KR101517689B1 - 신규한 KCa3.1 채널 항체 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성되는 KCa3.1 채널(intermediate conductance calcium-activated potassium channel, subfamily N, member 4) 단백질의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체, 상기 KCa3.1 채널 단백질의 에피토프인 폴리펩티드, 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 상기 벡터를 포함하는 형질전환체, 상기 항체를 포함하는 세포막의 KCa3.1 채널 검출용 조성물, 및 상기 항체를 포함하는 KCa3.1 채널 매개 질환의 진단용 조성물에 관한 것이다.

Description

신규한 KCa3.1 채널 항체 및 이의 용도{A novel antibody for KCa3.1 channel protein, and use thereof}
본 발명은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성되는 KCa3.1 채널(intermediate conductance calcium-activated potassium channel, subfamily N, member 4) 단백질의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체, 상기 KCa3.1 채널 단백질의 에피토프인 폴리펩티드, 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 상기 벡터를 포함하는 형질전환체, 상기 항체를 포함하는 세포막의 KCa3.1 채널 검출용 조성물, 및 상기 항체를 포함하는 KCa3.1 채널 매개 질환의 진단용 조성물에 관한 것이다.
KCa3.1 채널(intermediate conductance calcium-activated potassium channel, subfamily N, member 4)은 신경세포, 적혈구, 섬유아세포, 증식하는 혈관평활근 세포, 혈관내피세포, 그리고 면역세포(T 세포와 B 세포) 등에 분포하고 있으며 이들 세포의 기능을 조절하는데 기여한다(Kaushal V et al, 2007, J Neurosci 27(1):234-244). 이에, KCa3.1 채널은 이러한 세포들에 의하여 발생하는 질병들을 치료하는 타겟으로 여겨지고 있다.
구체적으로 심혈관계에서 KCa3.1 채널은 주로 혈관내피세포에 분포하므로, KCa3.1 채널 기능 이상은 혈관내피세포 기능 이상을 야기하여 혈압을 증가시키는 것으로 알려져 있다(Si H et al, 2006, Circ Res 99(5):537-544). 한편 KCa3.1 채널은 면역세포(T세포 및 B 세포), 섬유아세포, 암세포, 혈관평활근 세포 등의 증식에 기여하는 것으로 알려져 있다(Ghanshani S et al, 2000, J Biol Chem 275(47):37137-37149). 따라서, KCa3.1 채널을 억제하는 약물을 투여하거나 KCa3.1 채널을 파괴하는 경우, 암세포의 증식이 억제되고, 죽상경화증, 신 섬유화(renal fibrosis), 혈관성형술 후 재협착(post-angioplasty restenosis)의 진행이 억제되는 효과를 보일 수 있다. KCa3.1 채널을 비롯한 채널 단백질은 세포막에서 작용하므로 세포막에서의 발현 정도가 매우 중요하다. 따라서, 세포막에 위치한 KCa3.1 채널 단백질을 효과적으로 검출하면서도 특이도가 높은 항체의 개발이 중요하다. 한편, 기존에 개발된 KCa3.1 채널 단백질에 대한 항체들에는 다음 2 가지가 있다. KCa3.1 채널 단백질의 세포 내 부분을 인지하는 항체가 현재 사용되고 있다. 이 항체는 세포 내에서 KCa3.1 단백질과 반응하므로, 약물을 이용하여 세포막에 이 항체들이 들어갈 수 있는 구멍을 내거나 세포를 파쇄해야 한다. 그리고 이 항체로는 세포 전체에 있는 KCa3.1 단백질을 검출하며 세포막에 위치하는 KCa3.1 단백질만을 선택적으로 검출할 수 없다. 그러므로 이온채널 연구에서 중요한 세포막에서의 발현 조절 기전 연구에는 사용하기 어렵다. 그런데 KCa3.1 채널 단백질의 세포 외 부분을 인지하는 항체도 개발되어 현재 사용되고 있다. 그러나 이 항체가 인지하는 세포 외 부분의 구조는 KCa2.x(SKCa) 등 다른 K channel과 유사한 구조를 가지고 있어 KCa3.1 단백질 외에 KCa2.x(SKCa) 등에도 반응을 할 수 있으며 KCa3.1 단백질을 특이적으로 인지하지 못하는 문제점이 있었다.
