. Nach Verstreichen einer zur Produktion der
Antikörper in genügender Menge genügend langen Zeit, können diese durch
bekannte Techniken gewonnen werden. Zum Beispiel kann das Bauchwasser
entnommen werden und die monoklonalen Antikörper in reiner Form durch
Affinitätsreinigung daraus gewonnen werden. Diese Methode ist besonders
geeignet zur Herstellung der monoklonalen Antikörper in kommerziell
anwendbaren Mengen.
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Ebenso groß wie die Anzahl von verschiedenen Systemen und Methoden, die
für die Produktion von mit Isothiazolonen reaktiven monoklonalen
Antikörpern angewendet werden können, ist die Anzahl der aus diesen
Maßnahmen resultierenden monoklonalen Antikörpern, die von dem Antikörper in
den unten beschriebenen Beispielen verschieden sind. Jedoch sind solche
monoklonalen Antikörper, deren Herstellung durch die darin enthaltenen
Lehren möglich sind, dennoch eindeutig innerhalb des Umfangs dieser
Erfindung. Die hervorragende Eigenschaft solcher Antikörper in Hinsicht
auf die Belange dieser Erfindung ist neben ihrer Monoklonalität ihre
Reaktivität auf jede Weise mit Isothiazolonen, unabhängig von der
Ursprungsspezies, dem Isotyp, der molekularen Spezifität, der Affinität,
der Produktionsmethode oder der Verwendung eines besonderen Hybridoma-
Typs bei deren Produktion.
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Die monoklonalen und polyklonalen Antikörper können dazu verwendet
werden, Isothiazolone in Materialien zu identifizieren, insbesondere 5-
Chlor-2-methyl-3-isothiazolon, und die Konzentration der Chemikalie in
diesen Materialien zu bestimmen. Solche Materialien schließen z.B.
Verunreinigungen, Wasser, Nahrungsmittel und Körperflüssigkeiten ein. Bei
der Anwendung der Antikörper als ein Reagens in verschiedenen
Immunoassays zur Bestimmung der Anwesenheit oder Konzentration von
Isothiazobnen, stellen die der vorliegenden Erfindung einen verbesserten Assay zur
Verfügung. Der Nachweis ist bequem, schnell, sensitiv und spezifisch.
Die Immunoassays, in denen die Antikörper der vorliegenden Erfindung
verwendet werden können, umfassen Radioimmunoassays, ein Assay zur
kompetitiven Immunoprecipitation, einen enzymgekoppelten
Immunoabsorbtionsassay und einen Immunofluorescenzassay, sind jedoch nicht auf diese
begrenzt. Die monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung sind im
allgemeinen die bevorzugten Antikörper, obwohl bei bestimmten
Anwendungen die polyklonalen Antikörper bevorzugt sind.
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Eine Zusammensetzung zur Bestimmung der Anwesenheit oder Konzentration
von Isothiazolonen in einem Material enthält eine solche Konzentration
von Antikörpern gegen die Chemikalie, die wirksam ist, um die
Anwesenheit der Chemikalie nachzuweisen, oder deren Menge zu quantifizieren.
Die Antikörper können mit jedem geeigneten Träger gemischt oder daran
angebunden werden, wie z.B. Gummipartikel oder
Plastik-Microtiterplatten. Sie können außerdem mit einem Enzym oder mit einem Farbstoff
gekoppelt oder radioaktiv markiert sein, abhängig davon, welche
immunologische Methode angewendet wird. Daraus ergibt sich, daß jedes
Assaysystem, bei dem monoklonale oder polyklonale Antikörper mit Isothiazolonen
angewendet werden, die 5-Chloro-2-methyl-3-isothiazolon einschließen,
durch diese Erfindung umfaßt wird.
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Die monoklonalen und polyklonalen Antikörper sind auch für die
Isolierung, Reinigung, Neutralisation und/oder Entfernung von Isothiazolonen
aus komplexen Mischungen von Lösungen verwendbar auf der Basis einer
selektiven immunologischen Reaktion. Die Anwendung von Antikörpern, die
mit Isothiazolonen reaktionsfähig sind, stellt eine Verbesserung
gegenüber den bekannten Methoden dar.
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Monoklonale Antikörper werden gegenüber polyklonalen Antikörpern
bevorzugt. Aufgrund ihrer hohen Spezifität und ihrer Erhältlichkeit in nahezu
unbegrenzten Mengen, können monoklonale Antikörper in einem breiten
industriellen und kommerziellen Spektrum verwendet werden. Zum Beispiel
sind Anti-651-Antikörper anwendbar zur Trennung und Reinigung von 5-
Chlor-2-methyl-3-isothiazolon aus einer Mischung von anderen
Isothiazolonen oder ähnlichen organischen Komponenten. Die Mischung wird mit
immobil isierten monoklonalen Antikörpern gegen
5-Chlor-2-methyl-3-isothiazolon in Kontakt gebracht, die das 5-Chlor-2-methyl-3-isothiazolon
aus der Mischung abtrennen, indem immobilisierte Komplexe des 5-Chlor-2-
methyl-3-isothiazolon, gebunden an den Antikörper. entstehen. Nachdem
die Mischung entfernt worden ist, wird das
5-Chlor-2-methyl-3-isothiazolon von dem Antikörper abgetrennt und in gereinigter Form durch
bekannte Techni ken zurückgewonnen.
