CN100519579C - 一种藻毒素免疫亲和层析柱的制备与使用方法 - Google Patents
一种藻毒素免疫亲和层析柱的制备与使用方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN100519579C CN100519579C CNB2007100237708A CN200710023770A CN100519579C CN 100519579 C CN100519579 C CN 100519579C CN B2007100237708 A CNB2007100237708 A CN B2007100237708A CN 200710023770 A CN200710023770 A CN 200710023770A CN 100519579 C CN100519579 C CN 100519579C
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- chromatographic column
- algae toxin
- affinity chromatographic
- immune affinity
- algae
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Landscapes
- Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)
- Treatment Of Liquids With Adsorbents In General (AREA)
Abstract
一种藻毒素免疫亲和层析柱的制备与使用方法，属于生物技术领域。本发明涉及应用可特异性识别藻毒素的抗体来制备一种藻毒素免疫亲和层析填料和免疫亲和层析柱及其使用方法。其目的是为了方便从水、水产品、藻类及其制品的提取液中“一步法”富集纯化藻毒素，纯化后的样品进用HPLC或LC-MS等进行定性定量分析。本发明中所制备的藻毒素免疫亲和层析柱对一种藻毒素特异性强，纯化效果显著，明显优于现有的固相萃取方法。该藻毒素免疫亲和层析柱提高了富集和纯化的效率，从而提高了检测方法的灵敏度和准确性，制备方法简单，可重复使用。
Description
技术领域
一种藻毒素免疫亲和层析柱的制备与使用方法，属于生物技术领域。
背景技术
最近的调查表明，由于污染的原因，亚太地区54％的湖泊富营养化，欧洲、非洲、北美洲和南美洲的比例分别是53％，28％，48％和41％，我国则是60％。在富营养化的淡水水体中，当有适宜的条件时，水体中的蓝藻短时间内大量繁殖并聚集的生态异常现象称为水华(也称湖靛)。
蓝藻水华出现时，水面被厚厚的蓝绿色湖靛所覆盖，甚至在岸边大量堆积。在藻体大量死亡分解的过程中，不但散发恶臭，破坏景观；同时大量消耗水中溶解氧，使鱼类窒息死亡；尤其是蓝藻能释放生物毒素——藻毒素(主要是微囊藻毒素)，这些次级代谢产物严重危害人类和其他生物的安全。1996年巴西一透析中心，因透析液遭微囊藻毒素污染导致130名病人中有116人出现异常症状，并有53人最终死亡。我国对微囊藻毒素曾作过相关的调查，结果表明南方几个省市的各种水体均有不同程度的微囊藻毒素污染，其中以沟塘水、河水、湖水较为严重。对我国肝癌高发区江苏海门和启东两地进行了饮水与肝癌的病例对照和前瞻性研究，结果显示饮河水居民患肝癌的危险较饮井水或自来水居民高。有学者认为微囊藻毒素是引起我国南方肝癌高发的主要危险因素之一。
藻毒素对饮水安全的威胁越来越严重。世界卫生组织制定了饮用水中微囊藻毒素-LR(微囊藻毒素中毒性最强、含量较高的一种)的控制标准为1μg/L。我国2001年版的“生活饮用水卫生规范”参考了世卫组织的标准。GB5749-2006生活饮用水卫生标准也规定饮用水中的微囊藻毒素-LR的限值为0.001mg/L，此标准2007年7月1日起开始执行。
