CN103197072A - 一种头孢类抗生素的免疫亲和柱及其制备方法 - Google Patents

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一种检测头孢类抗生素的免疫亲和柱及其制备方法，属于免疫学检测领域，本发明免疫亲和柱由空柱管和琼脂糖凝胶组成，琼脂糖凝胶上偶联了抗头孢类抗生素的单克隆抗体；以一种抗头孢类抗生素的簇特异性抗体与凝胶的偶联物作为填充物组装成免疫亲和柱。本发明制备的免疫亲和柱能够与头孢类抗生素特异性结合，其最大结合容量约为160ngDMT；采用的洗脱液为80%的甲醇-水溶液时，液质联用法平均加标回收率为99.62%；重复使用4次，回收率不低于90%。进行检测头孢类抗生素时候的样品前处理成本低廉，快速，便携，可以用于不同样品的头孢类抗生素残留检测的前处理。

Description

一种头孢类抗生素的免疫亲和柱及其制备方法
技术领域
一种检测头孢类抗生素的免疫亲和柱及其制备方法，本发明涉及免疫学检测领域，具体涉及到头孢类单克隆抗体的制备及免疫亲和柱的制备。
背景技术
因为现有兽药种类繁多，就头孢类抗生素也有很多种，其广泛的使用也使得其残留于各种物质中，而样品中复杂的组成会对头孢类抗生素的检测造成影响。现有的检测头孢类抗生素的方法主要是仪器分析和免疫检测，前者包括高效液相色谱法、液质联用（HPLC-MS）、气质联用（GC-MS）等。但要想使这些检测方法能达到理想的检测效果，则需将样品进行不同程度的前处理，因此实现具有快速、便携优点的样品前处理方法具有现实意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测头孢类抗生素的免疫亲和柱及其制备方法，为了克服现有检测技术的缺陷，提供一种快速，便携优点的样品前处理方法。同时提供该亲和柱的制备方法。
本发明的技术方案：一种检测头孢类抗生素的免疫亲和柱，由空柱管和琼脂糖凝胶组成，琼脂糖凝胶上偶联了抗头孢类抗生素的单克隆抗体。所述单克隆抗体为单克隆细胞株，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.7201。
所述检测头孢类抗生素的免疫亲和柱的制备方法，制备步骤为：
（1）偶联：预先将纯化好的抗头孢类抗生素单克隆抗体CGMCC No.7201置于pH8.3含有0.5mol／L NaCl的0.1mol／L NaHCO3偶联缓冲液中透析12h；将用适量溴化氰活化的琼脂糖干粉Sepharose4B，用1mM盐酸使其溶胀，然后在砂心漏斗中用偶联缓冲液快速抽洗除去杂质；然后迅速倒入抗头孢氨苄单克隆抗体溶液中，混匀，室温下震荡充分反应1h；用5倍体积以上的偶联缓冲液洗去未偶联的抗头孢类抗生素单克隆抗体，得到琼脂糖-单抗偶联复合物；
（2）封闭活性基团：将琼脂糖-单抗偶联复合物转入5倍体积pH8.0的含0.5mol／L NaCl的0.1mol／L Tris-HCl缓冲液中，保持2h，以封闭琼脂糖凝胶中多余的活性基团；
（3）洗涤：步骤（2）得到的琼脂糖-单抗偶联复合物用5倍体积的pH4.0的含0.5mol／L NaCl的0.1mol／L醋酸缓冲液和5倍载体体积的pH8.0的含0.5mol／L NaCl的0.1mol／L Tris-HCl缓冲液各淋洗一次，此洗涤过程重复三次，然后用5倍载体体积的PBS洗涤两次；
（4）防腐处理：步骤（3）制备好的琼脂糖-单抗偶联复合物如需放置一段时间，应使用含有1／10000叠氮钠的PBS缓冲液浸泡，然后沥去多余的溶液后放入包装袋或瓶中在4℃密封保存；
（5）装柱：将步骤（3）或（4）得到的琼脂糖-单抗偶联复合物填充入55×6mm固相萃取空柱管中，在一定负压下用PBS将凝胶压紧(负压不能太低，否则会破坏凝胶结构)，5％甲醇平衡备用，即制成头孢类抗生素IAC柱。
（6）保存：琼脂糖一单抗偶联复合物或填充好的头孢类抗生素IAC柱切勿冷冻，保存在4℃的冰箱内。