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Eine für die Reinigung oder Entfernung von Isothiazolonen aus komplexen
Mischungen verwendbare Zusammensetzung enthält eine wirksame Menge des
monoklonalen Antikörpers, wobei dieser an eine annehmbare Matrix
gebunden ist, oder mit einem annehmbaren Träger vermischt ist, wodurch die
Reaktion und Bindung an die Isothiazolone ermöglicht wird. Jedoch können
für bestimmte Mischungen polyklonale Antikörper bevorzugt werden.
Die monoklonalen Antikörper dieser Erfindung sind ebenso verwendbar als
Reagenzien für die Forschung bezogen auf die Struktur und Funktion von
Isothiazolonen, insbesondere 5-Chlor-2-methyl-3-isothiazolon. Deren
Spezifität erlaubt ihnen, für immunochemische und
Struktur-Funktionsanalysen dieser Chemikalien verwendet zu werden, und macht sie für diese
Anwendung nützlicher als die weniger spezifischen polyklonalen
Antikörper.
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Die Zusammensetzungen sind auch als Untersuchungsreagenzien verwendbar.
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Die folgenden, nicht einschränkenden Beispiele stellen einige
Ausführungsformen der Erfindung dar.
Beispiele
Beispiel 1 - Synthese der immunisierenden Konjugate
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Zu 3,3'-Dithiodipropionsäure (21.03 g, 0,1 mol) wird unter externer
Kühlung Thionylchlorid (71.38 g, 0,6 mol) und Pyridin (0,5 ml) zugegeben.
Diese Mischung wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Das
überschüssige Thionylchlorid wurde im Vakuum entfernt, um 3,3'-
Dithiodipropionylchlorid in Form eines hell bemsteinfarbenen Öls
(23.7 g, 100 % Ausbeute) zu erhalten, welches in dem nächsten Schritt
ohne Reinigung weiter verwendet wurde.
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Eine Mischung aus Methyl-4-aminobutyrat-HCl (37.2 g, 0,242 mol) und
Triethylamin (67.8 ml, 0,486 mol) in Ethylendichlond (EDC. 300 ml)
wurde für 30 Minuten bei Raumtemperatur genihrt. Das
3,3'-Dithiodipropionylchlorid wurde in 50 ml EDC gelöst und tropfenweise unter
Kühlung zu der gerührten Lösung zugegeben, wobei die Temperatur bei
ungefähr 25ºC gehalten wurde. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur über
Nacht rühren gelassen. Die Mischung wurde dann in Wasser gegossen und
die organische Phase abgetrennt. Die organische Phase wurde daraufhin
mit gesättigter NaHCO&sub3;-Lösung, Wasser und dann Salzwasser gewaschen. Die
Lösung wurde dann getrocknet und konzentriert, was einen halbfesten
braunen Rückstand ergab. Dieser Rückstand wurde in Ethylacetat unter
Kühlung zerrieben, was 3,3'-Dithio-di-N-(3-methoxycarbonylpropyl)-
propionamid (Komponente 1) in Form eines fast weißen Feststoffes ergibt,
der filtriert und getrocknet wurde (20,4 g).
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Komponente 1 wurde zu dem Isothiazolon cyclisiert. 3,3'-dithio-di-N-(3-
methoxycarbonylpropyl)propionamid (12,0 g, 0,029 mol) und
Sulfurylchlorid (19.8 g, 0.147 mol) wurden gleichzeitig über den Zeitraum einer
Stunde in eine Flasche eingefüllt, die gekühltes (0ºC) und gerührtes
Ethylacetat (120 ml) enthielt. Das Amid und Sulfurylchlorid wurden in 24
gleichen Portionen von 0.5 g bzw. 0,5 ml alle 2,5 Minuten eingefüllt.
Während des Verlaufs der Zugabe bildete sich ein Niederschlag. Nachdem
die Zugabe abgeschlossen war, wurde die Mischung bei 0ºC für 30 Minuten
gerührt, und dann wurde zugelassen, daß sie sich auf Raumtemperatur
erwärmt. Die Mischung wurde eine Stunde lang bei Raumtemperatur gerührt.
auf 0ºC gekühlt und filtriert. Der Feststoff wurde in Wasser aufgelöst
und mit Chloroform (CHCl&sub3;) extrahiert. Die Chloroformphase wurde erst mit
Wasser und dann mit Salzwasser gewaschen. Das Chloroform wurde einmal
getrocknet und das Lösemittel entfernt, wodurch
5-Chlor-2-(3-methoxycarbonylpropyl)-3-isothiazolon als ein weißer Feststoff erhalten wurde
(Ausbeute 8,9 g, Schmelzpunkt 54,6ºC).
