JPWO2014192974A1 - 抗lgr6抗体を含む癌の検出用又は診断用試薬 - Google Patents
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Abstract
本発明は、癌の検出用又は診断用試薬を提供することを目的とする。本発明は、LGR6に対するモノクローナル抗体又はその断片を含む、癌の検出用又は診断用試薬を提供する。
Description
本発明は、抗LGR6抗体を含む癌の検出用又は診断用試薬に関する。
世界の死因の上位は、癌である。特に大腸癌は、欧米において癌死亡率の上位を占めている。大腸癌の患者数は近年急激に増加しており、日本では年間約6万人が大腸癌に罹患し、臓器別の死亡数でも、胃癌、肺癌に続く3番目の多さとなっている。また、乳癌は、英国、米国および日本において、最も一般的にみられる女性の癌である。現在日本の乳癌罹患者数は4万人を超えており、その数はいまだに増加傾向にある。
大腸癌や乳癌は、病期が進行していなければ手術によって治癒可能であり、他方、切除不能な進行・再発性の癌においても、薬物療法の進歩により治療成績が大幅に改善している。しかしながら、進行再発大腸癌の平均的な生存期間は約2年であり、乳癌の場合は約1年半である。
癌を診断する場合には、組織染色を行う前に体液成分を利用した検出が有用である。大腸癌の場合、便潜血反応を用いた診断法が普及している。この手法では、ヒトヘモグロビンの存在を調べることにより、腸内の出血の有無を診断し、間接的に大腸癌の発生を予測する。
便潜血反応は、簡単に受けられる検査であるため広く利用されているが、検査の有用性について課題もある。例えば、ヘモカルトII(アステラス製薬)を利用した試験で陽性判定になるには、大腸内で1日あたり20mgの出血が必要だが、実際の大腸癌患者の出血は10mg以下であると考えられている。そのため、便潜血反応の感度は26%程度で、実際の大腸癌患者のおよそ1/4しか発見できず、3/4を見逃しているとの報告がある(非特許文献1:Jama,Vol.269,1262−7,1993)。さらに、陽性判定がなされた被験者の中で、実際に大腸癌であったのは8.3%に過ぎず、多くの偽陽性を含む検査方法であり、課題が残されている。
乳癌の場合は、乳房X線検査(マンモグラフィー)や超音波による診断が行われている。マンモグラフィー検診を継続的に受けたグループでは、受けないグループに比べて乳癌死亡率は15〜20%減少すると報告されている。一方で、近年の報告では、乳癌の罹患者数が増える40歳代女性において、マンモグラフィーは死亡率減少に効果が認められないという報告がある(非特許文献2:Annals of Internal Medicine,Vol.137,305−312,2002)。これは、乳腺密度の高さが原因で乳癌を発見できないことが理由であり、特に年齢の若い日本人女性がマンモグラフィーによる検査に不向きであることも報告されている。このため、新たな診断方法の開発が求められている。
癌診断においては、身体検診、尿検査、血液生化学検査、血球算定、胸部X線や便潜血検査によって癌が疑われる場合、しこりのある組織の一部を採取した生検サンプルを用いた組織学的検査及び免疫組織化学検査が行われ、染色像について形態的な診断が行われる。一般的には、得られた組織から薄切切片を作製し、固定した後にヘマトキシリン・エオシン染色(HE染色)が行われる。
組織の所見においては、組織を構成する基底細胞の消失等が、癌であると判断するための重要な要素になっているが、基底細胞は良性病変でも変化することがあり、HE染色のみによる判断は困難なことが多く、異型病変における基底細胞の判定は免疫組織化学染色が主体として行われている。免疫組織化学染色において、大腸癌では上皮増殖因子受容体(EGFR)、乳癌では上皮成長因子受容体2(Her2/erbB2)を検出することにより、癌を評価する方法が利用されている(特許文献1:2006−519376号公報)。
しかしながら、免疫組織化学染色による発現頻度は、大腸癌でEGFRを検出した場合、25〜77%であり、報告者によって幅がみられる(非特許文献3:モダンメディア55巻7号2009年)。また、乳癌においては、Her2を検出した場合15〜25%であり、陽性を示す患者の割合が限られている(非特許文献4:Endocr Relat Cancer,Vol.9,p.75−85,2002)。また、EGFR及びHer2ともに、正常な組織でも染色の方法によっては染色される場合があり、陽性判定は厳密に標準化された方法が必要となる。
このような状況から、癌患者における発現割合が高く、抗体医薬品の効果予測ができるような新たな標的分子の開発と、新たな標的分子を検出するためのモノクローナル抗体の開発が求められている。
ロイシンリッチリピート含有Gタンパク質共役型受容体−6(leucine−rich repeat containing G protein−coupled receptor 6(LGR6))は、967アミノ酸からなる膜タンパク質であり、7回膜貫通型の領域とN末端の長い細胞外領域からなる構造を有している。
LGR6遺伝子は、正常組織と比較して胃癌患者において発現が上昇する遺伝子の一つとして開示されている(非特許文献5:Virchows Arch.,Vol.461,p.355−365,2012)。また、LGR6を認識するウサギ由来の抗LGR6ポリクローナル抗体(antibodies−online社)を用いた組織アレイにより、481症例の胃癌症例を解析し、153症例(32%)でLGR6陽性であるという結果が公開されている(同文献)。
他方、LGR6と相同性を示すLGRファミリータンパク質としては、LGR4及びLGR5が知られているが、LGR6とこれらの分子とは相違点が多く、以下の通り検出の標的分子としては異なるタンパク質であるといえる。
まず、ロイシンリッチリピート(LRRs)の繰り返し回数は、LGR4及びLGR6では15回であるのに対し、LGR5では16回であり、タンパク質の構造が相違する(図1)。
また、LGR4、LGR5及びLGR6は、R−spondin1、2、3及び4と結合し、Wnt/βカテニンシグナルを増強させるが(非特許文献6:PLoS One,Vol.7,e37137,2012)、R−spondin1、2、3及び4のそれぞれに対する親和性は、LGR4、LGR5及びLGR6の各分子によって異なっている。例えば、LGR6は、R−spondin2と最も親和性が高く、次いで、R−spondin3、1、4の順に親和性が高いことが報告されている。すなわち、各LGR分子は、親和性の高いR−spondinの違いによって、その効果も相違することが想定される(非特許文献6:PLoS One,Vol.7,e37137,2012)。
また、LGR4、LGR5及びLGR6の胃癌における発現プロファイルを解析した結果、LGR4及びLGR6の陽性率はそれぞれ43%及び32%であることが示されている(非特許文献5:Virchows Arch.,Vol.461,p.355−365,2012)。これに対し、LGR5は胃の正常幹細胞において陽性を示し、胃癌のマーカーとして使用できないことが示されている。他方、LGR5は、大腸癌の癌幹細胞のマーカーとして使用できる可能性が示唆されている(非特許文献7:Science,Vol.337,p.730−735,2012)。また、LGR5は胃癌においても幹細胞と考えられる部分に発現するが、それ以外の癌の部分では強い発現が見られないことが示されている。これに対し、LGR4やLGR6は、胃癌において、幹細胞を含む癌全体で発現することが示されている。
さらに、LGR4、LGR5及びLGR6は、ヒト癌細胞の株の種類によって細胞内mRNA量が大幅に異なることも報告されている(非特許文献6:PLoS One,Vol.7,e37137,2012)。
すなわち、LGR6は、LGR4及びLGR5とは癌における発現パターンが異なっている。
また、全長アミノ酸配列における相同性(同一性)は、LGR6とLGR4との間で55%、LGR6とLGR5との間で49%である。また、ヒンジ領域を含むECD2における相同性は、LGR6とLGR4との間で42%、LGR6とLGR5との間で51%である。すなわち、LGR6とLGR4及びLGR5との相同性は高いとはいえない。
従って、LGR6とLGR4及びLGR5とは、標的分子として全く異なるタンパク質である。
特表2010−532169号公報(特許文献2)には、ヒトLGRタンパク質の細胞外ドメインに特異的に結合するモノクローナル抗体が記載されている。また、同文献には、当該抗体が、R−spondin1、2、3及び4タンパク質のLGRタンパク質への結合を乱し、かつ/又はR−spondinによるLGRシグナル伝達の活性化を乱すことが記載されている。さらに、同文献には、LGRタンパク質として、LGR4、LGR5及びLGR6が記載されている。
しかしながら、同文献において解析結果が記載されているのはLGR5及びこれに対する抗体であり、LGR6については何ら解析結果が記載されておらず、LGR6に対する抗体を取得したことも記載されていない。上記の通り、LGR6とLGR4及びLGR5とは、標的分子として全く異なるタンパク質であるため、同文献の記載からLGR6に対する抗体の構造、性質、機能等は明らかではない。
また、同文献で評価されているのは一部の癌に対する評価であり、ヒト腫瘍より単離した腫瘍形成性(TG)結腸癌細胞を用いた解析と、3症例の結腸腫瘍に対する発現解析のみである。すなわち、同文献には、LGR6が他の癌、例えば大腸癌や乳癌において発現が亢進していることは記載されていない。
LGR6に対する抗体としては、複数のメーカーからポリクローナル抗体が供給されている。例えば、LGR6のN末端部分を抗原として作製された、LS−A621(LifeSpan BioSciences社)、ABIN122207(GenWay Biotech社)、NBP1−49696(Novus Biological社)等が公知である。その他、LGR6の445−504アミノ酸残基を抗原としたH00059352−A01(Abnova Corporation社)、456−548を抗原とした抗体(Novus Biologicalsh社)、516−528アミノ酸残基を抗原としたL4169(Sigma−Aldrich社)が公知である。
LGR6に結合するモノクローナル抗体としては、ウサギモノクローナル抗体としてEPR6874(GenTax社)が公知であるが、細胞内ドメインを抗原として作製されたものであため、この抗体を用いて生きた癌細胞を検出することは困難である。また、免疫染色を行う場合、細胞の固定化と細胞膜の透過処理により、LGR6タンパク質が変性するため、抗体の検出感度が低下する。
抗体を目的タンパク質の検出や疾患の診断ツールとして利用するには、継続的かつ均質な生産と供給が重要であるため、モノクローナル抗体であることが望まれる。一般的に、LGR6のような膜タンパク質、特に複数回膜貫通型タンパク質は、可溶化することが難しいこと、哺乳動物の間でアミノ酸配列の相同性が高いため力価の高い抗体を誘導することが難しいこと等の理由から、高感度に膜タンパク質を検出できる抗体を作製することが困難である。免疫した動物の末梢血等からポリクローナル抗体を得られたとしても、抗体産生細胞を単離できる確率は非常に少ないのが現状である。
大腸癌や乳癌は、病期が進行していなければ手術によって治癒可能であり、他方、切除不能な進行・再発性の癌においても、薬物療法の進歩により治療成績が大幅に改善している。しかしながら、進行再発大腸癌の平均的な生存期間は約2年であり、乳癌の場合は約1年半である。
癌を診断する場合には、組織染色を行う前に体液成分を利用した検出が有用である。大腸癌の場合、便潜血反応を用いた診断法が普及している。この手法では、ヒトヘモグロビンの存在を調べることにより、腸内の出血の有無を診断し、間接的に大腸癌の発生を予測する。
便潜血反応は、簡単に受けられる検査であるため広く利用されているが、検査の有用性について課題もある。例えば、ヘモカルトII(アステラス製薬)を利用した試験で陽性判定になるには、大腸内で1日あたり20mgの出血が必要だが、実際の大腸癌患者の出血は10mg以下であると考えられている。そのため、便潜血反応の感度は26%程度で、実際の大腸癌患者のおよそ1/4しか発見できず、3/4を見逃しているとの報告がある(非特許文献1:Jama,Vol.269,1262−7,1993)。さらに、陽性判定がなされた被験者の中で、実際に大腸癌であったのは8.3%に過ぎず、多くの偽陽性を含む検査方法であり、課題が残されている。
乳癌の場合は、乳房X線検査(マンモグラフィー)や超音波による診断が行われている。マンモグラフィー検診を継続的に受けたグループでは、受けないグループに比べて乳癌死亡率は15〜20%減少すると報告されている。一方で、近年の報告では、乳癌の罹患者数が増える40歳代女性において、マンモグラフィーは死亡率減少に効果が認められないという報告がある(非特許文献2:Annals of Internal Medicine,Vol.137,305−312,2002)。これは、乳腺密度の高さが原因で乳癌を発見できないことが理由であり、特に年齢の若い日本人女性がマンモグラフィーによる検査に不向きであることも報告されている。このため、新たな診断方法の開発が求められている。
癌診断においては、身体検診、尿検査、血液生化学検査、血球算定、胸部X線や便潜血検査によって癌が疑われる場合、しこりのある組織の一部を採取した生検サンプルを用いた組織学的検査及び免疫組織化学検査が行われ、染色像について形態的な診断が行われる。一般的には、得られた組織から薄切切片を作製し、固定した後にヘマトキシリン・エオシン染色(HE染色)が行われる。
組織の所見においては、組織を構成する基底細胞の消失等が、癌であると判断するための重要な要素になっているが、基底細胞は良性病変でも変化することがあり、HE染色のみによる判断は困難なことが多く、異型病変における基底細胞の判定は免疫組織化学染色が主体として行われている。免疫組織化学染色において、大腸癌では上皮増殖因子受容体(EGFR)、乳癌では上皮成長因子受容体2(Her2/erbB2)を検出することにより、癌を評価する方法が利用されている(特許文献1:2006−519376号公報)。
しかしながら、免疫組織化学染色による発現頻度は、大腸癌でEGFRを検出した場合、25〜77%であり、報告者によって幅がみられる(非特許文献3:モダンメディア55巻7号2009年)。また、乳癌においては、Her2を検出した場合15〜25%であり、陽性を示す患者の割合が限られている(非特許文献4:Endocr Relat Cancer,Vol.9,p.75−85,2002)。また、EGFR及びHer2ともに、正常な組織でも染色の方法によっては染色される場合があり、陽性判定は厳密に標準化された方法が必要となる。
このような状況から、癌患者における発現割合が高く、抗体医薬品の効果予測ができるような新たな標的分子の開発と、新たな標的分子を検出するためのモノクローナル抗体の開発が求められている。
ロイシンリッチリピート含有Gタンパク質共役型受容体−6(leucine−rich repeat containing G protein−coupled receptor 6(LGR6))は、967アミノ酸からなる膜タンパク質であり、7回膜貫通型の領域とN末端の長い細胞外領域からなる構造を有している。
LGR6遺伝子は、正常組織と比較して胃癌患者において発現が上昇する遺伝子の一つとして開示されている(非特許文献5:Virchows Arch.,Vol.461,p.355−365,2012)。また、LGR6を認識するウサギ由来の抗LGR6ポリクローナル抗体(antibodies−online社)を用いた組織アレイにより、481症例の胃癌症例を解析し、153症例(32%)でLGR6陽性であるという結果が公開されている(同文献)。
他方、LGR6と相同性を示すLGRファミリータンパク質としては、LGR4及びLGR5が知られているが、LGR6とこれらの分子とは相違点が多く、以下の通り検出の標的分子としては異なるタンパク質であるといえる。
まず、ロイシンリッチリピート(LRRs)の繰り返し回数は、LGR4及びLGR6では15回であるのに対し、LGR5では16回であり、タンパク質の構造が相違する(図1)。
また、LGR4、LGR5及びLGR6は、R−spondin1、2、3及び4と結合し、Wnt/βカテニンシグナルを増強させるが(非特許文献6:PLoS One,Vol.7,e37137,2012)、R−spondin1、2、3及び4のそれぞれに対する親和性は、LGR4、LGR5及びLGR6の各分子によって異なっている。例えば、LGR6は、R−spondin2と最も親和性が高く、次いで、R−spondin3、1、4の順に親和性が高いことが報告されている。すなわち、各LGR分子は、親和性の高いR−spondinの違いによって、その効果も相違することが想定される(非特許文献6:PLoS One,Vol.7,e37137,2012)。
また、LGR4、LGR5及びLGR6の胃癌における発現プロファイルを解析した結果、LGR4及びLGR6の陽性率はそれぞれ43%及び32%であることが示されている(非特許文献5:Virchows Arch.,Vol.461,p.355−365,2012)。これに対し、LGR5は胃の正常幹細胞において陽性を示し、胃癌のマーカーとして使用できないことが示されている。他方、LGR5は、大腸癌の癌幹細胞のマーカーとして使用できる可能性が示唆されている(非特許文献7:Science,Vol.337,p.730−735,2012)。また、LGR5は胃癌においても幹細胞と考えられる部分に発現するが、それ以外の癌の部分では強い発現が見られないことが示されている。これに対し、LGR4やLGR6は、胃癌において、幹細胞を含む癌全体で発現することが示されている。
さらに、LGR4、LGR5及びLGR6は、ヒト癌細胞の株の種類によって細胞内mRNA量が大幅に異なることも報告されている(非特許文献6:PLoS One,Vol.7,e37137,2012)。
すなわち、LGR6は、LGR4及びLGR5とは癌における発現パターンが異なっている。
また、全長アミノ酸配列における相同性(同一性)は、LGR6とLGR4との間で55%、LGR6とLGR5との間で49%である。また、ヒンジ領域を含むECD2における相同性は、LGR6とLGR4との間で42%、LGR6とLGR5との間で51%である。すなわち、LGR6とLGR4及びLGR5との相同性は高いとはいえない。
従って、LGR6とLGR4及びLGR5とは、標的分子として全く異なるタンパク質である。
特表2010−532169号公報(特許文献2)には、ヒトLGRタンパク質の細胞外ドメインに特異的に結合するモノクローナル抗体が記載されている。また、同文献には、当該抗体が、R−spondin1、2、3及び4タンパク質のLGRタンパク質への結合を乱し、かつ/又はR−spondinによるLGRシグナル伝達の活性化を乱すことが記載されている。さらに、同文献には、LGRタンパク質として、LGR4、LGR5及びLGR6が記載されている。
しかしながら、同文献において解析結果が記載されているのはLGR5及びこれに対する抗体であり、LGR6については何ら解析結果が記載されておらず、LGR6に対する抗体を取得したことも記載されていない。上記の通り、LGR6とLGR4及びLGR5とは、標的分子として全く異なるタンパク質であるため、同文献の記載からLGR6に対する抗体の構造、性質、機能等は明らかではない。
また、同文献で評価されているのは一部の癌に対する評価であり、ヒト腫瘍より単離した腫瘍形成性(TG)結腸癌細胞を用いた解析と、3症例の結腸腫瘍に対する発現解析のみである。すなわち、同文献には、LGR6が他の癌、例えば大腸癌や乳癌において発現が亢進していることは記載されていない。
LGR6に対する抗体としては、複数のメーカーからポリクローナル抗体が供給されている。例えば、LGR6のN末端部分を抗原として作製された、LS−A621(LifeSpan BioSciences社)、ABIN122207(GenWay Biotech社)、NBP1−49696(Novus Biological社)等が公知である。その他、LGR6の445−504アミノ酸残基を抗原としたH00059352−A01(Abnova Corporation社)、456−548を抗原とした抗体(Novus Biologicalsh社)、516−528アミノ酸残基を抗原としたL4169(Sigma−Aldrich社)が公知である。
LGR6に結合するモノクローナル抗体としては、ウサギモノクローナル抗体としてEPR6874(GenTax社)が公知であるが、細胞内ドメインを抗原として作製されたものであため、この抗体を用いて生きた癌細胞を検出することは困難である。また、免疫染色を行う場合、細胞の固定化と細胞膜の透過処理により、LGR6タンパク質が変性するため、抗体の検出感度が低下する。
抗体を目的タンパク質の検出や疾患の診断ツールとして利用するには、継続的かつ均質な生産と供給が重要であるため、モノクローナル抗体であることが望まれる。一般的に、LGR6のような膜タンパク質、特に複数回膜貫通型タンパク質は、可溶化することが難しいこと、哺乳動物の間でアミノ酸配列の相同性が高いため力価の高い抗体を誘導することが難しいこと等の理由から、高感度に膜タンパク質を検出できる抗体を作製することが困難である。免疫した動物の末梢血等からポリクローナル抗体を得られたとしても、抗体産生細胞を単離できる確率は非常に少ないのが現状である。
本発明はこのような状況に鑑みてなされたものであり、その解決しようとする課題は、高感度に癌を検出することができる抗体、及び当該抗体を含む癌の検出用又は診断用試薬を提供することにある。
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、LGR6、特にLGR6の細胞外領域に結合する抗体を用いることにより、従来の抗体に比べて癌を高感度で検出することに成功し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の通りである。
(1)ロイシンリッチリピート含有Gタンパク質共役型受容体−6(LGR6)に対するモノクローナル抗体又はその断片を含む、癌の検出用又は診断用試薬。
(2)前記抗体又はその断片がロイシンリッチリピート含有Gタンパク質共役型受容体−6(LGR6)の細胞外領域に結合するものである、上記(1)に記載の試薬。
(3)前記細胞外領域が配列番号7、8、9又は10で示されるアミノ酸配列を含むものである、上記(2)に記載の試薬。
(4)癌が、大腸癌、乳癌、子宮癌、胃癌、甲状腺癌、膵癌、脳腫瘍、頚癌、食道癌、舌癌、肺癌、小腸の癌、十二指腸癌、膀胱癌、腎癌、肝癌、前立腺癌、子宮頸癌、卵巣癌、胆嚢癌、咽頭癌、肉腫、メラノーマ、白血病、リンパ腫及び多発性骨髄腫からなる群から選ばれる少なくとも1種である、上記(1)に記載の試薬。
(5)癌が、大腸癌、乳癌、子宮癌、胃癌、甲状腺癌、膵癌及び白血病からなる群から選ばれる少なくとも1種である、上記(1)に記載の試薬。
(6)癌が大腸癌又は乳癌である、上記(1)に記載の試薬。
(7)ロイシンリッチリピート含有Gタンパク質共役型受容体−6(LGR6)に対するモノクローナル抗体又はその断片と、被験者から採取された生体試料とを接触させ、前記試料におけるLGR6を検出する工程を含む、癌の検出方法。
(8)ロイシンリッチリピート含有Gタンパク質共役型受容体−6(LGR6)に対するモノクローナル抗体又はその断片を含む、癌の検出用キット。
(9)ロイシンリッチリピート含有Gタンパク質共役型受容体−6(LGR6)に対するモノクローナル抗体又はその断片と、被験者から採取された生体試料とを接触させ、前記試料におけるLGR6を検出する工程を含む、癌の診断方法。
(10)癌の検出又は診断において使用するためのロイシンリッチリピート含有Gタンパク質共役型受容体−6(LGR6)に対するモノクローナル抗体又はその断片。
本発明により、従来の抗体に比べて癌を高感度で検出することができる。
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、LGR6、特にLGR6の細胞外領域に結合する抗体を用いることにより、従来の抗体に比べて癌を高感度で検出することに成功し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の通りである。
(1)ロイシンリッチリピート含有Gタンパク質共役型受容体−6(LGR6)に対するモノクローナル抗体又はその断片を含む、癌の検出用又は診断用試薬。
(2)前記抗体又はその断片がロイシンリッチリピート含有Gタンパク質共役型受容体−6(LGR6)の細胞外領域に結合するものである、上記(1)に記載の試薬。
(3)前記細胞外領域が配列番号7、8、9又は10で示されるアミノ酸配列を含むものである、上記(2)に記載の試薬。
(4)癌が、大腸癌、乳癌、子宮癌、胃癌、甲状腺癌、膵癌、脳腫瘍、頚癌、食道癌、舌癌、肺癌、小腸の癌、十二指腸癌、膀胱癌、腎癌、肝癌、前立腺癌、子宮頸癌、卵巣癌、胆嚢癌、咽頭癌、肉腫、メラノーマ、白血病、リンパ腫及び多発性骨髄腫からなる群から選ばれる少なくとも1種である、上記(1)に記載の試薬。