이러한 배경 하에 본 발명자들은 세포막에 위치한 KCa3.1 단백질을 특이적으로 인지하여, KCa3.1 단백질의 세포막에서의 존재 여부 등을 검출할 수 있는 항체를 개발하고자 예의 노력한 결과, 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열로 구성되는 KCa3.1 단백질의 에피토프를 구성하는 폴리펩티드가 KCa3.1 단백질에만 특이적으로 존재하는 부위이며, 이를 이용하여 제조한 항체의 경우, 세포막에 위치한 KCa3.1 단백질을 효과적으로 검출할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성되는 KCa3.1 채널(intermediate conductance calcium-activated potassium channel, subfamily N, member 4) 단백질의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산으로 구성되는, KCa3.1 단백질의 에피토프인 폴리펩티드를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 및 상기 벡터를 포함하는 형질전환체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체를 포함하는, 세포막의 KCa3.1 채널 검출용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체를 포함하는, KCa3.1 채널 매개 질환의 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체를 이용하여, KCa3.1 채널 매개 질환 의심 개체로부터 분리된 생물학적 시료의 KCa3.1 채널 단백질을 항원-항체 반응을 통하여 검출하는 단계를 포함하는, KCa3.1 채널 매개 질환의 진단을 위한 정보의 제공방법을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성되는 KCa3.1 채널(intermediate conductance calcium-activated potassium channel, subfamily N, member 4) 단백질의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다.
본 발명에서 용어, "KCa3.1 채널(intermediate conductance calcium-activated potassium channel, subfamily N, member 4) 단백질"은 세포 내 칼슘에 의해 활성화되는 헤테로테트라머(heterotetramer) 형태의 전압-비의존성 포타슘 채널을 의미한다. 본 발명에서 상기 KCa3.1 채널은 KCNN4와 혼용되어 사용될 수 있다. 이와 같은 KCa3.1 채널이 활성화되면 막전압이 과분극(hyperpolarization)되어 칼슘 유입(influx)을 촉진시키는 것으로 알려져 있다. 상기 KCa3.1 채널 단백질은 다른 KCNN 패밀리의 포타슘 채널 유전자와 유사한 점이 있으나, 이와는 다른 새로운 서브 패밀리에 속하는 것으로 여겨진다. 상기 KCa3.1 채널 단백질은 세포 내에서 생성되어 세포막에서 기능하므로, 실제 기능하는 채널 단백질을 연구하기 위해서는 세포막에 있는 단백질만을 선택적으로 인지하는 항체가 필요하다. KCa3.1 채널 단백질의 세포 외 부위를 특이적으로 인지하는 항체는 세포막에 있는 채널 단백질만 선택적으로 인지할 수 있다. 또한, 이때 사용되는 항체는 KCa의 다른 패밀리 단백질을 인지하지 않으며 KCa3.1 채널 단백질만을 특이적으로 인지할 수 있어야 한다. 이에, 본 발명은 이와 같이 세포막에 있는 KCa3.1 채널 특이적 항체의 개발을 기반으로 한다.
본 발명에서 용어, "서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성되는 KCa3.1 채널 단백질의 에피토프"는 KCa3.1 채널 단백질의 두 번째 세포 외 부위(second extracellular region)인 S3-S4 부위 중 다른 KCa 채널과 중첩되지 않으면서도 이를 이용하여 항체 제조시 민감도 및 특이도가 높은 부위를 말한다. 구체적으로, 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 KCa3.1 채널 단백질의 에피토프는 마우스 KCa3.1 단백질의 SPHCALAGEATDAQPWP (서열번호 1) 부위를 말하며, 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성되는 KCa3.1 채널 단백질의 에피토프는 인간 KCa3.1 단백질의 QDLGAPLTSPQPWP (서열번호 2) 부위를 말한다.
