JP3939391B2 - 細胞除去方法 - Google Patents
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【発明の属する技術分野】
本発明は、白血球浮遊液から白血球を除去し、かつその中でも特定の白血球サブセットをより高率に除去する細胞除去器及び細胞除去方法と該方法により得られた輸血用血液に関する。
【0002】
【従来の技術】
遺伝子工学の進歩に伴い、バイオリガンド、たとえばモノクローナル抗体、接着分子等(以下、抗体と略す)の入手が容易になったことから、これらを固定した器具を用いて病因細胞を除去して疾病の治療あるいは予防を行うことが盛んに検討されている。従来、抗体を利用した細胞除去器は抗体の特異性の高さという特長が利用されている。即ち、抗体がターゲットとする細胞のみを高率に除去し、それ以外は可及的高率に回収したい場合に用いられている。
特開平6−154316では、自己免疫疾患治療の為の、抗CD4抗体における可変領域を構成しているアミノ酸配列を有するペプチドを固定した不織布によるCD4陽性細胞捕集材が開示されている。本法ではCD4陽性Tリンパ球(ヘルパーTリンパ球)のみの除去が技術課題であって、その他の白血球、即ち、ヘルパーTリンパ球以外のTリンパ球(例えばCD8陽性Tリンパ球=サプレッサー/細胞傷害性Tリンパ球)や、Bリンパ球、NK細胞、顆粒球は除去せずに高率に回収する必要があるため、抗体が利用されている。
また、抗Tリンパ球抗体固定フラスコに、レクチン固定フラスコでの前処理粗分離を行った細胞集団を導入し、骨髄移植の重篤な合併症である移植片対宿主病の原因とされるTリンパ球を除去する方法が報告されている(Tricot,et al:Seminars in Hematology,1992)。本法においてレクチン固定フラスコの前処理粗分離の目的は、Tリンパ球を含む成熟細胞(他にはBリンパ球、顆粒球、単球)を非特異的に除去させて後続の抗Tリンパ球抗体固定フラスコの負担を減少(結果的に必要器具数の減少)しようというものであり、骨髄移植の際に用いられるため、白血球の1種である造血幹細胞及び/または造血前駆細胞(以下造血幹細胞と総称する)を可及的高率に回収する必要があり、白血球全てを除去する目的ではない。
特開平8−10321では抗体固定器具による目的細胞の分離の前処理として、ナイロンウールによる単球除去が開示されている。しかしながら、本法の目的は抗体固定器具による分離の際に妨害(粘着性の高い単球の非特異的粘着による細胞結合表面の被覆)する単球の除去のみを目的としたものであり、単球以外の白血球は除去対象になっていない。特に、前述のレクチン固定フラスコの例と同様、造血幹細胞の除去率を可及的に低くすることが必須であり、白血球全体を除去する目的とは全く異なる技術である。
【0003】
ところで、白血球全体を除去する方法としては、不織布や多孔質体からなる白血球除去フィルターが種々製品化されており、輸血現場で汎用されている。近年、これらフィルターは高性能化が進み、白血球除去率は上昇の一途をたどっている。これら白血球除去率向上の検討は白血球粘着の観点から、即ち不織布枚数増、不織布の小繊維径化で行われており、粘着性の弱い白血球、例えばTリンパ球はこれらによっても捕捉されずに漏れ出てしまうため、高率除去は困難であった。特公平7−20872では白血球の除去率を向上させるために、平均繊維径の異なる複数のフィルター要素を組み合わせることが開示されている。しかしながら、これも総白血球数の除去率向上を技術課題としたものであり、総白血球数の減少に加え、その中の特定の白血球サブセットをより高率に除去するという発想は全くない。実際、実施例ではチュルク法による総白血球数のみが測定されており、総白血球数の除去率は高いものの、粘着性の低いTリンパ球をフローサイトメトリー法で測定した場合、除去率は総白血球除去率よりはるかに低いことが予想される。
以上のように、抗体を利用した従来の細胞除去器では抗体はその特異性の高さという特長が利用され、抗体がターゲットとする細胞以外は可及的高率に回収したい場合にのみ用いられており、また、不織布等を利用した従来の白血球除去フィルターでは総白血球数の減少のみが注目されていた。即ち、総白血球数の減少に加え、更にその中の特定の白血球サブセットをより高率に除去する方法は存在しなかった。現在、輸血副作用は1)移植片対宿主病(GVHD)のように特定白血球サブセットのみが関与しているものと、2)ウイルス感染、非溶血性発熱のように白血球全体が関与しているものがある。前述の、抗体を利用した細胞除去器は1)を予防することは可能であるが、抗体がターゲットとする白血球サブセット以外の白血球は漏出しやすいので、2)の予防は不可能であり、また、不織布等を利用した従来の白血球除去フィルターでは2)は予防できるものの、1)の予防は不完全である。