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Zur Herstellung des 2-(3-methoxycarbonylpropyl)-3-isothiazolons wurde
Komponente 1 (1,02 g, 2,5 mmol) in 25 ml destilliertem Ethylacetat
gelöst und auf 0ºC gekühlt. Sulfurylchlorid (1,04 g, 7,75 mmol) wurde
langsam tropfenweise zugegeben und die gelbe Lösung eine Stunde lang bei
0ºC gerührt. Während dieser Zeit bildete sich ein weißer Niederschlag
(5-Chloro-2-(3-methoxycarbonylpropyl)-3-isothiazolon (200 ml)), welcher
durch Filtration entfernt wurde. Das entstandene Filtrat wurde
konzentriert, und der Rückstand flash-chromatographiert (10 % Aceton-
Chloroform), um 2-(3-methoxycarbonylpropyl)-3-isothiazolon (120 mg) in
Form eines durchsichtigen Öls zu erhalten.
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Die Methylester der Isothiazolone wurden zu den freien Säuren
hydrolysiert. 5-Chlor-2-(3-methoxycarbonylpropyl)-3-isothiazolon (4,0 g) wurden
in 6 ml Essigsäure aufgenommen. Zu dieser gerührten Lösung wurde bei
Raumtemperatur 6 M wässrige HCl (7 ml) zugegeben. Diese Lösung wurde
anschließend bei Raumtemperatur 24 Stunden gerührt, während dieser Zeit
bildete sich ein weißer Niederschlag. Die Lösung wurde filtriert und das
Filtrat weiter konzentriert, um mehr desselben Niederschlags zu erhalten
(5-Chlor-2-(3-hydroxycarbonylpropyl)-3-isothiazolon). Die vollständige
Ausbeute war 2,95 g (Schmelzpunkt 158-161ºC).
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2-(3-Methoxycarbonylpropyl)-3-isothiazolon wurde in einer Lösung von
4 ml Eisessig und 2 ml 6 N Hydrochlorsäure gelöst. Dies wurde eine
Stunde bei 85ºC gerührt. Diese Lösung wurde im Vakuum konzentriert, und der
Rückstand zwischen Wasser und Ethylacetat zweimal aufgeteilt. Die
Ethylacetatphasen wurden kombiniert, getrocknet und konzentriert. Der
erhaltene Feststoff wurde aus Ethylacetat umkristallisiert, wodurch ein
hellgelbes Pulver erhalten wurde.
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Die freie Säure der Isothiazolone wurde dann an Rinderserumalbumin
("BSA") und Thyroglobulin ("THY") gekoppelt.
5-Chlor-2-(3-hydroxycarbonylpropyl)-3-isothiazolon (0,45 g, 0.002 mol) und n-Bu&sub3;N (0.95 g,
0.0051 mol) wurden zu Dioxan (5 ml) zugegeben. Zu dieser gerührten
Suspension wurde Isobutylchlorformiat (0,77 g, 0,0056 mol) tropfenweise bei
0ºC zugegeben. Durch die Zugabe des Isobutylchlorformiats wurde das
suspendierte Material gelöst. Diese Lösung wurde eine Stunde bei
Raumtemperatur gerührt. Dies ergab das gemischte Anhydrid von Isothiazolon-
Isobutylformiat, das ohne Isolierung weiter verwendet wurde. BSA wurde
in deionisiertem Wasser (20 ml) gelöst, gefolgt von einer Zugabe einer
kleinen Menge von Dioxan (1 ml). Zu dieser bei 0ºC gerührten BSA-Lösung
wurde tropfenweise die Lösung des Isothiazolon-Isobutylformiat
gemischten Anhydrids zugegeben. Die Zugaberate war so, daß die
Reaktionstemperatur bei 0ºC gehalten wurde. Nachdem die Zugabe abgeschlossen war,
wurde
die Mischung eine Stunde bei 0ºC gerührt und dann zugelassen, daß sie
sich auf Raumtemperatur aufwärmt, gefolgt von einer Stunden Rühren bei
Raumtemperatur. Die Mischung wurde anschließend in einen Dialyseschlauch
überführt und 24 Stunden dialysiert, daraufhin lyophilisiert, um das
Wasser zu entfernen. Es wurde ein helles, weißes Pulver (651-BSA-
Konjugat) erhalten (2,9 g). Die Konjugate von 651 an THY (651-THY), 573
an BSA (573-BSA) und 573 an THY (573-THY) wurden auf dieselbe Weise
hergestellt.
Beispiel 1A - Immunisierungen
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BALB/c-Mäuse wurden von Taconic Farms, New York, USA, erhalten und mit
651-BSA, 651-THY, 573-BSA oder 573-THY Konjugaten immunisiert, die wie
im vorherigen Beispiel beschrieben hergestellt wurden, wobei die
Immunisierung entsprechend dem Zeitplan, der in Tabelle 1 dargelegt ist.
durchgeführt wurde, worin CFA "Komplettes Freundsches Adjuvans", IFA
"Nicht komplettes Freundsches Adjuvans", PBS "Physiologisch gepufferte
Salzlösung". "sc" subcutan und "ip" intraperitoneal bedeutet.
Tabelle I
Beispiel 1B - Durchsuchen der Isothiazolon Antiseren
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Von den nach dem oberen Beispiel immunisierten Mäusen wurden Blutproben
genommen. Die Seren wurden durch Zentrifugieren von den roten Blutzellen
getrennt. Die Seren wurden dann nach Aktivität durchgetestet unter
Anwendung eines kompetitiven Inhibitions-ELISA (CIEIA). Es wurden 96-Well
EIA (enzyme inhibition assay) Platten aus Polystyrol mit 100 ul von 651,
an BSA konjugiert (651-BSA), 651, konjugiert an THY (651-THY), 573,
konjugiert an BSA (573-BSA) oder 573, konjugiert an THY (573-THY) für
mindestens zwei Stunden bei Raumtemperatur oder 16 Stunden bei 4ºC beladen.
