JPH0975450A - 細胞選択フィルターおよび細胞分離方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 白血球含有液等の多細胞浮遊液中の特定細胞
を、選択採取或いは選択除去するためのフィルターと、
該フィルターを使用した細胞分離方法を提供する。 【解決手段】 細胞表面蛋白と相補的なアミノ酸配列か
らなるリガンドが、共有結合により、繊維構造体表面の
カルボニル炭素のα位またはβ位に置換され、該繊維構
造体の単位空隙容積が４．０×１０^-4ｃｍ³ ／ｃｍ² 以
上４．０×１０^-3ｃｍ³ ／ｃｍ² 未満である細胞選択フ
ィルター。上記フィルターを内蔵し、容量１ｍｌ以上３
５０ｍｌ以下の、入口と出口を備えた細胞選択フィルタ
ー装置に白血球含有液を通液させる細胞分離方法 【効果】 本発明によれば、リガンドが簡便に、安定
に、且つ高密度で大量に固定されているので、三次元的
環境下で目的細胞を効率的に分離できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、特定細胞のみに対して
相補的なリガンドを用いて細胞分離を行うフィルターお
よび、細胞分離方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】近年、輸血学の進歩に伴い血液製剤中に
混入している白血球が原因でＧＶＨＤ等の輸血後副作用
が誘発されることが明らかになり、白血球をいかに高率
除去するかが重要な課題である。また、治療分野におい
ても、リウマチ等の自己免疫疾患から、白血球および顆
粒球を除去することで症状改善を認めている。更に、免
疫学、細胞生物学、血液学の分野ではＴ／Ｂ細胞分離を
はじめとして、モノクローナル抗体を用いた細胞分離技
術が報告されている。その一例として、自家骨髄移植の
ための造血幹細胞および／または造血前駆細胞の選択的
採取に現在用いられている細胞分離器具としては、抗体
結合フラスコ、磁気ビーズ、アビジン−ビオチンカラム
（Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，
ＡｌｐｈＭｅｄ Ｐｒｅｓｓ，１９９４，１８６−１８
７）があるが、これらは細胞を採取できる表面積が小さ
く、抗体（リガンド）を３次元的に配置できず多点的結
合が困難なため、採取された細胞の回収率および純度と
もに十分なものではなかった。特開平１−２７９９０８
号、特開平２−２６１８３３号にはアセトアミド基を有
する芳香族ビニル重合体、即ち表面のカルボニル炭素の
α位に置換されたものが記載されているが、リガンドが
分散しており、立体的な構造が細胞を除去するのに適し
ていないため、目的細胞と多点で結合できず、充分な効
果が期待できない。また、特開平６−２１８０５１号に
エポキシ基を有する不織布表面にＣＤ４陽性細胞と結合
性を有するペプチドを固定化したものの開示がある。し
かし、ここで得られる細胞補集材はリガンド固定点が分
散するため高密度でリガンドを固定出来ず、細胞回収率
も十分なものではない。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、リガンドを
簡便に、安定に、高密度で大量に固定し、３次元的環境
下で目的細胞を分離する細胞分離フィルターおよび細胞
分離方法を提供することを課題とする。さらには親水性
表面修飾材を同時に表面に有する細胞分離フィルターを
提供することである。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らが鋭意検討し
た結果、細胞表面蛋白と相補的なアミノ酸配列からなる
リガンドが、共有結合により、繊維構造体表面のカルボ
ニル炭素のα位またはβ位に置換され、該繊維構造体の
単位空隙容積が４．０×１０^-4ｃｍ³ ／ｃｍ²以上４．
０×１０^-3ｃｍ³ ／ｃｍ² 未満である細胞選択フィルタ
ーによって、上記の課題が解決出来ることを見出した。
本発明で言う繊維構造体とは、繊維状、糸状或は棒状の
材料を、綿状、束状、簾状に或は織布、不織布の構造に
したものをいう。特に単位空隙容量を４．０×１０^-4ｃ
ｍ³ ／ｃｍ² 以上４．０×１０^-3ｃｍ³ ／ｃｍ² 未満に
制御しやすいこと、また使用時に構造変化が少なく表面
積当たりの空隙容量を安定に保てることにより、不織布
状であることが最も適している。本発明の不織布は公知
の何れの方法で製造されるものでも良く、具体的に例を
挙げると、メルトブロー法やフラッシュ紡糸法、短繊維
を相互に絡ませるニードルパンチ法、繊維を形成させる
と同時に不織布を製造するスパンボンド法、或いは溶融
紡糸により形成させると同時に不織布を製造するスパン
ボンド法、或は溶融紡糸により成形した短繊維をシート
状のウエブに広げ、このウエブを、ポリアクリル酸エス
テルエマルジョン或は合成ゴムラテックス等の接着材を
使用して接合する方法等の方法が挙げられる。この様に
して製造された不織布は、そのまま用いることも出来る
が、更にプレス圧縮や熱収縮、適当な液体による処理等
の２次加工を施しても、良好に使用することが出きる。