(5)癌が、大腸癌、乳癌、子宮癌、胃癌、甲状腺癌、膵癌及び白血病からなる群から選ばれる少なくとも1種である、上記(1)に記載の試薬。
(6)癌が大腸癌又は乳癌である、上記(1)に記載の試薬。
(7)ロイシンリッチリピート含有Gタンパク質共役型受容体−6(LGR6)に対するモノクローナル抗体又はその断片と、被験者から採取された生体試料とを接触させ、前記試料におけるLGR6を検出する工程を含む、癌の検出方法。
(8)ロイシンリッチリピート含有Gタンパク質共役型受容体−6(LGR6)に対するモノクローナル抗体又はその断片を含む、癌の検出用キット。
(9)ロイシンリッチリピート含有Gタンパク質共役型受容体−6(LGR6)に対するモノクローナル抗体又はその断片と、被験者から採取された生体試料とを接触させ、前記試料におけるLGR6を検出する工程を含む、癌の診断方法。
(10)癌の検出又は診断において使用するためのロイシンリッチリピート含有Gタンパク質共役型受容体−6(LGR6)に対するモノクローナル抗体又はその断片。
本発明により、従来の抗体に比べて癌を高感度で検出することができる。
図1は、LGR4、LGR5及びLGR6の構造の比較及び一部の領域のアライメントを示す図である。
図2は、免疫した抗原(ECD2)に対して反応する抗体を、ELISAにより評価した結果を示す図である。
図3は、樹立したハイブリドーマが産生した抗体をELISAにより評価した結果を示す図である。
図4は、樹立したハイブリドーマが産生した抗体をウエスタンブロットにより評価した結果を示す図である。
図5は、樹立したハイブリドーマが産生した抗体でHT29細胞を免疫細胞染色した結果を示す図である。
図6は、ECD2に反応する抗体を含む培養上清を用いてフローサイトメーターで評価した結果を示す図である。
図7は、Mu2C15抗体をProtein G精製し、フローサイトメーターでHT29細胞との反応性を解析した結果を示す図である。
図8Aは、クローン番号Mu2C15のハイブリドーマ細胞が産生する抗体を用いて、ヒト大腸癌組織を免疫染色した結果を示す図である。
図8Bは、免疫組織染色における染色度合を、強陽性(Strong)、陽性(Moderate)、弱陽性(Weak)、陰性(Negative)で分類し、統計解析した結果を示すグラフである。
図9は、クローン番号Mu2C15のハイブリドーマ細胞が産生する抗体を用いて、ヒト乳癌組織を免疫染色した結果を示す図である。
図10Aは、クローン番号Mu2C15とHercepTest IIとを用いて、病期(ステージ)の異なる乳癌組織を免疫染色した結果を示す図である。
図10Bは、HercepTest IIを用いた免疫組織染色における染色度合を統計解析した結果を示すグラフである。陽性の判定結果をシグナルの強いものから順番に「3+」、「2+」、「1+」、「0」と示した。
図10Cは、クローン番号Mu2C15を用いた免疫組織染色における染色度合を統計解析した結果を示すグラフである。陽性の判定結果をシグナルの強いものから順番に「3+」、「2+」、「1+」、「0」と示した。
図11は、LGR6の細胞外ドメインと結合する公知のモノクローナル抗体(クローン番号2A3)とクローン番号Mu2C15の親和性を比較した図である。
図12は、抗原であるECD2をサンドイッチELISAで検出できる抗体の組み合わせを解析した結果を示す図である。「−」は吸光度0.2〜0.3、「+」は0.3〜0.45、「++」は0.45〜0.8、「+++」は0.8以上であることを示している。
図13は、Mu2C15を固相化抗体とし、Mu2C21を検出用抗体とした場合に、ECD2を検出した場合の標準曲線を示す図である。
図14Aは、Mu2C15抗体の重鎖可変領域(VH)の塩基配列及びアミノ酸配列、並びにシグナル配列、CDR1、CDR2及びCDR3の位置を示す図である。
図14Bは、Mu2C15抗体の軽鎖可変領域(VL)の塩基配列及びアミノ酸配列、並びにシグナル配列、CDR1、CDR2及びCDR3の位置を示す図である。
図15は、LGR4、LGR5及びLGR6の部分ペプチドに対するMu2C15抗体の反応性を比較した結果を示す図である。
図2は、免疫した抗原(ECD2)に対して反応する抗体を、ELISAにより評価した結果を示す図である。
図3は、樹立したハイブリドーマが産生した抗体をELISAにより評価した結果を示す図である。
図4は、樹立したハイブリドーマが産生した抗体をウエスタンブロットにより評価した結果を示す図である。
図5は、樹立したハイブリドーマが産生した抗体でHT29細胞を免疫細胞染色した結果を示す図である。
図6は、ECD2に反応する抗体を含む培養上清を用いてフローサイトメーターで評価した結果を示す図である。
図7は、Mu2C15抗体をProtein G精製し、フローサイトメーターでHT29細胞との反応性を解析した結果を示す図である。
図8Aは、クローン番号Mu2C15のハイブリドーマ細胞が産生する抗体を用いて、ヒト大腸癌組織を免疫染色した結果を示す図である。
図8Bは、免疫組織染色における染色度合を、強陽性(Strong)、陽性(Moderate)、弱陽性(Weak)、陰性(Negative)で分類し、統計解析した結果を示すグラフである。
図9は、クローン番号Mu2C15のハイブリドーマ細胞が産生する抗体を用いて、ヒト乳癌組織を免疫染色した結果を示す図である。
図10Aは、クローン番号Mu2C15とHercepTest IIとを用いて、病期(ステージ)の異なる乳癌組織を免疫染色した結果を示す図である。
図10Bは、HercepTest IIを用いた免疫組織染色における染色度合を統計解析した結果を示すグラフである。陽性の判定結果をシグナルの強いものから順番に「3+」、「2+」、「1+」、「0」と示した。
図10Cは、クローン番号Mu2C15を用いた免疫組織染色における染色度合を統計解析した結果を示すグラフである。陽性の判定結果をシグナルの強いものから順番に「3+」、「2+」、「1+」、「0」と示した。
図11は、LGR6の細胞外ドメインと結合する公知のモノクローナル抗体(クローン番号2A3)とクローン番号Mu2C15の親和性を比較した図である。
図12は、抗原であるECD2をサンドイッチELISAで検出できる抗体の組み合わせを解析した結果を示す図である。「−」は吸光度0.2〜0.3、「+」は0.3〜0.45、「++」は0.45〜0.8、「+++」は0.8以上であることを示している。
図13は、Mu2C15を固相化抗体とし、Mu2C21を検出用抗体とした場合に、ECD2を検出した場合の標準曲線を示す図である。
図14Aは、Mu2C15抗体の重鎖可変領域(VH)の塩基配列及びアミノ酸配列、並びにシグナル配列、CDR1、CDR2及びCDR3の位置を示す図である。
図14Bは、Mu2C15抗体の軽鎖可変領域(VL)の塩基配列及びアミノ酸配列、並びにシグナル配列、CDR1、CDR2及びCDR3の位置を示す図である。
図15は、LGR4、LGR5及びLGR6の部分ペプチドに対するMu2C15抗体の反応性を比較した結果を示す図である。
以下、本発明を詳細に説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態のみに限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、様々な形態で実施をすることができる。また、本明細書は、本願優先権主張の基礎となる2013年5月30日に出願された日本国特許出願(特願2013−114150号)の明細書及び図面に記載の内容を包含する。
1.概要
本発明は、ロイシンリッチリピート含有Gタンパク質共役型受容体−6(LGR6)に対するモノクローナル抗体又はその断片を含む、癌の検出又は診断用試薬に関する。
本発明者は、膜貫通型タンパク質であるLGR6に着目し、鋭意検討を行った結果、LGR6が癌、特に大腸癌及び乳癌において発現が亢進していることを見出した。また、本発明者は、従来知られている抗体と比較して、極めて高感度かつ高精度に癌を検出することができるLGR6に対するモノクローナル抗体の作製に成功した。本発明の抗体は、癌の病期の初期段階においても高感度に癌を検出でき、またLGR6の細胞外領域に結合することができるため、生きた癌細胞を検出することができる。これにより、例えば、血液試料中に存在する癌細胞を検出することも可能である。すなわち、本発明の抗体を用いることにより、従来の方法では検出することができなかった癌を、簡便、高感度かつ高精度に検出することができるため、本発明の抗体は癌の検出又は診断に極めて有用である。本発明はこのような知見に基づいて完成されたものである。
2.LGR6に対する抗体(抗LGR6抗体)
(1)抗原の調製
本発明におけるLGR6は、任意の哺乳動物に由来するものであってもよく、そのような哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、サル、ヒトが挙げられ、好ましくは、マウス、ラット、ヒトであり、より好ましくはヒトである。
本発明において、マウス、ラット及びヒトのLGR6のアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号2、4及び6で示される。また、マウス、ラット及びヒトのLGR6をコードするDNAの塩基配列(ヌクレオチド配列)は、それぞれ、配列番号1、3、及び5で示される。各アミノ酸配列及び塩基配列は、それぞれGenBankデータベースにおいて、所定のアクセッション番号(Accession No.)により登録されている。
マウスLGR6のアミノ酸配列:NP_001028581.1(配列番号2)
ラットLGR6のアミノ酸配列:XP_001062538.1(配列番号4)
ヒトLGR6のアミノ酸配列:NP_001017403.1(配列番号6)
マウスLGR6をコードするDNAの塩基配列:NM_001033409.3(配列番号1)
ラットLGR6をコードするDNAの塩基配列:XM_001062538.3(配列番号3)
ヒトLGR6をコードするDNAの塩基配列:NM_001017403.1(配列番号5)
抗原としては、LGR6のアミノ酸配列の少なくとも一部(全部又は一部)を含むポリペプチド又はペプチド(単にペプチドともいう)を使用することができ、好ましくは、LGR6の細胞外領域のアミノ酸配列の少なくとも一部(全部又は一部)を含むペプチドを使用することができる。
LGR6の細胞外領域は、ロイシンリッチリピート(leucine−rich repeats:LRRs)、及びLRRsと膜貫通ドメインとを繋ぐヒンジ領域を含む領域をいう。ロイシンリッチリピートは、ロイシンに富んだ25アミノ酸残基程度からなる領域が繰り返して存在する構造をいい、LGR6の場合、その繰り返し回数は15回である。
LGR6の細胞外領域は、例えば、ヒトLGR6の場合、配列番号6で示されるアミノ酸配列のうちの第25番目〜第567番目からなる領域(配列番号7)であり、LRRsは配列番号6で示されるアミノ酸配列のうちの第91番目〜第443番目からなる領域(配列番号8)であり、ヒンジ領域は、配列番号6で示されるアミノ酸配列のうちの第444番目〜第567番目からなる領域(配列番号10)である(図1)。他の動物由来のLGR6については、これらの領域に相当する領域である。
抗原として用いるペプチドとしては、LGR6の少なくとも一部であればよく限定はされないが、LGR6の細胞外領域の少なくとも一部が好ましく、例えば、配列番号6で示されるLGR6のアミノ酸配列のうち、第25番目〜第567番目のアミノ酸からなる領域(配列番号7)、第91番目〜第567番目のアミノ酸からなる領域(配列番号8)、第319番目〜第567番目のアミノ酸からなる領域(配列番号9)、第444番目〜第567番目のアミノ酸からなる領域(配列番号10)の少なくとも一部であることが好ましい。なかでも、第319番目〜第567番目のアミノ酸からなる領域、第444番目〜第567番目のアミノ酸からなる領域の少なくとも一部がより好ましく、特に好ましくは、第319番目〜第567番目のアミノ酸からなる領域の少なくとも一部である。本発明においては、配列番号6で示されるLGR6のアミノ酸配列のうち、第319番目〜第567番目のアミノ酸からなるタンパク質を「ECD2」とも称する。
また、LGR6には、同じmRNAに由来する翻訳開始点の異なる変異体が存在する。例えば、ヒトLGR6の場合、N末端から第43番目までのアミノ酸が欠如し、第44番目から第71番目のアミノ酸が野生型(配列番号6)とは異なるペプチド(配列番号11)や、N末端から第52番目までのアミノ酸が欠如し、第53番目から第70番目のアミノ酸が野生型(配列番号6)とは異なるペプチド(配列番号12)などが存在する。
本発明におけるLGR6には、これらの変異体も含まれる。
LGR6は、マウス、ラット、ヒト等の組織や細胞から精製された天然型のLGR6でもよいし、遺伝子工学的に生産されたLGR6でもよい。例えば、LGR6が認められる生体試料を各種界面活性剤、例えばTriton−X、Sarkosylなどを用い、可溶性画分と不溶性画分に分画する。さらに不溶性画分を尿素やグアニジン塩酸などに溶解し、各種カラム、例えばヘパリンカラムあるいは結合樹脂に結合させることによりLGR6を得ることができる。
また、抗原とするペプチドの作製方法は、化学合成でも、大腸菌などを用いる遺伝子工学的手法による合成でもよく、当業者に周知の方法を用いることができる。
ペプチドの化学合成を行う場合は、周知のペプチドの合成方法によって合成することができる。また、その合成は、固相合成法及び液相合成法のいずれをも適用することができる。市販のペプチド合成装置(例えば、島津製作所製:PSSM−8など)を使用してもよい。
ペプチドを遺伝子工学的に合成する場合は、まず、当該ペプチドをコードするDNAを設計し合成する。当該設計及び合成は、例えば、全長LGR6遺伝子を含むベクター等を鋳型とし、所望のDNA領域を合成し得るように設計したプライマーを用いて、PCR法により行うことができる。そして、上記DNAを適当なベクターに連結することによってタンパク質発現用組換えベクターを得て、この組換えベクターを目的遺伝子が発現し得るように宿主中に導入することによって形質転換体を得る(Sambrook J.et al.,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,3rd edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,2001)。
ベクターには、宿主微生物で自律的に増殖し得るファージ又はプラスミドが使用される。さらに、動物ウイルス、昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。組換えベクターの作製は、精製されたDNAを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターDNAの制限酵素部位等に挿入してベクターに連結すればよい。形質転換に使用する宿主としては、目的の遺伝子を発現できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、細菌(大腸菌、枯草菌等)、酵母、動物細胞(COS細胞、CHO細胞等)、昆虫細胞又は昆虫が挙げられる。ヤギ等の哺乳動物を宿主として使用することも可能である。宿主への組換えベクターの導入方法は公知である。
そして、前記形質転換体を培養し、その培養物から抗原として使用されるペプチドを採取する。「培養物」とは、(a)培養上清、(b)培養細胞若しくは培養菌体又はその破砕物のいずれをも意味するものである。
培養後、目的ペプチドが菌体内又は細胞内に生産される場合には、菌体又は細胞を破砕することによりペプチドを抽出する。また、目的ペプチドが菌体外又は細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体又は細胞を除去する。その後、ペプチドの単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、目的のペプチドを単離精製することができる。
本発明においては、無細胞合成系を用いたin vitro翻訳により抗原となるペプチドを得ることもできる。この場合は、RNAを鋳型にする方法とDNAを鋳型にする方法(転写/翻訳)の2通りの方法を用いることができる。無細胞合成系としては、市販のシステム、例えばExpresswayTMシステム(インビトロジェン社)等を用いることができる。
上記のようにして得られたペプチドは、適当なキャリアタンパク質、例えば牛血清アルブミン(BSA)、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)、ヒトチログロブリン、ニワトリガンマグロブリン等に結合することも可能である。
また、本発明において、抗原としては、(a)配列番号2、4、6、7、8、9、10、11又は12で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドのほか、(b)配列番号2、4、6、7、8、9、10、11又は12で示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含むポリペプチド、(c)配列番号2、4、6、7、8、9、10、11又は12で示されるアミノ酸配列に対して70%以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、が挙げられる。
本発明において、「配列番号2、4、6、7、8、9、10、11又は12で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド」には、配列番号2、4、6、7、8、9、10、11又は12で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドが含まれる。
また、「配列番号2、4、6、7、8、9、10、11又は12で示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」としては、例えば、
(i)配列番号2、4、6、7、8、9、10、11又は12で示されるアミノ酸配列中の1〜10個(例えば、1〜5個、好ましくは1〜3個、より好ましくは1〜2個、さらに好ましくは1個)のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、
(ii)配列番号2、4、6、7、8、9、10、11又は12で示されるアミノ酸配列中の1〜10個(例えば、1〜5個、好ましくは1〜3個、より好ましくは1〜2個、さらに好ましくは1個)のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、
(iii)配列番号2、4、6、7、8、9、10、11又は12で示されるアミノ酸配列に1〜10個(例えば、1〜5個、好ましくは1〜3個、より好ましくは1〜2個、さらに好ましくは1個)のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、
(iv)上記(i)〜(iii)の組合せにより変異されたアミノ酸配列
などが挙げられる。
また、本発明におけるLGR6には、配列番号2、4、6、7、8、9、10、11又は12で示されるアミノ酸配列のほか、配列番号2、4、6、7、8、9、10、11又は12で示されるアミノ酸配列と70%以上の相同性(同一性)を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドが挙げられる。このようなポリペプチドとしては、配列番号2、4、6、7、8、9、10、11又は12で示されるアミノ酸配列に対して、約70%以上、75%以上、約80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、又は99%以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むもの(配列番号2、4、6、7、8、9、10、11又は12で示されるアミノ酸配列と実質的に同等のアミノ酸配列)も含まれる。相同性は、インターネットを利用したホモロジー検索サイト、例えば日本DNAデータバンク(DDBJ)において、FASTA、BLAST、PSI−BLAST等の相同性検索を利用できる。また、National Center for Biotechnology Information(NCBI)において、BLASTを用いた検索を行うこともできる。
上記の変異を有するタンパク質を調製するために、該タンパク質をコードする遺伝子(DNA)に変異を導入するには、Kunkel法やGapped duplex法等の部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット、例えばQuikChangeTM Site−Directed Mutagenesis Kit(ストラタジーン社製)、GeneTailorTM Site−Directed Mutagenesis System(インビトロジェン社製)、TaKaRa Site−Directed Mutagenesis System(Mutan−K、Mutan−Super Express Km等:タカラバイオ社製)等を用いて行うことができる。また、「Molecular Cloning,A Laboratory Manual(4th edition)」(Cold Spring Harbor Laboratory Press(2012))等に記載された部位特異的変異誘発法等の方法を用いることができる。
本発明において、細胞等に導入するための遺伝子としては、LGR6若しくはその部分断片又はこれらの変異型のペプチドをコードする遺伝子が挙げられる。そのような遺伝子としては、例えば、配列番号1、3若しくは5で示される塩基配列を含むものを使用することができる。
また、細胞等に導入するための遺伝子としては、配列番号1、3若しくは5で示される塩基配列に相補的な配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列、又はその部分配列を含む遺伝子を使用することも可能である。
本発明において、「ストリンジェントな条件」とは、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件及び高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。「低ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5%SDS、50%ホルムアミド、32℃の条件である。また、「中ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5%SDS、50%ホルムアミド、42℃の条件である。「高ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5%SDS、50%ホルムアミド、50℃の条件である。これらの条件において、温度を上げるほど高い相同性を有するDNAが効率的に得られることが期待できる。ただし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間、塩濃度等の複数の要素が考えられ、当業者であればこれらの要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
また、本発明に用いられるLGR6をコードする遺伝子には、配列番号1、3若しくは5で示される塩基配列に対して60%以上の相同性を有する塩基配列を含む遺伝子も含まれる。このような遺伝子としては、FASTA、BLASTなどの相同性検索ソフトウェアにより、デフォルトのパラメーターを用いて計算したときに、配列番号1、3若しくは5で示される塩基配列と、60%以上、70%以上、80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上又は99%以上の相同性を有する遺伝子を挙げることができる。
上記LGR6をコードする遺伝子又はその変異体は、例えば、NCBI GenBankデータベースなどに記載された塩基配列に基づいて、「Molecular Cloning,A Laboratory Manual(4th edition)」(Cold Spring Harbor Laboratory Press(2012))などに記載されている公知の遺伝子工学的手法を利用して得ることができる。
(2)ポリクローナル抗体の作製