抗头孢类抗生素的单克隆抗体的制备：用戊二醛法制备免疫原，使戊二醛:头孢氨苄:KLH=4200:3000:1(摩尔比)，先将头孢氨苄和戊二醛混合20min，然后再与KLH反应5h，透析得免疫原。用此免疫原100μg／50μL与50μL弗氏完全佐剂乳化后皮下注射每只10周龄BALB／C雄性小鼠，每隔20天后进行加强免疫。皮下注射50μg／50μL抗原(与弗氏不完全佐剂乳化)。加强免疫4次后第7至10天采用腹腔注射，剂量为50μg／50μL抗原。3天后取脾脏细胞融合。第二次免疫后7天从小鼠尾静脉采血用间接ELISA测血清效价。融合后筛选得合格的阳性脾细胞，将此细胞扩培后注射至小鼠腹腔,数日后抽取腹水,纯化后得到抗头孢类抗生素的单克隆抗体。
生物材料样品保藏：一株单克隆细胞株，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号CGMCC No.7201，保藏日期2013年1月23日。
本发明的有益效果：本发明制备的免疫亲和柱能够与头孢类抗生素特异性结合，其最大结合容量约为160ngDMT；采用的洗脱液为80%的甲醇-水溶液时，液质联用法平均加标回收率为99.62%；重复使用4次，回收率不低于90%。进行检测头孢类抗生素时候的样品前处理成本低廉，快速，便携，可以用于不同样品的头孢类抗生素残留检测的前处理。该免疫亲和柱便携，适合现场检测；操作简便，不需要专业技术人员。
附图说明
图1组装完成的免疫亲和柱结构和使用原理示意图。
具体实施方式
实施例1
一种检测头孢类抗生素的免疫亲和柱，由空柱管和凝胶组成，凝胶上偶联了抗头孢类抗生素的单克隆抗体。该免疫亲和柱按以下步骤制备：
（1）偶联：预先将纯化好的抗头孢类抗生素单克隆抗体置于pH8.3含有0.5mol／L NaCl的0.1mol／L NaHCO3偶联缓冲液中透析12h；将用适量溴化氰活化的琼脂糖干粉Sepharose4B，用1mM盐酸使其溶胀，然后在砂心漏斗中用偶联缓冲液快速抽洗除去杂质；然后迅速倒入抗头孢氨苄单克隆抗体溶液中，混匀，室温下震荡充分反应1h；用5倍体积以上的偶联缓冲液洗去未偶联的抗头孢类抗生素单克隆抗体，得到琼脂糖-单抗偶联复合物；
（2）封闭活性基团：将琼脂糖-单抗偶联复合物转入5倍体积pH8.0的含0.5mol／L NaCl的0.1mol／L Tris-HCl缓冲液中，保持2h，以封闭琼脂糖凝胶中多余的活性基团；
（3）洗涤：步骤（2）得到的琼脂糖-单抗偶联复合物用5倍体积的pH4.0的含0.5mol／L NaCl的0.1mol／L醋酸缓冲液和5倍载体体积的pH8.0的含0.5mol／L NaCl的0.1mol／L Tris-HCl缓冲液各淋洗一次，此洗涤过程重复三次，然后用5倍载体体积的PBS洗涤两次；
（4）防腐处理：步骤（3）制备好的琼脂糖-单抗偶联复合物如需放置一段时间，应使用含有1／10000叠氮钠的PBS缓冲液浸泡，然后沥去多余的溶液后放入包装袋或瓶中在4℃密封保存；
（5）装柱：将步骤（3）或（4）得到的琼脂糖-单抗偶联复合物填充入1mL固相萃取空柱管中，在一定负压下用PBS将凝胶压紧(负压不能太低，否则会破坏凝胶结构)，5％甲醇平衡备用，即制成头孢类抗生素IAC柱。
（6）保存：琼脂糖一单抗偶联复合物或填充好的头孢类抗生素IAC柱切勿冷冻，保存在4℃的冰箱内。
实施例2
用免疫亲和柱液质联用法测定头孢类抗生素。
在不含头孢类抗生素的样品（脱脂牛奶）中分别添加1ppb、5ppb、10ppb、50ppb的头孢氨苄、头孢羟氨苄和头孢拉定的混合样品，样品提取液用实施例1制备的亲和柱纯化，用液质联用法测定浓度。具体操作方法参照GB/T22989-2008,结果如下，参见表1。
表1采用本发明制备的免疫亲和柱液质联用法测定头孢类抗生素的结果
Figure BDA00002949988400031
Figure BDA00002949988400041
从以上数据可以看出，在空白样品脱脂牛奶中对头孢类抗生素进行4个浓度水平的添加回收率实验，平均回收率在98.64%～100.88%，变异系数2.46%～9.42%，这表明本发明制备的免疫亲和柱性能稳定、结果可靠，完全可以满足头孢类抗生素的检测需要。

Claims (2)