藻毒素不但存在于饮用水中，而且能够在鱼类或贝类中富集、通过食物链传递进入人体。一些以藻类为原料的食品、保健品如螺旋藻等，据报道也含有藻毒素。研究表明蓝绿藻对于湖边，池塘边生活的人及动物会产生危害。WHO暂定的藻毒素临时可耐受的每日摄取量为0.04μg(kg·d)。因此水产品、以藻类为原料的食品、保健品中的藻毒素的检测也刻不容缓。
而要保证饮用水、水产品、藻类制品中藻毒素的限量，建立快速、灵敏、准确的藻毒素检测分析方法至关重要。
藻毒素是一组环状七肽，一般结构为：环(-D-Ala-L-X-D-MeAsp-L-Z-Adda-D-Glu-Mdha)。其中：L为左旋；D为右旋。MeAsp为D-赤-β-甲基天冬氨酸；Adda为(2s，3s，8s，9s)-3-氨基-9-甲氧基-2，6，8-三甲基-10-苯基-4，6-二烯酸；Mdha为N-甲基脱氢丙氨酸。其中2、4位氨基酸X和Z为两种可变的氨基酸，目前已发现下列三种XZ组合的藻毒素毒性较大：LR、RR和YR，其中L、R、Y分别代表Leu(亮氨酸)、Arg(精氨酸)和Tyr(酪氨酸)。
由于XZ的不同及MeAsp和Adda的甲基化或去甲基化产生的差异，可以形成多种不同的微囊藻毒素异构体。目前已从不同微囊藻菌株中分离、鉴定了70多种微囊藻毒素结构。
目前针对藻毒素的检测以HPLC、LC-MS或GC-MS等仪器检测为主，其前处理要用固相萃取柱富集，而固相萃取柱无特异性，会引入许多杂质，干扰检测结果，有时测定值与实际值相去甚远。
本发明——藻毒素免疫亲和层析柱，就是针对固相萃取柱在藻毒素检测中出现的不足所研制的。
免疫亲和层析柱是利用免疫亲和层析技术，基于免疫反应的基本原理，利用生物体内抗体大分子具有与某些相应抗原专一性可逆结合的特性和色谱差速迁移理论，实现目标物的分离与分析。将目标物相应抗体(单抗或多抗)作为固定相固定在介质上，制成免疫亲和介质，然后填入柱中，使用时，抗原样品组分与吸附剂上的抗体发生抗原-抗体结合反应而被保留在柱上，其他成分则直接被洗脱，随后再使用适当的洗脱剂将待测的抗原洗脱下来，从而达到富集、纯化的目的。由于抗体与抗原作用具有高度的专一性，因此能够去除绝大部分杂质，通过一次纯化就能提纯1000-10000倍。纯化后的样品进HPLC或LC-MS等进行定性定量分析。
免疫亲和层析在与藻毒素类似的真菌毒素的检测中已广泛应用，真菌毒素的免疫亲和层析柱已经非常成熟。其中黄曲霉毒素的免疫亲和层析已被列入新的国标中(GB18980-2003乳和乳粉中黄曲霉毒素M1的测定——免疫亲和层析净化高效液相色谱法和荧光光度法，GB18979-2003食品中黄曲霉毒素的测定——免疫亲和层析净化高效液相色谱法和荧光光度法)。
发明内容
本发明的目的是提供一种藻毒素免疫亲和层析柱的制备与使用方法，是为了解决从水、水产品、藻类及其制品的提取液中“一步法”提取净化藻毒素。
首先制备出针对藻毒素的特异性好，分离纯化效果明显的免疫亲和层析柱，以及建立免疫亲和层析柱与HPLC、HPLC-MS等联用检测藻毒素的快速、准确的检测方法，并且最终能建立水、藻类制品、保健品、水产品、食品等不同样品的标准检测方法。
本发明的技术方案：
一、藻毒素免疫亲和层析柱制备步骤如下：
(1)将所需量的藻毒素抗体：单抗或多抗，溶于pH 8.3含有0.5M NaCl的0.1M NaHCO3缓冲液中，每毫克藻毒素抗体冻干粉末用10-50mL缓冲液溶解；
(2)称取适量溴化氰活化的琼脂糖冻干粉末，用适量1mM的稀盐酸使其溶胀，然后在烧结玻璃滤器上冲洗以除去杂质，1g琼脂糖干粉溶胀为3.5mL凝胶，1mL琼脂糖凝胶结合0.5-10mg抗体；
(3)将溶胀后的琼脂糖凝胶在pH 8.3含有0.5M NaCl的0.1M NaHCO3缓冲液中与(1)制备得到的抗体溶液均匀混合，并在室温下震荡充分反应1-3小时，或在4℃下过夜；
(4)用pH 8.3含有0.5M NaCl的0.1M NaHCO3缓冲液洗去未与琼脂糖凝胶结合的游离抗体，得到琼脂糖-抗体偶联复合物；
(5)将琼脂糖-抗体偶联复合物转入pH 8.0的含0.5M NaCl的0.1MTris-HCl缓冲液，或pH 8.0的含0.5M NaCl的1M乙醇胺溶液中，保持1-3小时，以封闭琼脂糖凝胶中多余的活性基团；