상기 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열로 구성되는 KCa3.1 채널 단백질의 에피토프는, 기존에 보고된 여러 KCa3.1 채널 단백질의 항체의 에피토프와 달리, KCa3.1 채널 단백질의 세포 외 부위면서도, 다른 KCa 채널 단백질의 부위와 동일하지 않아, KCa3.1 채널 단백질의 에피토프로서 특이성을 지닌다. 따라서, 상기 에피토프에 결합하는 항체의 경우, 면역세포화학분석법, 웨스턴 블롯팅에 사용될 수 있는 이점이 있다. 즉, KCa2.x와 같은 다른 KCa 채널 단백질을 인지할 수 있는 항체의 경우, 웨스턴 블롯팅과 같은 분석 방법에 있어서는 검출된 단백질의 분자량을 통하여 KCa3.1 채널 단백질의 특이성을 확인하는 2차적 확인 단계가 필요하나, 면역세포화학분석법에서는 세포 파쇄 및 다른 검출 지표가 없어 KCa3.1 채널 단백질의 검출 여부를 확신할 수 없다. 특히 현재 상용화된 세포 외 부분을 인지하는 경우 KCa2.x도 인식할 가능성이 높은데, KCa2.x는 단백질 분자량이 KCa3.1과 큰 차이가 없어 분자량만으로는 구별할 수 없을 가능성도 높다. 그러나, 본 발명의 신규한 에피토프에 결합하는 항체의 경우, KCa3.1 채널 단백질에 특이성을 가지므로, 분자량의 확인 없이도 면역세포화학분석법에도 용이하게 적용할 수 있는 이점을 가진다.
본 발명에서 용어, "에피토프(epitope)"란, 항원 분자에 존재하는 항원 특이성을 결정하는 부위를 의미하며, "항원결정기" 또는 "항원결정부위"와 혼용되어 사용될 수 있다.
본 발명에서 용어, "항체"는 면역학적으로 특정 항원과 반응성을 갖는 면역글로불린 분자를 포함하는, 항원을 특이적으로 인식하는 수용체 역할을 하는 단백질 분자를 의미한다. 본 발명에서 상기 항체는 다클론항체, 단일클론항체, 전체(whole) 항체 및 항체 단편을 모두 포함한다. 또한, 상기 용어는 키메라성 항체(예를 들면, 인간화 뮤린 항체) 및 이종결합항체(예를 들면, 양특이성 항체)와 같은 유전공학에 의해 생산된 형태를 포함한다. 전체 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며, 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 상기 전체 항체는 IgA, IgD, IgE, IgM 및 IgG를 포함하며, IgG는 아형(subtype)으로, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함한다. 상기 항체 단편은 항원결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, Fab' F(ab')2 및 Fv 등을 포함한다. 상기 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역(CH1 도메인)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C 말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv(variable fragment)는 중쇄 가변부위 및 경쇄 가변부위만을 가지고 있는 최소의 항체조각을 의미한다. 이중쇄Fv(dsFv)는 디설파이드 결합으로 중쇄 가변부위와 경쇄 가변부위가 연결되어 있고 단쇄 Fv(scFv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변 영역과 경쇄의 가변 영역이 공유 결합으로 연결되어 있다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하며 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있다), 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다.
본 발명에서 용어, "다클론 항체(polyclonal antibody)"는 동일한 항원 또는 별개의 다른 항원상에서 동일하거나 상이한 에피토프와 반응하는 상이한 항체로서, 본 발명에서는 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 KCa3.1 채널 단백질 특이적 다클론항체를 의미한다.
본 발명에서 용어, "서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열로 구성되는 KCa3.1 채널 단백질의 에피토프를 특이적으로 인지하는 항체"는 세포막에 위치하는 KCa3.1 채널 단백질을 세포 파쇄 없이도 효과적으로 인지하는 항체를 의미한다. 상기 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열로 구성되는 에피토프의 경우, 다른 KCa 단백질의 부위와 동일하지 않아 이를 인지하는 항체의 경우 KCa3.1 채널 단백질을 높은 특이도로 인지할 수 있는 이점을 가진다.
또한, 상기 항체는 KCa3.1 채널 단백질의 세포 외 부위를 인지하여, 세포 파쇄 없이 세포막에 위치한 KCa3.1 단백질을 특이적으로 인지할 수 있는 이점이 있다.
