CN111381041A - Pd-1抗体检测试剂盒 - Google Patents

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CN111381041A CN201811633350.6A CN201811633350A CN111381041A CN 111381041 A CN111381041 A CN 111381041A CN 201811633350 A CN201811633350 A CN 201811633350A CN 111381041 A CN111381041 A CN 111381041A
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金华君
张亚军
宋姗姗
黄晨
朱梦玲
钱其军
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Shanghai Cell Therapy Group Co Ltd
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Shanghai Cell Therapy Research Institute
Shanghai Cell Therapy Group Co Ltd
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
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Abstract

本发明提供了一种PD‑1抗体检测试剂盒，其包括PD‑1抗原和第二抗体，所述试剂盒以“支持物‑PD‑1抗原‑PD‑1抗体‑第二抗体‑标记物”形式完成检测，优选地，所述PD‑1抗体包括IgG4Fc。)本发明提供的PD‑1抗体检测试剂盒检测特异性强，灵敏度高，稳定性好。能有效的捕获细胞分泌的PD‑1抗体，实现对细胞分泌的PD‑1抗体的有效检测。

Description

PD-1抗体检测试剂盒
技术领域
本发明涉及分子生物学检测领域，具体而言，涉及一种PD-1抗体检测试剂盒。
背景技术
程序性死亡分子1(programmed death-1,PD-1)，也称CD279，是一种分子量在50-55kD的跨膜糖蛋白，主要表达与激活的T淋巴细胞、B淋巴细胞、单核细胞等免疫细胞表面，在健康状态下，其正常功能是下调不需要的或过度的免疫反应，包括自身免疫反应。PD-1是免疫球蛋白(Ig)超家族成员，现已证实PD-1与其配体(PD-L1和/或PD-L2)结合时，可负性调节抗原受体信号。作为T细胞的负性调控因子，PD-1与其配体PD-L1/PD-L2一同参与T细胞免疫过程。已有大量研究证实，PD-1在体内炎症和肿瘤免疫过程中发挥重要作用。PD-1/PD-L1调节轴在人体T细胞活化控制与机体免疫耐受维持中发挥关键作用，因此也被肿瘤细胞以及慢性病毒感染中所利用。虽然正常的器官仅能少量表达PD-1，但已有研究证实各种肿瘤细胞可大量表达这种T细胞的抑制剂。PD-1/PD-L1调节轴已被证实促进T细胞耗竭，肿瘤或病毒诱导的PD-1/PD-L1信号通路也可通过多种机制来实现宿主免疫监视的逃逸，包括促进T细胞失活、衰竭、反应迟钝和细胞凋亡，诱导Treg细胞扩增，以及增强肿瘤内在性抵抗杀伤和凋亡的能力。通过癌细胞介导的PD-1和PD-L1相互作用导致肿瘤浸润淋巴细胞减少，T细胞增殖抑制，并增加免疫逃逸(Topalian SL等，Cancer Cell，2015)。现已发现肿瘤细胞中PD-L1的高表达(PD-L2的水平较低)与各种肿瘤的不良预后和生存相关，包括肾细胞癌、胰腺癌、肝细胞癌、卵巢癌和非小细胞肺癌。此外，研究还发现PD-1可调节黑色素瘤患者体内肿瘤特异性T细胞的扩增。这表明PD-1/PD-L1通路在肿瘤侵袭中起到一个重要的作用，因而是一个备受瞩目的治疗干预靶点。