(6)步骤(5)得到的琼脂糖-抗体偶联复合物用不少于5倍该偶联复合物体积的pH 4.0的含0.5M NaCl的0.1M醋酸缓冲液洗，和用不少于5倍该偶联复合物体积的pH 8.0的含0.5M NaCl的0.1M Tris-HCl缓冲液洗，此洗涤过程重复三次；
(7)防腐处理：步骤(6)制备好的琼脂糖-抗体偶联复合物如需放置一段时间，应使用含有1/10000叠氮钠的PBS缓冲液浸泡，然后沥去多余的溶液后放入包装袋或瓶中在4℃中密闭保存；
(8)装柱：将步骤(6)或(7)得到的琼脂糖-抗体偶联复合物填充入层析柱或固相萃取空柱管中，即制成藻毒素免疫亲和层析柱；
(9)保存：琼脂糖-抗体偶联复合物或填充好的藻毒素免疫亲和层析柱切勿冷冻，保存在4℃的冰箱内，1年之内性能稳定；
(10)柱的再生：用4-10个柱床体积pH8.5含0.5M NaCl的0.1M Tris—HCl缓冲液，和用4-10个柱床体积pH4.5含0.5M NaCl的0.1M醋酸钠缓冲液轮流清洗免疫亲和层析柱2次，再用PBS缓冲液充分平衡免疫亲和层析柱后保存在4℃冰箱内供下次使用，免疫亲和层析柱经过再生后可再次使用，每根免疫亲和层析柱可反复再生使用5-10次。
二、藻毒素免疫亲和层析柱应用方法如下：
(A)样品中藻毒素的分离纯化：
(1)水样：制备的藻毒素免疫亲和层析柱先依次用5mL甲醇和5mL蒸馏水预处理；1L水样通过玻璃GF/C微纤维过滤器或0.45μm微孔滤膜过滤，滤液过处理好的藻毒素免疫亲和层析柱，然后依次用5mLPBS和5mL蒸馏水洗；最后用10mL纯甲醇洗脱，洗脱液减压蒸干，残留物用0.5mL30％甲醇溶液溶解后进HPLC分析；
(2)藻类及其制品
将粉碎藻粉按1g藻粉加10-30mL5％乙酸的比例加入5％乙酸中，搅拌抽提30-90min，离心分离，收集上层清液，沉淀再重复抽提两次，合并上清液并过滤，滤液按(1)水样的方法处理后进HPLC分析；
(3)水产品
水产品样品用丁醇+甲醇+水，5+25+70体积分数，抽提30-120min；肝脏试样用pH＝7的含50mM Tris-HCl、2mM EDTA、2mM 2-ME(2-巯基乙醇)和10％甘油溶液抽提30-120min；抽提液按(1)水样的方法处理后进HPLC分析；
(B)藻毒素净化样的HPLC分析
藻毒素净化样进HPLC分析，色谱条件如下：
色谱柱为Kromasil 100-5C18 250×4.6mm，高效液相色谱仪为Waters 2965配合Waters 996二极管阵列检测器，流动相为含0.08％甲酸的去离子水：乙腈＝60：40(v/v)，流速为1mL/min，柱温均在30℃，进样量20μL，检测波长为238nm。
本发明的有益效果：所制备的藻毒素免疫亲和层析柱对微囊藻毒素-LR特异性强，纯化效果显著，明显优于现有的固相萃取方法。从附图中可以看出，标样微囊藻毒素-LR在5.942min处出峰，对应的藻毒素免疫亲和柱净化的水样中微囊藻毒素-LR在5.974min处出峰，固相萃取柱净化的相同水样中微囊藻毒素-LR在5.988min处出峰。且在藻毒素免疫亲和柱净化的水样中只有两个小的杂质峰，即有两种少量杂质，并且杂质不会干扰微囊藻毒素-LR的测定；而在固相萃取柱净化的相同水样中出现大量的杂质峰，且峰面积远大于微囊藻毒素-LR的峰，杂质峰信号几乎掩盖了微囊藻毒素-LR的峰信号，即固相萃取柱净化的水样中许多种杂质没能除去，并且杂质的量远多于需要检测的微囊藻毒素-LR的量，杂质信号几乎掩盖了微囊藻毒素-LR的信号。该藻毒素免疫亲和层析柱提高了富集和纯化的效率，从而提高了检测方法的灵敏度和准确性，制备方法简单，柱子可重复使用。
附图说明
图1微囊藻毒素-LR标样HPLC谱图。
图2免疫亲和柱净化的蓝藻污染的太湖水样HPLC谱图。
图3固相萃取柱净化的蓝藻污染的太湖水样HPLC谱图。
具体实施方式
实施例1、藻毒素免疫亲和层析柱的制备
1、将0.1mg的微囊藻毒素-LR多克隆抗体，溶于5mL pH 8.3含有0.5M NaCl的0.1M NaHCO3缓冲液中。