본 발명에서 상기 항체는 공지의 항체의 제조 방법에 따라 제조될 수 있으며, 그 예로 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열로 구성되는 KCa3.1 채널 단백질의 에피토프인 폴리펩티드를 적합한 개체, 예컨대, 생쥐, 래빗 또는 염소와 같은 개체에 접종하여 생산할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 실시예에서는 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열로 구성되는, KCa3.1 채널 단백질의 특정 부위를 면역원을 선별하고, 이를 토끼에 접종하여 다클론항체를 제조하고, 이를 세럼으로부터 정제하였다(실시예, 도 1). 또한, 이와 같이 제조한 항체가 KCa3.1 채널 단백질을 효과적으로 인지할 수 있는지를 확인하기 위하여 ELISA, 웨스턴 블롯 및 면역세포화학 분석을 수행하였고(도 2 내지 도 5), 그 결과 상기 모든 실험에서 본 발명의 항체가 KCa3.1 채널 단백질을 효과적으로 검출할 수 있을 뿐 아니라, 세포막에 위치한 KCa3.1 채널 단백질을 검출하는 결과를 나타내어, 이를 면역세포화학 분석법 등에 유용하게 사용될 수 있을 뿐 아니라, KCa3.1 채널 단백질의 검출 여부가 중요한 KCa3.1 채널 매개 질환의 진단에 사용할 수 있음을 확인하였다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산으로 구성되는, KCa3.1 채널 단백질의 에피토프인 폴리펩티드를 제공한다.
상기 KCa3.1 채널 단백질 및 에피토프에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 및 상기 벡터를 포함하는 형질전환체를 제공한다.
상기 폴리펩티드에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명에서 제공하는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터는 특별히 이에 제한되지 않으나, 포유류 세포(예를 들어, 사람, 원숭이, 토끼, 랫트, 햄스터, 마우스 세포 등), 식물 세포, 효모 세포, 곤충 세포 또는 박테리아 세포(예를 들어, 대장균 등)를 포함하는 진핵 또는 원핵세포에서 상기 폴리뉴클레오티드를 복제 및/또는 발현할 수 있는 벡터가 될 수 있고, 바람직하게는 숙주세포에서 상기 뉴클레오티드가 발현될 수 있도록 적절한 프로모터에 작동가능하도록 연결되며, 적어도 하나의 선별마커를 포함하는 벡터가 될 수 있다. 그 예로 파아지, 플라스미드, 코스미드, 미니-염색체, 바이러스 또는 레트로바이러스벡터 등에 상기 폴리뉴클레오티드가 도입된 형태가 될 수 있다.
본 발명에서 제공하는 발현 벡터가 도입된 형질전환체는 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 발현벡터가 도입되어 형질전환된 대장균, 스트렙토미세스, 살모넬라 티피뮤리움 등의 박테리아 세포; 효모 세포; 피치아 파스토리스 등의 균류세포; 드로조필라, 스포도프테라 Sf9 세포 등의 곤충 세포; CHO(중국 햄스터 난소 세포, chinese hamster ovary cells), SP2/0(마우스 골수종), 인간 림프아구(human lymphoblastoid), COS, NSO(마우스 골수종), 293T, 보우 멜라노마 세포, HT-1080, BHK(베이비 햄스터 신장세포, baby hamster kidney cells), HEK(인간 배아신장 세포, human embryonic kidney cells), PERC.6(인간망막세포) 등의 동물 세포; 또는 식물 세포가 될 수 있다.
본 발명에서 용어, "도입"은 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주세포에 전달하는 방법을 의미한다. 이와 같은 도입은 칼슘 포스페이트-DNA 공침전법, DEAE-덱스트란-매개 트랜스펙션법, 폴리브렌-매개 형질감염법, 전기충격법, 미세주사법, 리포좀 융합법, 리포펙타민 및 원형질체 융합법 등의 당 분야에 공지된 여러 방법에 의해 수행될 수 있다. 또한, 형질도입은 감염(infection)을 수단으로 하여 바이러스 입자를 사용하여 목적물을 세포 내로 전달시키는 것을 의미한다. 아울러, 유전자 밤바드먼트 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 도입할 수 있다. 본 발명에서 도입은 형질전환과 혼용되어 사용될 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 항체를 포함하는, 세포막의 KCa3.1 채널 검출용 조성물을 제공한다.