【0004】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は血液中の白血球を高率に除去し、かつその中でも特定の白血球サブセットをより高率に除去する細胞除去器、細胞除去方法及び該方法により得られた輸血用血液を提供することにある。より具体的には特定白血球サブセットに起因する副作用と、白血球全体が関与する副作用を同時に予防できる細胞除去器、細胞除去方法及び輸血用血液を提供することにある。
【0005】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは従来技術の有する問題点を解決すべく鋭意検討した結果、白血球除去手段により、白血球全体を除去することにより、白血球全体が関与している輸血副作用を防止し、それでもまだ残っている微量の白血球サブセットを白血球サブセット除去手段により徹底的に除去することにより、上記問題点がほぼ完全に解決できることを見出し、本発明を完成させたものである。即ち、本発明は白血球浮遊液から白血球を除去し、かつその中でもリンパ球をより高率に除去する方法であって、除去対象リンパ球に対する抗体が固定されている不織布状のリンパ球除去手段と、該リンパ球除去手段の上流に位置する、白血球中のリンパ球に対する抗体が固定されていない不織布状の白血球除去手段とが同一容器内に収納されている細胞除去器の入口側から白血球浮遊液を通液することにより、該細胞除去器の出口側から、総白血球数が1μl当たり10個以下で、かつリンパ球数aと総白血球数bの比がa / b<0.8である輸血用血液を得ることを特徴とする細胞除去方法である。
【0006】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を更に詳細に説明する。本発明で言う白血球浮遊液とは末梢血、リンパ液、骨髄液、臍帯血、あるいはこれらに何らかの処理を施した白血球を含む液体である。また、本発明で言う特定の白血球サブセットとは白血球集団を構成する細胞の一部(複数を含む)のことであり、具体的には以下があげられるが、これに限定されるものではない。リンパ球、Tリンパ球、ヘルパーTリンパ球、サプレッサーTリンパ球、細胞傷害性Tリンパ球、活性化Tリンパ球、Bリンパ球、NK細胞、顆粒球、好塩基球、好中球、好酸球、単球、造血幹細胞、造血前駆細胞、白血病細胞。除去対象白血球サブセツトに対する抗体とはたとえば以下があげられるが、これに限定されるものではない。抗CD2抗体、抗CD3抗体、抗CD4抗体、抗CD5抗体、抗CD6抗体、抗CD7抗体、抗CD8抗体、抗CD10抗体、抗CD16抗体、抗CD19抗体、抗CD20抗体、抗CD22抗体、抗CD23抗体、抗CD25抗体、抗CD33抗体、抗CD34抗体、抗CD38抗体、抗CD45抗体、抗CD45RA抗体、抗CD45RO抗体、抗CD56抗体、抗CD62L抗体、抗CD69抗体、抗IL2R抗体、抗IL4R抗体、抗IL6R抗体。これらの抗体は、例えば除去対象白血球サブセツトがTリンパ球全体である場合には抗CD2抗体、抗CD3抗体、抗CD5抗体、抗CD7抗体を、Tリンパ球の一部であるヘルパーTリンパ球あるいはサブレッサーTリンパ球/細胞傷害性Tリンパ球である場合にはそれぞれ抗CD4抗体、抗CD8抗体を、白血病細胞に対しては抗CD10抗体を、というように除去対象によって適宜選択して用いる。なお、本発明で言う抗体とは抗体全分子だけでなく、抗原結合部位を含む断片、可変領域を構成するアミノ酸配列からなるペプチド、可変領域以外の部分をヒト型化したいわゆるキメラ抗体なども含まれる。
【0007】
本発明で言う、除去対象白血球サブセットに対する抗体が固定されている白血球サブセット除去手段とは、前述の抗体(複数を含む)が水不溶性抗体に固定され、容器に充填されたものである。ここで、水不溶性担体としてはいかなる材質も使用可能であるが、成型性、滅菌性や細胞毒性が低いという点で好ましいものを列記すると、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、アクリル樹脂、ナイロン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリアクリルアミド、ポリウレタン等の合成高分子、アガロース、セルロース、酢酸セルロース、キチン、キトサン、アルギン酸塩等の天然高分子、ハイドロキシアパタイト、ガラス、アルミナ、チタニア等の無機材料、ステンレス、チタン等の金属材料があげられる。担体の形状としては、粒状、綿状、織布、不織布、スポンジ状多孔質体、平板があげられるが、体積当たりの表面積が大きいという点で粒状、綿状、織布、不織布、スポンジ状多孔質体が好ましい。