2、称取0.2g溴化氰活化的琼脂糖冻干粉末，用适量1mM的稀盐酸使其溶胀，然后在烧结玻璃滤器上冲洗以除去杂质。
3、将溶胀后的琼脂糖凝胶在pH 8.3含有0.5M NaCl的0.1M NaHCO3缓冲液中与(1)制备得到的抗体溶液均匀混合，并在室温下震荡充分反应3小时。
4、用pH 8.3含有0.5M NaCl的0.1M NaHCO3缓冲液洗去未与琼脂糖凝胶结合的游离抗体，得到琼脂糖-抗体偶联复合物。
5、将琼脂糖-抗体偶联复合物转入pH 8.0的含0.5M NaCl的1M乙醇胺溶液中，保持3小时，以封闭琼脂糖凝胶中多余的活性基团。
6、步骤(5)得到的琼脂糖-抗体偶联复合物用7倍偶联复合物体积的pH 4.0的含0.5M NaCl的0.1M醋酸缓冲液洗，和用7倍偶联复合物体积的pH 8.0的含0.5M NaCl的0.1M Tris-HCl缓冲液洗，此洗涤过程重复三次。
7、装柱：将步骤(6)得到的琼脂糖-抗体偶联复合物填充入层析柱中，即制成免疫亲和层析柱。
8、保存：填充好的免疫亲和层析柱，保存在4℃的冰箱内，1年之内性能稳定。
9、柱的再生：用10个柱床体积pH8.5含0.5M NaCl的0.1M Tris—HCl缓冲液，和用10个柱床体积pH4.5含0.5M NaCl的0.1M醋酸钠缓冲液轮流清洗免疫亲和层析柱2次，再用PBS缓冲液充分平衡免疫亲和层析柱后保存在4℃冰箱内供下次使用，免疫亲和层析柱经过再生后可再次使用，每根免疫亲和层析柱可反复再生使用5-10次。
实施例2、藻毒素免疫亲和层析柱在检测蓝藻污染的太湖水样中微囊藻毒素-LR的应用
1、藻毒素免疫亲和层析柱的使用方法
(1)制备的藻毒素免疫亲和层析柱先用5mL甲醇和5mL蒸馏水预处理。
(2)1L水样通过玻璃GF/C微纤维过滤器，滤液过处理好的藻毒素免疫亲和层析柱。
(3)用5mLPBS和5mL蒸馏水洗柱，除去杂质；
(4)用10mL纯甲醇将柱中吸附的微囊藻毒素-LR洗脱，洗脱液减压蒸干，残留物用0.5mL30％甲醇溶液溶解后进HPLC分析；
(5)藻毒素净化样进HPLC分析，色谱条件如下：色谱柱为Kromasil100-5C18 250×4.6mm，高效液相色谱仪为Waters 2965配合Waters 996二极管阵列检测器，流动相为含0.08％甲酸的去离子水：乙腈＝60：40(v/v)，流速为1mL/min，柱温均在30℃，进样量20μL，检测波长为238nm。
2、用固相萃取柱按上述相同的方法处理同样的水样，净化样按相同的色谱条件进HPLC分析。
3、检测结果
藻毒素免疫亲和层析柱净化水样的效果如附图2所示，固相萃取柱净化水样的效果如附图3所示。从附图1可以看出，标样微囊藻毒素-LR在5.942min处出峰，附图2中藻毒素免疫亲和柱净化的水样对应的微囊藻毒素-LR在5.974min处出峰，附图3中固相萃取柱净化的相同水样微囊藻毒素-LR在5.988min处出峰。可以看出藻毒素免疫亲和层析柱净化水样的杂质远少于固相萃取柱净化的水样。
用不同浓度微囊藻毒素-LR标样进HPLC分析，根据不同浓度微囊藻毒素-LR标样的峰面积，线性拟合得标准曲线为y＝71008x+381，其中x为微囊藻毒素-LR浓度(μg/mL)，y为微囊藻毒素-LR峰面积(μAU·s)，线性范围为0.01-0.5μg/mL，相关系数R2＝0.979。按三倍信噪比测得微囊藻毒素-LR检出限为5ng/mL。
根据峰面积计算，免疫亲和层析柱两次平行测定蓝藻污染的太湖水样中微囊藻毒素-LR含量为0.197ng/mL和0.213ng/mL，固相萃取柱两次平行测定蓝藻污染的太湖水样中MC-LR含量为0(对应位置未出峰)和0.032ng/mL。说明免疫亲和层析柱提高了富集和纯化的效率，从而提高了检测方法的灵敏度和准确性。
实施例3、藻毒素免疫亲和层析柱在检测蓝藻粉中微囊藻毒素-LR的应用
1、蓝藻粉的前处理
将1g粉碎蓝藻粉加入30mL 5％乙酸中，搅拌抽提60min，离心分离，收集上层清液，沉淀再重复抽提两次，合并上清液并过滤，滤液备用。