前記のようにして作製したLGR6又は部分ペプチドをそれ自体で、あるいは担体、希釈剤と共に非ヒト哺乳動物、例えばウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヤギ等に投与することにより免疫する。抗原の動物1匹当たりの投与量は、アジュバントを用いるときは1μg〜10mgである。アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント(FCA)、フロイント不完全アジュバント(FIA)、水酸化アルミニウムアジュバント等が挙げられる。免疫は、主として静脈内、皮下又は腹腔内等に注入することにより行われる。また、免疫の間隔は特に限定されず、数日から数週間間隔、好ましくは1〜2週間間隔で、2〜20回、好ましくは5〜15回免疫を行う。免疫の間隔は、当業者であれば得られる抗体価を勘案して設定することができる。3〜4回皮下免疫を行った時点で試採血を行い、抗体価を測定することが好ましい。血清中の抗体価の測定は、ELISA(enzyme−linked immunosorbent assay)、EIA(enzyme immunoassay)、放射性免疫測定法(RIA;radioimmuno assay)等によって行うことができる。抗体価が十分上昇したことを確認した後、全採血し、通常行われる方法により抗体を分離精製することができる。分離精製は、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の公知の方法を適宜選択して、又はこれらを組み合わせることにより、精製することができる。具体的には、目的の抗体を含有する血清を、LGR6以外のタンパク質を結合したカラムに通し、素通り画分を採取することにより、LGR6に対する特異性を向上させたポリクローナル抗体を得ることができる。
(3)モノクローナル抗体の作製
(i)抗体産生細胞の採取
ポリクローナル抗体の作製と同様に、LGR6又は部分ペプチド(例えばECD2)をそれ自体で、あるいは担体及び希釈剤と共に非哺乳動物に投与することにより免疫する。動物1匹当たりの抗原の投与量、用いられるアジュバントの種類、免疫方法、免疫の間隔はポリクローナル抗体の作製と同様である。最終の免疫日から1〜30日後、好ましくは2〜5日後に、抗体価の認められた個体を選択し抗体産生細胞を採集する。抗体産生細胞としては、脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血細胞等が挙げられるが、脾臓細胞又はリンパ節細胞が好ましい。
(ii)細胞融合
ハイブリドーマを得るため、抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合を行う。融合操作は既知の方法、例えばKohlerらの方法に従い実施できる。抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞として、マウスなどの動物の一般に入手可能な株化細胞を使用することができる。使用する細胞株としては、薬剤選択性を有し、未融合の状態ではHAT選択培地(ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジンを含む)で生存できず、抗体産生細胞と融合した状態でのみ生存できる性質を有するものが好ましい。ミエローマ細胞としては、例えばP3X63−Ag8、P3X63−Ag8U.1、SP2/O−Ag14、PAI、P3U1、NSI/1−Ag4−1、NSO/1などのマウスミエローマ細胞株、YB2/0などのラットミエローマ細胞株などが挙げられる。
上記ミエローマ細胞と抗体産生細胞との細胞融合は、血清を含まないDMEM、RPMI−1640培地などの動物細胞培養用培地中で、1×108〜5×108個の抗体産生細胞と2×107〜10×107個のミエローマ細胞とを混合し(抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞比10:1〜1:1)、細胞融合促進剤存在のもとで融合反応を行う。細胞融合促進剤として、平均分子量1000〜6000ダルトンのポリエチレングリコール又はセンダイウイルス等を使用することができる。また、電気刺激(例えばエレクトロポレーション)を利用した市販の細胞融合装置を用いて抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることもできる。
(iii)ハイブリドーマの選別及びクローニング
細胞融合処理後の細胞から目的とするハイブリドーマを選別する。その方法として、細胞懸濁液を、例えば10〜20%のウシ胎児血清含有RPMI−1640培地などで適当に希釈後、マイクロタイタープレート上に限界希釈法で計算上0.3個/well程度まき、各ウェルにHAT培地などの選択培地を加え、以後適当に選択培地を交換して培養を行う。その結果、選択培地で培養開始後、10日前後から生育してくる細胞をハイブリドーマとして得ることができる。
次に、生育してきたハイブリドーマをさらにスクリーニングする。ハイブリドーマのスクリーニングは、通常の方法に従えばよく、特に限定されるものではない。例えば、ハイブリドーマを培養したウェルに含まれる培養上清の一部を採集し、酵素免疫測定法、放射性免疫測定法等によって、スクリーニングすることができる。具体的には、96ウエルプレートに抗原を吸着させた後、仔牛血清、スキムミルク等でブロッキングする。ハイブリドーマ細胞の培養上清を固相化した抗原に37℃で1時間反応させた後、ペルオキシダーゼ標識した抗マウスIgGを37℃で1時間反応させ、オルトフェニレンジアミンを基質として用いて発色させる。酸で反応を停止させた後、490nmの波長における吸光度を測定することにより、スクリーニングすることができる。上記測定法により陽性を示したモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを、限界希釈法等によりクローニングする。そして、最終的に、LGR6に特異的に結合するモノクローナル抗体を産生する細胞であるハイブリドーマを樹立する。
本発明のモノクローナル抗体を産生する細胞株(ハイブリドーマ)としては、例えば、「Mouse−Mouse hybridoma Mu2C15」(以下「Mu2C15」という)、「Mouse−Mouse hybridoma Mu2C21」(以下「Mu2C21」という)、「Mouse−Mouse hybridoma Mu2C22」(以下「Mu2C22」という)が挙げられる。ハイブリドーマを培養することにより、均質なモノクローナル抗体を製造することができる。
(iv)モノクローナル抗体の採取
樹立したハイブリドーマからモノクローナル抗体を採取する方法として、通常の細胞培養法又は腹水形成法等を採用することができる。細胞培養法においては、ハイブリドーマを10%ウシ胎児血清含有RPMI−1640培地、MEM培地又は無血清培地等の動物細胞培養培地中で、通常の培養条件(例えば37℃、5%CO2濃度)で7〜14日間培養し、その培養上清から抗体を取得する。腹水形成法の場合は、ミエローマ細胞由来の哺乳動物と同種系動物、例えばマウス(BALB/c)の腹腔内にハイブリドーマを約5×106〜2×107個投与し、ハイブリドーマを大量に増殖させる。そして、1〜2週間後に腹水を採取する。上記抗体の採取方法において抗体の精製が必要とされる場合は、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィーなどの公知の方法を適宜選択して、又はこれらを組み合わせることにより精製することができる。
本発明の抗LGR6抗体としては、例えば、重鎖可変領域(VH)の相補性決定領域(CDR)1〜3のアミノ酸配列がそれぞれ配列番号27、29、及び31で示されるアミノ酸配列を含むか若しくは該アミノ酸配列からなり、かつ/又は軽鎖可変領域(VL)の相補性決定領域(CDR)1〜3のアミノ酸配列がそれぞれ配列番号33、35及び37で示されるアミノ酸配列を含むか若しくは該アミノ酸配列からなるものが好ましい。また別の態様において、本発明の抗LGR6抗体としては、例えば、重鎖可変領域(VH)のアミノ酸配列が、配列番号23で示されるアミノ酸配列を含むか若しくは該アミノ酸配列からなり、かつ/又は軽鎖可変領域(VL)のアミノ酸配列が、配列番号25で示されるアミノ酸配列を含むか若しくは該アミノ酸配列からなるものが好ましい。
(v)抗LGR6抗体のエピトープ
本発明の抗LGR6抗体のエピトープ(抗原決定基)は、抗原であるLGR6の少なくとも一部であればよく限定はされないが、LGR6の細胞外領域の少なくとも一部が好ましく、例えば、配列番号6で示されるLGR6のアミノ酸配列のうち、第25番目〜第567番目のアミノ酸からなる領域(配列番号7)、第91番目〜第567番目のアミノ酸からなる領域(配列番号8)、第319番目〜第567番目のアミノ酸からなる領域(配列番号9)、第444番目〜第567番目のアミノ酸からなる領域(配列番号10)の少なくとも一部であることが好ましい。なかでも、第319番目〜第567番目のアミノ酸からなる領域、第444番目〜第567番目のアミノ酸からなる領域の少なくとも一部がより好ましく、特に好ましくは、第319番目〜第567番目のアミノ酸からなる領域の少なくとも一部である。当該領域を認識する(当該領域と結合する)抗LGR6抗体は、例えば、生体試料中のLGR6の検出感度が高く、後述する癌の検出及び診断の用途に極めて有用なものである。
また、上述した通り、LGRには二種類の欠損変異体が存在する。具体的には、ヒトLGR6の場合、N末端から第43番目までのアミノ酸が欠如し、第44番目から第71番目のアミノ酸が野生型(配列番号6)とは異なるペプチド(配列番号11)や、N末端から第52番目までのアミノ酸が欠如し、第53番目から第70番目のアミノ酸が野生型(配列番号6)とは異なるペプチド(配列番号12)などが存在する。
これらのペプチドは、配列番号6で示されるLGR6のアミノ酸配列のうち、第91番目〜第567番目のアミノ酸からなる領域、第319番目〜第567番目のアミノ酸からなる領域、第444番目〜第567番目のアミノ酸からなる領域において、野生型LGR6と共通する。従って、本発明の抗体はこれらの欠損変異体も検出することができる。
また、本発明の抗LGR6抗体のエピトープ(抗原決定基)には、他の動物由来のLGR6における上記領域に相当する領域の少なくとも一部が含まれる。
本発明のLGR6に対する抗体には、当該抗体が結合する部位(例えばエピトープ)に結合する抗体、例えば、本発明のハイブリドーマが産生する抗体が結合する部位に結合する抗体が含まれる。
(4)遺伝子組換え抗体の作製
本発明の抗体の好ましい態様の一つとして、遺伝子組換え抗体が挙げられる。遺伝子組換え抗体としては、限定はされないが、例えば、キメラ抗体、ヒト型化抗体及びヒト化抗体等が挙げられる。
キメラ抗体(すなわちヒト型キメラ抗体)は、マウス由来抗体の可変領域をヒト由来の定常領域に連結(接合)した抗体であり(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81,6851−6855,(1984)等を参照)、キメラを作製する場合は、そのように連結した抗体が得られるよう、遺伝子組換え技術によって容易に構築できる。ここで、マウス由来抗体の可変領域としては、重鎖可変領域が、例えば配列番号23で示されるアミノ酸配列を含むか若しくは該アミノ酸配列からなるものが好ましく、軽鎖可変領域が、例えば配列番号25で示されるアミノ酸配列を含むか若しくは該アミノ酸配列からなるものが好ましい。
ヒト型化抗体を作製する場合は、いわゆるCDRグラフティング(CDR移植)と呼ばれる手法を採用することができる。CDRグラフティングとは、マウス抗体の可変領域から相補性決定領域(CDR)をヒト可変領域に移植して、フレームワーク領域(FR)はヒト由来のものでCDRはマウス由来のものからなる、再構成した可変領域を作製する方法である。次に、これらのヒト型化された再構成ヒト可変領域をヒト定常領域に連結する。このようなヒト型化抗体の作製法は、当分野において周知である(Nature,321,522−525(1986);J.Mol.Biol.,196,901−917(1987);Queen C et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86:10029−10033(1989);特許第2828340号公報等を参照)。ここで、本発明のヒト型化抗LGR6抗体に用いることができるマウス由来のCDRのアミノ酸配列としては、限定されるものではないが、例えば、重鎖可変領域のCDR1〜3として、それぞれ配列番号27、29及び31で示されるアミノ酸配列が好ましく、軽鎖可変領域のCDR1〜3として、それぞれ配列番号33、35及び37で示されるアミノ酸配列が好ましい。
ヒト抗体(完全ヒト抗体)は、一般に可変領域(V領域)の抗原結合部位である超可変領域(hyper variable region)、V領域のその他の部分及び定常領域の構造が、ヒトの抗体と同じ構造を有するものである。ヒト抗体を作製する技術も公知であり、ヒトに共通の遺伝子配列については遺伝子工学的手法によって作製する方法が確立されている。ヒト抗体は、例えば、ヒト抗体の重鎖(H鎖)及び軽鎖(L鎖)の遺伝子を含むヒト染色体断片を有するヒト抗体産生マウスを用いた方法(Tomizuka,K.et al.,Nature Genetics,(1977)16,133−143;Kuroiwa,Y.et.al.,Nuc.Acids Res.,(1998)26,3447−3448;Yoshida,H.et.al.,Animal Cell Technology:Basic and Applied Aspects,(1999)10,69−73(Kitagawa,Y.,Matuda,T.and Iijima,S.eds.),Kluwer Academic Publishers;Tomizuka,K.et.al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,(2000)97,722−727等を参照)や、ヒト抗体ライブラリーより選別したファージディスプレイ由来のヒト抗体を取得する方法(Wormstone,I.M.et.al,Investigative Ophthalmology & Visual Science.,(2002)43(7),2301−8;Carmen,S.et.al.,Briefings in Functional Genomics and Proteomics,(2002)1(2),189−203;Siriwardena,D.et.al.,Opthalmology,(2002)109(3),427−431等を参照)により取得することができる。
また、本発明においては、ハイブリドーマ又は当該ハイブリドーマから抽出したDNA若しくはRNAなどを原料として、上述した周知の方法に準じてキメラ抗体、ヒト型化抗体、ヒト化抗体を作製することができる。
さらに、本発明の抗体が融合したタンパク質は、抗体の可変領域とその他のタンパク質を公知の遺伝子組換え方法を用いることにより作製することができる。また、当該融合タンパク質は、モノクローナル抗体と他のタンパク質とをクロスリンカーを用いて架橋することにより作製することができる。
(5)抗体断片の作製
本発明で使用されるLGR6に対する抗体の断片は、LGR6に特異的に結合する。
抗体の断片は、本発明の抗体の一部分の領域を意味し、例えば、Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv、diabody(dibodies)、dsFv、scFv(single chain Fv)などが挙げられる。上記抗体断片は、本発明の抗体を目的に応じて各種タンパク質分解酵素で切断することにより得ることができる。
例えば、Fabは、抗体分子をパパインで処理することにより、F(ab′)2は、抗体分子をペプシンで処理することによりそれぞれ得ることができる。また、Fab′は、上記F(ab′)2のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断することで得ることができる。
scFvの場合は、抗体の重鎖可変領域(H鎖V領域)及び軽鎖可変領域(L鎖V領域)をコードするcDNAを取得し、scFvをコードするDNAを構築する。このDNAを発現ベクターに挿入し、当該発現ベクターを宿主生物に導入して発現させることにより、scFvを製造することができる。
diabodyの場合は、抗体のH鎖V領域及びL鎖V領域をコードするcDNAを取得し、ペプチドリンカーのアミノ酸配列の長さが8残基以下となるようにscFvをコードするDNAを構築する。このDNAを発現ベクターに挿入し、当該発現ベクターを宿主生物に導入して発現させることにより、diabodyを製造することができる。
dsFvの場合は、抗体のH鎖V領域及びL鎖V領域をコードするcDNAを取得し、dsFvをコードするDNAを構築する。このDNAを発現ベクターに挿入し、当該発現ベクターを宿主生物に導入して発現させることにより、dsFvを製造することができる。
本発明において、重鎖可変領域をコードするDNAの塩基配列としては、例えば配列番号22で示される塩基配列を含むか又は該塩基配列からなるものが挙げられ、軽鎖可変領域をコードするDNAの塩基配列としては、例えば配列番号24で示される塩基配列を含むか又は該塩基配列からなるものが挙げられる。
また、本発明の抗体断片の具体例としては、限定されるものではないが、例えば、VH CDR1〜3のアミノ酸配列としてそれぞれ配列番号27、29及び31で示されるアミノ酸配列を含み、かつ/又はVL CDR1〜3のアミノ酸配列としてそれぞれ配列番号33、35及び37で示されるアミノ酸配列を含む、抗体断片が挙げられる。さらに、VHとして配列番号23で示されるアミノ酸配列を含み、かつ/又はVLとして配列番号25で示されるアミノ酸配列を含む、抗体断片が挙げられる。
CDRを含む抗体断片(ペプチド)は、VH又はVLのCDR(CDR1〜3)の少なくとも1領域以上を含んで構成される。複数のCDRを含む抗体断片は、直接又は適当なペプチドリンカーを介して結合させることができる。CDRを含む抗体断片は、抗体のVHおよびVLのCDRをコードするDNAを構築し、該DNAを原核生物用発現ベクター又は真核生物用発現ベクターに挿入して、該発現ベクターを原核生物又は真核生物へ導入することにより発現させて、製造することができる。また、CDRを含むペプチドは、Fmoc法(フルオレニルメチルオキシカルボニル法)及びtBoc法(t−ブチルオキシカルボニル法)等の化学合成法によって製造することもできる。
VHのCDR1〜3をコードする塩基配列としては、例えば、それぞれ配列番号26、28及び29で示される塩基配列が好ましく、VLのCDR1〜3をコードする塩基配列としては、例えば、それぞれ配列番号32、34及び36で示される塩基配列が好ましい。
(6)結合親和性
結合親和性は、結合定数(KA)及び解離定数(KD)により決定することができる。親和性平衡定数(K)はKA/KDの比で表される。その結合親和性は、以下のようにして検出することができる。
結合親和性は、少なくとも1×10−10Mの解離定数(KD)を有しており、この解離定数に対し、例えば2〜5倍、5〜10倍、10〜100倍、100〜1000倍又は1000〜10,000倍高い親和性を有する。具体的には、本発明の抗体は、LGR6の結合親和性に関する解離定数(KD)が、1×10−10M、5×10−11M、1×10−11M、5×10−12M、1×10−12M、5×10−13M、1×10−13M、5×10−14M、1×10−14M、5×10−15M、又は1×10−15Mであり、1×10−10M〜1×10−13Mであることがより好ましい。あるいはこれらのKDよりも低い値であり高親和性であってもよい。
ここで、親和性の測定対象となる抗体の解離定数(KD)が、本発明の抗体のKDの約1〜100倍以内であるときは、当該抗体は、本発明の抗体と実質的に同一であるとして本発明に含まれる。
結合定数(KA)及び解離定数(KD)は、表面プラスモン共鳴(SPR)を用いて測定することができ、結合率をリアルタイムで検出し、さらにモニタリングする公知の機器及び方法を採用することができる(例えばBiacore(登録商標)T200(GE Healthcare社)、ProteON XPR36(Bio−Rad社)など)。
3.癌の検出用又は診断用試薬(癌の検出剤又は診断剤)
本発明の癌の検出用又は診断用試薬は、上記「2.LGR6に対する抗体(抗LGR6抗体)」に記載した抗体又はその断片を含有するものである。本発明の抗体は、癌に発現しているLGR6に対して特異的に結合することができるため、当該抗体を含む本発明の試薬は癌の検出又は診断のために使用することができる。
本発明における検出又は診断の対象となる癌としては、例えば大腸癌、乳癌、子宮癌、胃癌、甲状腺癌、膵癌、脳腫瘍、頚癌、食道癌、舌癌、肺癌、小腸の癌、十二指腸癌、膀胱癌、腎癌、肝癌、前立腺癌、子宮頸癌、卵巣癌、胆嚢癌、咽頭癌、肉腫、メラノーマ、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫などが挙げられるが、好ましくは、正常細胞又は組織と比較してLGR6が有意に高く発現している癌が好ましい。そのような癌としては、例えば、大腸癌、乳癌、子宮癌、胃癌、甲状腺癌、膵癌などが挙げられ、好ましくは大腸癌、乳癌、子宮癌、胃癌であり、より好ましくは大腸癌、乳癌である。
本発明の試薬は、本発明の抗体のほか、薬学的に許容できる担体を含むことができる。「薬学的に許容できる担体」とは、本発明の試薬に適する任意の担体(リポソーム、脂質小胞体、ミセル等)、希釈剤、賦形剤、湿潤剤、緩衝剤、懸濁剤、潤滑剤、アジュバント、乳化剤、崩壊剤、吸収剤、保存料、界面活性剤、着色料、又は着香料などを指す。
また別の態様において、本発明は、癌の検出用又は診断用試薬の製造のためのLGR6に対するモノクローナル抗体又はその断片の使用を提供する。また、本発明は、癌の検出又は診断において使用するためのLGR6に対するモノクローナル抗体又はその断片を提供する。さらに、本発明は、癌の検出用又は診断用試薬として使用するためのLGR6に対するモノクローナル抗体又はその断片を提供する。LGR6に対するモノクローナル抗体又はその断片の説明については上記「2.LGR6に対する抗体(抗LGR6抗体)」に記載した通りである。
4.癌の検出又は診断方法
本発明の癌の検出又は診断方法は、上記「2.LGR6に対する抗体(抗LGR6抗体)」に記載した抗体又はその断片と、被験者から採取された生体試料(以下、単に「生体試料」ともいう)とを接触させ、前記試料におけるLGR6を検出する工程を含む方法である。この場合、LGR6の検出結果と癌の可能性とを関連づけることが好ましい。
本発明において、「被験者」としては、例えばヒト、ウサギ、モルモット、ラット、マウス、ハムスター、ネコ、イヌ、ヤギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、ウマ、サルなどの哺乳動物が挙げられ、好ましくはヒトである。
また、生体試料としては、例えば、哺乳動物由来の組織、細胞、これらの破砕物又は抽出物、体液、排泄物そのもの又はこれらを含む試料を意味し、特に限定されるものではない。また、生体試料には、哺乳動物由来の組織、細胞、これらの破砕物又は抽出物、及び体液、排泄物に対し、任意の処理、例えば希釈、分離、核酸又はタンパク質の抽出、タンパク質の変性等を行うことにより得られた試料も含まれる。生体試料は、大腸癌又は胃癌を検査する場合は、体液、排泄物が好ましく、特に糞便であることが好ましい。膀胱癌、腎臓癌を検査する場合は組織、尿を使用することができ、乳癌、子宮癌を検査する場合は母乳や生理用品などを使用することができる。いずれの生体試料も適切な前処理を行うことによって適用可能である。
糞便を試料とする場合、特開2005−46065号公報に記載される方法で調製することが好ましい。当該方法は、糞便から癌細胞を効率よく回収できる方法である。具体的には、ストマッカーバックに便とバッファーを入れ、糞便の懸濁液を作製する。この懸濁液を、多段式フィルタ装置でろ過し、最終フィルタの口径を10μm以下にすることで、細胞を最終フィルタ上に捕らえる。その中から、Ber−EP4抗体結合磁気ビーズ(Dynabeads Epithelial Enrich、ダイナル社)を用いて細胞を回収する。この他、パーコール遠心分離法など当業者が通常用いる細胞の効率的な回収方法を利用すればよい。
大腸癌や乳癌をはじめとする様々な癌において、体液を用いて早期に発見できる腫瘍マーカーはいまだ確立されていない。一般的なマーカーでは、ステージの進んだ癌であっても擬陰性を示すことがある。これに対し、本発明の抗体を用いれば、癌が進行する前に、体液や排泄物に含まれる、マーカーとしてのLGR6を発現する微量な細胞を検出および/または測定することができる。
「被験者」がヒトの場合、被験者には癌患者、例えば早期癌の患者、進行癌の患者、及び健常者が含まれる。ここで、早期癌は、例えば大腸癌、胃癌などの場合は癌細胞が粘膜層又は粘膜下層までに留まっていること、進行癌は癌細胞が固有筋層又はそれより深い層に達していることを基準に患者を区別して本発明の検出を行うことも可能である。また、血液試料としては末梢血が好ましく、末梢血由来の血清がより好ましい。さらに、組織には、癌組織及び癌が生じる可能性のある正常組織が含まれる。