目前，有5种针对PD-1/PD-L1的抗体已获得了美国食品和药物管理局批准，分别为抗PD-1抗体(Pembrolizumab和Nivolumab)、抗PD-L1抗体(Atezolizumab，Avelumab及Durvalumab)。但PD-1抗体在临床应用中仍然存在一些不可避免的问题。一方面由于PD-1单抗是静脉注射全身用药，大多数接受PD-1抗体阻断治疗的患者都会出现不同程度的药物毒副作用。另一方面PD-1单抗的生产涉及复杂的生产制备与纯化工艺，成本高，导致治疗费用昂贵。
近年来将嵌合抗原受体T细胞(chimeric antigen receptor T cell,CAR-T)治疗技术与免疫检查点的阻断联用，如与PD-1抗体的联用成为越来越受关注的一种治疗手段。但PD-1抗体在临床应用中仍然存在一些不可避免的问题。一方面由于PD-1单抗是静脉注射全身用药，大多数接受PD-1抗体阻断治疗的患者都会出现不同程度的药物毒副作用。并且大分子抗体对实体瘤的穿透力不足，全身用药具有较大的毒副作用，且药物成本很高。分泌免疫检查点抗体的CAR-T细胞，如分泌PD-1抗体的CAR-T细胞，成为克服上述治疗方案缺陷的一种选择。对于自表达PD-1抗体的免疫效应细胞如CAR-T细胞，其自身的PD-1抗体的表达水平对肿瘤杀伤的效果至关重要。因此目前仍然需要有效的检测手段检测PD-1抗体的表达。
发明内容
本发明的所要解决的技术问题是为了解决目前需要PD-1抗体表达水平的检测方法，提供了一种PD-1抗体检测试剂盒，选用PD-1抗原蛋白和第二抗体进行检测，检测特异性强，灵敏度高，稳定性好。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
本发明一方面提供了一种PD-1抗体检测试剂盒，所述试剂盒包括PD-1抗原和第二抗体，所述试剂盒以“支持物-PD-1抗原-PD-1抗体-第二抗体-标记物”形式完成检测。
在一优选实施方案中，所述PD-1抗原可以为任何表达PD-1物种的PD-1抗原，优选地为哺乳动物PD-1抗原，如人PD-1抗原、兔PD-1抗原、小鼠PD-1抗原或大鼠PD-1抗原，更优选地为人PD-1抗原。
在一优选实施方案中，所述PD-1抗原为全长抗原。
在一优选实施方案中，所述PD-1抗原为PD-1蛋白胞外区；优选地，所述PD-1蛋白胞外区的序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明提供的PD-1抗体检测试剂盒，选用PD-1抗原与PD-1抗体进行结合，能有效的抓获抗体，实现抗体表达水平的有效检测。
支持物包括但不限于聚苯乙烯、聚乙烯、纤维素、硝酸纤维素、醋酸纤维素、硅化物等材料制备的酶标板、小球、微粒子、玻片、芯片、塑料、薄膜等。
本发明提供的试剂盒以“支持物-PD-1抗原-PD-1抗体-第二抗体-标记物”的形式完成检测，主要检测流程如下：
包被：将PD-1抗原包被到支持物上，并清洗。
封闭：将支持物上没有包被上PD-1抗体的空位点用惰性蛋白封闭，以免后续反应中的非特异性吸附。
PD-1抗原捕获PD-1抗体：加入待测样品后孵育，PD-1抗原捕获样品中的PD-1抗体。
PD-1抗体捕获带标记物的第二抗体：加入带标记物的第二抗体后孵育，PD-1抗体捕获第二抗体。
检测：通过一步或几步引入标记物进行检测。
进一步地，所述标记物选自荧光物质、量子点、地高辛标记探针、生物素、放射性同位素、放射性造影剂、顺磁离子荧光微球、电子致密物质、化学发光标记物、超声造影剂、光敏剂、胶体金或酶中的任一种。
在一些实施方式中，所述荧光物质包括Alexa 350、Alexa 405、Alexa 430、Alexa488、Alexa 555、Alexa 647、AMCA、氨基吖啶、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665、BODIPY-FL、BODIPY-R6G、BODIPY-TMR、BODIPY-TRX、5-羧基-4′，5′-二氯-2′，7′-二甲氧基荧光素、5-羧基-2′，4′，5′，7′-四氯荧光素、5-羧基荧光素、5-羧基罗丹明、6-羧基罗丹明、6-羧基四甲基罗丹明、Cascade Blue、Cy2、Cy3、Cy5、Cy7、6-FAM、丹磺酰氯、荧光素、HEX、6-JOE、NBD(7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑)、Oregon Green 488、Oregon