2、藻毒素免疫亲和层析柱的使用方法
滤液的免疫亲和层析柱净化方法同实施例2中的水样。
3、检测结果
蓝藻粉中微囊藻毒素-LR的含量远高于水中的含量。根据免疫亲和层析柱净化的滤液第一次进HPLC得到的大致含量，将其稀释至微囊藻毒素-LR的0.01-0.5μg/mL线性范围内再次进HPLC，根据峰面积使用标准曲线计算得此蓝藻粉中微囊藻毒素-LR的含量为75.4μg/g藻粉。
Claims (2)
1、一种藻毒素免疫亲和层析柱的制备方法，其特征是制备步骤如下：
(1)将所需量的藻毒素抗体：单抗或多抗，溶于pH8.3含有0.5M NaCl的0.1M NaHCO3缓冲液中，每毫克藻毒素抗体冻干粉末用10-50mL缓冲液溶解；
(2)称取适量溴化氰活化的琼脂糖冻干粉末，用适量1mM的稀盐酸使其溶胀，然后在烧结玻璃滤器上冲洗以除去杂质，1g琼脂糖干粉溶胀为3.5mL凝胶，1mL琼脂糖凝胶结合0.5-10mg抗体；
(3)将溶胀后的琼脂糖凝胶在pH8.3含有0.5M NaCl的0.1M NaHCO3缓冲液中与(1)制备得到的抗体溶液均匀混合，并在室温下震荡充分反应1-3小时，或在4℃下过夜；
(4)用pH8.3含有0.5M NaCl的0.1M NaHCO3缓冲液洗去未与琼脂糖凝胶结合的游离抗体，得到琼脂糖-抗体偶联复合物；
(5)将琼脂糖-抗体偶联复合物转入pH8.0的含0.5M NaCl的0.1MTris-HCl缓冲液，或pH8.0的含0.5M NaCl的1M乙醇胺溶液中，保持1-3小时，以封闭琼脂糖凝胶中多余的活性基团；
(6)步骤(5)得到的琼脂糖-抗体偶联复合物用不少于5倍该偶联复合物体积的pH4.0的含0.5M NaCl的0.1M醋酸缓冲液洗，和用不少于5倍该偶联复合物体积的pH8.0的含0.5M NaCl的0.1M Tris-HCl洗，此洗涤过程重复三次；
(7)防腐处理：步骤(6)制备好的琼脂糖-抗体偶联复合物如需放置一段时间，应使用含有1/10000叠氮钠的PBS缓冲液浸泡，然后沥去多余的溶液后放入包装袋或瓶中在4℃中密闭保存，待用；
(8)装柱：将步骤(6)或(7)得到的琼脂糖-抗体偶联复合物填充入层析柱或固相萃取空柱管中，即制成藻毒素免疫亲和层析柱；
(9)保存：琼脂糖-抗体偶联复合物或填充好的藻毒素免疫亲和层析柱切勿冷冻，保存在4℃的冰箱内，1年之内性能稳定；
(10)柱的再生：用4-10个柱床体积pH8.5含0.5M NaCl的0.1M Tris—HCl缓冲液，和用4-10个柱床体积pH4.5含0.5M NaCl的0.1M醋酸钠缓冲液轮流清洗免疫亲和层析柱2次，再用PBS缓冲液充分平衡免疫亲和层析柱后保存在4℃冰箱内供下次使用，免疫亲和层析柱经过再生后可再次使用，每根免疫亲和层析柱可反复再生使用5-10次。
2、如权利要求1所述方法制备的藻毒素免疫亲和层析柱的应用方法，其特征是：
(A)样品中藻毒素的分离纯化：
(1)水样
制备的藻毒素免疫亲和层析柱先依次用5mL甲醇和5mL蒸馏水预处理；1L水样通过玻璃GF/C微纤维过滤器或0.45μm微孔滤膜过滤，滤液过处理好的藻毒素免疫亲和层析柱，然后依次用5mL PBS和5mL蒸馏水洗；最后用10mL纯甲醇洗脱，洗脱液减压蒸干，残留物用0.5mL30％甲醇溶液溶解后进HPLC分析；
或(2)藻类及其制品
将粉碎藻粉按1g藻粉加10-30mL5％乙酸的比例加入5％乙酸中，搅拌抽提30-90min，离心分离，收集上层清液，沉淀再重复抽提两次，合并上清液并过滤，滤液按(1)水样的方法处理后进HPLC分析；
或(3)水产品
水产品样品用丁醇+甲醇+水，5+25+70体积分数，抽提30-120min；肝脏试样用pH＝7的含50mM Tris-HCl、2mM EDTA、2mM2-ME和10％甘油溶液抽提30-120min；抽提液按(1)水样的方法处理后进HPLC分析；
(B)藻毒素净化样的HPLC分析
藻毒素净化样进HPLC分析，色谱条件如下：