Ungebundenes Material wurde aus den Wells durch fünf Waschschritte mit
PBS-T abgewaschen. Die Wells erhielten dann 50 ul reinen Puffer (PBS-T),
oder Inhibitoren, entweder 651 oder 573, jeweils auf 2 ppm (Teile pro
Million) in Puffer verdünnt. Die Wells erhielten dann 50 ul Mäuseserum,
so daß jedes Serum entweder mit reinem Puffer, mit 651 oder mit 573 (den
Inhibitoren) reagieren gelassen wurde. Die Kombination von gleichen
Volumina der Seren und Inhibitoren oder des Puffers resultierten in einer
Endkonzentration der Inhibitoren von 1 ppm. Die Wells wurden 30-60
Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden sie fünfmal mit
PBS-T gewaschen, um ungebundenes Material zu entfernen, dann erhielt
jedes Well 100 ul einer 1 ul/ml Lösung von biotinyliertem Pferd Anti-Maus
IgG (Vector Laboratories, Burlingame, CA), und der Assay verlief weiter
wie für den ELISA oben beschrieben.
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Wenn die Antikörper in einem Serum mit einem oder beiden der Inhibitoren
in der Lösung der Wells reaktiv wären, würden die Antikörpermoleküle
oder ein Prozentsatz der Antikörpermoleküle an die Inhibitoren binden,
und würden dadurch einen Antikörper-Inhibitorkomplex bilden, der in
Lösung bleiben würde und während des Waschschritts von der Platte entfernt
werden würde. In diesem Fall würde die Bindung des Antikörpers an den
Inhibitor die Anzahl der Antikörpermoleküle reduzieren, die für die
Bindung an das beschichtende Antigen, 651-BSA verfügbar sind. Da weniger
Antikörpermoleküle an das 651-BSA gebunden sind, reduziert sich die
Anzahl der gebundenen biotinylierten Pferde-Anti-Maus IgG Moleküle, was
bewirkt, daß weniger Moleküle des Avidin-Peroxidasekomplex gebunden
werden, was wiederum eine reduzierte Hydrolyse des Substrats bewirkt, was
schließlich zu einer niedrigeren Absorption führt. Die Daten sind in
Tabelle IA gezeigt. In allen Fällen war die Inhibitorkonzentration 10&supmin;&sup4; M.
Tabelle IB
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Die Ergebnisse weisen darauf hin, daß die Maus Nummer 1E, immunisiert
mit 573-THY. ein Serum mit Antikörpern herstellt, die gegen beide,
nämlich 651 und 573 reaktiv sind.
Beispiel 2 - Fusion
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Alle Techniken wurden antiseptisch und mit sterilen Reagenzien
durchgeführt. Die Maus Nummer 1E, die polyklonale Antikörper herstellt, wurde
durch einen Überschuß an Betäubungsmittel (Rompum /Ketamine ) getötet.
Die Milz wurde entnommen und in eine 100 mm Petri-Schale gelegt, die
ungefähr 20 ml ABC-Medium (Cell Enterprises, Harrisonburg, VA) enthielt.
Die Milz wurde dann mit 10 ml des ABC-Mediums perfundiert, um die
meisten der Splenocyten zu entfernen. Die verbleibenden Zellen wurden durch
Abziehen der Milzkapsel mit 21 geeichten Nadeln erhalten. Das Volumen
wurde mit ABC-Medium auf ungefähr 50 ml gebracht, davon eine 0,1 ml
Probe abgenommen und 1:50 in ABC-Medium verdünnt. Die verdünnten Zellen
wurden an einem Hemocytometer gezählt, um eine Näherung zu erhalten über
die Anzahl der Lymphocyten. die aus der Milz erhalten wurden. Während
dieser Zeit wurden die Zellen durch Zentrifugieren bei ungefähr 200 x g
in 5 Minuten bei Raumtemperatur pelletiert.
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Es wurden ungefähr 1,2 x 10&sup8; Lymphocyten aus der Milz erhalten. Diese
wurden mit 1,2 x 10&sup7; Myelomazellen (SP2/0-Ag14,ATCC Cat CRL1581)
gemischt. Die Zellen wurden erneut durch Zentrifugieren (bei ungefähr 250
x g, 10 Minuten bei Raumtemperatur) pelletiert. Der Überstand wurde bis
fast zur Trockenheit entfernt und die Zellen resuspendiert, indem das
Zentrifugenröhrchen vorsichtig angestoßen wurde, um das Zellpellet zu
lösen.
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Die Zellen wurden dann mit 1 ml 50 % Polyethylenglycol (PEG).
Molekulargewicht 1500 behandelt, welches auf 36ºC vorgewärmt wurde. Das PEG wurde
langsam (tropfenweise) über einen Zeitraum von ungefähr 75 Sekunden un
ter ständigem Drehen des Zentrifugenröhrchens zugegeben, um
sicherzustellen, daß die Zellen während dem Kontakt mit PEG gut gemischt bleiben
würden.