Green 500、Oregon Green514、Pacific Blue、邻苯二甲酸、对苯二甲酸、间苯二甲酸、甲酚固紫、甲酚蓝紫、亮甲酚蓝、对氨基苯甲酸、赤藓红、酞菁、偶氮甲碱、花青、黄嘌呤、琥珀酰荧光素、稀土金属穴状化合物、三双吡啶基二胺铕、铕穴状化合物或螯合物、二胺、双花青苷、La Jolla蓝染料、别藻蓝蛋白、allococyanin B、藻蓝蛋白C、藻蓝蛋白R、硫胺、藻红青蛋白、藻红蛋白R、REG、罗丹明绿、罗丹明异硫氰酸酯、罗丹明红、ROX、TAMRA、TET、TRIT(四甲基罗丹明异硫醇)、四甲基罗丹明和德克萨斯红中的任一种。
在一些实施方式中，所述放射性同位素包括110In、111In、177Lu、18F、52Fe、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、86Y、90Y、89Zr、94mTc、94Tc、99mTc、120I、123I、124I、125I、131I、154-158Gd、32P、11C、13N、15O、186Re、188Re、51Mn、52mMn、55Co、72As、75Br、76Br、82mRb和83Sr中的任一种。
在一些实施方式中，所述荧光微球为：聚苯乙烯荧光微球，内部包裹有稀土荧光离子铕。
进一步地，所述标记物后还包括识别信号，所述标记物与所述识别信号通过生物素-亲合素系统显色。
本发明采用生物素-链霉亲合素系统显色，提高灵敏度。链霉亲合素与生物素之间的亲和力极强，二者结合的亲和常数比抗原与抗体的亲和常数至少高1万倍以上，因此二者能快速结合，而且反应不受外界干扰。
进一步地，所述标记物为生物素，所述识别信号包括依次链霉亲和素标记的催化酶以及与所述催化酶相适的底物。
进一步地，所述催化酶选自辣根过氧化酶或碱性磷酸酶；
相应地，所述底物为3,3',5,5'-四甲基联苯胺或邻苯二胺。
底物为3,3',5,5'-四甲基联苯胺时，因为显色液的批次不同，所以显色的时间不固定，一般标准是浓度最高的标准品的OD值在2.0左右。
进一步地，所述试剂盒包括包被有PD-1抗原的反应板、生物素标记的第二抗体、链霉亲和素标记的催化酶以及底物。
本发明试剂盒的优选方案是将链霉亲合素进行辣根过氧化物酶的标记，采用该标记物识别生物素化的第二抗体，即借助生物素-链霉亲合素放大系统实现更灵敏的检测。
进一步地，所述试剂盒还包括PD-1抗体标准品、样品稀释液、洗涤液和终止液中的任一种或多种。
进一步地，所述洗涤液为PBST。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明以PD-1抗原包被基质，能有效的捕获细胞分泌的PD-1抗体，实现对细胞分泌的PD-1抗体的有效检测；
(2)本发明提供的PD-1抗体检测试剂盒检测特异性强，灵敏度高，稳定性好。
附图说明
图1为PD-1抗体ELISA检测试剂盒的标准曲线。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例中所述的“室温”是指进行试验的操作间的温度，一般为25℃。
以下实施例中所用到的PD-1抗原和PD-1抗体的制备方法如下：
PD-1抗原：合成序列为SEQ ID NO:3所示的DNA序列，编码的蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:1所示，依次包括轻链信号肽和PD-1蛋白胞外区，分别在SEQ ID NO:3的5’端与3’端连接EcoRI与XbaI的酶切位点接头后，连接到pCDNA3.4载体上，构建得到过表达PD-1蛋白胞外区的表达载体，根据ExpiCHOTM(购自Thermo Fisher公司，货号：A29133)表达系统说明书，使用ExpiCHOTM表达系统对上述融合蛋白进行过表达后，使用GE Healthcare的MabSelect亲和层析树脂按说明书操作步骤对表达产物进行纯化，获得PD-1抗原(PD-1蛋白胞外区)。
PD-1抗体：方法与PD-1抗原的制备方法类似，合成序列为SEQ ID NO:4所示的DNA序列，编码的蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:2所示，依次包括轻链信号肽、PD-1单链抗体、铰链区和IgG4Fc，按上述PD-1抗原合成的方法进行同样处理，获得PD-1抗体。