色谱柱为Kromasil 100-5C18250×4.6mm，高效液相色谱仪为Waters2965配合Waters996二极管阵列检测器，流动相为含0.08％甲酸的去离子水：乙腈＝60：40(v/v)，流速为1mL/min，柱温均在30℃，进样量20μL，检测波长为238nm。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CNB2007100237708A CN100519579C (zh) | 2007-07-09 | 2007-07-09 | 一种藻毒素免疫亲和层析柱的制备与使用方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CNB2007100237708A CN100519579C (zh) | 2007-07-09 | 2007-07-09 | 一种藻毒素免疫亲和层析柱的制备与使用方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN101134161A CN101134161A (zh) | 2008-03-05 |
| CN100519579C true CN100519579C (zh) | 2009-07-29 |
Family
ID=39158610
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CNB2007100237708A Expired - Fee Related CN100519579C (zh) | 2007-07-09 | 2007-07-09 | 一种藻毒素免疫亲和层析柱的制备与使用方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN100519579C (zh) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2731377A1 (en) * | 2008-08-27 | 2010-03-04 | Ge Healthcare Bioscience Bioprocess Corp. | A system and method for manufacturing bed supports for chromatography columns |
| CN101446576B (zh) * | 2008-12-29 | 2011-06-22 | 江苏省苏微微生物研究有限公司 | 一种微囊藻毒素-lr单抗免疫亲和柱的制备和使用方法 |
| CN102407098A (zh) * | 2011-11-15 | 2012-04-11 | 南昌大学 | 一种免疫亲和层析介质的制备方法及在纯化河豚毒素中的应用 |
| CN103224542B (zh) * | 2013-04-17 | 2014-09-10 | 江苏澳格姆生物科技有限公司 | 一种用于常温下抗体活性保存的溶液及其制备方法 |
| CN104128167B (zh) * | 2014-07-29 | 2016-02-24 | 四川材料与工艺研究所 | 氢同位素定量分析用的气相色谱柱填料的制备方法及其色谱柱的制作工艺 |
| CN104698176A (zh) * | 2015-03-18 | 2015-06-10 | 天津农学院 | 吸附氯霉素的免疫亲和搅拌棒及其制备方法与应用 |
| CN104931695A (zh) * | 2015-07-02 | 2015-09-23 | 北京农学院 | 一种同时分析4种真菌毒素(don、zea、t-2、ht-2)的免疫亲和柱制备方法 |
| CN111748031B (zh) * | 2020-06-24 | 2021-12-10 | 浙江毓昌生物技术有限公司 | 高纯度抗蛇毒血清及其制备方法 |
| CN111921509B (zh) * | 2020-07-16 | 2021-04-20 | 深圳职业技术学院 | 固相萃取柱及其制备方法和乳铁蛋白的检测方法 |
-
2007