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Das Zentrifugenröhrchen, das die Zellen enthielt, wurde dann eine Minute
in ein 37ºC Wasserbad gehalten. Das Röhrchen wurde dann aus dem
Wasserbad herausgenommen und 1 ml warmes ABC-Medium wurde tropfenweise während
der nächsten 60 bis 75 Sekunden unter konstantem Drehen des
Zentrifugenröhrchens zugegeben. um sicherzugehen, daß die Zellen und das PEG gut
mit dem Medium vermischt werden. Die Zellen wurden nochmals für eine
Minute in das 37ºC Wasserbad überführt und dann daraus entnommen. Während
der nächsten 60 bis 75 Sekunden wurden 2 ml des ABC-Mediums zugegeben
unter konstantem Drehen des Zentrifugenröhrchens wie zuvor, und die
Zellen wurden nochmals für eine Minute in das 37ºC Wasserbad gehalten. Das
Zentrifugenröhrchen wurde aus dem Wasserbad entnommen, und 4 ml des
warmen ABS-Mediums zugegeben, wiederum unter konstantem Drehen des
Zentrifugenröhrchens wie zuvor. Die Zellen wurden eine Minute bei
Raumtemperatur inkubiert, wonach 8 ml des warmen ABC-Mediums zugegeben wurden,
unter konstantem Drehen des Zentrifugenröhrchens wie zuvor. Die Zellen
wurden eine Minute bei Raumtemperatur inkubiert, wonach 12 ml des warmen
ABC-Mediums zugegeben wurden mit konstantem Drehen des
Zentrifugenröhrchens wie zuvor. Letztlich wurde das Volumen durch Zugabe von ABC-Medium
auf ungefähr 50 ml gebracht.
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Die Zellen wurden durch Zentrifugieren wie zuvor beschrieben pelletiert.
Das Medium wurde durch Absaugen entfernt, und die Zellen in 60 ml HM
resuspendiert. Diese Zellen wurden dann in zwei 30 ml Aliquots geteilt,
das eine erhielt endotheliales Zellwachstumssupplement (ECGS (erhältlich
von Sigma, Katalog Nr. E2759), 5 ug/ml), und das andere erhielt keine
weiteren Zusätze.
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Die Zellen wurden in 96-Well-Platten mit 100 ul/Well ausplattiert. Mit
A,B,C markierte Platten erhielten Zellen ohne ECGS, solche mit ECGS
wurden in Platten, markiert mit D,E,F gegeben. Die Zellen wurden in einer
befeuchteten Atmosphäre mit 5 % CO&sub2; in Luft inkubiert.
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Am Tag eins nach der Fusion erhielt jedes Well 100 ul von 1X HAT Medium,
hergestellt in HM mit oder ohne ECGS, wie jeweils zugehörig. (HAT ist
eine Mischung von Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin. Die
Endkonzentrationen, die im Kulturmedium verwendet werden, sind 5x10&supmin;³ M
Hypoxanthin, 2x10&supmin;&sup5; M Aminopterin und 1x10&supmin;&sup4; M Thymidin). Die Zellen wurden dann
ungestört 144 Stunden inkubiert, wonach 50 ul HM ohne HAT, aber mit oder
ohne ECGS, wie jeweils zugehörig, zu jedem Well zugegeben.
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Ungefähr 14 Tage nach der Fusion wurde das Vorhandensein wachsender
Kolonien von Hybridomas auf den Platten angezeichnet. Die Ergebnisse sind
wie in Tabelle II aufgezeigt.
Tabelle II
Prozentanteil der Wells mit wachsenden Hybridomas
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Durchschnittlicher Prozentanteil von Kolonien auf der Platte, A-C: 41,6
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Durchschnittlicher Prozentanteil von Kolonien auf der Platte, D-F: 45,5
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Durchschnittlicher Prozentanteil von Kolonien auf der Platte, A-F: 43,6
Beispiel 3 - Durchsuchen der Überstände nach Antikörpern
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Die Überstände der Wells mit wachsenden Kolonien von Hybridomas wurden
mit Hilfe eines enzymgekoppelten Immunoassays (EIA) durchsucht. 96-Well
Polystyrol EIA Platten wurden mit 100 ul/Well von 651, konjugiert an BSA
(651-BSA) für wenigstens zwei Stunden bei Raumtemperatur oder 16 Stunden
bei 4ºC beladen. Ungebundenes Material wurde aus den Wells durch
fünfmaliges Waschen mit PBS-T ausgewaschen, dann erhielten die Wells 50 ul
PBS-T. 50 ul des Überstandes oder von reinem Kulturmedium
(Negativkontrolle) wurden dann zu den Wells zugegeben und 30 bis 60 Minuten bei
Raumtemperatur inkubiert. Die Wells wurden anschließend fünfmal mit PBS-
T gewaschen, um ungebundenes Material zu entfernen, anschließend erhielt
jedes Well 100 ul einer 1 mg/ml Lösung von biotinyliertem Anti-Maus IgG
(Vector Laboratories, Burlingame, CA). Die Wells wurden wiederum bei
Raumtemperatur 30 bis 60 Minuten inkubiert und anschließend fünfmal mit
PBS-T gewaschen, um ungebundenes Material zu entfernen. Jedes Well
erhielt dann 100 ul eines Avidin-biotinylierten Meerrettich-Peroxidase-
Komplex (AB Komplex; Vector Laboratories. Der Avidinanteil des AB
Komplexes bindet mit extrem hoher Affinität an den Biotinanteil des
biotinylierten Pferde-Anti-Maus IgGs, wodurch ein stabiler, Enzym
enthaltender Komplex entsteht). Nach einer Inkubationsdauer von 30 bis 60
Minuten bei Raumtemperatur wurden die ungebundenen Reagenzien wiederum aus
den Wells mit PBS-T ausgewaschen, und jedes Well erhielt 100 ul von ABTS
Substraten (K&P). Die Absorptionen (bei 414 nm) wurden 30 bis 60 Minuten
später unter Anwendung eines FLOW Titertek Multiscan 340 EIA Plate
Lesegerätes bestimmt.