本発明において、「接触」とは、本発明の抗体と被験者から採取された生体試料とを同一の反応系に存在させることを意味し、例えば、反応用ウェルにおいて本発明の抗体と生体試料とを混合すること、当該生体試料に本発明の抗体を添加すること、本発明の抗体又は生体試料のいずれか一方を固定した担体に他方を添加すること等が含まれる。
本発明において、LGR6の検出、発現量の測定又は評価には、例えば、酵素免疫測定法(EIA)、蛍光免疫測定法(FIA)、放射免疫測定法(RIA)、化学発光免疫測定法(CIA)、免疫比濁法、免疫比ろう法、ラテックス凝集法、ラテックス比濁法、赤血球凝集反応、粒子凝集反応、ウェスタンブロット法、免疫染色、免疫沈降法、イムノクロマト法などを利用できる。
このような検出等に用いるデバイスとしては、特に限定されないが、例えば、マイクロウェルプレート、アレイ、チップ、フローサイトメーター、表面プラズモン共鳴装置、イムノクロマトグラフィーストリップなどが利用できる。このようなデバイスを用いたときは、発色量、蛍光量、発光量などのシグナルを検出、測定及び/又は評価し、その検出、測定又は評価結果と癌の可能性等とを関連づけることができる。
本発明においては、LGR6の検出、発現量の測定又は評価結果に基づいて、被験者が癌に罹患している可能性の有無を診断することができる。
本発明の検出又は診断方法を、酵素免疫測定法や蛍光免疫測定法により実施する場合は、例えば、糞便より回収した癌細胞を含む細胞や患者より採取した組織から作製した切片など、上述した試料を適切に前処理したサンプルをマイクロウェルプレートやスライドガラスなどの固相に固定化して、免疫学的反応を行う。あるいは、チューブ内で細胞懸濁液を抗体と反応させることもできる。また、本発明のモノクローナル抗体をビーズやマイクロウェルプレートに固定化し、細胞と反応する方法も利用できる。
この場合、本発明のモノクローナル抗体を酵素や蛍光物質で標識することにより該反応を蛍光シグナルとして直接検出してもよく、または本発明のモノクローナル抗体に結合する標識された二次抗体を用いることによりシグナルを間接的に検出しても良い。標識物質としては、ペルオキシダーゼ(POD)、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ビオチン−アビジン複合体など、当業者が通常用いる物質を利用できる。また、検出方法は、競合法、サンドイッチ法または直接吸着法など、いずれの方法を用いてもよい。そして、反応の強さや、反応させたサンプル中の全体の細胞の中で、抗体と結合した細胞の割合を測定し、予め設定した基準値や指標と比較することによって、癌に罹患している可能性を判定又は診断することができる。
本発明において、LGR6の検出、発現量の測定又は評価を免疫染色を用いて行う場合には、例えば、免疫組織染色における染色度合(LGR6の検出結果)を、強陽性(Strong)、陽性(Moderate)、弱陽性(Weak)、陰性(Negative)などに分類し、染色度合と癌の可能性とを関連付けることにより、癌を検出又は被験者の癌の可能性(癌に罹患している可能性)の有無を診断することができる。
また、LGR6の細胞外領域は、血液中に放出される場合が想定されるため、血液試料中のLGR6の発現量を測定することにより、癌を検出又は被験者の癌の可能性の有無を診断することも可能である。この場合、LGR6の発現量の測定結果と癌の可能性とを関連づけて癌を検出するためには、生体試料中のLGR6の発現量の臨界値(cut−off値)を定めることが望ましい。
LGR6の発現量のcut−off値は、例えば、次のようにして求めることができる。まず、癌患者由来の生体試料におけるLGR6の発現量を測定する。このとき対象となる患者の例数は2例以上であり、例えば、5例以上、10例以上、50例以上、100例以上である。また、2例以上の健常者由来の生体試料におけるLGR6の発現量も測定しておくことが好ましく、対象となる健常者の例数は2例以上であり、例えば、5例以上、10例以上、50例以上、100例以上である。そして、癌患者由来の生体試料群と健常者由来の生体試料群の両方を含む全体から、LGR6の発現量のcut−off値を、統計処理により求める。統計処理としては、例えば、4−parameter logistic fitting法を用いて、標準曲線を作成する。LGR6を含まないサンプルのシグナル値を基準として、その数値の2倍をcut−off値と定めること等ができる。統計解析を行うための症例は、癌の種類(例えば、大腸癌、乳癌、子宮癌、胃癌、甲状腺癌、膵癌、白血病等)、病期、再発の有無、転移の有無、手術前後等により分類することもできる。さらに、統計処理は、健常者のLGR6の発現量の測定値と、癌患者において癌の種類、病期、再発の有無、転移の有無、手術前後等により分類したときのLGR6の発現量の測定値とを適宜組み合わせて行うこともできる。
本発明において、血液試料中のLGR6(細胞外領域)の発現量の臨界値(cut−off値)は、血清中濃度で、例えば、約10ng/ml、11ng/ml、12ng/ml、13ng/ml、14ng/ml、15ng/ml、16ng/ml、17ng/ml、18ng/ml、19ng/ml、20ng/ml、21ng/ml、22ng/ml、23ng/ml、24ng/ml、25ng/ml、26ng/ml、27ng/ml、28ng/ml、29ng/ml、30ng/ml、35ng/ml、40ng/ml、45ng/ml、50ng/ml、55ng/ml、60ng/ml、65ng/mlであるが、好ましくは約20ng/mlである。
上記条件下でLGR6の発現量を測定した場合において、測定したLGR6の発現量が上記cut−off値以上であるときに、癌が検出されたと判定でき、又は被験者が癌に罹患している可能性があると診断することができる。本発明においては、前記判定又は診断のための血清中濃度の値に上限値を設けてもよく、例えば、上記各cut−off値以上であって、かつ所定上限値以下(例えば、200ng/ml以下、190ng/ml以下、180ng/ml以下、170ng/ml以下、160ng/ml以下、150ng/ml以下、145ng/ml以下、140ng/ml以下、135ng/ml以下、130ng/ml以下)であるときに、癌を検出又は被験者の癌の可能性の有無を診断することができる。
本発明において、癌を検出したときの当該検出結果の確からしさ(確率)は、60%以上、70%以上、80%以上、90%以上、95%以上、好ましくは99%以上である。
さらに、本発明の別の態様において、一人の被験者(患者)のサンプルから測定されたLGR6の発現量を上記cut−off値と比較することで癌との関連性を検出又は診断するほかに、複数の患者由来の生体試料を用いてLGR6の発現量を測定する場合がある。従って、上記cut−off値を決定する手法と同様にして、所定数の健常人及び患者を含む集団(1次母集団)においてLGR6の発現量を測定して統計解析処理し、これらの集団に属する被験者において癌が検出された群と検出されない群に分けることも可能である。さらに、このようにして得られた測定値を基本データとして、この基本データと他の集団(2次母集団)における検出又は診断の対象となる個々の被験者由来の試料におけるLGR6の発現量とを比較することができる。
あるいは、それぞれの患者のデータを前記母集団の値に組み込んでLGR6の発現量を再度データ処理し、対象となる患者(母集団)の例数を増やすこともできる。例数を増やすことにより、LGR6の発現量の臨界値の精度を高め、これにより1人又は複数人の被験者における検出又は診断精度を高めることができる。
本発明においては、(i)被験者の生体試料におけるLGR6の発現量と、(ii)健常者の生体試料におけるLGR6の発現量との比較を行うことも可能である。
そして、前記(i)の場合のLGR6の発現量が、前記(ii)の場合のLGR6の発現量と比較して高い場合、例えば、健常者の生体試料におけるLGR6の発現量の約10%以上、約20%以上、約30%以上、約40%以上、約50%以上、約60%以上、約70%以上、約80%以上、約90%以上、約100%以上高い場合に、癌が検出されたと判断でき、又は被験者が癌に罹患している可能性があると診断できる。
上記検出結果は、例えば、癌の検査又は治療効果の確定診断を行う場合の主要資料又は補助資料とすることができる。
LGR6の発現量は各種癌患者において発現するため、健康診断等においてLGR6の発現量が検出されてもどの癌であるのか特定することができない場合がある。そこで、集団で行う健康検診等の場では「癌が疑われる」という評価を行い、後に癌種の特定や進行度を決定する(精密検査を行う)ための補助資料として使用することができる。また、癌種がある程度疑われた患者由来の試料を用いてLGR6が検出されたときは、癌種の主要資料(確定診断等)に利用することができる。なお、癌種の特定には、他の腫瘍マーカー、画像診断、病理診断等を使用することができる。
すなわち、本発明は、LGR6に対するモノクローナル抗体又はその断片と、被験者から採取された生体試料とを接触させ、前記試料におけるLGR6を検出する工程を含む、癌の検出又は診断を補助する方法も提供する。
5.癌の検出用又は診断用キット
本発明の抗LGR6抗体は、癌の検出用又は診断用キットの形態で提供することができる。本発明のキットは抗体を含むが、その他に、標識物質、あるいは抗体又はその標識物を固定した固相化試薬などを含めることができる。抗体の標識物質とは、酵素、放射性同位体、蛍光化合物及び化学発光化合物等によって標識されたものを意味する。本発明のキットは、上記の構成要素のほか、本発明の検出を実施するための他の試薬、例えば標識物が酵素標識物の場合は、酵素及び基質(発色性基質等)、基質溶解液、酵素反応停止液、あるいは検体用希釈液等を含んでいてもよい。また、各種バッファー、滅菌水、各種細胞培養容器、各種反応容器(エッペンドルフチューブ等)、ブロッキング剤(Bovine Serum Albumin(BSA),Skim milk,Goat血清等の血清成分)、洗浄剤、界面活性剤、各種プレート、アジ化ナトリウム等の防腐剤、及び実験操作マニュアル(説明書)等を含んでいてもよい。試薬は、固定化された状態、水溶液、凍結乾燥状態などにて提供され、使用前に適切な状態に調製されるものであってもよい。
本発明のキットは、上記本発明の検出方法を行うために有効に用いることができ、極めて有用性が高いものである。本発明のキットを利用することにより、検診等における癌患者の高精度スクリーニング、癌の早期発見、癌の進行度の特定、治療時の治療効果モニタリング、転移・再発の予見等に有用な情報を得ることができるため、癌による死亡率を低下させることができる。
抗LGR抗体、癌の種類、検出方法等については上記と同様である。
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
1.概要
本発明は、ロイシンリッチリピート含有Gタンパク質共役型受容体−6(LGR6)に対するモノクローナル抗体又はその断片を含む、癌の検出又は診断用試薬に関する。
本発明者は、膜貫通型タンパク質であるLGR6に着目し、鋭意検討を行った結果、LGR6が癌、特に大腸癌及び乳癌において発現が亢進していることを見出した。また、本発明者は、従来知られている抗体と比較して、極めて高感度かつ高精度に癌を検出することができるLGR6に対するモノクローナル抗体の作製に成功した。本発明の抗体は、癌の病期の初期段階においても高感度に癌を検出でき、またLGR6の細胞外領域に結合することができるため、生きた癌細胞を検出することができる。これにより、例えば、血液試料中に存在する癌細胞を検出することも可能である。すなわち、本発明の抗体を用いることにより、従来の方法では検出することができなかった癌を、簡便、高感度かつ高精度に検出することができるため、本発明の抗体は癌の検出又は診断に極めて有用である。本発明はこのような知見に基づいて完成されたものである。
2.LGR6に対する抗体(抗LGR6抗体)
(1)抗原の調製
本発明におけるLGR6は、任意の哺乳動物に由来するものであってもよく、そのような哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、サル、ヒトが挙げられ、好ましくは、マウス、ラット、ヒトであり、より好ましくはヒトである。
本発明において、マウス、ラット及びヒトのLGR6のアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号2、4及び6で示される。また、マウス、ラット及びヒトのLGR6をコードするDNAの塩基配列(ヌクレオチド配列)は、それぞれ、配列番号1、3、及び5で示される。各アミノ酸配列及び塩基配列は、それぞれGenBankデータベースにおいて、所定のアクセッション番号(Accession No.)により登録されている。
マウスLGR6のアミノ酸配列:NP_001028581.1(配列番号2)
ラットLGR6のアミノ酸配列:XP_001062538.1(配列番号4)
ヒトLGR6のアミノ酸配列:NP_001017403.1(配列番号6)
マウスLGR6をコードするDNAの塩基配列:NM_001033409.3(配列番号1)
ラットLGR6をコードするDNAの塩基配列:XM_001062538.3(配列番号3)
ヒトLGR6をコードするDNAの塩基配列:NM_001017403.1(配列番号5)
抗原としては、LGR6のアミノ酸配列の少なくとも一部(全部又は一部)を含むポリペプチド又はペプチド(単にペプチドともいう)を使用することができ、好ましくは、LGR6の細胞外領域のアミノ酸配列の少なくとも一部(全部又は一部)を含むペプチドを使用することができる。
LGR6の細胞外領域は、ロイシンリッチリピート(leucine−rich repeats:LRRs)、及びLRRsと膜貫通ドメインとを繋ぐヒンジ領域を含む領域をいう。ロイシンリッチリピートは、ロイシンに富んだ25アミノ酸残基程度からなる領域が繰り返して存在する構造をいい、LGR6の場合、その繰り返し回数は15回である。
LGR6の細胞外領域は、例えば、ヒトLGR6の場合、配列番号6で示されるアミノ酸配列のうちの第25番目〜第567番目からなる領域(配列番号7)であり、LRRsは配列番号6で示されるアミノ酸配列のうちの第91番目〜第443番目からなる領域(配列番号8)であり、ヒンジ領域は、配列番号6で示されるアミノ酸配列のうちの第444番目〜第567番目からなる領域(配列番号10)である(図1)。他の動物由来のLGR6については、これらの領域に相当する領域である。
抗原として用いるペプチドとしては、LGR6の少なくとも一部であればよく限定はされないが、LGR6の細胞外領域の少なくとも一部が好ましく、例えば、配列番号6で示されるLGR6のアミノ酸配列のうち、第25番目〜第567番目のアミノ酸からなる領域(配列番号7)、第91番目〜第567番目のアミノ酸からなる領域(配列番号8)、第319番目〜第567番目のアミノ酸からなる領域(配列番号9)、第444番目〜第567番目のアミノ酸からなる領域(配列番号10)の少なくとも一部であることが好ましい。なかでも、第319番目〜第567番目のアミノ酸からなる領域、第444番目〜第567番目のアミノ酸からなる領域の少なくとも一部がより好ましく、特に好ましくは、第319番目〜第567番目のアミノ酸からなる領域の少なくとも一部である。本発明においては、配列番号6で示されるLGR6のアミノ酸配列のうち、第319番目〜第567番目のアミノ酸からなるタンパク質を「ECD2」とも称する。
また、LGR6には、同じmRNAに由来する翻訳開始点の異なる変異体が存在する。例えば、ヒトLGR6の場合、N末端から第43番目までのアミノ酸が欠如し、第44番目から第71番目のアミノ酸が野生型(配列番号6)とは異なるペプチド(配列番号11)や、N末端から第52番目までのアミノ酸が欠如し、第53番目から第70番目のアミノ酸が野生型(配列番号6)とは異なるペプチド(配列番号12)などが存在する。
本発明におけるLGR6には、これらの変異体も含まれる。
LGR6は、マウス、ラット、ヒト等の組織や細胞から精製された天然型のLGR6でもよいし、遺伝子工学的に生産されたLGR6でもよい。例えば、LGR6が認められる生体試料を各種界面活性剤、例えばTriton−X、Sarkosylなどを用い、可溶性画分と不溶性画分に分画する。さらに不溶性画分を尿素やグアニジン塩酸などに溶解し、各種カラム、例えばヘパリンカラムあるいは結合樹脂に結合させることによりLGR6を得ることができる。
また、抗原とするペプチドの作製方法は、化学合成でも、大腸菌などを用いる遺伝子工学的手法による合成でもよく、当業者に周知の方法を用いることができる。
ペプチドの化学合成を行う場合は、周知のペプチドの合成方法によって合成することができる。また、その合成は、固相合成法及び液相合成法のいずれをも適用することができる。市販のペプチド合成装置(例えば、島津製作所製:PSSM−8など)を使用してもよい。
ペプチドを遺伝子工学的に合成する場合は、まず、当該ペプチドをコードするDNAを設計し合成する。当該設計及び合成は、例えば、全長LGR6遺伝子を含むベクター等を鋳型とし、所望のDNA領域を合成し得るように設計したプライマーを用いて、PCR法により行うことができる。そして、上記DNAを適当なベクターに連結することによってタンパク質発現用組換えベクターを得て、この組換えベクターを目的遺伝子が発現し得るように宿主中に導入することによって形質転換体を得る(Sambrook J.et al.,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,3rd edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,2001)。
ベクターには、宿主微生物で自律的に増殖し得るファージ又はプラスミドが使用される。さらに、動物ウイルス、昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。組換えベクターの作製は、精製されたDNAを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターDNAの制限酵素部位等に挿入してベクターに連結すればよい。形質転換に使用する宿主としては、目的の遺伝子を発現できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、細菌(大腸菌、枯草菌等)、酵母、動物細胞(COS細胞、CHO細胞等)、昆虫細胞又は昆虫が挙げられる。ヤギ等の哺乳動物を宿主として使用することも可能である。宿主への組換えベクターの導入方法は公知である。
そして、前記形質転換体を培養し、その培養物から抗原として使用されるペプチドを採取する。「培養物」とは、(a)培養上清、(b)培養細胞若しくは培養菌体又はその破砕物のいずれをも意味するものである。
培養後、目的ペプチドが菌体内又は細胞内に生産される場合には、菌体又は細胞を破砕することによりペプチドを抽出する。また、目的ペプチドが菌体外又は細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体又は細胞を除去する。その後、ペプチドの単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、目的のペプチドを単離精製することができる。
本発明においては、無細胞合成系を用いたin vitro翻訳により抗原となるペプチドを得ることもできる。この場合は、RNAを鋳型にする方法とDNAを鋳型にする方法(転写/翻訳)の2通りの方法を用いることができる。無細胞合成系としては、市販のシステム、例えばExpresswayTMシステム(インビトロジェン社)等を用いることができる。
上記のようにして得られたペプチドは、適当なキャリアタンパク質、例えば牛血清アルブミン(BSA)、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)、ヒトチログロブリン、ニワトリガンマグロブリン等に結合することも可能である。
また、本発明において、抗原としては、(a)配列番号2、4、6、7、8、9、10、11又は12で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドのほか、(b)配列番号2、4、6、7、8、9、10、11又は12で示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含むポリペプチド、(c)配列番号2、4、6、7、8、9、10、11又は12で示されるアミノ酸配列に対して70%以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、が挙げられる。
本発明において、「配列番号2、4、6、7、8、9、10、11又は12で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド」には、配列番号2、4、6、7、8、9、10、11又は12で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドが含まれる。
また、「配列番号2、4、6、7、8、9、10、11又は12で示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」としては、例えば、
(i)配列番号2、4、6、7、8、9、10、11又は12で示されるアミノ酸配列中の1〜10個(例えば、1〜5個、好ましくは1〜3個、より好ましくは1〜2個、さらに好ましくは1個)のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、
(ii)配列番号2、4、6、7、8、9、10、11又は12で示されるアミノ酸配列中の1〜10個(例えば、1〜5個、好ましくは1〜3個、より好ましくは1〜2個、さらに好ましくは1個)のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、
(iii)配列番号2、4、6、7、8、9、10、11又は12で示されるアミノ酸配列に1〜10個(例えば、1〜5個、好ましくは1〜3個、より好ましくは1〜2個、さらに好ましくは1個)のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、
(iv)上記(i)〜(iii)の組合せにより変異されたアミノ酸配列
などが挙げられる。
また、本発明におけるLGR6には、配列番号2、4、6、7、8、9、10、11又は12で示されるアミノ酸配列のほか、配列番号2、4、6、7、8、9、10、11又は12で示されるアミノ酸配列と70%以上の相同性(同一性)を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドが挙げられる。このようなポリペプチドとしては、配列番号2、4、6、7、8、9、10、11又は12で示されるアミノ酸配列に対して、約70%以上、75%以上、約80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、又は99%以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むもの(配列番号2、4、6、7、8、9、10、11又は12で示されるアミノ酸配列と実質的に同等のアミノ酸配列)も含まれる。相同性は、インターネットを利用したホモロジー検索サイト、例えば日本DNAデータバンク(DDBJ)において、FASTA、BLAST、PSI−BLAST等の相同性検索を利用できる。また、National Center for Biotechnology Information(NCBI)において、BLASTを用いた検索を行うこともできる。
上記の変異を有するタンパク質を調製するために、該タンパク質をコードする遺伝子(DNA)に変異を導入するには、Kunkel法やGapped duplex法等の部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット、例えばQuikChangeTM Site−Directed Mutagenesis Kit(ストラタジーン社製)、GeneTailorTM Site−Directed Mutagenesis System(インビトロジェン社製)、TaKaRa Site−Directed Mutagenesis System(Mutan−K、Mutan−Super Express Km等:タカラバイオ社製)等を用いて行うことができる。また、「Molecular Cloning,A Laboratory Manual(4th edition)」(Cold Spring Harbor Laboratory Press(2012))等に記載された部位特異的変異誘発法等の方法を用いることができる。
本発明において、細胞等に導入するための遺伝子としては、LGR6若しくはその部分断片又はこれらの変異型のペプチドをコードする遺伝子が挙げられる。そのような遺伝子としては、例えば、配列番号1、3若しくは5で示される塩基配列を含むものを使用することができる。