상기 항체에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명의 항체는, KCa3.1 채널 단백질의 세포 외 부위로서, KCa3.1 채널 단백질에 특이적인 부위에 결합하는 항체이므로, 이를 이용하여 세포막의 KCa3.1 채널 단백질을 효과적으로 검출할 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 항체를 이용하여, KCa3.1 채널 매개 질환 의심 개체로부터 분리된 생물학적 시료의 KCa3.1 채널 단백질을 항원-항체 반응을 통하여 검출하는 단계를 포함하는, KCa3.1 채널 매개 질환의 진단을 위한 정보의 제공방법을 제공한다.
상기 항체 및 KCa3.1에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명에서 용어, "KCa3.1 채널 매개 질환"은, KCa3.1 채널 단백질의 발현 변화가 질환의 발병 또는 진행에 관여하는 질환을 의미하며, 그 예로 겸상적혈구 빈혈증(sickle cell anemia); 급성 면역반응 또는 자가 면역질환을 포함하는 면역질환; 염증 반응을 나타내는 염증성 질환; 재협착 또는 죽상동맥경화증을 포함하는 혈관질환; 트라우마 뇌손상, 뇌허혈, 또는 퇴행성 신경질환을 포함하는 뇌질환; 전립선암, 또는 췌장암을 포함하는 암질환; 또는 분비성 설사 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다. KCa3.1 채널은 적혈구, 면역세포, 증식하는 혈관 평활근세포, 내피세포, 암세포 일부, 분비하는 상피세포 등에 분포하고 있으며, 그 중에서도 혈관평활근 세포에 KCa3.1 채널이 발현하면 혈관평활근의 증식이 유도되어 동맥경화증이나(Toyama K et al., J Clin Invest. 2008 Sep;118(9):3025-37.), 재협착(Signal Transduction in the Cardiovascular System in Health and Disease Advances in Biochemistry in Health and Disease Volume 3, 2008, pp 357-374)을 유발할 수 있는 것으로 알려져 있다.
상기 KCa3.1 채널 매개 질환의 진단을 위한 정보의 제공방법은 본 발명의 KCa3.1 채널에 특이적인 항체를 KCa3.1 채널 매개 질환이 의심되는 개체의 분리된 생물학적 시료와 반응시키고 항원-항체 복합체 형성을 검출함으로써 KCa3.1 단백질을 검출할 수 있으며, 이를 통해 KCa3.1 채널 매개 질환의 진단을 위한 정보의 제공을 할 수 있다. 이때, 정상 세포 또는 조직과 같은 대조군과 발현량을 비교하여 암을 진단할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어, "생물학적 시료"란 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 조직 부검 시료(뇌, 피부, 림프절, 척수 등), 세포 배양 상등액, 파열된 진핵세포 및 세균 발현계 등을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들 생물학적 시료를 조작하거나 조작하지 않은 상태로 본 발명의 항체와 반응시켜 KCa3.1 단백질의 존재 또는 KCa3.1 채널 매개 질환의 유무를 확인할 수 있다.
본 발명에서 용어, "항원-항체 복합체"란 시료 중의 KCa3.1 단백질 항원과 이를 인지하는 본 발명에 따른 항체의 결합물을 의미하며, 이러한 항원-항체 복합체의 형성은 비색법(colormetric method), 전기화학법(electrochemical method), 형광법(fluorimetric method), 발광법(luminometry), 입자계수법(particle counting method), 육안측정법(visual assessment) 및 섬광계수법(scintillation counting method)으로 이루어진 군에서 선택되는 임의의 방법으로 검출할 수 있다. 그러나 반드시 이들로만 제한되지 않고 다양한 응용과 적용이 가능하다.
본 발명에서는 항원-항체 복합체를 검출하기 위한 것으로 여러 가지 표지체를 사용할 수 있다. 구체적인 예로는 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자, 방사성 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택될 수 있으며, 반드시 이들로만 한정되는 것은 아니다.