中でも、血液の通液性、除去効率、充填の容易さという点から不織布が特に好ましい。不織布の繊維径としては0.3〜50μm程度のものが通常用いられるが、血液の通液性、除去効率の観点から1〜20μmが好ましく、更に、1〜5μmがより好ましい。これらの担体への抗体固定は公知のパンニング法、即ち抗体溶液と担体を数時間接触することで物理吸着により達成することもできるが、より強固に、化学結合により固定したい場合には特開平2−261833で提案されているハロアセトアミド活性化法、特開平3−505287に例示されている、ハロゲン化シアン活性化法、エピクロルヒドリン活性化法、ポリオキシシラン活性化法等、公知の方法を適宜選択すれば良い。
本発明で言う白血球中の特定サブセットに対する抗体が固定されていない白血球除去手段とは、前述の抗体が固定されていない水不溶性担体が容器に充填されているものを言う。ここで、水不溶性担体としてはいかなる材質も使用可能であるが、成型性、滅菌性や細胞毒性が低いという点で好ましいものを列記すると、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、アクリル樹脂、ナイロン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリアクリルアミド、ポリウレタン等の合成高分子、アガロース、セルロース、酢酸セルロース、キチン、キトサン、アルギン酸塩等の天然高分子、ハイドロキシアパタイト、ガラス、アルミナ、チタニア等の無機材料、ステンレス、チタン等の金属材料があげられる。担体の形状としては、粒状、綿状、織布、不織布、スポンジ状多孔質体、平板があげられるが、体積当たりの表面積が大きいという点で粒状、綿状、織布、不織布、スポンジ状多孔質体が好ましい。中でも、血液の通液性、除去効率、充填の容易さという点から不織布が特に好ましい。不織布の繊維径としては0.3〜20μm程度のものが通常用いられるが、血液の通液性、除去効率の観点から1〜5μmが好ましく、更に、1〜2μmがより好ましい。また、これらの水不溶性担体は血液の通液性向上の為WO87/05812で開示されている非イオン性親水基と塩基性含窒素官能基を有するポリマーをコートして用いることがより好ましい。また、前述の白血球サブセット除去手段と白血球除去手段はそれぞれ別の容器に入れることもできるが、同一の容器に収納する方が、コンパクト化、白血球以外の成分の回収率、容器部材削減という点でより好ましい。
本発明で言う、白血球浮遊液には末梢血、骨髄、臍帯血及びこれらを遠心分離器により粗分離し、必要に応じ保存剤等を添加したもの(例:「MAP−CRC」、「PC」)が含まれるが、血小板製剤を用いる場合には、白血球サブセット除去手段、白血球除去手段等に血小板通過性の向上の為の何らかの表面改質をすることが好ましい。表面改質の方法としては、WO87/05812で提案されている非イオン性親水基と塩基性含窒素官能基を有するポリマーコート等、公知の表面改質法が採用できる。
【0008】
本発明による細胞除去方法では、白血球浮遊液を先ず白血球全体の細胞数を減少する手段に通液する。ここで用いられる白血球全体の細胞数を減少する手段とは、例えば、不織布や多孔質体が除去材として用いられている白血球除去フィルターや遠心型血球分離装置があげられるが、操作の簡便さという点で白血球除去フィルターが好ましい。ここでは、白血球全体が特定のサブセットに限定されることなくまんべんなく除去される。但し、夫々の除去手段の特性により、一部のサブセットの除去率が若干高い傾向を示す場合がある(例えば、単球は粘着性が高いので白血球除去フィルターでは除去率がリンパ球と比べ、若干高くなる傾向がある)が、これは「後述する特定の白血球サブセットの細胞数を選択的に減少させる手段」とは呼ばない。白血球全体の細胞数が減少した白血球浮遊液は、次に特定の白血球サブセットの細胞数を選択的に減少させる手段に通液する。ここで用いられる特定の白血球サブセットの細胞数を選択的に減少させる手段は、除去対象白血球サブセットに対する抗体が固定された除去材を予め容器に充填したフィルターや、ビーズや繊維からなる除去材を白血球浮遊液の入ったコニカルチューブに投入するいわゆるバッチ法があげられるが、操作の簡便さという点でフィルター法が好ましい。
本発明による白血球数を減少させた輸血用血液は、総白血球数が1μl当たり10個以下で、かつTリンパ球数aと総白血球数bの比がa/b<0.8である。より好ましくはa/b<0.5であり、更により好ましくはa/b<0.1である。
本発明による細胞除去器は、輸血におけるGVHDの予防、白血病患者、担癌患者等の自己血輸血における腫瘍細胞の除去等に好適に用いられることが期待できるが、これらの用途に限定されるものではない。