【０００５】繊維構造体の材質 本発明で用いる繊維構造体の材質は、活性水素を殆ど有
せず水不溶性であれば如何なる材質も使用可能である
が、例を示すと、ポリスチレン、ポリアルキルスチレ
ン、ポリアルコキシスチレン、ポリ安息香酸エステル、
ポリハロゲン化スチレン、ポリビニルナフタレン、ポリ
ビニルピレン、ポリビニルフェナントレン等のポリスチ
レン誘導体またはポリ芳香族置換エチレン、更に上記以
外の基材に芳香族環を公知の方法で新たに導入しても良
好なものが得られる。上記の内、フィルターへの成形
性、滅菌における安定性等から好ましい例を挙げると、
ポリエチレン及び／またはポリスチレン誘導体或はスチ
レンブタジエン共重合体等のスチレンモノマー共重合
体、を含むもの等がリガンドの固定に良好であることよ
り特に有効に用いられる。更に好ましくは、ポリスチレ
ン含量が少なくとも５０％以上の時に特に好ましく用い
られる。

【０００６】芳香族環導入用修飾材 本発明に用いる芳香族環導入用の修飾材は、芳香族環の
末端に反応性の置換基を有するものであれば何れの構造
体でも用いることが出来るが、好ましくは、スチレン及
びその誘導体の様にビニル基を有する構造体、アクリル
酸ベンジル、メタクリル酸ベンジル等のベンジル基等の
芳香族環を有するアクリル酸或いはメタクリル酸誘導体
等があるががこれに限定されるものではない。またこれ
らのモノマーを重合したポリマー或いはオリゴマーもこ
の表面修飾材として良好に用いることができる。

【０００７】単位空隙容積 本発明において、まず繊維構造体の空間容積は、不織布
の目付（ｇ／ｍ² ）及びその厚み（ｍｍ）より求めた１
ｃｍ³ 当たりの重量をその材質の比重で除し１からこの
値を減じた値をいう。この空間容積を繊維の体積とその
繊維の繊度から算定した繊維構造体の１ｃｍ³ の総表面
積で除した値が表面積当たりの空隙容積となる。容器内
の空隙総体積を容器に充填した繊維集合体の総表面積で
除した値を言う。また容器内に充填した後の空隙総体積
は繊維集合体の保有する空隙であり、容器内に水やエタ
ノール等の液体を注入し、空気と置換した容量を測定し
て求めることも出来る。本発明で用いる単位空隙容積が
４．０×１０^-4ｃｍ³ ／ｃｍ² 以上４．０×１０^-3ｃｍ
³ ／ｃｍ² 未満であるとき良好に用いることが出来る。
単位空隙容積が４．０×１０^-4ｃｍ³ ／ｃｍ² 未満であ
る時、目的細胞以外の非特異的な吸着が増加し好ましく
ない。４．０×１０^-3ｃｍ³ ／ｃｍ² 以上であると目的
細胞との接触頻度が低下し実用範囲としては好ましくな
い。

【０００８】不織布の平均繊維直径 本発明の平均繊維直径の測定は走査電子顕微鏡で繊維状
のフィルターの表面を撮影し、目視により撮影面上に分
散している糸の直径をランダムに１００個以上測定して
求める。機械的強度及び表面積の点より有効なフィルタ
ーの繊維直径は３μｍ以上５０μｍ未満で、より好まし
くは、３μｍ以上４０μｍ以下、更に好ましくは３．２
μｍ以上３０μｍ以下である。