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Das Durchsuchen der Hybridoma-Überstände deckte zwei Kolonien auf, die
Antikörper herstellten, die mit dem beschichtenden Antigen reaktiv
waren. Diese Kolonien wurden als 89-147EH9 und 89-147EC2 bezeichnet. Diese
Kulturen wurden vermehrt und tiefgefroren. und es wurden weitere
Evaluierungsschritte mit Hilfe des kompetitiven Inhibitions-ELISA (enzyme
linked immunosorbtive assay) wie unten beschrieben, durchgeführt.
Beispiel 4 - Kompetitiver Inhibitions-ELISA (CIEIA)
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Die Überstände aus den Wells mit wachsenden Kolonien von Hybridomas
wurden unter Anwendung des CIEIA gescreent. 96-Well Polystyrol EIA (enzyme
inhibition assay) Platten wurden mit 100 ul von 651, an BSA konjugiert
(651-BSA) für wenigstens zwei Stunden bei Raumtemperatur oder 16 Stunden
bei 4ºC beladen. Ungebundenes Material wurde aus den Wells durch
fünfmaliges Waschen mit PBS-T ausgewaschen. Die Wells erhielten dann 50 ul
reinen Puffer (PBS-T), oder Inhibitoren, entweder 651 oder 573, jeweils
verdünnt auf 2 ppm in Puffer. Die Wells erhielten anschließend 50 ul des
Überstandes von jeder Zellkultur, so daß jeder Überstand entweder mit
nur Puffer, oder 651, oder 573 (den Inhibitoren) zur Reaktion gebracht
wurde. Die Kombination gleicher Volumina der Überstände und Inhibitoren
oder des Puffers führte zu einer Endverdünnung der Überstände von 1:2
und einer Endkonzentration der Inhibitoren von 1 ppm. Die Wells wurden
30 bis 60 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden sie
fünfmal mit PBS-T gewaschen, um ungebundenes Material zu entfernen, und
jedes Well erhielt dann 100 ul einer 1 ug/ml Lösung von biotinyliertem
Pferd-Anti-Maus IgG (Vector Laboratories, Burlingame, CA), und der Assay
wurde, wie oben für den ELISA beschrieben, weiter durchgeführt.
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Wenn die Antikörper in einem Überstand mit einem oder beiden der
Inhibitoren in der Lösung in den Wells reaktiv wären. würden die
Antikörpermoleküle, oder ein Prozentanteil der Antikörpermoleküle an die Inhibitoren
binden, und würden aufgrunddessen einen Antikörper-Inhibitorkomplex
bilden, der in Lösung verbleiben würde und von der Platte während des
Waschschritts entfernt werden würde. In diesem Fall würde die Bindung
des Antikörpers an den Inhibitor die Anzahl der Antikörpermoleküle
reduzieren, die zur Bindung an das geladene Antigen. 651-BSA verfügbar sind.
Da weniger Antikörpermoleküle an das 651-BSA angelagert sind, ergibt
sich eine Reduktion der Anzahl von gebundenen biotinylierten Pferd-Anti-
Maus IgG Molekülen, was dazu führt, daß weniger Moleküle des Avidin-
Peroxidase Komplex gebunden werden, was wiederum eine reduzierte
Hydrolyse
des Substrats ergibt, welche letztlich zu einer niedrigeren
Absorption führt.
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Um eine stärkere Inhibition zu erreichen, ist es möglich. den CIEIA
durch Variation der Konzentrationen des geladenen Antigens, der
Antikörper und der Detektionsmoleküle (wie z.B. das Pferd-Anti-Maus IgG und den
Avidin-Peroxidase Komplex) zu beeinflussen. Solch eine "Optimierung" des
CIEIAs wird angewendet, um höhere Niveaus an Sensitivität zu erreichen
und somit die Verwendung von niedrigeren Konzentrationen (das bedeutet
höhere Verdünnungen) der monoklonalen Antikörper zuzulassen.
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Im CIEIA-Test war nur die Zellkultur 89-147EH9 übereinstimmend mit dem
geladenen Antigen reaktiv und durch die Komponenten 651 und 573
inhibierbar. Repräsentative CIEIA Daten sind in Tabelle III vorgestellt.