实施例1
PD-1抗体检测试剂盒，包括以下组分：
包被有按上述方法制得的PD-1抗原的反应板、生物素标记的二抗、链霉亲和素-辣根过氧化物酶耦合物(Streptavidin-HRP)、TMB显色液、PD-1抗体标准品、样品稀释液、洗涤液和终止液；
所述PD-1抗原为PD-1抗原胞外结构域，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
1)包被液：Na2CO3 1.59g，NaHCO3 2.93g，加双蒸水定容1L，调节pH为9.6(灭菌)；
2)终止液：蒸馏水178.3ml，98％浓硫酸21.7ml；
3)10×PBS缓冲液：NaCl 80.0g，KCl 2.0g，Na2HPO4·12H2O 35.8g,
KH2PO4 2.4g，加双蒸水定容1L，调节pH为6.8(灭菌)；
4)PBST:PBS+0.05％吐温(500ml PBS+250μl吐温)；
5)封闭液：1％BSA(10ml PBST+0.1g的BSA)；
6)样品稀释液：PBS+0.08％吐温+1％BSA；
7)TMB(3,3’,5,5’-四甲基联苯胺)：购自ThermoFisher，货号：002023；
8)Streptavidin-HRP：购自ThermoFisher，货号：S911
PD-1抗体标准品为C端融合IgG4Fc的靶向PD-1的单链抗体，序列如SEQ ID NO.2所示。
包被有PD-1抗原的反应板采用以下方法制备：
1)用包被液将PD-1抗原稀释至1μg/ml(0.51μl+4ml包被液)，100μl/孔包被酶标反应板，4℃过夜。
2)用PBST清洗3遍，200μl/孔，每次1分钟，用吸水纸拍干。
3)每孔加封闭液300μl，37℃生化培养箱孵育2小时。
4)用PBST清洗3遍，200μl/孔，每次1分钟，用吸水纸拍干。
PD-1抗原制备方法如下：
实施例2
采用实施例1提供的试剂盒制备标准曲线，步骤如下：
1)用封闭液稀释标准品，从8ng/ml开始，向下设置6个梯度及0ng/ml，每孔加入标准品100μl；标准品稀释设置7个浓度如下，即原液、2倍稀释液、4倍稀释液、8倍稀释液、16倍稀释液、32倍稀释液、64倍稀释液，以及0，每孔加入100μl；37℃生化培养箱孵育2小时。
2)用PBST清洗3遍，200μl/孔，每次1分钟，用吸水纸拍干。
3)用商品化PBS将Streptavidin(HRP)按1：40，000的比例稀释，100μl/孔，37℃孵育30分钟。
6)用PBST清洗3遍，200μl/孔，每次1分钟，用吸水纸拍干。
7)加入显色液TMB，100μl/孔，室温避光显色15min。
8)加入终止液50μl/孔，终止反应。
得到的标准曲线如图1所示，标准曲线有较好的线性关系，符合抗体检测的要求。根据标准品的检测曲线，计算待检测样品中的PD-1抗体含量。
实施例3
采用实施例1提供的试剂盒检测样品1-3，样品1-3分别为配置的浓度为0.01ng/ml、0.02ng/ml和0.03ng/ml的PD-1scFv-IgG4Fc，步骤如下：
1)取待检测样品进行稀释，设置5个浓度，以10倍进行稀释，每孔加入100μl；37℃生化培养箱孵育2小时。
2)用PBST清洗3遍，200μl/孔，每次1分钟，用吸水纸拍干。
3)用封闭液将biotin标记的mesoCAR3-Fc稀释，100μl/孔，37℃生化培养箱孵育30分钟。
4)用PBST清洗3遍，200μl/孔，每次1分钟，用吸水纸拍干。
5)用商品化PBS将Streptavidin(HRP)按1：40，000的比例稀释，100μl/孔，37℃孵育30分钟。
6)用PBST清洗3遍，200μl/孔，每次1分钟，用吸水纸拍干。
7)加入显色液TMB，100μl/孔，室温避光显色15min。
8)加入终止液50μl/孔，终止反应。
阴性对照：水。
表1检测结果
Figure BDA0001929453030000081
Figure BDA0001929453030000091