【０００９】細胞表面蛋白と相補的なアミノ酸配列を有
するリガンド 細胞表面蛋白と相補的なアミノ酸配列を有するリガンド
とは、細胞、特に免疫細胞が、その表面に有する蛋白と
溶液中で結合するペプチドまたはタンパクをいい、何れ
の構造或いは配列であっても良いが、活性基と共有結合
する点から少なくとも活性水素を有するアミノ基を有す
ることが好ましい。より好ましくは、リガンドの細胞と
のアフィニティの高さや、安全性の面からアミノ酸数１
〜５０程度のオリゴペプチドが良好に用いられる。更に
好ましくはアフィニティの高さよりモノクローナル抗体
が挙げられる。リガンドをその機能により例示すると、
抗ＣＤ４、抗ＣＤ３、抗ＣＤ２、抗ＣＤ１ａ、抗ＣＤ１
ｂ、抗ＣＤ１ｃ、抗ＣＤ２、抗ＣＤ２Ｒ、抗ＣＤ５、抗
ＣＤ６、抗ＣＤ７、抗ＣＤ８、抗ＣＤ９、抗ＣＤ１１
ａ、抗ＣＤ１８、抗ＣＤ１９、抗ＣＤ２０、抗ＣＤ２
１、抗ＣＤ２２、抗ＣＤ２３、抗ＣＤ２４、抗ＣＤ３
７、抗ＣＤ４０、抗ＣＤ７２、抗ＣＤ７７、抗ＣＤ７９
ｂ、抗ＣＤ８０、抗ＣＤ８１、その他抗ＣＤ１３、抗Ｃ
Ｄ１４、抗ＣＤ１５、抗ＣＤ１６、抗ＣＤ３２、抗ＣＤ
３３、抗ＣＤ３４、抗ＣＤ３５、抗ＣＤ６４、抗ＣＤ６
５、抗ＣＤｗ６５、抗ＣＤ６６ｂ、抗ＣＤ６６ｅ、抗Ｃ
Ｄ８９、抗ＣＤｗ９０、抗ＣＤ５６、抗ＣＤ５７、抗Ｃ
Ｄ９４、抗ＣＤ１０５、抗ＣＤ１０６、抗ＣＤ４６、抗
ＣＤ９、抗ＣＤ３１、抗ＣＤ３６、抗ＣＤ４１、抗ＣＤ
４２ａ、抗ＣＤ４２ｂ、抗ＣＤ６３、抗ＣＤ１１ａ、抗
ＣＤ１１ｂ、抗ＣＤ１１ｃ、抗ＣＤ１８２９、抗ＣＤ４
４、抗ＣＤ４８、抗ＣＤ４９ａ、抗ＣＤ４９ｂ、抗ＣＤ
４９ｃ、抗ＣＤ４９ｄ、抗ＣＤ４９ｅ、抗ＣＤ４９ｆ、
抗ＣＤ５０、抗ＣＤ５１、抗ＣＤ５４、抗ＣＤ５８、抗
ＣＤ６１、抗ＣＤ６２Ｅ、抗ＣＤ６２Ｌ、抗ＣＤ６２
Ｐ、抗ＣＤ１０３、抗ＣＤ２６、抗ＣＤ３０、抗ＣＤ６
９、抗ＣＤ７０、抗ＣＤ７１、抗ＣＤ９５、抗ＣＤ２
５、抗ＣＤ１１７、抗ＣＤ１２２、抗ＣＤｗ１２４、抗
ＣＤ１２６、抗ＣＤ１２７等挙げられるがこれに限定さ
れるものではない。更にこれらのリガンドは単独で用い
ても良好に用いられるが、複数のリガンドを固定しても
良好に用いられる。

【００１０】リガンドの導入方法 本発明のフィルターには、予めリガンドを有していても
良いし、フィルターにリガンドを固定するために用いる
活性基を介してリガンドが固定されていても良好に用い
ることが出来る。