검출 표지체로서 사용되는 효소로는 아세틸콜린에스테라제, 알칼라인 포스파타제, β-D-갈락토시다제, 호스래디쉬 퍼옥시다제, β-라타마제 등을 포함하며, 형광물로는 플루오레세인, Eu3 +, Eu3 + 킬레이트 또는 크립테이트 등을 포함하며, 리간드로는 바이오틴 유도체 등을 포함하며, 발광물로는 아크리디늄 에스테르, 이소루미놀 유도체 등을 포함하며, 미소입자로는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등을 포함하며, 방사성 동위원소로는 57Co, 3H, 125I, 125I-볼톤(Bonton) 헌터(Hunter) 시약 등을 포함한다.
바람직하게는, 항원-항체 복합체를 효소면역흡착법(ELISA)을 이용하여 검출할 수 있다. 효소면역흡착법(ELISA)에는 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 표지된 항체를 이용하는 직접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체의 복합체에서 포획 항체를 인지하는 표지된 이차 항체를 이용하는 간접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또 다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 2차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA 등 다양한 ELISA 방법을 포함한다.
상기 항체는 검출 표지를 가질 수 있으며, 검출표지를 가지지 않을 경우는 이들 항체를 포획할 수 있고 검출 표지를 가지는 또 다른 항체를 처리하여 확인할 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 항체를 포함하는, KCa3.1 채널 매개 질환의 진단용 조성물을 제공한다.
상기 항체 및 KCa3.1 채널에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명의 항체는 KCa3.1 단백질에 특이적으로 존재하는 에피토프에 결합하며, 세포막에 위치하는 KCa3.1 단백질을 효과적으로 검출하므로, 상기 항체를 웨스턴블롯 뿐만 아니라, 면역화학 등에 이용할 수 있다.
도 1은, 본 발명의 마우스 KCa3.1 채널 단백질의 에피토프로 제조한 항체의 정제 과정 결과를 나타낸 도이다.
도 2는, 본 발명의 마우스 또는 인간 KCa3.1 채널 단백질의 에피토프로 제조한 항체의 ELISA 테스트 결과를 나타낸 도이다.
도 3은, 본 발명의 마우스 KCa3.1 결합 항체를 이용하여 웨스턴 블롯팅을 시행한 결과를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는, 본 발명의 항-KCa3.1 세럼을 이용하여 KCa3.1을 발현하는 HEK293 세포에서 면역세포화학 분석을 수행한 결과를 나타낸 도이다. 세포막을 나타내는 WGA의 붉은 색 형광과 KCa3.1을 나타내는 초록 색 형광이 잘 일치하여 항-KCa3.1 세럼은 세포막에 있는 KCa3.1을 잘 보여주고 있음을 알 수 있다.
도 5는, HUVEC 세포에서 본 발명의 KCa3.1 결합 항체를 이용하여 면역세포화학 분석을 수행한 결과를 나타낸 도이다. 이때 KCa3.1 결합 항체가 세포막을 통과할 수 있도록 약물 처치를 하였으며, KCa3.1을 나타내는 붉은 색 형광이 세포 전체에서 관찰되고 있다. 이와 같이 이 항체가 세포막을 통과할 수 있도록 세포막에 적절한 처치를 하는 경우 세포 내에 있는 KCa3.1도 찾아낼 수 있다.
이하 본 발명을 하기 예에 의해 상세히 설명한다. 다만, 하기 예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 하기 예에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.
실시예 : 마우스 KCa3 .1 채널 단백질에 특이적으로 결합하는 항체( EC124 )의 제조
마우스 또는 인간 기원의 KCa3.1 단백질에 대한 면역원을 준비하였고, 여기서 마우스 KCa3.1 단백질 기원의 면역원은 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되었고, 인간 KCa3.1 단백질 기원의 면역원은 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성되었다.
아미노산 서열 (N term ->C term ) 서열번호
마우스 기원의 KCa3.1 단백질 기원의 면역원 SPHCALAGEATDAQPWP 1
인간 기원의 KCa3.1 단백질 기원의 면역원 QDLGAPLTSPQPWP 2
이와 같이 준비한 면역원을 토끼를 대상으로 하기 표 2와 같은 면역 진도표를 시행하여 토끼 다클론 항체를 제작하였다.