从表1可以看出，本发明提供的试剂盒，特异性强，检测灵敏度佳，可以检测到样品中0.01ng/ml级别的PD-1抗体。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 上海细胞治疗集团有限公司
上海细胞治疗研究院
<120> PD-1抗体检测试剂盒
<130> 18B030
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<211> 186
<212> PRT
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Val Leu Gln Leu Gly Trp Arg Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp
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tccaccacaa ccgcctacat ggaactgaag tccctgcagt tcgacgacac cgccgtgtac 720
tactgcgcca ggcgggacta ccggttcgac atgggcttcg actactgggg ccagggcacc 780
accgtgaccg tgtcctccga gtccaaatat ggtcccccat gcccaccatg cccagggcag 840
ccccgagagc cacaggtgta caccctgccc ccatcccagg aggagatgac caagaaccag 900
gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc taccccagcg acatcgccgt ggagtgggag 960
agcaatgggc agccggagaa caactacaag accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc 1020
tccttcttcc tctacagcag gctaaccgtg gacaagagca ggtggcagga ggggaatgtc 1080
ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg cacaaccact acacacagaa gagcctctcc 1140
ctgtctctgg gtaaatga 1158

Claims (9)

1.一种PD-1抗体检测试剂盒，其特征在于，其包括PD-1抗原和第二抗体，所述试剂盒以“支持物-PD-1抗原-PD-1抗体-第二抗体-标记物”形式完成检测，优选地，所述PD-1抗体包括IgG4Fc。
2.根据权利要求1所述PD-1抗体检测试剂盒，其特征在于，所述PD-1抗体的序列如SEQID NO:1所示。
3.根据权利要求1所述PD-1抗体检测试剂盒，其特征在于，所述标记物选自荧光物质、量子点、地高辛标记探针、生物素、放射性同位素、放射性造影剂、顺磁离子荧光微球、电子致密物质、化学发光标记物、超声造影剂、光敏剂、胶体金或酶中的任一种。
4.根据权利要求1所述PD-1抗体检测试剂盒，其特征在于，所述标记物后还包括识别信号，所述标记物与所述识别信号通过生物素-链霉亲合素系统显色。
5.根据权利要求4所述PD-1抗体检测试剂盒，其特征在于，所述标记物为生物素，所述识别信号包括依次链霉亲和素标记的催化酶以及与所述催化酶相适的底物。
6.根据权利要求5所述PD-1抗体检测试剂盒，其特征在于，所述催化酶选自辣根过氧化酶或碱性磷酸酶；
相应地，所述底物为3,3',5,5'-四甲基联苯胺或邻苯二胺。
7.根据权利要求1-6任一项所述PD-1抗体检测试剂盒，其特征在于，其还包括包被有所述PD-1抗原的反应板、生物素标记的第二抗体、链霉亲和素标记的催化酶以及底物。
8.根据权利要求7所述PD-1抗体检测试剂盒，其特征在于，其还包括PD-1抗体标准品、样品稀释液、洗涤液和终止液中的任一种或多种。
9.根据权利要求8所述PD-1抗体检测试剂盒，其特征在于，所述洗涤液为PBST。
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