また、細胞等に導入するための遺伝子としては、配列番号1、3若しくは5で示される塩基配列に相補的な配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列、又はその部分配列を含む遺伝子を使用することも可能である。
本発明において、「ストリンジェントな条件」とは、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件及び高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。「低ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5%SDS、50%ホルムアミド、32℃の条件である。また、「中ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5%SDS、50%ホルムアミド、42℃の条件である。「高ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5%SDS、50%ホルムアミド、50℃の条件である。これらの条件において、温度を上げるほど高い相同性を有するDNAが効率的に得られることが期待できる。ただし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間、塩濃度等の複数の要素が考えられ、当業者であればこれらの要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
また、本発明に用いられるLGR6をコードする遺伝子には、配列番号1、3若しくは5で示される塩基配列に対して60%以上の相同性を有する塩基配列を含む遺伝子も含まれる。このような遺伝子としては、FASTA、BLASTなどの相同性検索ソフトウェアにより、デフォルトのパラメーターを用いて計算したときに、配列番号1、3若しくは5で示される塩基配列と、60%以上、70%以上、80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上又は99%以上の相同性を有する遺伝子を挙げることができる。
上記LGR6をコードする遺伝子又はその変異体は、例えば、NCBI GenBankデータベースなどに記載された塩基配列に基づいて、「Molecular Cloning,A Laboratory Manual(4th edition)」(Cold Spring Harbor Laboratory Press(2012))などに記載されている公知の遺伝子工学的手法を利用して得ることができる。
(2)ポリクローナル抗体の作製
前記のようにして作製したLGR6又は部分ペプチドをそれ自体で、あるいは担体、希釈剤と共に非ヒト哺乳動物、例えばウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヤギ等に投与することにより免疫する。抗原の動物1匹当たりの投与量は、アジュバントを用いるときは1μg〜10mgである。アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント(FCA)、フロイント不完全アジュバント(FIA)、水酸化アルミニウムアジュバント等が挙げられる。免疫は、主として静脈内、皮下又は腹腔内等に注入することにより行われる。また、免疫の間隔は特に限定されず、数日から数週間間隔、好ましくは1〜2週間間隔で、2〜20回、好ましくは5〜15回免疫を行う。免疫の間隔は、当業者であれば得られる抗体価を勘案して設定することができる。3〜4回皮下免疫を行った時点で試採血を行い、抗体価を測定することが好ましい。血清中の抗体価の測定は、ELISA(enzyme−linked immunosorbent assay)、EIA(enzyme immunoassay)、放射性免疫測定法(RIA;radioimmuno assay)等によって行うことができる。抗体価が十分上昇したことを確認した後、全採血し、通常行われる方法により抗体を分離精製することができる。分離精製は、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の公知の方法を適宜選択して、又はこれらを組み合わせることにより、精製することができる。具体的には、目的の抗体を含有する血清を、LGR6以外のタンパク質を結合したカラムに通し、素通り画分を採取することにより、LGR6に対する特異性を向上させたポリクローナル抗体を得ることができる。
(3)モノクローナル抗体の作製
(i)抗体産生細胞の採取
ポリクローナル抗体の作製と同様に、LGR6又は部分ペプチド(例えばECD2)をそれ自体で、あるいは担体及び希釈剤と共に非哺乳動物に投与することにより免疫する。動物1匹当たりの抗原の投与量、用いられるアジュバントの種類、免疫方法、免疫の間隔はポリクローナル抗体の作製と同様である。最終の免疫日から1〜30日後、好ましくは2〜5日後に、抗体価の認められた個体を選択し抗体産生細胞を採集する。抗体産生細胞としては、脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血細胞等が挙げられるが、脾臓細胞又はリンパ節細胞が好ましい。
(ii)細胞融合
ハイブリドーマを得るため、抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合を行う。融合操作は既知の方法、例えばKohlerらの方法に従い実施できる。抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞として、マウスなどの動物の一般に入手可能な株化細胞を使用することができる。使用する細胞株としては、薬剤選択性を有し、未融合の状態ではHAT選択培地(ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジンを含む)で生存できず、抗体産生細胞と融合した状態でのみ生存できる性質を有するものが好ましい。ミエローマ細胞としては、例えばP3X63−Ag8、P3X63−Ag8U.1、SP2/O−Ag14、PAI、P3U1、NSI/1−Ag4−1、NSO/1などのマウスミエローマ細胞株、YB2/0などのラットミエローマ細胞株などが挙げられる。
上記ミエローマ細胞と抗体産生細胞との細胞融合は、血清を含まないDMEM、RPMI−1640培地などの動物細胞培養用培地中で、1×108〜5×108個の抗体産生細胞と2×107〜10×107個のミエローマ細胞とを混合し(抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞比10:1〜1:1)、細胞融合促進剤存在のもとで融合反応を行う。細胞融合促進剤として、平均分子量1000〜6000ダルトンのポリエチレングリコール又はセンダイウイルス等を使用することができる。また、電気刺激(例えばエレクトロポレーション)を利用した市販の細胞融合装置を用いて抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることもできる。
(iii)ハイブリドーマの選別及びクローニング
細胞融合処理後の細胞から目的とするハイブリドーマを選別する。その方法として、細胞懸濁液を、例えば10〜20%のウシ胎児血清含有RPMI−1640培地などで適当に希釈後、マイクロタイタープレート上に限界希釈法で計算上0.3個/well程度まき、各ウェルにHAT培地などの選択培地を加え、以後適当に選択培地を交換して培養を行う。その結果、選択培地で培養開始後、10日前後から生育してくる細胞をハイブリドーマとして得ることができる。
次に、生育してきたハイブリドーマをさらにスクリーニングする。ハイブリドーマのスクリーニングは、通常の方法に従えばよく、特に限定されるものではない。例えば、ハイブリドーマを培養したウェルに含まれる培養上清の一部を採集し、酵素免疫測定法、放射性免疫測定法等によって、スクリーニングすることができる。具体的には、96ウエルプレートに抗原を吸着させた後、仔牛血清、スキムミルク等でブロッキングする。ハイブリドーマ細胞の培養上清を固相化した抗原に37℃で1時間反応させた後、ペルオキシダーゼ標識した抗マウスIgGを37℃で1時間反応させ、オルトフェニレンジアミンを基質として用いて発色させる。酸で反応を停止させた後、490nmの波長における吸光度を測定することにより、スクリーニングすることができる。上記測定法により陽性を示したモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを、限界希釈法等によりクローニングする。そして、最終的に、LGR6に特異的に結合するモノクローナル抗体を産生する細胞であるハイブリドーマを樹立する。
本発明のモノクローナル抗体を産生する細胞株(ハイブリドーマ)としては、例えば、「Mouse−Mouse hybridoma Mu2C15」(以下「Mu2C15」という)、「Mouse−Mouse hybridoma Mu2C21」(以下「Mu2C21」という)、「Mouse−Mouse hybridoma Mu2C22」(以下「Mu2C22」という)が挙げられる。ハイブリドーマを培養することにより、均質なモノクローナル抗体を製造することができる。
(iv)モノクローナル抗体の採取
樹立したハイブリドーマからモノクローナル抗体を採取する方法として、通常の細胞培養法又は腹水形成法等を採用することができる。細胞培養法においては、ハイブリドーマを10%ウシ胎児血清含有RPMI−1640培地、MEM培地又は無血清培地等の動物細胞培養培地中で、通常の培養条件(例えば37℃、5%CO2濃度)で7〜14日間培養し、その培養上清から抗体を取得する。腹水形成法の場合は、ミエローマ細胞由来の哺乳動物と同種系動物、例えばマウス(BALB/c)の腹腔内にハイブリドーマを約5×106〜2×107個投与し、ハイブリドーマを大量に増殖させる。そして、1〜2週間後に腹水を採取する。上記抗体の採取方法において抗体の精製が必要とされる場合は、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィーなどの公知の方法を適宜選択して、又はこれらを組み合わせることにより精製することができる。
本発明の抗LGR6抗体としては、例えば、重鎖可変領域(VH)の相補性決定領域(CDR)1〜3のアミノ酸配列がそれぞれ配列番号27、29、及び31で示されるアミノ酸配列を含むか若しくは該アミノ酸配列からなり、かつ/又は軽鎖可変領域(VL)の相補性決定領域(CDR)1〜3のアミノ酸配列がそれぞれ配列番号33、35及び37で示されるアミノ酸配列を含むか若しくは該アミノ酸配列からなるものが好ましい。また別の態様において、本発明の抗LGR6抗体としては、例えば、重鎖可変領域(VH)のアミノ酸配列が、配列番号23で示されるアミノ酸配列を含むか若しくは該アミノ酸配列からなり、かつ/又は軽鎖可変領域(VL)のアミノ酸配列が、配列番号25で示されるアミノ酸配列を含むか若しくは該アミノ酸配列からなるものが好ましい。
(v)抗LGR6抗体のエピトープ
本発明の抗LGR6抗体のエピトープ(抗原決定基)は、抗原であるLGR6の少なくとも一部であればよく限定はされないが、LGR6の細胞外領域の少なくとも一部が好ましく、例えば、配列番号6で示されるLGR6のアミノ酸配列のうち、第25番目〜第567番目のアミノ酸からなる領域(配列番号7)、第91番目〜第567番目のアミノ酸からなる領域(配列番号8)、第319番目〜第567番目のアミノ酸からなる領域(配列番号9)、第444番目〜第567番目のアミノ酸からなる領域(配列番号10)の少なくとも一部であることが好ましい。なかでも、第319番目〜第567番目のアミノ酸からなる領域、第444番目〜第567番目のアミノ酸からなる領域の少なくとも一部がより好ましく、特に好ましくは、第319番目〜第567番目のアミノ酸からなる領域の少なくとも一部である。当該領域を認識する(当該領域と結合する)抗LGR6抗体は、例えば、生体試料中のLGR6の検出感度が高く、後述する癌の検出及び診断の用途に極めて有用なものである。
また、上述した通り、LGRには二種類の欠損変異体が存在する。具体的には、ヒトLGR6の場合、N末端から第43番目までのアミノ酸が欠如し、第44番目から第71番目のアミノ酸が野生型(配列番号6)とは異なるペプチド(配列番号11)や、N末端から第52番目までのアミノ酸が欠如し、第53番目から第70番目のアミノ酸が野生型(配列番号6)とは異なるペプチド(配列番号12)などが存在する。
これらのペプチドは、配列番号6で示されるLGR6のアミノ酸配列のうち、第91番目〜第567番目のアミノ酸からなる領域、第319番目〜第567番目のアミノ酸からなる領域、第444番目〜第567番目のアミノ酸からなる領域において、野生型LGR6と共通する。従って、本発明の抗体はこれらの欠損変異体も検出することができる。
また、本発明の抗LGR6抗体のエピトープ(抗原決定基)には、他の動物由来のLGR6における上記領域に相当する領域の少なくとも一部が含まれる。
本発明のLGR6に対する抗体には、当該抗体が結合する部位(例えばエピトープ)に結合する抗体、例えば、本発明のハイブリドーマが産生する抗体が結合する部位に結合する抗体が含まれる。
(4)遺伝子組換え抗体の作製
本発明の抗体の好ましい態様の一つとして、遺伝子組換え抗体が挙げられる。遺伝子組換え抗体としては、限定はされないが、例えば、キメラ抗体、ヒト型化抗体及びヒト化抗体等が挙げられる。
キメラ抗体(すなわちヒト型キメラ抗体)は、マウス由来抗体の可変領域をヒト由来の定常領域に連結(接合)した抗体であり(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81,6851−6855,(1984)等を参照)、キメラを作製する場合は、そのように連結した抗体が得られるよう、遺伝子組換え技術によって容易に構築できる。ここで、マウス由来抗体の可変領域としては、重鎖可変領域が、例えば配列番号23で示されるアミノ酸配列を含むか若しくは該アミノ酸配列からなるものが好ましく、軽鎖可変領域が、例えば配列番号25で示されるアミノ酸配列を含むか若しくは該アミノ酸配列からなるものが好ましい。
ヒト型化抗体を作製する場合は、いわゆるCDRグラフティング(CDR移植)と呼ばれる手法を採用することができる。CDRグラフティングとは、マウス抗体の可変領域から相補性決定領域(CDR)をヒト可変領域に移植して、フレームワーク領域(FR)はヒト由来のものでCDRはマウス由来のものからなる、再構成した可変領域を作製する方法である。次に、これらのヒト型化された再構成ヒト可変領域をヒト定常領域に連結する。このようなヒト型化抗体の作製法は、当分野において周知である(Nature,321,522−525(1986);J.Mol.Biol.,196,901−917(1987);Queen C et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86:10029−10033(1989);特許第2828340号公報等を参照)。ここで、本発明のヒト型化抗LGR6抗体に用いることができるマウス由来のCDRのアミノ酸配列としては、限定されるものではないが、例えば、重鎖可変領域のCDR1〜3として、それぞれ配列番号27、29及び31で示されるアミノ酸配列が好ましく、軽鎖可変領域のCDR1〜3として、それぞれ配列番号33、35及び37で示されるアミノ酸配列が好ましい。
ヒト抗体(完全ヒト抗体)は、一般に可変領域(V領域)の抗原結合部位である超可変領域(hyper variable region)、V領域のその他の部分及び定常領域の構造が、ヒトの抗体と同じ構造を有するものである。ヒト抗体を作製する技術も公知であり、ヒトに共通の遺伝子配列については遺伝子工学的手法によって作製する方法が確立されている。ヒト抗体は、例えば、ヒト抗体の重鎖(H鎖)及び軽鎖(L鎖)の遺伝子を含むヒト染色体断片を有するヒト抗体産生マウスを用いた方法(Tomizuka,K.et al.,Nature Genetics,(1977)16,133−143;Kuroiwa,Y.et.al.,Nuc.Acids Res.,(1998)26,3447−3448;Yoshida,H.et.al.,Animal Cell Technology:Basic and Applied Aspects,(1999)10,69−73(Kitagawa,Y.,Matuda,T.and Iijima,S.eds.),Kluwer Academic Publishers;Tomizuka,K.et.al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,(2000)97,722−727等を参照)や、ヒト抗体ライブラリーより選別したファージディスプレイ由来のヒト抗体を取得する方法(Wormstone,I.M.et.al,Investigative Ophthalmology & Visual Science.,(2002)43(7),2301−8;Carmen,S.et.al.,Briefings in Functional Genomics and Proteomics,(2002)1(2),189−203;Siriwardena,D.et.al.,Opthalmology,(2002)109(3),427−431等を参照)により取得することができる。
また、本発明においては、ハイブリドーマ又は当該ハイブリドーマから抽出したDNA若しくはRNAなどを原料として、上述した周知の方法に準じてキメラ抗体、ヒト型化抗体、ヒト化抗体を作製することができる。
さらに、本発明の抗体が融合したタンパク質は、抗体の可変領域とその他のタンパク質を公知の遺伝子組換え方法を用いることにより作製することができる。また、当該融合タンパク質は、モノクローナル抗体と他のタンパク質とをクロスリンカーを用いて架橋することにより作製することができる。
(5)抗体断片の作製
本発明で使用されるLGR6に対する抗体の断片は、LGR6に特異的に結合する。
抗体の断片は、本発明の抗体の一部分の領域を意味し、例えば、Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv、diabody(dibodies)、dsFv、scFv(single chain Fv)などが挙げられる。上記抗体断片は、本発明の抗体を目的に応じて各種タンパク質分解酵素で切断することにより得ることができる。
例えば、Fabは、抗体分子をパパインで処理することにより、F(ab′)2は、抗体分子をペプシンで処理することによりそれぞれ得ることができる。また、Fab′は、上記F(ab′)2のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断することで得ることができる。
scFvの場合は、抗体の重鎖可変領域(H鎖V領域)及び軽鎖可変領域(L鎖V領域)をコードするcDNAを取得し、scFvをコードするDNAを構築する。このDNAを発現ベクターに挿入し、当該発現ベクターを宿主生物に導入して発現させることにより、scFvを製造することができる。
diabodyの場合は、抗体のH鎖V領域及びL鎖V領域をコードするcDNAを取得し、ペプチドリンカーのアミノ酸配列の長さが8残基以下となるようにscFvをコードするDNAを構築する。このDNAを発現ベクターに挿入し、当該発現ベクターを宿主生物に導入して発現させることにより、diabodyを製造することができる。
dsFvの場合は、抗体のH鎖V領域及びL鎖V領域をコードするcDNAを取得し、dsFvをコードするDNAを構築する。このDNAを発現ベクターに挿入し、当該発現ベクターを宿主生物に導入して発現させることにより、dsFvを製造することができる。
本発明において、重鎖可変領域をコードするDNAの塩基配列としては、例えば配列番号22で示される塩基配列を含むか又は該塩基配列からなるものが挙げられ、軽鎖可変領域をコードするDNAの塩基配列としては、例えば配列番号24で示される塩基配列を含むか又は該塩基配列からなるものが挙げられる。
また、本発明の抗体断片の具体例としては、限定されるものではないが、例えば、VH CDR1〜3のアミノ酸配列としてそれぞれ配列番号27、29及び31で示されるアミノ酸配列を含み、かつ/又はVL CDR1〜3のアミノ酸配列としてそれぞれ配列番号33、35及び37で示されるアミノ酸配列を含む、抗体断片が挙げられる。さらに、VHとして配列番号23で示されるアミノ酸配列を含み、かつ/又はVLとして配列番号25で示されるアミノ酸配列を含む、抗体断片が挙げられる。
CDRを含む抗体断片(ペプチド)は、VH又はVLのCDR(CDR1〜3)の少なくとも1領域以上を含んで構成される。複数のCDRを含む抗体断片は、直接又は適当なペプチドリンカーを介して結合させることができる。CDRを含む抗体断片は、抗体のVHおよびVLのCDRをコードするDNAを構築し、該DNAを原核生物用発現ベクター又は真核生物用発現ベクターに挿入して、該発現ベクターを原核生物又は真核生物へ導入することにより発現させて、製造することができる。また、CDRを含むペプチドは、Fmoc法(フルオレニルメチルオキシカルボニル法)及びtBoc法(t−ブチルオキシカルボニル法)等の化学合成法によって製造することもできる。
VHのCDR1〜3をコードする塩基配列としては、例えば、それぞれ配列番号26、28及び29で示される塩基配列が好ましく、VLのCDR1〜3をコードする塩基配列としては、例えば、それぞれ配列番号32、34及び36で示される塩基配列が好ましい。
(6)結合親和性
結合親和性は、結合定数(KA)及び解離定数(KD)により決定することができる。親和性平衡定数(K)はKA/KDの比で表される。その結合親和性は、以下のようにして検出することができる。
結合親和性は、少なくとも1×10−10Mの解離定数(KD)を有しており、この解離定数に対し、例えば2〜5倍、5〜10倍、10〜100倍、100〜1000倍又は1000〜10,000倍高い親和性を有する。具体的には、本発明の抗体は、LGR6の結合親和性に関する解離定数(KD)が、1×10−10M、5×10−11M、1×10−11M、5×10−12M、1×10−12M、5×10−13M、1×10−13M、5×10−14M、1×10−14M、5×10−15M、又は1×10−15Mであり、1×10−10M〜1×10−13Mであることがより好ましい。あるいはこれらのKDよりも低い値であり高親和性であってもよい。
ここで、親和性の測定対象となる抗体の解離定数(KD)が、本発明の抗体のKDの約1〜100倍以内であるときは、当該抗体は、本発明の抗体と実質的に同一であるとして本発明に含まれる。
結合定数(KA)及び解離定数(KD)は、表面プラスモン共鳴(SPR)を用いて測定することができ、結合率をリアルタイムで検出し、さらにモニタリングする公知の機器及び方法を採用することができる(例えばBiacore(登録商標)T200(GE Healthcare社)、ProteON XPR36(Bio−Rad社)など)。
3.癌の検出用又は診断用試薬(癌の検出剤又は診断剤)
本発明の癌の検出用又は診断用試薬は、上記「2.LGR6に対する抗体(抗LGR6抗体)」に記載した抗体又はその断片を含有するものである。本発明の抗体は、癌に発現しているLGR6に対して特異的に結合することができるため、当該抗体を含む本発明の試薬は癌の検出又は診断のために使用することができる。
本発明における検出又は診断の対象となる癌としては、例えば大腸癌、乳癌、子宮癌、胃癌、甲状腺癌、膵癌、脳腫瘍、頚癌、食道癌、舌癌、肺癌、小腸の癌、十二指腸癌、膀胱癌、腎癌、肝癌、前立腺癌、子宮頸癌、卵巣癌、胆嚢癌、咽頭癌、肉腫、メラノーマ、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫などが挙げられるが、好ましくは、正常細胞又は組織と比較してLGR6が有意に高く発現している癌が好ましい。そのような癌としては、例えば、大腸癌、乳癌、子宮癌、胃癌、甲状腺癌、膵癌などが挙げられ、好ましくは大腸癌、乳癌、子宮癌、胃癌であり、より好ましくは大腸癌、乳癌である。
本発明の試薬は、本発明の抗体のほか、薬学的に許容できる担体を含むことができる。「薬学的に許容できる担体」とは、本発明の試薬に適する任意の担体(リポソーム、脂質小胞体、ミセル等)、希釈剤、賦形剤、湿潤剤、緩衝剤、懸濁剤、潤滑剤、アジュバント、乳化剤、崩壊剤、吸収剤、保存料、界面活性剤、着色料、又は着香料などを指す。
また別の態様において、本発明は、癌の検出用又は診断用試薬の製造のためのLGR6に対するモノクローナル抗体又はその断片の使用を提供する。また、本発明は、癌の検出又は診断において使用するためのLGR6に対するモノクローナル抗体又はその断片を提供する。さらに、本発明は、癌の検出用又は診断用試薬として使用するためのLGR6に対するモノクローナル抗体又はその断片を提供する。LGR6に対するモノクローナル抗体又はその断片の説明については上記「2.LGR6に対する抗体(抗LGR6抗体)」に記載した通りである。