Tabelle III - CIEIA von Kulturüberständen
-
* Ein Klon von 89-147EC2
-
&spplus; Getestet gegen 0,4 ppm des Inhibitors
-
Um zu demonstrieren, daß die Antikörper, die durch Zellkultur 89-147EH9
hergestellt wurden, bevorzugt mit der Komponente 651 reagiert haben,
wurde ein CIEIA wie oben beschrieben durchgeführt, außer daß die
Antikörper enthaltenden Überstände mit vier unterschiedlichen Inhibitoren,
jeder bei verschiedenen unterschiedlichen Konzentrationen, in Reaktion
gebracht wurden. Die Ergebnisse dieses Vorgehens sind in Tabelle IV
dargestellt. Die Antikörper dieser Erfindung sind mit 651 stärker reaktiv
als mit den anderen gepruften Komponenten, was höhere Grade an
Inhibition mit 651 als mit ähnlichen Mengen der anderen Biocide bewiesen.
Tabelle IV - CIEIA zur Detektion von Biociden
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* ND = nicht bestimmt
-
NMA = N-Methylmalonsäure
Beispiel 5 - Klonierung der Hybridomas
-
Um sicherzugehen, daß die Antikörper, die mit Komponente 651
reaktionsfähig sind, aus Zellen mit identischer genetischer Ausstattung
hergestellt werden, war es nötig. Klone der Zellkultur 89-147EH9 abzuleiten.
Die Klonierung wurde ausgeführt, indem zunächst die absolute Anzahl von
lebenden Zellen in einer Population von 89-147EH9-Zellen bestimmt wurde.
Die Zellpopulation wurde dann auf eine Dichte von 4-5 Zellen pro ml
Zellkulturmedium
verdünnt. Von dieser Zellsuspension wurden dann 200 ul
je Well in vier 96-Well Zellkulturschalen gegeben, bezeichnet mit I-IV.
Vierzehn Tage später wurde jedes Well durch mikroskopische Bestimmung
wachsender Zellkolonien kontrolliert. Solche mit nur einem einzelnen
scharf abgegrenzten Kreis von Zellen wurden als monoklonal bezeichnet.
Die Ergebnisse der Klonierungsprozedur sind in Tabelle V unten gezeigt.
Tabelle V - Klonierung der Zellkultur 89-147EH9
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Im folgenden wurde jede Kolonie auf Reaktivität im ELISA wie zuvor
beschrieben getestet. Verschiedene der Kolonien wurden für die Vermehrung
ausgesucht und mittels CIEIA auf die Reaktivität mit sowohl 651, wie
auch 573 gegengetestet. Die Ergebnisse dieses Assays sind in Tabelle VI
unten gezeigt.
Tabelle VI - CIEIA: Reaktivität von 89-147EH9 Klonen
mit den Komponenten 651 und 573
-
*%I= der Prozentanteil der Inhibition, erhältlich durch Teilen der mit
jedem Inhibitor (651 oder 573) erhältlichen Absorption durch die
Absorption ohne Inhibition (PBS) und die Subtraktion des Quotienten von 1 und
anschließender Multiplikation der Differenz mit 100. Negative Werte
werden durch 0,0 ausgedrückt.
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Aufgrund der Ergebnisse dieses und folgender Assays wurde die klonale
Zellinie 89-147EH9 IIIH6 vermehrt, als Ascites gezogen, gereinigt und in
nachfolgenden Assays verwendet.
Beispiel 6 - Quantitativer CIEIA für 651
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Um die Anwendbarkeit des CIEIA für die Bestimmung von 651-
Konzentrationen in unbekannten Proben zu zeigen, wurde ein quantitativer
Immunoassay entwickelt. Dieser Assay wurde wie in Beispiel 4 beschrieben
durchgeführt, außer, daß gleiche Proben des Antikörpers einerseits mit
einer Serie von bekannten Konzentrationen der Komponente 651,
andererseits mit verschiedenen Verdünnungen von Proben, die unbekannte Mengen
von 651 enthielten, in Reaktion gebracht wurden. Wie in Beispiel 4
beschrieben, findet eine maximale Interaktion des Antikörpers mit 651 bei
den höchsten Konzentrationen von 651 statt, was letztendlich zu
verringerten Absorptionswerten führt. Mittlere Niveaus von 651 bewirken eine
mäßige Reduktion der Absorptionswerte, und niedrige Niveaus von 651
bewirken eine geringe oder keine Reduktion der Absorptionswerte.
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Im quantitativen CIEIA wurde eine Standardkurve erzeugt, indem der
Absorptionwert gegen den Logarithmus der Konzentration von 651 aufgetragen
wurde. Die Punkte wurden durch Anwenden der Regressionsanalyse, der vier
Parameter Logistik Kurvenanpassung oder anderer statistischer Methoden
angepaßt. Die Konzentration des 651 in einer unbekannten Probe wurde
dann durch Vergleichen der Absorptionswerte in den Wells, in denen die
unbekannten Proben mit dem Antikörper in Reaktion gebracht wurden, zu
den Werten, die aus der Standardkurve erhalten wurden, bestimmt.