【0009】
【実施例】
以下に、本発明の実施例を比較例と共に示すが、本発明はこれに限定されるものではない。
【実施例1】
▲1▼細胞除去器の作製
容器寸法41×41×18mmで液体流出口と液体流入口を対角線上に持つポリカーボネート製角型容器に、寸法30×30mmの不織布を入口側から順に表1の構成となるように充填した。ここで用いた各不織布の目付は繊維径12μmポリエステル不織布100g/m2、同1.7μmが66g/m2、同1.2μmが40g/m2、繊維径1.8μmポリプロピレン不織布が60g/m2であり、充填密度は0.20g/cm3であった。本細胞除去器は白血球、中でもTリンパ球を特に高率に除去するために設計されており、ラット抗ヒト抗CD2モノクローナル抗体(コールター社製、クローン名39C1.5。以下CD2抗体と略す)を選択した。抗体固定不織布は特開平2−261833で提案されている公知のハロアセトアミド活性化法を用いて作製した。即ち、ポリプロピレン不織布を活性化する目的で、スルホラン165mlにヒドロキシメチルヨードアセトアミド3.6gとトリフルオロメタンスルホン酸25gを添加した反応液に前述のポリプロピレン不織布(予め前述の寸法にカットしてある)を室温で5時間含浸、反応させた。次にこの活性化済み不織布に抗体を固定する目的で、ダルベッコリン酸塩緩衝液(以下D−PBS)で20μg/ml濃度に調製したCD2抗体溶液10mlに活性化済み不織布を2時間含浸し、D−PBSで洗浄後、真空乾燥して抗体固定不織布とした。
▲2▼細胞除去操作
ヒト新鮮末梢全血(抗凝固剤ACD−A)40mlを入れた血液バッグを▲1▼の細胞除去器の入口側に、途中にローラークランプとドリップチャンバーを有するチューブで接続した。細胞除去器の出口側には細胞採取用血液バッグをチューブで接続した。ローラークランプを調節し、流速5g/分の落差処理で細胞除去器に血液を通液した。血液は、フィルター内の入口側の抗体未固定不織布にて、白血球全体の細胞数が減じられ、その後に接触するCD2抗体固定不織布により、CD2陽性細胞の細胞数が減じられ、細胞採取用血液バッグに回収される。なお、本操作に要した時間は約10分であった。
▲3▼分析
総白血球数は、細胞除去操作前は公知のチュルク法により、細胞除去操作後は公知のナジェットチャンバー法により測定した。また、白血球中のCD2陽性細胞比率は公知のFITC標識CD2抗体を用い、SSC−FITCに展開するフローサイトメトリー法にて測定した。CD2陽性細胞数は、以下の式により計算した。
CD2陽性細胞数=白血球数×CD2陽性率
▲4▼結果
処理前及び処理後の総白血球数、CD2陽性細胞数、それらから以下の式で算出した白血球除去率、CD2陽性細胞除去率を表2に示す。
除去率(%)=100−100×(処理後細胞数/処理前細胞数)
白血球全体が高率に除去され、更にCD2陽性細胞の除去率がより高いことがわかる。
【0010】
【比較例1】
▲1▼細胞除去器の作製
実施例1の細胞除去器においてCD2抗体固定不織布の代わりに抗体未固定不織布(ポリプロピレン製1.8μm)を同一表面積となるように充填した。なお、構成は表1のとおりである。充填密度は実施例1と同様の0.20g/cm3であった。
▲2▼細胞除去操作
実施例1と同様な操作を行った。
▲3▼分析
実施例1と同様な操作を行った。
▲4▼結果
実施例1と同様、結果を表2に示す。白血球全体の除去率はやや低く、CD2陽性細胞の除去率は更に低いことがわかる。
【0011】
【0012】
【0013】
【発明の効果】
以上示したように、本発明によれば血液中の白血球を高率に除去し、更にその中でも特定の白血球サブセットをより高率に除去することができる。これにより従来不可能であった、特定白血球サブセットに起因する副作用(GVHD等)と、白血球全体が関与する副作用が同時に予防できることが期待される。また、本操作は極めて短時間かつ簡便なので、臨床現場でのルーチン作業にも適している。
Claims (1)
- 白血球浮遊液から白血球を除去し、かつその中でもリンパ球をより高率に除去する方法であって、除去対象リンパ球に対する抗体が固定されている不織布状のリンパ球除去手段と、該リンパ球除去手段の上流に位置する、白血球中のリンパ球に対する抗体が固定されていない不織布状の白血球除去手段とが同一容器内に収納されている細胞除去器の入口側から白血球浮遊液を通液することにより、該細胞除去器の出口側から、総白血球数が1μ l 当たり10個以下で、かつリンパ球数aと総白血球数bの比がa / b<0.8である輸血用血液を得ることを特徴とする細胞除去方法。
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