4.癌の検出又は診断方法
本発明の癌の検出又は診断方法は、上記「2.LGR6に対する抗体(抗LGR6抗体)」に記載した抗体又はその断片と、被験者から採取された生体試料(以下、単に「生体試料」ともいう)とを接触させ、前記試料におけるLGR6を検出する工程を含む方法である。この場合、LGR6の検出結果と癌の可能性とを関連づけることが好ましい。
本発明において、「被験者」としては、例えばヒト、ウサギ、モルモット、ラット、マウス、ハムスター、ネコ、イヌ、ヤギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、ウマ、サルなどの哺乳動物が挙げられ、好ましくはヒトである。
また、生体試料としては、例えば、哺乳動物由来の組織、細胞、これらの破砕物又は抽出物、体液、排泄物そのもの又はこれらを含む試料を意味し、特に限定されるものではない。また、生体試料には、哺乳動物由来の組織、細胞、これらの破砕物又は抽出物、及び体液、排泄物に対し、任意の処理、例えば希釈、分離、核酸又はタンパク質の抽出、タンパク質の変性等を行うことにより得られた試料も含まれる。生体試料は、大腸癌又は胃癌を検査する場合は、体液、排泄物が好ましく、特に糞便であることが好ましい。膀胱癌、腎臓癌を検査する場合は組織、尿を使用することができ、乳癌、子宮癌を検査する場合は母乳や生理用品などを使用することができる。いずれの生体試料も適切な前処理を行うことによって適用可能である。
糞便を試料とする場合、特開2005−46065号公報に記載される方法で調製することが好ましい。当該方法は、糞便から癌細胞を効率よく回収できる方法である。具体的には、ストマッカーバックに便とバッファーを入れ、糞便の懸濁液を作製する。この懸濁液を、多段式フィルタ装置でろ過し、最終フィルタの口径を10μm以下にすることで、細胞を最終フィルタ上に捕らえる。その中から、Ber−EP4抗体結合磁気ビーズ(Dynabeads Epithelial Enrich、ダイナル社)を用いて細胞を回収する。この他、パーコール遠心分離法など当業者が通常用いる細胞の効率的な回収方法を利用すればよい。
大腸癌や乳癌をはじめとする様々な癌において、体液を用いて早期に発見できる腫瘍マーカーはいまだ確立されていない。一般的なマーカーでは、ステージの進んだ癌であっても擬陰性を示すことがある。これに対し、本発明の抗体を用いれば、癌が進行する前に、体液や排泄物に含まれる、マーカーとしてのLGR6を発現する微量な細胞を検出および/または測定することができる。
「被験者」がヒトの場合、被験者には癌患者、例えば早期癌の患者、進行癌の患者、及び健常者が含まれる。ここで、早期癌は、例えば大腸癌、胃癌などの場合は癌細胞が粘膜層又は粘膜下層までに留まっていること、進行癌は癌細胞が固有筋層又はそれより深い層に達していることを基準に患者を区別して本発明の検出を行うことも可能である。また、血液試料としては末梢血が好ましく、末梢血由来の血清がより好ましい。さらに、組織には、癌組織及び癌が生じる可能性のある正常組織が含まれる。
本発明において、「接触」とは、本発明の抗体と被験者から採取された生体試料とを同一の反応系に存在させることを意味し、例えば、反応用ウェルにおいて本発明の抗体と生体試料とを混合すること、当該生体試料に本発明の抗体を添加すること、本発明の抗体又は生体試料のいずれか一方を固定した担体に他方を添加すること等が含まれる。
本発明において、LGR6の検出、発現量の測定又は評価には、例えば、酵素免疫測定法(EIA)、蛍光免疫測定法(FIA)、放射免疫測定法(RIA)、化学発光免疫測定法(CIA)、免疫比濁法、免疫比ろう法、ラテックス凝集法、ラテックス比濁法、赤血球凝集反応、粒子凝集反応、ウェスタンブロット法、免疫染色、免疫沈降法、イムノクロマト法などを利用できる。
このような検出等に用いるデバイスとしては、特に限定されないが、例えば、マイクロウェルプレート、アレイ、チップ、フローサイトメーター、表面プラズモン共鳴装置、イムノクロマトグラフィーストリップなどが利用できる。このようなデバイスを用いたときは、発色量、蛍光量、発光量などのシグナルを検出、測定及び/又は評価し、その検出、測定又は評価結果と癌の可能性等とを関連づけることができる。
本発明においては、LGR6の検出、発現量の測定又は評価結果に基づいて、被験者が癌に罹患している可能性の有無を診断することができる。
本発明の検出又は診断方法を、酵素免疫測定法や蛍光免疫測定法により実施する場合は、例えば、糞便より回収した癌細胞を含む細胞や患者より採取した組織から作製した切片など、上述した試料を適切に前処理したサンプルをマイクロウェルプレートやスライドガラスなどの固相に固定化して、免疫学的反応を行う。あるいは、チューブ内で細胞懸濁液を抗体と反応させることもできる。また、本発明のモノクローナル抗体をビーズやマイクロウェルプレートに固定化し、細胞と反応する方法も利用できる。
この場合、本発明のモノクローナル抗体を酵素や蛍光物質で標識することにより該反応を蛍光シグナルとして直接検出してもよく、または本発明のモノクローナル抗体に結合する標識された二次抗体を用いることによりシグナルを間接的に検出しても良い。標識物質としては、ペルオキシダーゼ(POD)、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ビオチン−アビジン複合体など、当業者が通常用いる物質を利用できる。また、検出方法は、競合法、サンドイッチ法または直接吸着法など、いずれの方法を用いてもよい。そして、反応の強さや、反応させたサンプル中の全体の細胞の中で、抗体と結合した細胞の割合を測定し、予め設定した基準値や指標と比較することによって、癌に罹患している可能性を判定又は診断することができる。
本発明において、LGR6の検出、発現量の測定又は評価を免疫染色を用いて行う場合には、例えば、免疫組織染色における染色度合(LGR6の検出結果)を、強陽性(Strong)、陽性(Moderate)、弱陽性(Weak)、陰性(Negative)などに分類し、染色度合と癌の可能性とを関連付けることにより、癌を検出又は被験者の癌の可能性(癌に罹患している可能性)の有無を診断することができる。
また、LGR6の細胞外領域は、血液中に放出される場合が想定されるため、血液試料中のLGR6の発現量を測定することにより、癌を検出又は被験者の癌の可能性の有無を診断することも可能である。この場合、LGR6の発現量の測定結果と癌の可能性とを関連づけて癌を検出するためには、生体試料中のLGR6の発現量の臨界値(cut−off値)を定めることが望ましい。
LGR6の発現量のcut−off値は、例えば、次のようにして求めることができる。まず、癌患者由来の生体試料におけるLGR6の発現量を測定する。このとき対象となる患者の例数は2例以上であり、例えば、5例以上、10例以上、50例以上、100例以上である。また、2例以上の健常者由来の生体試料におけるLGR6の発現量も測定しておくことが好ましく、対象となる健常者の例数は2例以上であり、例えば、5例以上、10例以上、50例以上、100例以上である。そして、癌患者由来の生体試料群と健常者由来の生体試料群の両方を含む全体から、LGR6の発現量のcut−off値を、統計処理により求める。統計処理としては、例えば、4−parameter logistic fitting法を用いて、標準曲線を作成する。LGR6を含まないサンプルのシグナル値を基準として、その数値の2倍をcut−off値と定めること等ができる。統計解析を行うための症例は、癌の種類(例えば、大腸癌、乳癌、子宮癌、胃癌、甲状腺癌、膵癌、白血病等)、病期、再発の有無、転移の有無、手術前後等により分類することもできる。さらに、統計処理は、健常者のLGR6の発現量の測定値と、癌患者において癌の種類、病期、再発の有無、転移の有無、手術前後等により分類したときのLGR6の発現量の測定値とを適宜組み合わせて行うこともできる。
本発明において、血液試料中のLGR6(細胞外領域)の発現量の臨界値(cut−off値)は、血清中濃度で、例えば、約10ng/ml、11ng/ml、12ng/ml、13ng/ml、14ng/ml、15ng/ml、16ng/ml、17ng/ml、18ng/ml、19ng/ml、20ng/ml、21ng/ml、22ng/ml、23ng/ml、24ng/ml、25ng/ml、26ng/ml、27ng/ml、28ng/ml、29ng/ml、30ng/ml、35ng/ml、40ng/ml、45ng/ml、50ng/ml、55ng/ml、60ng/ml、65ng/mlであるが、好ましくは約20ng/mlである。
上記条件下でLGR6の発現量を測定した場合において、測定したLGR6の発現量が上記cut−off値以上であるときに、癌が検出されたと判定でき、又は被験者が癌に罹患している可能性があると診断することができる。本発明においては、前記判定又は診断のための血清中濃度の値に上限値を設けてもよく、例えば、上記各cut−off値以上であって、かつ所定上限値以下(例えば、200ng/ml以下、190ng/ml以下、180ng/ml以下、170ng/ml以下、160ng/ml以下、150ng/ml以下、145ng/ml以下、140ng/ml以下、135ng/ml以下、130ng/ml以下)であるときに、癌を検出又は被験者の癌の可能性の有無を診断することができる。
本発明において、癌を検出したときの当該検出結果の確からしさ(確率)は、60%以上、70%以上、80%以上、90%以上、95%以上、好ましくは99%以上である。
さらに、本発明の別の態様において、一人の被験者(患者)のサンプルから測定されたLGR6の発現量を上記cut−off値と比較することで癌との関連性を検出又は診断するほかに、複数の患者由来の生体試料を用いてLGR6の発現量を測定する場合がある。従って、上記cut−off値を決定する手法と同様にして、所定数の健常人及び患者を含む集団(1次母集団)においてLGR6の発現量を測定して統計解析処理し、これらの集団に属する被験者において癌が検出された群と検出されない群に分けることも可能である。さらに、このようにして得られた測定値を基本データとして、この基本データと他の集団(2次母集団)における検出又は診断の対象となる個々の被験者由来の試料におけるLGR6の発現量とを比較することができる。
あるいは、それぞれの患者のデータを前記母集団の値に組み込んでLGR6の発現量を再度データ処理し、対象となる患者(母集団)の例数を増やすこともできる。例数を増やすことにより、LGR6の発現量の臨界値の精度を高め、これにより1人又は複数人の被験者における検出又は診断精度を高めることができる。
本発明においては、(i)被験者の生体試料におけるLGR6の発現量と、(ii)健常者の生体試料におけるLGR6の発現量との比較を行うことも可能である。
そして、前記(i)の場合のLGR6の発現量が、前記(ii)の場合のLGR6の発現量と比較して高い場合、例えば、健常者の生体試料におけるLGR6の発現量の約10%以上、約20%以上、約30%以上、約40%以上、約50%以上、約60%以上、約70%以上、約80%以上、約90%以上、約100%以上高い場合に、癌が検出されたと判断でき、又は被験者が癌に罹患している可能性があると診断できる。
上記検出結果は、例えば、癌の検査又は治療効果の確定診断を行う場合の主要資料又は補助資料とすることができる。
LGR6の発現量は各種癌患者において発現するため、健康診断等においてLGR6の発現量が検出されてもどの癌であるのか特定することができない場合がある。そこで、集団で行う健康検診等の場では「癌が疑われる」という評価を行い、後に癌種の特定や進行度を決定する(精密検査を行う)ための補助資料として使用することができる。また、癌種がある程度疑われた患者由来の試料を用いてLGR6が検出されたときは、癌種の主要資料(確定診断等)に利用することができる。なお、癌種の特定には、他の腫瘍マーカー、画像診断、病理診断等を使用することができる。
すなわち、本発明は、LGR6に対するモノクローナル抗体又はその断片と、被験者から採取された生体試料とを接触させ、前記試料におけるLGR6を検出する工程を含む、癌の検出又は診断を補助する方法も提供する。
5.癌の検出用又は診断用キット
本発明の抗LGR6抗体は、癌の検出用又は診断用キットの形態で提供することができる。本発明のキットは抗体を含むが、その他に、標識物質、あるいは抗体又はその標識物を固定した固相化試薬などを含めることができる。抗体の標識物質とは、酵素、放射性同位体、蛍光化合物及び化学発光化合物等によって標識されたものを意味する。本発明のキットは、上記の構成要素のほか、本発明の検出を実施するための他の試薬、例えば標識物が酵素標識物の場合は、酵素及び基質(発色性基質等)、基質溶解液、酵素反応停止液、あるいは検体用希釈液等を含んでいてもよい。また、各種バッファー、滅菌水、各種細胞培養容器、各種反応容器(エッペンドルフチューブ等)、ブロッキング剤(Bovine Serum Albumin(BSA),Skim milk,Goat血清等の血清成分)、洗浄剤、界面活性剤、各種プレート、アジ化ナトリウム等の防腐剤、及び実験操作マニュアル(説明書)等を含んでいてもよい。試薬は、固定化された状態、水溶液、凍結乾燥状態などにて提供され、使用前に適切な状態に調製されるものであってもよい。
本発明のキットは、上記本発明の検出方法を行うために有効に用いることができ、極めて有用性が高いものである。本発明のキットを利用することにより、検診等における癌患者の高精度スクリーニング、癌の早期発見、癌の進行度の特定、治療時の治療効果モニタリング、転移・再発の予見等に有用な情報を得ることができるため、癌による死亡率を低下させることができる。
抗LGR抗体、癌の種類、検出方法等については上記と同様である。
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例1.抗LGR6モノクローナル抗体の作製
(1)細胞培養
マウス骨髄腫株P3X63−Ag8(ATCC 受託番号 CRL−1580)、ヒト大腸癌細胞株HT−29(ATCC 受託番号 HTB38)、ヒト胎児腎細胞293Tを、それぞれ10%(v/v)の血清(Hyclone社製)を含むRPMI1640培地(Sigma社製)で80%コンフルエントを越えないように37℃、5%CO2下で48〜72時間培養および継代を行った。
(2)LGR6遺伝子のクローニング
293T細胞を培養し、Qiagen社のRNeasy Miniキットを用いて、total RNAを抽出した。抽出したtotal RNA 2μgから、SuperScript III reverse transcriptase(Invitrogen)を用いて、逆転写(RT)反応を50℃で1時間行ってcDNAを合成し、85℃、5分間の加熱により、反応を停止させた。得られたcDNAを鋳型とし、以下のプライマーを用い、KOD PLUS(TOYOBO社)を用いたPCR反応を行なうことで、LGR6のアミノ酸第319番目から第567番目をコードする塩基配列(配列番号13)を含むDNAを増幅した。
プライマー配列
PCR反応は、95℃、10分間のプレインキュベーションを行ない、次に95℃、15秒間のデナチュレーション、および58℃、1分間のアニーリング/エロンゲーションのサイクルを40サイクル行い、遺伝子断片を増幅した。
得られた増幅断片は、プライマー上に配置した制限酵素サイトにおいて、制限酵素(EcoRI及びNotI)で切断し、pET32bベクター(Invitrogen社)へ組み込んだ。これにより、N末端側にTrx−、S−及びHis−Tagを持ち、C末端側にHis−Tagを持つLGR6の部分タンパク質をコードする塩基配列を含むDNAを得た。
(3)LGR6部分タンパク質の作製
上記(2)で作製したベクターでBL21(DE3)(Invitrogen社)を形質転換し、1%(w/v)のグルコースを含むLB培地[1%(w/v)トリプトン(Sigma社)、0.5%(w/v)Yeast extract(Sigma社)、0.5%(w/v)NaCl(Sigma社)]で培養した。培地の濁度が600nmの波長で0.6となった後、1mM IPTG(WAKO社)を加え、16時間培養を行った。菌体を遠心分離により回収後、超音波破砕を行い、LGR6細胞外領域を含む分画を不溶性タンパク質として得た。
約10mgのサンプルをBuffer A(1M塩酸グアニジン(Sigma社)、10mM DTT(Sigma社)、10mM EDTA(Sigma社))に溶解し、37℃で1時間反応させた。反応液を1LのBuffer B(50mM Tris、150mM NaCl、5%グリセロール、0.4mM 酸化型グルタチオン(Sigma社)、pH8.5)に緩やかに加え、4℃で18時間撹拌した。溶解したサンプルをNi−sepharoseカラム(GE社)に供し、Buffer C(50mM リン酸カリウム緩衝液、150mM NaCl、200mM Imidazole、pH8.0)で溶出した。Imidazoleを含まないBuffer Cに透析して、精製したLGR6のヒンジ領域を含む部分タンパク質を得た。このタンパク質を以後、ECD2と称する。ECD2のアミノ酸配列は配列番号9で示される。
(4)免疫
上記で作製したECD2をフロイント完全アジュバントと等量混合し、BALB/cマウスの腹腔内に100μl(約40μg/マウス)投与した。約3週間後、同じくECD2をフロイント不完全アジュバントと等量混合し、腹腔内に投与した。この作業を7回〜12回繰り返した後、抗体価の上昇を確認した。力価の上昇したマウスに対しては、最終免疫としてECD2約40μgを静脈内に投与し、その3日後に脾臓を摘出した。
(5)細胞融合
マウスの脾臓由来のリンパ球をマウス骨髄腫株P3X63−Ag8と電気的に融合させた。細胞融合に際しては、1×108個の脾臓細胞と0.25×108個の骨髄腫株とを混合し、EP Buffer(0.3M Mannitol、0.1mM CaCl2、0.1mM MgCl2)に細胞密度が0.25×108個/mLとなるよう懸濁し、電気融合装置LF201(ネッパジーン社製)で融合を行った。融合条件はメーカー推奨の手法に従った。
融合後の細胞をHAT培地(Invitrogen社製)に懸濁し、各ウエル100μLとなるよう30枚の96ウエルプレートに散布した。途中、HAT培地を200μL添加し、11〜16日間培養後に顕微鏡下で観察すると、1ウエルあたり5〜12個のコロニーが形成された。
(6)ELISA
ハイブリドーマが増殖してきたウエルの培養上清を回収し、ECD2に反応するモノクローナル抗体を産生しているハイブリドーマを選択した。ECD2をPBS(−)で希釈し、96ウエルのELISAプレート(Nunc社)に1ウエル当たり1μgとなるよう分注して、4℃で一晩放置することでプレート表面に結合させた。次に、0.05%Tween20を含むPBS(−)(以下、PBS−Tと記載する)350μLで3回洗浄した後、1%スキムミルクを含むPBS−Tを300μLずつ各ウエルに分注し、1時間、室温でブロッキングした。PBS−Tで洗浄後、ハイブリドーマの培養上清をECD2結合ELISAプレートに分注し、1時間、室温で反応させた。PBS−Tで洗浄後、ペルオキシダーゼ(以下、PODと記載する)標識抗マウス免疫グロブリン抗体(BETHYL社製)を10000倍希釈したものを各ウエル100μL分注し、1時間、室温で反応させた。同様の洗浄を行った後、1mg/mL PODとなるよう調製したPOD基質を加え、室温、5分間発色させた。1.5Nの硫酸で反応を停止した後、490nmの吸収を、プレートリーダー(モレキュラーデバイス社)を用いて測定した。
(7)モノクローナル抗体の取得
上記(5)で形成されたハイブリドーマ細胞から産生される抗体の中から、上記(6)の方法でECD2に反応する抗体を選別した。また、ECD2を作製する際に付加したTrx−、S−、His−Tagに反応する抗体を除くために、pET32bベクターのみを大腸菌に導入し、上記(3)記載の方法で発現させ、精製したタンパク質をネガティブコントロールとして用いた。以降では、このネガティブコントロールに利用したタンパク質をTagと称する。
ECD2に反応し、Tagに反応しないモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞を選択した結果、37クローンが取得された。それぞれの抗体に関して、ELISAの結果を図2に示した。これらのハイブリドーマ細胞の中から、ECD2に強く反応し、Tagに反応しない抗体を産生する細胞を選択し、限界希釈により単クローニングを行った結果、6クローンのハイブリドーマ細胞を樹立した。これらのハイブリドーマから産生される抗体の反応性をELISAで測定した結果を図3に示した。以降では、6クローンの抗体をそれぞれ、「Mu2C1」、「Mu2C15」、「Mu2C21」、「Mu2C22」、「Mu2C24」、「Mu2C26」とも称する。
これらのハイブリドーマ細胞を、それぞれ10cmディッシュ10枚に90%コンフルエントとなるよう培養し、HT培地(Invitrogen社製)とEX CELL Sp2/O(ニチレイバイオサイエンス社製)とを1:1で混合した培地で10日間培養を行った。培養上清を回収し、ProteinGカラムを用いて精製した。培養上清100mLに対し、0.5mLのProteinGカラム(GEヘルスケア社)を用いた。PBSで平衡化したProteinGカラムに対し、培養液を1〜3ml/minの流速で通過させた後、6mLの洗浄バッファー(25mM Tris−HCl(pH7.4)、140mM NaCl、10mM KCl)で洗浄した。次に1mLの溶出バッファー(0.1M Glycine(pH2.5))で抗体タンパク質を溶出させ、3M Tris−HCl(pH7.4)を用いてpH7.0〜7.4の間になるよう中和した。Amicon Ultra 30(Millipore社)を用いて抗体を濃縮するとともにバッファーをPBSに置換した。
実施例2.抗LGR6モノクローナル抗体の解析
(1)ウエスタンブロッティング
実施例1.(7)で得られた6種類のハイブリドーマ細胞「Mu2C1」、「Mu2C15」、「Mu2C21」、「Mu2C22」、「Mu2C24」、「Mu2C26」が産生する抗体に関して、ウエスタンブロッティングによる解析を行った。まず、抗原であるECD2との反応性を解析した。実施例1.(3)で作製したECD2のタンパク質濃度をBradford法により測定後、1μg/mLとなるよう調製し、SDS−PAGEに供した。泳動後、トランスブロットSDセル(バイオラッド社)を用い、メーカー推奨のプロトコールに従いPVDFメンブレン(PIERCE社)にタンパク質を転写した。TBS−Tに5%(w/v)となるよう溶解したスキムミルクを用いて、室温で30分間ブロッキングを行い、TBS−Tで2回洗浄を行った。実施例1.(7)で作製した6種類のモノクローナル抗体をTBS−Tで1μg/mLに希釈し、メンブレンと1時間、室温で反応させた。TBS−Tで3回洗浄後、二次抗体として、抗マウスIgGポリクローナル抗体−HRP標識(BETHYL社製)をTBS−Tで1万倍に希釈した。メンブレンと室温で30分反応させた後、TBS−Tで3回洗浄した。メンブレンをImmobilon(Millipore社)に浸したのち、ラップしてLAS−3000(富士フィルム社)でシグナルを検出した。実験結果を図4に示した。この結果から、6種類の抗体は変性させたECD2とも反応することが示された。
(2)免疫細胞染色
実施例1.(7)で得られた6種類の抗体と、大腸癌細胞(HT−29)との反応性を解析した。以下では、ハイブリドーマ細胞が産生する抗体をそれぞれのクローン番号で記載することがある。
HT−29を80%コンフルエントとなるよう培養し、Cellmatrix Type I−A(新田ゼラチン社)でコートしたカバーガラス上へ播種した。2日間培養後、10%中性緩衝ホルマリン(WAKO社)を用いて細胞を固定した。0.3%(v/v)過酸化水素水で20分間処理した後、TBSTで3回洗浄し、5%(w/v)Skim milkを含むTBSTで処理した後、上記(7)で精製した抗体を10μg/mLとなるよう添加し、4℃、16時間反応させた。TBSTで3回洗浄した後、二次抗体として抗マウスIgGポリクローナル抗体−AlexaFluor488標識あるいは抗マウスIgMポリクローナル抗体−AlexaFluor488標識で室温30分間反応させた。TBSTで3回洗浄した後、Mounting Medium(Vector Shield社)で封入した。図5には、同一条件で蛍光強度を解析した結果を示す。Mu2C15のみ強いシグナルが観察され、細胞膜及び細胞質が染色されていると考えられた。すなわち、Mu2C15は細胞表面上のLGR6を認識することが確認された。さらに、LGR6は7回膜貫通型の膜タンパク質であることから、細胞質にみられるシグナルは、細胞膜上のLGR6がInternalizationにより細胞内部に取り込まれた結果を示していると考えられる。LGR6がInternalizationを起こすという現象は、これまでに報告がなく、初めての報告である。
