JP4953295B2 - 特定細胞吸着器 - Google Patents
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Description
(1) 特定細胞の表面抗原と親和性を有するリガンドを繊維状の水不溶性担体に保持した特定細胞吸着材が血液入口および血液出口を有する容器の中に充填された特定細胞吸着器であって、該特定細胞吸着材の平均繊維直径が7μm以上20μm以下であり、かつ該容器に充填された特定細胞吸着材の平均繊維間距離が11μm以上38μm以下であることを特徴とする特定細胞吸着器。
(2) 前記リガンドが抗体である(1)記載の特定細胞吸着器。
(3) 前記特定細胞が白血球である(1)または(2)に記載の特定細胞吸着器。
(4) 前記白血球がリンパ球である(3)記載の特定細胞吸着器。
(5) 前記リンパ球がヘルパーT細胞である(4)記載の特定細胞吸着器。
(6) 前記特定細胞吸着材が滅菌されていることを特徴とする(1)乃至(5)の何れかに記載の特定細胞吸着器。
本発明でいう特定細胞吸着器とは、入口と出口を有する容器に水不溶性担体に特定細胞と親和性を有するリガンドを保持させた特定細胞吸着材を充填してなるものである。容器の入口から血液を導入し、特定細胞吸着材に接触させた後に出口から処理された血液を回収することによって、特定細胞が吸着除去された血液が得られる。また本発明は、血液を容器内に導入し、特定細胞吸着材に接触させた後に特定細胞吸着材に吸着された特定細胞を分離回収して、血液中から特定細胞のみを得る場合にも有用に用いられる。さらに本発明は、血液の体外循環細胞除去療法により、疾患の起因あるいは誘因となっている細胞を選択的に吸着除去する治療法としても有効に用いられる。
が優位な免疫性疾患においてはTh1細胞であり、また潰瘍性大腸炎のようなヘルパーT細胞2型(Th2型)が優位な免疫性疾患においてはTh2細胞である。
Vc=(√3/2)×(x+y)2×H・・・(1)
Vf=(π/4)×x2×H・・・(2)
ここで、繊維の比重を(ρf)とすると、カラムの充填密度(ρc)は、
ρc=(Vf × ρf)/Vc
=(π/2√3)×x2×(ρf)/(x+y)2・・・(3)
であるから、平均繊維間距離(y)は次式(4)により求められる。
y=x ×((π/2√3)1/2 ×(ρf/ρc)1/2−1)・・・(4)
不織布の場合、カラムの充填密度(ρc)は不織布の嵩密度に等しく、単位体積当りの不織布重量を指す。不織布の体積は不織布の面積に厚みをかけて算出するが、不織布の厚みとは、1.8Nの力でフィルター層を上下から挟んだときの直線距離をいい、例えばダイヤルシックネスゲージG(株式会社 尾崎製作所)等の市販の厚みゲージによって測定できる。
抗体の固定状態としては、抗体が担体表面に直接結合していてもよいし、リンカーを介して結合していてもよい。抗体の固定部位としては、固定後も抗体が細胞親和性を維持できる状態であればどのような部位であってもよいが、より安定した細胞親和力を維持する点から抗体のFc部分であることが好ましい。
<活性化不織布の作成>
ガラス製のフラスコにN−ヒドロキシメチルヨードアセトアミド0.6g、濃硫酸5.7ml及びニトロベンゼン7.2mlを加えて常温にて撹拌溶解し、更にパラホルムアルデヒド0.036gを加え、撹拌した。これにポリプロピレンからなる不織布(平均繊維直径16.9μm、目付80g/m2、厚み約0.7mm)0.3gを入れ常温にて24時間遮光反応した。24時間反応後不織布を取り出し、エタノール及び純水にて洗浄し、これを真空乾燥して活性化不織布を得た。
この活性化不織布を直径0.68cmの円に切断したもの12枚を、カルシウム、マグネシウムを含まないリン酸緩衝液(以下、「PBS(−)」と略す)に溶解した抗ヒトCD4モノクローナル抗体(以下、「抗ヒトCD4抗体」と略す)1.2ml(48μg/1.2ml)に常温で2.5時間浸し、モノクローナル抗体を固定後、PBS(−)3mlで洗浄した。次に0.2%ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート/PBS(−)溶液(以下、「Tween20溶液」と略す)を加え常温で2.5時間浸漬した後、PBS(−)3mlで洗浄し、目的の特定細胞吸着材を得た。
入口と出口を有する容積約1mlの容器に上記特定細胞吸着材(平均繊維直径16.9μm、平均繊維間距離31.4μm、目付80g/m2、厚み約0.7mm、嵩密度0.11g/cm3、単位表面積当り抗体保持量0.55pmol/cm2)10枚と、充填液として10mMアスコルビン酸PBS(−)溶液(アスコルビン酸の分子量176)を充填し、有効濾過長が約7.0mmの特定細胞吸着器を作成した。この特定細胞吸着器の物性は特定細胞吸着材と同等であった。この特定細胞吸着材に約25kGyのγ線を照射して滅菌した。