Figure 112013090791194-pat00001
또한, 상기와 같은 과정으로 제조한 마우스 KCa3.1 결합 다클론항체를 포함하는 세럼을 정제하는 과정을 수행하였고, 정제 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1에서 화살표는 정제된 본 발명의 항체를 나타낸다.
실험예 : EC124 항체의 KCa3 .1 채널 단백질의 검출 능력 확인
(1) ELISA ( enzyme - linked immunosorbent assay ) 분석
상기 실시예에서 제조한 본 발명의 마우스 KCa3.1 결합 항체 및 인간 KCa3.1 결합 항체의 결합력을 ELISA 분석으로 확인하였고, 그 결과를 도 2에 나타내었다.
여기서, ELISA 분석은 KCa3.1 단백질을 포함하는 코팅 용액(0.05-0.1 ㎍/50 ㎕ 카보네이트 완충액, pH 9.0)을 96-웰 플레이트의 각 웰에 첨가하고, 이를 상온에서 반응시킨 후, 세척하였다.
그 다음, 코팅된 웰의 남아있는 단백질 결합 위치를 블록킹시키기 위하여, PBS(pH 7.0)에 희석된 5% 보바인 젤라틴을 각 웰에 첨가하여 반응시킨 다음, 이를 세척하였다.
상기와 같은 코팅 및 블록킹 과정을 거친 다음, 본 발명의 항체를 포함하는 최종 안티-세럼(또는 대조군으로서 전-면역 세럼)을 첨가하여 상온에서 3시간 반응시킨 후, 결합된 면역 복합체를 규명하기 위하여 항-토끼 이차 항체를 첨가하고, 30 분 동안 반응시킨 후, OD 450nm에서 반응정도를 검출하였다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 항-KCa3.1 항체는 농도 의존적으로 항원인 KCa3.1과 반응하는 결과를 나타내었다.
(2) 마우스 KCa3 .1 결합 항체의 면역 블롯 검사
또한, 본 발명에서는 면역 블롯 방법을 통하여 본 발명의 KCa3.1 결합 항체의 항원 결합능을 NIH-3T3 세포에서 확인하였다.
구체적으로, NIH-3T3 세포의 파쇄물을 SDS-PAGE 겔에 전기 영동한 다음, PVDF 막에 전사하고, 블록킹한 다음, 1 : 2,000으로 비율로 희석한 마우스 KCa3.1 결합 항체와 3 시간 동안 상온에서 반응시킨 후, HRP(horse radish peroxidase)가 컨쥬게이션된 항-토끼 2차 항체를 1 : 2,000의 비율로 1 시간 동안 상온에서 반응시킨 후, 이를 세척하고 ECL 용액을 사용하여 KCa3.1 단백질을 검출하였다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 마우스 KCa3.1 결합 항체를 이용하여 웨스턴 블롯을 수행한 경우, KCa3.1 단백질이 강하게 나타내는 밴드가 나타나(KCa3.1 dominant band, 빨간색 상자), 본 발명의 항체를 이용하여 KCa3.1 단백질을 효과적으로 인지할 수 있음을 확인하였다.
(3) 면역 세포 화학 분석
본 발명의 KCa3.1 항체가 세포막에 위치한 KCa3.1 단백질을 효과적으로 인지할 수 있어 세포 파쇄 없이 세포막에 위치한 KCa3.1 항체를 인지하는 것에 용이하게 사용할 수 있는지를 확인하기 위하여 면역 세포 화학 분석을 수행하였다.