(3)FACS
ヒト大腸癌細胞であるHT−29細胞を90%コンフルエントとなるよう培養した。細胞をPBSで2回洗浄した後、Cell Dissociation Buffer(Invitrogen社)でプレートより非酵素的に剥離し、1.5mLチューブに回収した。実施例1.(7)で得られたハイブリドーマ細胞のうち、Mu2C1、7、11、12、13、14、15、16、19、21、22、23、25、28、30、31の16種類に関し、それぞれの培養上清を回収して100μLずつ添加し、60分間反応させた。比較対象として、抗体を含まない培地のみを準備し、反応させた。PBS+2%FBSで2回洗浄後、AlexaFluor488標識されたGoat−Anti−mouse IgG(Invitrogen社)をPBS+2%FBSで1/1000希釈して添加し、30分間反応させた。PBS+2%PBSで2回洗浄後、Guava Flow Cytometry (Millipore社)で解析を行った。結果を図6に示す。Mu2C15及びMu2C30以外の抗体ではネガティブコントロールと同様のシグナルを示し、nativeな構造のLGR6とは反応しなかったが、Mu2C15及びMu2C30でわずかなシグナルの変化が見られた。さらに、Mu2C15に関して、抗体を精製し、抗体濃度を100μg/mLに上昇させてSW480細胞と反応させた結果を図7に示す。この場合、ネガティブコントロールと比べてシグナルの明確なシフトが観察された。すなわち、抗体が生きた細胞(生存癌細胞)と反応していることが示された。
この結果から、本発明の抗体は、生体試料、例えば血液試料中に存在する生存癌細胞の検出に有用であることが示された。
(4)抗体の可変領域の塩基配列及びアミノ酸配列の決定
実施例1.(7)で得られたハイブリドーマ細胞を培養し、Qiagen社のRNeasy Miniキットを用いて、total RNAを抽出した。抽出したtotal RNA 500ngから、SMARTer RACE cDNA Amplification Kit(Clontech)を用いて、逆転写(RT)反応を42℃で1.5時間行ってcDNAを合成し、70℃、10分間の加熱により、反応を停止させた。得られたcDNAを鋳型とし、以下のプライマーを用い、KOD PLUS ver.2(TOYOBO社)を用いたPCR反応を行なうことで、目的の遺伝子を増幅した。実施例1.(7)で得られたハイブリドーマ細胞から産生される抗体の代表例として、ハイブリドーマ細胞「Mu2C15」が産生する抗体(「Mu2C15」又は「Mu2C15抗体」とも称する)の可変領域のアミノ酸配列を下記方法を用いて決定した。
抗体のH鎖可変領域断片を増幅するために、下記プライマー(配列番号16、17及び18)を用いてPCR反応(94℃、2分間のデナチュレーションを行ない、続いて、56℃、15秒間のアニーリング、68℃、45秒間のエロンゲーションのサイクルを30サイクル)により断片を得た。
抗体のL鎖リーダー配列及び可変領域断片を増幅するために、上記プライマー(Long及びShort)並びに下記プライマー(配列番号19)を用いてPCR反応(94℃、2分間のデナチュレーションを行ない、続いて、56℃、15秒間のアニーリング、68℃、45秒間のエロンゲーションのサイクルを30サイクル)により断片を得た。
精製したPCR増幅断片を10mM dNTP Mix(インビトロジェン社)及び2×GoTaq Maxter Mix(Promega社)と混合し、70℃、15分間反応後、4℃、2分間氷冷することで、3’末端へdAを付加した。その後、pGEM−T−Easy Vector System(Promega社)を用い、いわゆるTAクローニング法によりH鎖断片及びL鎖断片をクローニングした。その後、下記プライマー(配列番号20および配列番号21)を用いて、シークエンス反応を行い、H鎖とL鎖の可変領域の配列を決定した。
Mu2C15抗体のH鎖可変領域(以下「VH」とも称する)のアミノ酸配列を配列番号23で示し、この領域をコードする塩基配列を配列番号22で示す。また、Mu2C15抗体のL鎖可変領域(以下「VL」とも称する)のアミノ酸配列を配列番号25で示し、この領域をコードする塩基配列を配列番号24で示す。
また、Mu2C15抗体の可変領域のアミノ酸配列のうち、既存の抗LGR6抗体の可変領域のアミノ酸配列と比較して特に変化が大きい(相同性が低い)領域を、当該抗体の相補性決定領域(CDR)として同定した。
同定したMu2C15抗体のCDRのアミノ酸配列を下記に示す。
また、上記VH CDR1、VH CDR2及びVH CDR3をコードする塩基配列をそれぞれ配列番号26、28及び30で示し、VL CDR1、VL CDR2及びVL CDR3をコードする塩基配列をそれぞれ配列番号32、34及び36で示す。Mu2C15抗体のVH及びVLにおける各CDRの位置を図14A及び図14Bに示す。
(5)他のLGRファミリータンパク質との結合性の検討
(5−1)LGRファミリータンパク質の相同性解析
実施例1(7)で得られたハイブリドーマ細胞から産生される抗体の代表例としてMu2C15抗体を用いて、LGRファミリーに属するLGR6以外の分子との結合性について解析を行った。ヒトLGR6の細胞外ドメインと相同性を示すタンパク質としては、ヒトLGR4及びヒトLGR5が挙げられる。実施例1(3)及び(4)記載のECD2と相同性を示すヒトLGR4のアミノ酸配列を配列番号39、ヒトLGR5のアミノ酸配列を配列番号41で示した。
ヒトLGR4の第311番目から第577番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列:(配列番号39)
ヒトLGR5の第319番目から第563番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列:(配列番号41)
これらのアミノ酸配列とヒトLGR6のECD2のアミノ酸配列との相同性を解析した結果、類似性(similarity)はLGR6とLGR4との間で78%、LGR6とLGR5との間で83%であり、同一性(identity)はLGR6とLGR4との間で42%、LGR6とLGR5との間で51%であった(図1)。
ヒトLGR4の第311番目から第577番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列:(配列番号39)
ヒトLGR5の第319番目から第563番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列:(配列番号41)
(5−2)LGRファミリータンパク質の部分タンパク質遺伝子のクローニング
HT−29細胞を培養し、実施例1(2)記載の方法でRNAを抽出し、cDNAを合成後、下記プライマーを用いてLGR4のアミノ酸第311番目から第577番目をコードする塩基配列(配列番号38)を含むDNAを増幅した。
プライマー配列
PCR反応は、95℃、10分間のプレインキュベーションを行ない、次に95℃、15秒間のデナチュレーション、および58℃、1分間のアニーリング/エロンゲーションのサイクルを40サイクル行い、遺伝子断片を増幅した。
得られた増幅断片は、プライマー上に配置した制限酵素サイトにおいて、制限酵素(Hind III及びEcoRI)で切断し、pET32bベクター(Invitrogen社)へ組み込んだ。これにより、N末端側にTrx−、S−及びHis−Tagを持ち、C末端側にHis−Tagを持つLGR4の部分タンパク質をコードする塩基配列を含むDNAを得た。
LGR5のアミノ酸第319番目から第563番目をコードする塩基配列(配列番号40)は、化学合成(株式会社医学生物学研究所)によって作製した後、この塩基配列の外側に設計した制限酵素サイトにおいて、制限酵素(BamHI及びEcoRI)で切断し、pET32aベクター(Invitrogen社)へ組み込んだ。これにより、N末端側にTrx−、S−及びHis−Tagを持ち、C末端側にHis−Tagを持つLGR5の部分タンパク質をコードする塩基配列を含むDNAを得た。
(5−3)LGR4及びLGR5部分タンパク質との結合性の検討
実施例1.(2)記載のLGR6の部分タンパク質をコードする塩基配列を含むベクター、及び上記(5−2)で作製したLGR4及びLGR5の部分タンパク質をコードする塩基配列を含むベクターそれぞれでBL21(DE3)を形質転換した。また、pET32bベクターでBL21(DE)を同様に形質転換した。実施例1.(3)記載の方法により発現誘導を行った後、細胞培養液20μlに対して5μlとなるよう、5 x Loading Buffer(10%SDS、10mM Dithiotheritol、20%Glycorol、200mM Tris−HCl(pH6.8)、0.05%Bromophenolblue)を添加し、95℃で5分間加熱した後に、SDS−PAGEに供した(図15a)。
泳動後、PVDFメンブレンにタンパク質を転写し、TBS−Tに5%(w/v)となるよう溶解したスキムミルクを用いて、室温で30分間ブロッキングを行い、TBS−Tで2回洗浄を行った。実施例1.(7)で作製したモノクローナル抗体の中から、Mu2C15をTBS−Tで1μg/mLに希釈し、メンブレンと1時間、室温で反応させた。TBS−Tで3回洗浄後、二次抗体として、抗マウスIgGポリクローナル抗体−HRP標識をTBS−Tで10万倍に希釈した。メンブレンと室温で30分反応させた後、TBS−Tで3回洗浄した。メンブレンをImmobilon(登録商標)に浸したのち、ラップしてLAS−3000でシグナルを検出した(図15b)
この結果から、Mu2C15抗体はLGR6の部分タンパク質には反応するが、LGR4及びLGR5の部分タンパク質とは反応しないことが示された。
実施例3.臨床組織サンプルの解析
(1)大腸癌組織を用いた免疫組織染色
Mu2C15と大腸癌組織との反応性を解析することで、LGR6の大腸癌における発現割合を解析した。今回、ヒト大腸癌組織アレイスライド(CDA3;SuperBiochips社)を用いて解析した。
大腸癌組織アレイスライドをキシレンに5分間浸す操作を3回繰り返して脱パラフィンを行った後、100%エタノールに5分浸すことを2回繰り返し、90%エタノール、80%エタノールにそれぞれ5分浸した後、流水下で2分間浸すことでサンプルの水和を行った。スライドを10mM クエン酸緩衝液(pH6.0)に浸し、600Wのマイクロウエーブで5分間処理する操作を3回繰り返すことで、抗原の賦活化を行った。メタノールで希釈した3%過酸化水溶液で10分間処理することで、内在性のペルオキシダーゼ活性を失活させた。この後の検出に関しては、ヒストファイン(M)キット(ニチレイ社)を用い、添付のプロトコールに従って、ブロッキング、二次抗体反応、洗浄、検出反応を行った。一次抗体反応は、Mu2C15を5あるいは10μg/mLとなるようTBS−Tに希釈して室温で1時間反応させた。発色は、ImpactDAB(VectorLaboratories社)を用いて、室温で5分間反応させることにより行った。反応後のスライドを流水洗浄後、ヘマトキシリン(Merck社)を用いて対比染色した後、封入した。組織染色の結果を図8Aに示した。
免疫組織染色における染色度合を、強陽性(Strong)、陽性(Moderate)、弱陽性(Weak)、陰性(Negative)で分類し、Mu2C15の免疫組織染色結果を統計解析した結果を図8Bに示した。
正常の大腸粘膜では、測定に用いた組織サンプルのうち約半数がほとんど染色されず、また残りに関しても弱い染色のみ見られた。これに対し、大腸癌組織においては、強陽性に染色される組織が進行ステージIから見られ、ステージIIのサンプルでは、測定に用いたサンプルの90%以上が強陽性を示すことが明らかになった。このことから、LGR6は、大腸癌の初期のステージから発現しており、測定に用いた大腸癌組織サンプルの90%以上で陽性又は強陽性を示すこと、及びMu2C15抗体を用いてその発現を高感度に検出できることが示された。
(2)乳癌組織を用いた免疫組織染色
Mu2C15と乳癌組織との反応性を解析することで、LGR6の乳癌における発現割合を解析した。解析には、ヒト乳癌組織アレイスライド(FDA808b;USBiomax社、BC081120;USBiomax社、及びCBA4;SuperBiochips社)を用いた。
免疫染色は上記実施例3.(1)記載の方法と同様に行った。実験の結果を図9に示した。
正常組織では全く染色されないか、腺細胞が陽性になる場合があった。これに対し、乳癌組織においては、強陽性に染色される組織が進行ステージIから見られ、測定に用いたサンプルの80%以上が強陽性又は陽性を示すことが明らかになった。このことから、LGR6は乳癌の初期のステージから発現しており、測定に用いた乳癌組織サンプルの90%以上で陽性及び強陽性を示すこと、及びMu2C15抗体を用いてその発現を高感度に検出できることが示された。
これらの結果から、LGR6は、少なくとも大腸癌及び乳癌の両方で、癌の診断に利用することができるマーカーであることが示された。また、本発明の抗体は、少なくとも大腸癌及び乳癌の検出及び診断に有用であることが示された。
(3)HercepTestIIとの対比
Her2の発現は、既存の分子標的薬であるハーセプチンの治療を行うかどうかを判断する指標になっている。Her2陽性患者は、乳癌患者全体の15−20%に過ぎないとされている。Her2検査は、浸潤性のある乳癌の場合に行われる。Her2の発現を同定する方法としては、複数のメーカーから体外診断薬が販売されている。そこで、HercepTest II(DAKO社)を用いて、上記実施例3.(2)と同じ組織アレイスライドを用い、Her2陽性率を解析し、LGR6陽性率と比較した。
ステージの異なる乳癌組織を免疫染色した結果を図10Aに示す。また、Her2陽性率及びLGR6陽性率を解析した結果を、それぞれ図10B及び図10Cに示す。
HercepTest IIでは、測定に用いたサンプルのうち、強陽性(3+)及び陽性(2+)で検出される割合が13%であったのに対し(図10B、下のグラフ)、抗LGR6抗体を用いた検出では78%であった(図10C、下のグラフ)。さらに、ステージ毎の発現を解析したところ、ステージIの症例では、HercepTest IIでは7.1%しか検出できなかったのに対し(図10B、上のグラフ)、抗LGR6抗体を用いた場合は90%以上を検出することができた(図10C、上のグラフ)。
これらの結果から、本発明の抗体を用いることにより、ステージIの段階で乳癌を高感度に検出することができることが示され、当該抗体を含む本発明の試薬は、早期の乳癌の検出に極めて有効であることが示された。
また、本発明の抗体を用いることにより、乳癌の悪性度を評価できることが示された。
LGR6の細胞外ドメインと結合するモノクローナル抗体としては、クローン番号2A3(Abcam)で示される抗体が公知である。Mu2C15と2A3との力価を、大腸癌組織を用いて比較した。
免疫染色は上記実施例3.(1)記載の方法と同様に行い、抗体濃度を5μg/mLとなるよう調製して行った。実験の結果を図11に示した。
2症例の大腸癌組織において、Mu2C15を用いた場合には明確な染色が見られたのに対し、2A3を用いた場合には全く染色が見られなかった。
この結果より、本発明の抗体は、既存のLGR6細胞外ドメインと結合するモノクローナル抗体よりも親和性が高く、高感度に癌を検出できることが示された。
実施例4.LGR6検出系の構築
EGFRなど、膜タンパク質の一部は、細胞外ドメインが血液中に放出されることが知られている(Molecular Cancer,Vol.9,166,2010)。同様に、LGR6についても、血液中のLGR6細胞外ドメイン部分を検出することで、癌診断が可能であると予測される。さらに、便からLGR6タンパク質を変性させた状態で抽出し、検出することも想定される。そこで、実施例1.(7)で得られた6種類のハイブリドーマ細胞が産生するモノクローナル抗体を利用して、サンドイッチELISAによってLGR6の細胞外ドメインを高感度に検出する方法の構築を行った。
まず、モノクローナル抗体をBiotin Labeling Kit−NH2(同仁化学社)を用い、添付の手法に従ってビオチン標識した。次に、標識を行っていないモノクローナル抗体を96ウエルのELISAプレート(Nunc社)に1ウエル当たり500ngとなるよう分注し、4℃で一晩放置することでプレート表面に結合させた。次に、0.05%Tween20を含むPBS(−)(以下、PBS−Tと記載する)350μLで3回洗浄した後、1%スキムミルクを含むPBS−Tを300μLずつ各ウエルに分注し、1時間、室温でブロッキングした。PBS−Tで洗浄後、ECD2が50ng/mLとなるよう添加し、1時間、室温で反応させた。350μLで3回洗浄した後、0.5mg/mLとなるよう調製したビオチン化抗体を添加し、1時間、室温で反応させた。350μLで3回洗浄した後、ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン(Vector Labs社)をTBS−Tで5000倍希釈したものを100μL添加し、1時間、室温で反応させた。その後の検出は、実施例1.(6)と同様の方法で行った。実験結果を図12に示した。
実験の結果、Mu2C15を固相化し、Mu2C21又はMu2C22をビオチン標識した抗体で検出することで、バックグラウンドが低く、かつECD2を高感度に検出できることが示された。
さらに、これらの組み合わせを用いて、ECD2の検出限界(臨界値)を解析した。
その実験結果を図13に示した。この結果、およそ20ng/mLを越える濃度であれば検出可能であることが示された。
この結果から、本発明の抗体を用いることにより、生体試料、例えば血液試料、糞便等から癌を高精度かつ高感度で検出することができることが示された。
(1)細胞培養
マウス骨髄腫株P3X63−Ag8(ATCC 受託番号 CRL−1580)、ヒト大腸癌細胞株HT−29(ATCC 受託番号 HTB38)、ヒト胎児腎細胞293Tを、それぞれ10%(v/v)の血清(Hyclone社製)を含むRPMI1640培地(Sigma社製)で80%コンフルエントを越えないように37℃、5%CO2下で48〜72時間培養および継代を行った。
(2)LGR6遺伝子のクローニング
293T細胞を培養し、Qiagen社のRNeasy Miniキットを用いて、total RNAを抽出した。抽出したtotal RNA 2μgから、SuperScript III reverse transcriptase(Invitrogen)を用いて、逆転写(RT)反応を50℃で1時間行ってcDNAを合成し、85℃、5分間の加熱により、反応を停止させた。得られたcDNAを鋳型とし、以下のプライマーを用い、KOD PLUS(TOYOBO社)を用いたPCR反応を行なうことで、LGR6のアミノ酸第319番目から第567番目をコードする塩基配列(配列番号13)を含むDNAを増幅した。
プライマー配列
PCR反応は、95℃、10分間のプレインキュベーションを行ない、次に95℃、15秒間のデナチュレーション、および58℃、1分間のアニーリング/エロンゲーションのサイクルを40サイクル行い、遺伝子断片を増幅した。
得られた増幅断片は、プライマー上に配置した制限酵素サイトにおいて、制限酵素(EcoRI及びNotI)で切断し、pET32bベクター(Invitrogen社)へ組み込んだ。これにより、N末端側にTrx−、S−及びHis−Tagを持ち、C末端側にHis−Tagを持つLGR6の部分タンパク質をコードする塩基配列を含むDNAを得た。
(3)LGR6部分タンパク質の作製
上記(2)で作製したベクターでBL21(DE3)(Invitrogen社)を形質転換し、1%(w/v)のグルコースを含むLB培地[1%(w/v)トリプトン(Sigma社)、0.5%(w/v)Yeast extract(Sigma社)、0.5%(w/v)NaCl(Sigma社)]で培養した。培地の濁度が600nmの波長で0.6となった後、1mM IPTG(WAKO社)を加え、16時間培養を行った。菌体を遠心分離により回収後、超音波破砕を行い、LGR6細胞外領域を含む分画を不溶性タンパク質として得た。
約10mgのサンプルをBuffer A(1M塩酸グアニジン(Sigma社)、10mM DTT(Sigma社)、10mM EDTA(Sigma社))に溶解し、37℃で1時間反応させた。反応液を1LのBuffer B(50mM Tris、150mM NaCl、5%グリセロール、0.4mM 酸化型グルタチオン(Sigma社)、pH8.5)に緩やかに加え、4℃で18時間撹拌した。溶解したサンプルをNi−sepharoseカラム(GE社)に供し、Buffer C(50mM リン酸カリウム緩衝液、150mM NaCl、200mM Imidazole、pH8.0)で溶出した。Imidazoleを含まないBuffer Cに透析して、精製したLGR6のヒンジ領域を含む部分タンパク質を得た。このタンパク質を以後、ECD2と称する。ECD2のアミノ酸配列は配列番号9で示される。
(4)免疫
上記で作製したECD2をフロイント完全アジュバントと等量混合し、BALB/cマウスの腹腔内に100μl(約40μg/マウス)投与した。約3週間後、同じくECD2をフロイント不完全アジュバントと等量混合し、腹腔内に投与した。この作業を7回〜12回繰り返した後、抗体価の上昇を確認した。力価の上昇したマウスに対しては、最終免疫としてECD2約40μgを静脈内に投与し、その3日後に脾臓を摘出した。
(5)細胞融合
マウスの脾臓由来のリンパ球をマウス骨髄腫株P3X63−Ag8と電気的に融合させた。細胞融合に際しては、1×108個の脾臓細胞と0.25×108個の骨髄腫株とを混合し、EP Buffer(0.3M Mannitol、0.1mM CaCl2、0.1mM MgCl2)に細胞密度が0.25×108個/mLとなるよう懸濁し、電気融合装置LF201(ネッパジーン社製)で融合を行った。融合条件はメーカー推奨の手法に従った。
融合後の細胞をHAT培地(Invitrogen社製)に懸濁し、各ウエル100μLとなるよう30枚の96ウエルプレートに散布した。途中、HAT培地を200μL添加し、11〜16日間培養後に顕微鏡下で観察すると、1ウエルあたり5〜12個のコロニーが形成された。
(6)ELISA
ハイブリドーマが増殖してきたウエルの培養上清を回収し、ECD2に反応するモノクローナル抗体を産生しているハイブリドーマを選択した。ECD2をPBS(−)で希釈し、96ウエルのELISAプレート(Nunc社)に1ウエル当たり1μgとなるよう分注して、4℃で一晩放置することでプレート表面に結合させた。次に、0.05%Tween20を含むPBS(−)(以下、PBS−Tと記載する)350μLで3回洗浄した後、1%スキムミルクを含むPBS−Tを300μLずつ各ウエルに分注し、1時間、室温でブロッキングした。PBS−Tで洗浄後、ハイブリドーマの培養上清をECD2結合ELISAプレートに分注し、1時間、室温で反応させた。PBS−Tで洗浄後、ペルオキシダーゼ(以下、PODと記載する)標識抗マウス免疫グロブリン抗体(BETHYL社製)を10000倍希釈したものを各ウエル100μL分注し、1時間、室温で反応させた。同様の洗浄を行った後、1mg/mL PODとなるよう調製したPOD基質を加え、室温、5分間発色させた。1.5Nの硫酸で反応を停止した後、490nmの吸収を、プレートリーダー(モレキュラーデバイス社)を用いて測定した。
(7)モノクローナル抗体の取得
上記(5)で形成されたハイブリドーマ細胞から産生される抗体の中から、上記(6)の方法でECD2に反応する抗体を選別した。また、ECD2を作製する際に付加したTrx−、S−、His−Tagに反応する抗体を除くために、pET32bベクターのみを大腸菌に導入し、上記(3)記載の方法で発現させ、精製したタンパク質をネガティブコントロールとして用いた。以降では、このネガティブコントロールに利用したタンパク質をTagと称する。
ECD2に反応し、Tagに反応しないモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞を選択した結果、37クローンが取得された。それぞれの抗体に関して、ELISAの結果を図2に示した。これらのハイブリドーマ細胞の中から、ECD2に強く反応し、Tagに反応しない抗体を産生する細胞を選択し、限界希釈により単クローニングを行った結果、6クローンのハイブリドーマ細胞を樹立した。これらのハイブリドーマから産生される抗体の反応性をELISAで測定した結果を図3に示した。以降では、6クローンの抗体をそれぞれ、「Mu2C1」、「Mu2C15」、「Mu2C21」、「Mu2C22」、「Mu2C24」、「Mu2C26」とも称する。