1.一种检测头孢类抗生素的免疫亲和柱，由空柱管和琼脂糖凝胶组成，琼脂糖凝胶上偶联了抗头孢类抗生素的单克隆抗体；
所述单克隆抗体为单克隆细胞株，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.7201。
2.权利要求1所述检测头孢类抗生素的免疫亲和柱的制备方法，其特征在于制备步骤为：
（1）偶联：预先将纯化好的抗头孢类抗生素单克隆抗体CGMCC No.7201置于pH8.3含有0.5M NaCl的0.1M NaHCO3偶联缓冲液中透析12h；将用适量溴化氰活化的琼脂糖干粉Sepharose4B用1mM盐酸使其溶胀，然后在砂心漏斗中用偶联缓冲液快速抽洗除去杂质；然后迅速倒入抗头孢氨苄单克隆抗体溶液中，混匀，室温下震荡充分反应1h；用5倍体积以上的偶联缓冲液洗去未偶联的抗头孢类抗生素单克隆抗体，得到琼脂糖-单抗偶联复合物；
（2）封闭活性基团：将琼脂糖-单抗偶联复合物转入5倍体积pH8.0的含0.5M NaCl的0.1M Tris-HCl缓冲液中，保持2h，以封闭琼脂糖凝胶中多余的活性基团；
（3）洗涤：步骤（2）得到的琼脂糖-单抗偶联复合物用5倍载体体积的pH4.0的含0.5M NaCl的0.1M醋酸缓冲液和5倍载体体积的pH8.0的含0.5M NaCl的0.1M Tris-HCl缓冲液各淋洗一次，此洗涤过程重复三次，然后用5倍载体体积的PBS洗涤两次；
（4）防腐处理：步骤（3）制备好的琼脂糖-单抗偶联复合物如需放置一段时间，应使用含有1／10000叠氮钠的PBS缓冲液浸泡，然后沥去多余的溶液后放入包装袋或瓶中在4℃密封保存；
（5）装柱：将步骤（3）或（4）得到的琼脂糖-单抗偶联复合物填充入55×6mm固相萃取空柱管中，在一定负压下用PBS将凝胶压紧，5％甲醇平衡备用，即制成头孢类抗生素免疫亲和柱；
（6）保存：琼脂糖一单抗偶联复合物或填充好的头孢类抗生素免疫亲和柱切勿冷冻，保存在4℃的冰箱内。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105087500A (zh) * 2015-09-07 2015-11-25 江南大学 一株利巴韦林单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用
CN105112376A (zh) * 2015-09-07 2015-12-02 江南大学 一株金刚烷胺单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101059487A (zh) * 2007-05-31 2007-10-24 北京望尔生物技术有限公司 一种免疫亲和色谱柱及其在净化喹诺酮类药物中的应用
CN101315372A (zh) * 2008-06-23 2008-12-03 江南大学 一种定量检测动物源食品中头孢类抗生素含量的酶联免疫检测方法
CN101446575A (zh) * 2008-12-29 2009-06-03 无锡市疾病预防控制中心 一种微囊藻毒素-lr多抗免疫亲和柱的制备和使用方法
CN101726589A (zh) * 2009-11-20 2010-06-09 江南大学 一种拟除虫菊酯类药物群选性免疫亲和层析柱的制备方法
WO2010073015A2 (en) * 2008-12-24 2010-07-01 Kinasource Ltd Peptide tag and uses thereof
CN102455361A (zh) * 2010-10-21 2012-05-16 北京勤邦生物技术有限公司 一种检测β-内酰胺类抗生素的试剂盒及方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101059487A (zh) * 2007-05-31 2007-10-24 北京望尔生物技术有限公司 一种免疫亲和色谱柱及其在净化喹诺酮类药物中的应用
CN101315372A (zh) * 2008-06-23 2008-12-03 江南大学 一种定量检测动物源食品中头孢类抗生素含量的酶联免疫检测方法
WO2010073015A2 (en) * 2008-12-24 2010-07-01 Kinasource Ltd Peptide tag and uses thereof
CN101446575A (zh) * 2008-12-29 2009-06-03 无锡市疾病预防控制中心 一种微囊藻毒素-lr多抗免疫亲和柱的制备和使用方法
CN101726589A (zh) * 2009-11-20 2010-06-09 江南大学 一种拟除虫菊酯类药物群选性免疫亲和层析柱的制备方法
CN102455361A (zh) * 2010-10-21 2012-05-16 北京勤邦生物技术有限公司 一种检测β-内酰胺类抗生素的试剂盒及方法

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105087500A (zh) * 2015-09-07 2015-11-25 江南大学 一株利巴韦林单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用
CN105112376A (zh) * 2015-09-07 2015-12-02 江南大学 一株金刚烷胺单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用

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