- 2007-07-09 CN CNB2007100237708A patent/CN100519579C/zh not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN101134161A (zh) | 2008-03-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN100519579C (zh) | 一种藻毒素免疫亲和层析柱的制备与使用方法 | |
| Druffel et al. | Cycling of dissolved and particulate organic matter in the open ocean | |
| CN101446576B (zh) | 一种微囊藻毒素-lr单抗免疫亲和柱的制备和使用方法 | |
| US9131724B2 (en) | Methods for removal of microcystins and isolation of phycocyanin from cyanobacteria | |
| CN101397346B (zh) | 一种具有免疫调节作用的龙须菜纯多糖的制备方法 | |
| CN1995007B (zh) | 迷迭香酸的制备方法 | |
| Larson | Dissolved organic matter of a low‐coloured stream | |
| CN104117229A (zh) | 一种黄曲霉毒素免疫亲和柱及其制备方法和用途 | |
| CN103160471B (zh) | 赭曲霉毒素a杂交瘤细胞株和抗体与复合免疫吸附剂和免疫亲和柱与试剂盒及其应用 | |
| CN107964031A (zh) | 一种从泽泻中提取分离的三萜类化合物及其方法和应用 | |
| CN101900711A (zh) | 土壤中土霉素残留量的高效液相色谱检测方法 | |
| CN101863935A (zh) | 1,4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯对照品的制备方法 | |
| CN101974080A (zh) | 一种利用串联固相萃取小柱分离纯化微囊藻毒素的方法 | |
| CN102994418A (zh) | 一株产表面活性素和伊枯草菌素a类化合物的甲基营养型芽孢杆菌及其应用 | |
| CN102297967B (zh) | 一种pvy/cmv表面等离子体共振检测方法 | |
| CN104109204A (zh) | 一种从水稻种子中分离纯化重组人乳铁蛋白的方法 | |
| CN104181300A (zh) | 一种伏马毒素免疫亲和柱及其制备方法和用途 | |
| CN103160472A (zh) | 黄曲霉毒素杂色曲霉素杂交瘤细胞株和抗体与免疫吸附剂和免疫亲和柱与试剂盒及其应用 | |
| CN108467398A (zh) | 一种二酮哌嗪类化合物及其制备和应用 | |
| CN109503393B (zh) | 一种高速逆流色谱制备伏马毒素b1标准品的方法 | |
| CN103071315B (zh) | 微型高效沙丁胺醇免疫亲和纯化富集柱制备及应用 | |
| CN109609568B (zh) | 一种采用固体发酵法制备苦马豆素的方法 | |
| CN103509744A (zh) | 一株溶藻希瓦氏菌及其在控制蓝藻水华中的应用 | |
| CN104387499B (zh) | 一种利用免疫亲和技术提纯硫酸软骨素的方法 | |
| CN102329346A (zh) | 一种从肉苁蓉中提取松果菊苷的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| C17 | Cessation of patent right | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20090729 Termination date: 20100709 |