これらのハイブリドーマ細胞を、それぞれ10cmディッシュ10枚に90%コンフルエントとなるよう培養し、HT培地(Invitrogen社製)とEX CELL Sp2/O(ニチレイバイオサイエンス社製)とを1:1で混合した培地で10日間培養を行った。培養上清を回収し、ProteinGカラムを用いて精製した。培養上清100mLに対し、0.5mLのProteinGカラム(GEヘルスケア社)を用いた。PBSで平衡化したProteinGカラムに対し、培養液を1〜3ml/minの流速で通過させた後、6mLの洗浄バッファー(25mM Tris−HCl(pH7.4)、140mM NaCl、10mM KCl)で洗浄した。次に1mLの溶出バッファー(0.1M Glycine(pH2.5))で抗体タンパク質を溶出させ、3M Tris−HCl(pH7.4)を用いてpH7.0〜7.4の間になるよう中和した。Amicon Ultra 30(Millipore社)を用いて抗体を濃縮するとともにバッファーをPBSに置換した。
実施例2.抗LGR6モノクローナル抗体の解析
(1)ウエスタンブロッティング
実施例1.(7)で得られた6種類のハイブリドーマ細胞「Mu2C1」、「Mu2C15」、「Mu2C21」、「Mu2C22」、「Mu2C24」、「Mu2C26」が産生する抗体に関して、ウエスタンブロッティングによる解析を行った。まず、抗原であるECD2との反応性を解析した。実施例1.(3)で作製したECD2のタンパク質濃度をBradford法により測定後、1μg/mLとなるよう調製し、SDS−PAGEに供した。泳動後、トランスブロットSDセル(バイオラッド社)を用い、メーカー推奨のプロトコールに従いPVDFメンブレン(PIERCE社)にタンパク質を転写した。TBS−Tに5%(w/v)となるよう溶解したスキムミルクを用いて、室温で30分間ブロッキングを行い、TBS−Tで2回洗浄を行った。実施例1.(7)で作製した6種類のモノクローナル抗体をTBS−Tで1μg/mLに希釈し、メンブレンと1時間、室温で反応させた。TBS−Tで3回洗浄後、二次抗体として、抗マウスIgGポリクローナル抗体−HRP標識(BETHYL社製)をTBS−Tで1万倍に希釈した。メンブレンと室温で30分反応させた後、TBS−Tで3回洗浄した。メンブレンをImmobilon(Millipore社)に浸したのち、ラップしてLAS−3000(富士フィルム社)でシグナルを検出した。実験結果を図4に示した。この結果から、6種類の抗体は変性させたECD2とも反応することが示された。
(2)免疫細胞染色
実施例1.(7)で得られた6種類の抗体と、大腸癌細胞(HT−29)との反応性を解析した。以下では、ハイブリドーマ細胞が産生する抗体をそれぞれのクローン番号で記載することがある。
HT−29を80%コンフルエントとなるよう培養し、Cellmatrix Type I−A(新田ゼラチン社)でコートしたカバーガラス上へ播種した。2日間培養後、10%中性緩衝ホルマリン(WAKO社)を用いて細胞を固定した。0.3%(v/v)過酸化水素水で20分間処理した後、TBSTで3回洗浄し、5%(w/v)Skim milkを含むTBSTで処理した後、上記(7)で精製した抗体を10μg/mLとなるよう添加し、4℃、16時間反応させた。TBSTで3回洗浄した後、二次抗体として抗マウスIgGポリクローナル抗体−AlexaFluor488標識あるいは抗マウスIgMポリクローナル抗体−AlexaFluor488標識で室温30分間反応させた。TBSTで3回洗浄した後、Mounting Medium(Vector Shield社)で封入した。図5には、同一条件で蛍光強度を解析した結果を示す。Mu2C15のみ強いシグナルが観察され、細胞膜及び細胞質が染色されていると考えられた。すなわち、Mu2C15は細胞表面上のLGR6を認識することが確認された。さらに、LGR6は7回膜貫通型の膜タンパク質であることから、細胞質にみられるシグナルは、細胞膜上のLGR6がInternalizationにより細胞内部に取り込まれた結果を示していると考えられる。LGR6がInternalizationを起こすという現象は、これまでに報告がなく、初めての報告である。
(3)FACS
ヒト大腸癌細胞であるHT−29細胞を90%コンフルエントとなるよう培養した。細胞をPBSで2回洗浄した後、Cell Dissociation Buffer(Invitrogen社)でプレートより非酵素的に剥離し、1.5mLチューブに回収した。実施例1.(7)で得られたハイブリドーマ細胞のうち、Mu2C1、7、11、12、13、14、15、16、19、21、22、23、25、28、30、31の16種類に関し、それぞれの培養上清を回収して100μLずつ添加し、60分間反応させた。比較対象として、抗体を含まない培地のみを準備し、反応させた。PBS+2%FBSで2回洗浄後、AlexaFluor488標識されたGoat−Anti−mouse IgG(Invitrogen社)をPBS+2%FBSで1/1000希釈して添加し、30分間反応させた。PBS+2%PBSで2回洗浄後、Guava Flow Cytometry (Millipore社)で解析を行った。結果を図6に示す。Mu2C15及びMu2C30以外の抗体ではネガティブコントロールと同様のシグナルを示し、nativeな構造のLGR6とは反応しなかったが、Mu2C15及びMu2C30でわずかなシグナルの変化が見られた。さらに、Mu2C15に関して、抗体を精製し、抗体濃度を100μg/mLに上昇させてSW480細胞と反応させた結果を図7に示す。この場合、ネガティブコントロールと比べてシグナルの明確なシフトが観察された。すなわち、抗体が生きた細胞(生存癌細胞)と反応していることが示された。
この結果から、本発明の抗体は、生体試料、例えば血液試料中に存在する生存癌細胞の検出に有用であることが示された。
(4)抗体の可変領域の塩基配列及びアミノ酸配列の決定
実施例1.(7)で得られたハイブリドーマ細胞を培養し、Qiagen社のRNeasy Miniキットを用いて、total RNAを抽出した。抽出したtotal RNA 500ngから、SMARTer RACE cDNA Amplification Kit(Clontech)を用いて、逆転写(RT)反応を42℃で1.5時間行ってcDNAを合成し、70℃、10分間の加熱により、反応を停止させた。得られたcDNAを鋳型とし、以下のプライマーを用い、KOD PLUS ver.2(TOYOBO社)を用いたPCR反応を行なうことで、目的の遺伝子を増幅した。実施例1.(7)で得られたハイブリドーマ細胞から産生される抗体の代表例として、ハイブリドーマ細胞「Mu2C15」が産生する抗体(「Mu2C15」又は「Mu2C15抗体」とも称する)の可変領域のアミノ酸配列を下記方法を用いて決定した。
抗体のH鎖可変領域断片を増幅するために、下記プライマー(配列番号16、17及び18)を用いてPCR反応(94℃、2分間のデナチュレーションを行ない、続いて、56℃、15秒間のアニーリング、68℃、45秒間のエロンゲーションのサイクルを30サイクル)により断片を得た。
抗体のL鎖リーダー配列及び可変領域断片を増幅するために、上記プライマー(Long及びShort)並びに下記プライマー(配列番号19)を用いてPCR反応(94℃、2分間のデナチュレーションを行ない、続いて、56℃、15秒間のアニーリング、68℃、45秒間のエロンゲーションのサイクルを30サイクル)により断片を得た。
精製したPCR増幅断片を10mM dNTP Mix(インビトロジェン社)及び2×GoTaq Maxter Mix(Promega社)と混合し、70℃、15分間反応後、4℃、2分間氷冷することで、3’末端へdAを付加した。その後、pGEM−T−Easy Vector System(Promega社)を用い、いわゆるTAクローニング法によりH鎖断片及びL鎖断片をクローニングした。その後、下記プライマー(配列番号20および配列番号21)を用いて、シークエンス反応を行い、H鎖とL鎖の可変領域の配列を決定した。
Mu2C15抗体のH鎖可変領域(以下「VH」とも称する)のアミノ酸配列を配列番号23で示し、この領域をコードする塩基配列を配列番号22で示す。また、Mu2C15抗体のL鎖可変領域(以下「VL」とも称する)のアミノ酸配列を配列番号25で示し、この領域をコードする塩基配列を配列番号24で示す。
また、Mu2C15抗体の可変領域のアミノ酸配列のうち、既存の抗LGR6抗体の可変領域のアミノ酸配列と比較して特に変化が大きい(相同性が低い)領域を、当該抗体の相補性決定領域(CDR)として同定した。
同定したMu2C15抗体のCDRのアミノ酸配列を下記に示す。
また、上記VH CDR1、VH CDR2及びVH CDR3をコードする塩基配列をそれぞれ配列番号26、28及び30で示し、VL CDR1、VL CDR2及びVL CDR3をコードする塩基配列をそれぞれ配列番号32、34及び36で示す。Mu2C15抗体のVH及びVLにおける各CDRの位置を図14A及び図14Bに示す。
(5)他のLGRファミリータンパク質との結合性の検討
(5−1)LGRファミリータンパク質の相同性解析
実施例1(7)で得られたハイブリドーマ細胞から産生される抗体の代表例としてMu2C15抗体を用いて、LGRファミリーに属するLGR6以外の分子との結合性について解析を行った。ヒトLGR6の細胞外ドメインと相同性を示すタンパク質としては、ヒトLGR4及びヒトLGR5が挙げられる。実施例1(3)及び(4)記載のECD2と相同性を示すヒトLGR4のアミノ酸配列を配列番号39、ヒトLGR5のアミノ酸配列を配列番号41で示した。
ヒトLGR4の第311番目から第577番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列:(配列番号39)
ヒトLGR5の第319番目から第563番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列:(配列番号41)
これらのアミノ酸配列とヒトLGR6のECD2のアミノ酸配列との相同性を解析した結果、類似性(similarity)はLGR6とLGR4との間で78%、LGR6とLGR5との間で83%であり、同一性(identity)はLGR6とLGR4との間で42%、LGR6とLGR5との間で51%であった(図1)。
ヒトLGR4の第311番目から第577番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列:(配列番号39)
ヒトLGR5の第319番目から第563番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列:(配列番号41)
(5−2)LGRファミリータンパク質の部分タンパク質遺伝子のクローニング
HT−29細胞を培養し、実施例1(2)記載の方法でRNAを抽出し、cDNAを合成後、下記プライマーを用いてLGR4のアミノ酸第311番目から第577番目をコードする塩基配列(配列番号38)を含むDNAを増幅した。
プライマー配列
PCR反応は、95℃、10分間のプレインキュベーションを行ない、次に95℃、15秒間のデナチュレーション、および58℃、1分間のアニーリング/エロンゲーションのサイクルを40サイクル行い、遺伝子断片を増幅した。
得られた増幅断片は、プライマー上に配置した制限酵素サイトにおいて、制限酵素(Hind III及びEcoRI)で切断し、pET32bベクター(Invitrogen社)へ組み込んだ。これにより、N末端側にTrx−、S−及びHis−Tagを持ち、C末端側にHis−Tagを持つLGR4の部分タンパク質をコードする塩基配列を含むDNAを得た。
LGR5のアミノ酸第319番目から第563番目をコードする塩基配列(配列番号40)は、化学合成(株式会社医学生物学研究所)によって作製した後、この塩基配列の外側に設計した制限酵素サイトにおいて、制限酵素(BamHI及びEcoRI)で切断し、pET32aベクター(Invitrogen社)へ組み込んだ。これにより、N末端側にTrx−、S−及びHis−Tagを持ち、C末端側にHis−Tagを持つLGR5の部分タンパク質をコードする塩基配列を含むDNAを得た。
(5−3)LGR4及びLGR5部分タンパク質との結合性の検討
実施例1.(2)記載のLGR6の部分タンパク質をコードする塩基配列を含むベクター、及び上記(5−2)で作製したLGR4及びLGR5の部分タンパク質をコードする塩基配列を含むベクターそれぞれでBL21(DE3)を形質転換した。また、pET32bベクターでBL21(DE)を同様に形質転換した。実施例1.(3)記載の方法により発現誘導を行った後、細胞培養液20μlに対して5μlとなるよう、5 x Loading Buffer(10%SDS、10mM Dithiotheritol、20%Glycorol、200mM Tris−HCl(pH6.8)、0.05%Bromophenolblue)を添加し、95℃で5分間加熱した後に、SDS−PAGEに供した(図15a)。
泳動後、PVDFメンブレンにタンパク質を転写し、TBS−Tに5%(w/v)となるよう溶解したスキムミルクを用いて、室温で30分間ブロッキングを行い、TBS−Tで2回洗浄を行った。実施例1.(7)で作製したモノクローナル抗体の中から、Mu2C15をTBS−Tで1μg/mLに希釈し、メンブレンと1時間、室温で反応させた。TBS−Tで3回洗浄後、二次抗体として、抗マウスIgGポリクローナル抗体−HRP標識をTBS−Tで10万倍に希釈した。メンブレンと室温で30分反応させた後、TBS−Tで3回洗浄した。メンブレンをImmobilon(登録商標)に浸したのち、ラップしてLAS−3000でシグナルを検出した(図15b)
この結果から、Mu2C15抗体はLGR6の部分タンパク質には反応するが、LGR4及びLGR5の部分タンパク質とは反応しないことが示された。
実施例3.臨床組織サンプルの解析
(1)大腸癌組織を用いた免疫組織染色
Mu2C15と大腸癌組織との反応性を解析することで、LGR6の大腸癌における発現割合を解析した。今回、ヒト大腸癌組織アレイスライド(CDA3;SuperBiochips社)を用いて解析した。
大腸癌組織アレイスライドをキシレンに5分間浸す操作を3回繰り返して脱パラフィンを行った後、100%エタノールに5分浸すことを2回繰り返し、90%エタノール、80%エタノールにそれぞれ5分浸した後、流水下で2分間浸すことでサンプルの水和を行った。スライドを10mM クエン酸緩衝液(pH6.0)に浸し、600Wのマイクロウエーブで5分間処理する操作を3回繰り返すことで、抗原の賦活化を行った。メタノールで希釈した3%過酸化水溶液で10分間処理することで、内在性のペルオキシダーゼ活性を失活させた。この後の検出に関しては、ヒストファイン(M)キット(ニチレイ社)を用い、添付のプロトコールに従って、ブロッキング、二次抗体反応、洗浄、検出反応を行った。一次抗体反応は、Mu2C15を5あるいは10μg/mLとなるようTBS−Tに希釈して室温で1時間反応させた。発色は、ImpactDAB(VectorLaboratories社)を用いて、室温で5分間反応させることにより行った。反応後のスライドを流水洗浄後、ヘマトキシリン(Merck社)を用いて対比染色した後、封入した。組織染色の結果を図8Aに示した。
免疫組織染色における染色度合を、強陽性(Strong)、陽性(Moderate)、弱陽性(Weak)、陰性(Negative)で分類し、Mu2C15の免疫組織染色結果を統計解析した結果を図8Bに示した。
正常の大腸粘膜では、測定に用いた組織サンプルのうち約半数がほとんど染色されず、また残りに関しても弱い染色のみ見られた。これに対し、大腸癌組織においては、強陽性に染色される組織が進行ステージIから見られ、ステージIIのサンプルでは、測定に用いたサンプルの90%以上が強陽性を示すことが明らかになった。このことから、LGR6は、大腸癌の初期のステージから発現しており、測定に用いた大腸癌組織サンプルの90%以上で陽性又は強陽性を示すこと、及びMu2C15抗体を用いてその発現を高感度に検出できることが示された。
(2)乳癌組織を用いた免疫組織染色
Mu2C15と乳癌組織との反応性を解析することで、LGR6の乳癌における発現割合を解析した。解析には、ヒト乳癌組織アレイスライド(FDA808b;USBiomax社、BC081120;USBiomax社、及びCBA4;SuperBiochips社)を用いた。
免疫染色は上記実施例3.(1)記載の方法と同様に行った。実験の結果を図9に示した。
正常組織では全く染色されないか、腺細胞が陽性になる場合があった。これに対し、乳癌組織においては、強陽性に染色される組織が進行ステージIから見られ、測定に用いたサンプルの80%以上が強陽性又は陽性を示すことが明らかになった。このことから、LGR6は乳癌の初期のステージから発現しており、測定に用いた乳癌組織サンプルの90%以上で陽性及び強陽性を示すこと、及びMu2C15抗体を用いてその発現を高感度に検出できることが示された。
これらの結果から、LGR6は、少なくとも大腸癌及び乳癌の両方で、癌の診断に利用することができるマーカーであることが示された。また、本発明の抗体は、少なくとも大腸癌及び乳癌の検出及び診断に有用であることが示された。
(3)HercepTestIIとの対比
Her2の発現は、既存の分子標的薬であるハーセプチンの治療を行うかどうかを判断する指標になっている。Her2陽性患者は、乳癌患者全体の15−20%に過ぎないとされている。Her2検査は、浸潤性のある乳癌の場合に行われる。Her2の発現を同定する方法としては、複数のメーカーから体外診断薬が販売されている。そこで、HercepTest II(DAKO社)を用いて、上記実施例3.(2)と同じ組織アレイスライドを用い、Her2陽性率を解析し、LGR6陽性率と比較した。
ステージの異なる乳癌組織を免疫染色した結果を図10Aに示す。また、Her2陽性率及びLGR6陽性率を解析した結果を、それぞれ図10B及び図10Cに示す。
HercepTest IIでは、測定に用いたサンプルのうち、強陽性(3+)及び陽性(2+)で検出される割合が13%であったのに対し(図10B、下のグラフ)、抗LGR6抗体を用いた検出では78%であった(図10C、下のグラフ)。さらに、ステージ毎の発現を解析したところ、ステージIの症例では、HercepTest IIでは7.1%しか検出できなかったのに対し(図10B、上のグラフ)、抗LGR6抗体を用いた場合は90%以上を検出することができた(図10C、上のグラフ)。
これらの結果から、本発明の抗体を用いることにより、ステージIの段階で乳癌を高感度に検出することができることが示され、当該抗体を含む本発明の試薬は、早期の乳癌の検出に極めて有効であることが示された。
また、本発明の抗体を用いることにより、乳癌の悪性度を評価できることが示された。
LGR6の細胞外ドメインと結合するモノクローナル抗体としては、クローン番号2A3(Abcam)で示される抗体が公知である。Mu2C15と2A3との力価を、大腸癌組織を用いて比較した。
免疫染色は上記実施例3.(1)記載の方法と同様に行い、抗体濃度を5μg/mLとなるよう調製して行った。実験の結果を図11に示した。
2症例の大腸癌組織において、Mu2C15を用いた場合には明確な染色が見られたのに対し、2A3を用いた場合には全く染色が見られなかった。
この結果より、本発明の抗体は、既存のLGR6細胞外ドメインと結合するモノクローナル抗体よりも親和性が高く、高感度に癌を検出できることが示された。
実施例4.LGR6検出系の構築
EGFRなど、膜タンパク質の一部は、細胞外ドメインが血液中に放出されることが知られている(Molecular Cancer,Vol.9,166,2010)。同様に、LGR6についても、血液中のLGR6細胞外ドメイン部分を検出することで、癌診断が可能であると予測される。さらに、便からLGR6タンパク質を変性させた状態で抽出し、検出することも想定される。そこで、実施例1.(7)で得られた6種類のハイブリドーマ細胞が産生するモノクローナル抗体を利用して、サンドイッチELISAによってLGR6の細胞外ドメインを高感度に検出する方法の構築を行った。
まず、モノクローナル抗体をBiotin Labeling Kit−NH2(同仁化学社)を用い、添付の手法に従ってビオチン標識した。次に、標識を行っていないモノクローナル抗体を96ウエルのELISAプレート(Nunc社)に1ウエル当たり500ngとなるよう分注し、4℃で一晩放置することでプレート表面に結合させた。次に、0.05%Tween20を含むPBS(−)(以下、PBS−Tと記載する)350μLで3回洗浄した後、1%スキムミルクを含むPBS−Tを300μLずつ各ウエルに分注し、1時間、室温でブロッキングした。PBS−Tで洗浄後、ECD2が50ng/mLとなるよう添加し、1時間、室温で反応させた。350μLで3回洗浄した後、0.5mg/mLとなるよう調製したビオチン化抗体を添加し、1時間、室温で反応させた。350μLで3回洗浄した後、ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン(Vector Labs社)をTBS−Tで5000倍希釈したものを100μL添加し、1時間、室温で反応させた。その後の検出は、実施例1.(6)と同様の方法で行った。実験結果を図12に示した。
実験の結果、Mu2C15を固相化し、Mu2C21又はMu2C22をビオチン標識した抗体で検出することで、バックグラウンドが低く、かつECD2を高感度に検出できることが示された。
さらに、これらの組み合わせを用いて、ECD2の検出限界(臨界値)を解析した。
その実験結果を図13に示した。この結果、およそ20ng/mLを越える濃度であれば検出可能であることが示された。
この結果から、本発明の抗体を用いることにより、生体試料、例えば血液試料、糞便等から癌を高精度かつ高感度で検出することができることが示された。
本発明により、従来の抗体に比べて癌を高感度で検出することができる。
配列番号7−12:合成ペプチド
配列番号13−21:合成DNA
配列番号22:合成DNA
配列番号23:合成ペプチド
配列番号24:合成DNA
配列番号25:合成ペプチド
配列番号26:合成DNA
配列番号27:合成ペプチド
配列番号28:合成DNA
配列番号29:合成ペプチド
配列番号30:合成DNA
配列番号31:合成ペプチド
配列番号32:合成DNA
配列番号33:合成ペプチド
配列番号34:合成DNA
配列番号35:合成ペプチド
配列番号36:合成DNA
配列番号37:合成ペプチド
配列番号38:合成DNA
配列番号39:合成ペプチド
配列番号40:合成DNA
配列番号41:合成ペプチド
配列番号42及び43:合成DNA
[配列表]
配列番号13−21:合成DNA
配列番号22:合成DNA
配列番号23:合成ペプチド
配列番号24:合成DNA
配列番号25:合成ペプチド
配列番号26:合成DNA
配列番号27:合成ペプチド
配列番号28:合成DNA
配列番号29:合成ペプチド
配列番号30:合成DNA
配列番号31:合成ペプチド
配列番号32:合成DNA
配列番号33:合成ペプチド
配列番号34:合成DNA
配列番号35:合成ペプチド
配列番号36:合成DNA
配列番号37:合成ペプチド
配列番号38:合成DNA
配列番号39:合成ペプチド
配列番号40:合成DNA
配列番号41:合成ペプチド
配列番号42及び43:合成DNA
[配列表]
Claims (10)
- ロイシンリッチリピート含有Gタンパク質共役型受容体−6(LGR6)に対するモノクローナル抗体又はその断片を含む、癌の検出用又は診断用試薬。
- 前記抗体又はその断片がロイシンリッチリピート含有Gタンパク質共役型受容体−6(LGR6)の細胞外領域に結合するものである、請求項1に記載の試薬。
- 前記細胞外領域が配列番号7、8、9又は10で示されるアミノ酸配列を含むものである、請求項2に記載の試薬。
- 癌が、大腸癌、乳癌、子宮癌、胃癌、甲状腺癌、膵癌、脳腫瘍、頚癌、食道癌、舌癌、肺癌、小腸の癌、十二指腸癌、膀胱癌、腎癌、肝癌、前立腺癌、子宮頸癌、卵巣癌、胆嚢癌、咽頭癌、肉腫、メラノーマ、白血病、リンパ腫及び多発性骨髄腫からなる群から選ばれる少なくとも1種である、請求項1に記載の試薬。
- 癌が、大腸癌、乳癌、子宮癌、胃癌、甲状腺癌、膵癌及び白血病からなる群から選ばれる少なくとも1種である、請求項1に記載の試薬。
- 癌が大腸癌又は乳癌である、請求項1に記載の試薬。
- ロイシンリッチリピート含有Gタンパク質共役型受容体−6(LGR6)に対するモノクローナル抗体又はその断片と、被験者から採取された生体試料とを接触させ、前記試料におけるLGR6を検出する工程を含む、癌の検出方法。
- ロイシンリッチリピート含有Gタンパク質共役型受容体−6(LGR6)に対するモノクローナル抗体又はその断片を含む、癌の検出用キット。
- ロイシンリッチリピート含有Gタンパク質共役型受容体−6(LGR6)に対するモノクローナル抗体又はその断片と、被験者から採取された生体試料とを接触させ、前記試料におけるLGR6を検出する工程を含む、癌の診断方法。
- 癌の検出又は診断において使用するためのロイシンリッチリピート含有Gタンパク質共役型受容体−6(LGR6)に対するモノクローナル抗体又はその断片。
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