低分子ヘパリン加血液(5000IU/L)を体外循環に近い線速条件である流速0.2ml/minでシリンジポンプを用いて細胞吸着器の入口より送液し、出口から処理後の血液を回収した。血液の処理量は、平均繊維直径から算出した繊維表面積当りの血液処理量が約0.027ml/cm2となるように設定した。このときのCD4(+)細胞の吸着率とCD8(+)細胞の吸着率を、FACSCalibur(BECTON DICKINSON)を用いてフローサイトメトリー法で測定したところCD4(+)細胞の吸着率は93.4%、CD8(+)細胞の吸着率は17.2%でありCD4(+)細胞を選択的に吸着できた。この試験管スケールから血液体外循環を想定してスケールアップすると、血液処理量を3Lに設定した場合、血液と特定細胞吸着材の比を一定にして必要な特定細胞吸着材の重量を算出すると約9gとなる。この時の特定細胞吸着材の容積(ml)を、特定細胞吸着材の重量(g)、目付け(g/m2)、厚み(mm)を用いて次式(5)から算出される。
特定細胞吸着材の容積=特定細胞吸着材の重量/目付け×厚み×1000・・・(5)
これより算出された特定細胞吸着材の容積は約354mlであった。
平均繊維直径が7.0μm、平均繊維間距離が11.0μm、目付80g/m2、厚み約0.7mm、嵩密度0.12g/cm3、単位表面積当り抗体保持量0.47pmol/cm2の不織布を10枚充填し、有効濾過長が約7.0mmの特定細胞吸着材を用いた以外は、実施例1と同じ方法で実施した。その結果、CD4(+)細胞の吸着率は98.6%、CD8(+)細胞の吸着率は36.3%でありCD4(+)細胞を選択的に吸着できた。またこの時の特定細胞吸着材を用いて実施例1と同様に血液体外循環を想定してスケールアップした場合、特定細胞吸着材の容積は136mlであった。
平均繊維直径が3.8μm、平均繊維間距離が5.4μm、目付80g/m2、厚み約0.6mm、嵩密度0.14g/cm3、単位表面積当り抗体保持量0.58pmol/cm2の不織布を12枚充填し、有効濾過長が約7.2mmの特定細胞吸着材を用いた以外は、実施例1と同じ方法で実施した。その結果、CD4(+)細胞の吸着率は99.9%、CD8(+)細胞の吸着率は71.6%でありCD4(+)細胞を選択的に吸着できなかった。またこの時の特定細胞吸着材を用いて実施例1と同様に血液体外循環を想定してスケールアップした場合、特定細胞吸着材の容積は65mlであった。
平均繊維直径が20.0μm、平均繊維間距離が38.0μm、目付80g/m2、厚み約0.7mm、嵩密度0.10g/cm3、単位表面積当り抗体保持量0.38pmol/cm2の不織布を10枚充填し、有効濾過長が約7.0mmの特定細胞吸着材を用いた以外は、実施例1と同じ方法で実施した。その結果、CD4(+)細胞の吸着率は72.3%、CD8(+)細胞の吸着率は22.0%でありCD4(+)細胞を選択的に吸着できた。またこの時の特定細胞吸着材を用いて実施例1と同様に血液体外循環を想定してスケールアップした場合、特定細胞吸着材の容積は480mlであった。
[比較例2]
平均繊維直径が7.0μm、平均繊維間距離が8.4μm、目付80g/m2、厚み約0.7mm、嵩密度0.17g/cm3、単位表面積当り抗体保持量0.40pmol/cm2の不織布を10枚充填し、有効濾過長が約7.0mmの特定細胞吸着材を用いた以外は、実施例1と同じ方法で実施した。その結果、CD4(+)細胞の吸着率は95.9%、CD8(+)細胞の吸着率は84.0%でありCD4(+)細胞を選択的に吸着できなかった。またこの時の特定細胞吸着材を用いて実施例1と同様に血液体外循環を想定してスケールアップした場合、特定細胞吸着材の容積は99mlであった。
H・・・カラムの高さ
x・・・平均繊維直径
y・・・平均繊維間距離
Claims (6)
- 特定細胞の表面抗原と親和性を有するリガンドを繊維状の水不溶性担体に保持した特定細胞吸着材が血液入口および血液出口を有する容器の中に充填された特定細胞吸着器であって、該特定細胞吸着材の平均繊維直径が7μm以上20μm以下であり、かつ該容器に充填された特定細胞吸着材の平均繊維間距離が11μm以上38μm以下であることを特徴とする特定細胞吸着器。
- 前記リガンドが抗体である請求項1記載の特定細胞吸着器。
- 前記特定細胞が白血球である請求項1または2に記載の特定細胞吸着器。
- 前記白血球がリンパ球である請求項3記載の特定細胞吸着器。
- 前記リンパ球がヘルパーT細胞である請求項4記載の特定細胞吸着器。
- 前記特定細胞吸着材が滅菌されていることを特徴とする請求項1乃至5の何れかに記載の特定細胞吸着器。
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