구체적으로, KCa3.1을 발현하는 HEK 293 세포인, HEK_KCa3 .1 세포에 항-KCa3.1 세럼을 반응시킨 다음, 알렉사 플루오르 488-컨쥬게이션된 이차 항체(Alexa Fluor 488-conjugated secondary antibody) (녹색) 또는 알렉사 플루오르 594-컨쥬게이션된 소맥배아응집소(Alexa Fluor 594-conjugated wheat germ agglutinin (WGA; red))를 반응시켜, 세포막에 위치한 KCa3.1 단백질의 검출 여부를 확인하였다. 여기서, DAPI로 핵을 염색하였다.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 항체를 이용하여 세포막의 KCa3.1 단백질을 염색하는 경우, 세포 내부에 대한 염색 없이 세포막만을 뚜렷하게 염색(녹색)하는 결과를 나타내어, 본 발명의 항체가 세포 파쇄 없이 세포막에 위치한 KCa3.1 단백질을 효과적으로 인지할 수 있는 항체라는 것을 시사하였다.
또한, 세포 내 존재하는 모든 인간 KCa3.1 항원을 감지하기 위하여HUVEC(primary human umbilical endothelial cells)에 본 발명의 인간 KCa3.1 항체를 적용하여 면역세포화학 분석을 수행하였다.
구체적으로, HUVEC 세포에 본 발명의 인간 KCa3.1 항체를 반응시킨 다음, 항-토끼 알렉사 555 2차 항체를 반응시켜 KCa3.1의 분포 여부를 확인하였다. 또한, DAPI로 핵을 염색하였다.
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 항체는 KCa3.1 단백질을 효과적으로 인지하는 결과를 나타내었다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> Ewha University - Industry Collaboration Foundation <120> A novel antibody for KCa3.1 channel protein, and use thereof <130> PA130709KR <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope for KCa3.1 antibody (mouse) <400> 1 Ser Pro His Cys Ala Leu Ala Gly Glu Ala Thr Asp Ala Gln Pro Trp 1 5 10 15 Pro <210> 2 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope for KCa3.1 antibody (Human) <400> 2 Gln Asp Leu Gly Ala Pro Leu Thr Ser Pro Gln Pro Trp Pro 1 5 10

Claims (11)

  1. 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성되는 KCa3.1 채널(intermediate conductance calcium-activated potassium channel, subfamily N, member 4) 단백질의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 항체는 세포막에 위치한 KCa3.1 채널 단백질을 특이적으로 인지할 수 있는 것인 항체.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 항체는 상기 에피토프를 토끼에 투여하여 제조된 것인 항체.
  4. 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성되는, KCa3.1 채널(intermediate conductance calcium-activated potassium channel, subfamily N, member 4) 단백질의 에피토프인 폴리펩티드.
  5. 제4항의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  6. 제5항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  7. 제6항의 벡터를 포함하는 형질전환체.
  8. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 항체를 포함하는, 세포막의 KCa3.1 채널 검출용 조성물.
  9. 삭제
  10. 제1항의 항체를 포함하는, KCa3.1 채널 매개 질환의 진단용 조성물로서, 상기 KCa3.1 채널 매개 질환은 겸상적혈구 빈혈증(sickle cell anemia); 급성 면역반응 또는 자가 면역질환을 포함하는 면역질환; 염증성 질환; 재협착 또는 죽상동맥경화증을 포함하는 혈관질환; 트라우마 뇌손상, 뇌허혈, 또는 퇴행성 신경질환을 포함하는 뇌질환; 전립선암, 또는 췌장암을 포함하는 암질환; 또는 분비성 설사인 것인 조성물.
  11. 제1항의 항체를 이용하여, KCa3.1 채널 매개 질환 의심 개체로부터 분리된 생물학적 시료의 KCa3.1 채널 단백질을 항원-항체 반응을 통하여 검출하는 단계를 포함하는, KCa3.1 채널 매개 질환의 진단을 위한 정보의 제공방법으로서, 상기 KCa3.1 채널 매개 질환은 겸상적혈구 빈혈증(sickle cell anemia); 급성 면역반응 또는 자가 면역질환을 포함하는 면역질환; 염증성 질환; 재협착 또는 죽상동맥경화증을 포함하는 혈관질환; 트라우마 뇌손상, 뇌허혈, 또는 퇴행성 신경질환을 포함하는 뇌질환; 전립선암, 또는 췌장암을 포함하는 암질환; 또는 분비성 설사인 KCa3.1 채널 매개 질환의 진단을 위한 정보의 제공방법.
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