Diese Verfahren wurden verwendet, um die Konzentrationen von 651 in im
Labor aufbereiteten Proben von Papierbrei, Kühlturmwasser und einer bei
der Metallbearbeitung verwendeten Flüssigkeit (metal working fluid MWF)
abzuschätzen, wobei alle Proben in den Verdünnungen der Verwendung
eingesetzt wurden. Die Ergebnisse dieser Assays sind in Tabelle VII
gezeigt, zusammen mit den tatsächlichen Konzentrationen in der Probe.
Diese Ergebnisse weisen darauf hin, daß dieser Assay für eine erfolgreiche
Abschätzung des 651-Gehalts in einer Probe verwendet werden kann.
Tabelle VII
Abschätzungen von 651-Konzentrationen
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1. Nominal: Zielwert der Probe
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2. HPLC ist die derzeit verwendete analytische Standardmethode.
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3. CIEIA Proben wurden vor der Analyse 1:4 verdünnt.
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Ein zweites Set von im Labor aufbereiteten Proben von Kühlturmwasser
wurde als Doppelbestimmung durch CIEIA bezüglich 651 entsprechend der
Prozedur, wie in Beispiel 4 oben definiert, analysiert. Diese Ergebnisse
sind in Tabelle VIII gezeigt.
Tabelle VIII
Abschätzungen der 651-Konzentration (in ppm) in Kühlturmwasser
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nd = nicht bestimmt
Beispiel 7 - ELISA Kit
A. Eintauchstiftformat
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In der Kit-Ausführung mit Eintauchstift ist ein Plastikstreifen an dem
Deckel eines Fläschchens so fixiert, daß es in das Fläschchen
hineinhängt. Auf der Oberfläche des Eintauchstiftes ist ein 2 cm² großer
Detektionsbereich, auf den 100 ng des Anti-651-Antikörpers fixiert ist. Die
Probe wird in einem Fläschchen, das eine Lösung 651-BSA-Konjugat
(200 ng) enthält, verdünnt. Der Deckel des Fläschchens mit dem
Eintauchstift wird auf dieses Fläschchen aufgedreht und dieses ungefähr 15
bis 30 Minuten inkubiert. Der Eintauchstift wird herausgenommen, mit
Wasser oder Puffer gespült und auf ein Fläschchen aufgedreht, das einen
Avidin-HRP (Meerrettich-Peroxidase) Komplex enthält, 15 Minuten
inkubiert, und dann gewaschen. Der Eintauchstift wird dann in ein Fläschchen
überführt, das HRP-Substrat enthält, wie z.B.
Azino-bis-ethylbenzthiazolinsulfonsäure ("ABTS"). Die Isothiazolonkonzentration wird dann
durch Bestimmung der Intensität der blauen Farbe in dem Fläschchen nach
einer spezifischen Inkubationszeit abgeschätzt.
B. Membranformat
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Der Anti-651-Antikörper wird auf einer Membran fixiert, und die Membran
(ungefähr 2 cm² enthalten 100 ng Antikörper) wird über einen kleinen
Behälter gelegt. Die Probe wird mit dem 651-BSA-Biotinkonjugat gemischt
(bestehend aus einer 1:2 Verdünnung der Probe, die absolute Menge des
Konjugats ist 200 ng), und diese Lösung wird über die Membran gegossen.
Die Schwerkraft zieht die Lösung durch die Membran. Als nächstes wird
eine Lösung Avidin-HRP über die Membran gegossen, gespült und dann die
Detektionslösung (HRP Substrat) über die Membran gegossen. Die
Isothiazolonkonzentration wird dann durch Bestimmung der Intensität der blauen
Farbe der Membran abgeschätzt.
Beispiel 8 - Colorimetrische Bestimmung von Isothiazolonen in Holz
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Gelbe Südpinie, die unter Anwendung kommerzieller Methoden unter Druck
mit einer Lösung behandelt wurde, die 4,5-Dichlor-2-n-octyl-3-
isothiazolon enthält, wurde in Scheiben (0,5 x 2,5 cm) geschnitten.
Diese Holzscheiben wurden in eine Lösung von 3 % Magermilch 30 Minuten
eingeweicht. Die Scheiben wurden dann kurz mit PBS-T gespült und
anschließend 15 Minuten dem Anti-651-Antikörper bei einer Konzentration von 500
nglml ausgesetzt, der kovalent an Meerrettich-Peroxidase gekoppelt war.
Die Scheiben wurden dann zweimal je 30 Minuten in PBS-T Puffer
gewaschen. Der gebundene Anti-651-HRP Komplex wurde durch Überführen der
Scheiben in ein Fläschchen, das HRP Substrat (ABTS) enthielt, sichtbar
gemacht. Die Entwicklung einer blauen Farbe in der Lösung wies auf die
Anwesenheit von 4,5-Dichlor-2-n-octyl-3-isothiazolon hin. Ein 200 ul
Aliquot der Lösung in dem Fläschchen wurde abgenommen und die Absorption
bei 405 nm bestimmt. Diese wurde gegenüber einer Kontroll-Holzscheibe
verglichen, die auf identische Weise behandelt worden war, jedoch kein
Isothiazolon enthielt. Die Absorptionswerte wurden noch um den
Hintergrund korrigiert.
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Diese Daten zeigen, daß diese Methode für die Bestimmung der
Isothiazolonkonzentration in Holz oder einer festen Matrix verwendet werden kann.