【００１１】活性基 本発明の固定基に用いるハロアセトアミノメチル化剤と
しては、Ｎ−ヒドロキシメチルクロロアセトアミド、Ｎ
−ヒドロキシメチルフルオロアセトアミド、Ｎ−ヒドロ
キシメチルブロモアセトアミド、Ｎ−ヒドロキシメチル
ヨードアセトアミド等が良好に用いられる。中でも、経
済性及び安定性の面から好ましくは、Ｎ−ヒドロキシメ
チルブロモアセトアミド、Ｎ−ヒドロキシメチルヨード
アセトアミド、等が良好に用いられる。繊維構造体に導
入されたフルオロ基、クロロ基は活性基導入後の基材を
ヨウ化カリウム或いは臭化カリウムの溶液で処理するこ
とで容易にヨウ素基或いは臭素基に変換できる。本発明
の繊維構造体の製造に用いられる酸触媒としては、強酸
特にプロトン酸であれば何れのものでもよいが、敢えて
例を挙げるとトリフルオロメタン、メタン、ベンゼン、
トルエン等のスルホン酸誘導体及び硫酸、塩化亜鉛、塩
化アルミニウム、四塩化スズ等のフリーデル・クラフツ
触媒等が良好に用いられる。中での反応性の点で、トリ
フルオロメタンスルホン酸等の有機スルホン酸が良好に
用いられる。酸触媒の量は、ハロアセトアミノメチル化
剤の１倍モル以上であれば良好に用いられるが、膨潤剤
等の量により適宜至適使用量を変化しても良好に用いら
れる。更に、本発明のフィルター材料用繊維構造体とし
て用いる膨潤剤としては、直鎖及び／または架橋ポリビ
ニル芳香族化合物に対する膨潤作用を有し、且つ、ハロ
アミドメチル化剤及び酸触媒に対する溶解性を有する不
活性溶媒であれば何れでも良いが、ニトロプロパン等の
ニトロアルカン、スルホラン、ジメチルスルホキシド等
の非プロトン性極性有機溶媒が挙げられる。これらは別
々に、もしくは、互いに混合して用いることが出来る。

【００１２】親水性表面修飾材 本発明に用いる活性基は、表面に親水性を付与する親水
性表面構造材とともに良好に用いることができる。親水
性表面構造材とは、親水性を有する無定型の構造体で、
基材に結合する事によって、表面に安定に存在する構造
材を指し、その構成要素に、細胞が存在するとき、その
非特異吸着を防止するために、有効に働く。更にこの親
水性表面構造材は、血液中の蛋白の吸着を少なくできる
点より、親水性を有することが好ましい。敢えて例を挙
げるとアルブミン、グロブリン、塩基性蛋白質Ｂ１、塩
基性蛋白質Ｂ２、オロソムコイド、プレアルブミン、ポ
ストアルブミン、免疫グロブリンＡ、免疫グロブリン
Ｄ、免疫グロブリンＥ、免疫グロブリンＧ、免疫グロブ
リンＭ、α２−ミクログロブリン、β２−ミクログロブ
リン、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）、低密度リ
ポタンパク質（ＬＤＬ１）、低密度リポタンパク質（Ｌ
ＤＬ２）、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ２）、高密度
リポタンパク質（ＨＤＬ３）、レチノール結合蛋白、セ
ルロプラスミン、トランスフェリン、フィブリノーゲ
ン、プラズマ、ラクトフェリン等の生体由来の蛋白、が
それに該当する。中でも特に好ましくは、アルブミン、
グロブリン等が入手が容易でかつ経済的な点より好まし
い。

【００１３】親水性を付与する合成官能基の例を示す
と、繰り返し単位が２から１５００のポリエチレングリ
コール鎖、水酸基、アミド基、エーテル基、エステル基
がそれに該当する。但し、ポリエチレングリコール鎖と
水酸基は結合していても、別に存在しても良い。親水性
を付与するポリエチレングリコール鎖を有するモノマー
の例を挙げると、メトキシジエチレングリコールメタク
リレート、メトキシトリエチレングリコールメタクリレ
ート、メトキシテトラエチレングリコールメタクリレー
ト、メトキシペンタエチレングリコールメタクリレー
ト、メトキシヘキサエチレングリコールメタクリレー
ト、メトキシヘプタエチレングリコールメタクリレー
ト、メトキシオクタエチレングリコールメタクリレー
ト、メトキシノナエチレングリコールメタクリレート、
メトキシデカエチレングリコールメタクリレート、メト
キシウンデカエチレングリコールメタクリレート、メト
キシドデカエチレングリコールメタクリレート、メトキ
シトリデカエチレングリコールメタクリレート、メトキ
シテトラデカエチレングリコールメタクリレート、メト
キシペンタデカエチレングリコールメタクリレート、等
の末端メトキシメタクリレート、メトキシジエチレング
リコールアクリレート、メトキシトリエチレングリコー
ルアクリレート、メトキシテトラエチレングリコールア
クリレート、メトキシペンタエチレングリコールアクリ
レート、メトキシヘキサエチレングリコールアクリレー
ト、メトキシヘプタエチレングリコールアクリレート、
メトキシオクタエチレングリコールアクリレート、メト
キシノナエチレングリコールアクリレート、メトキシデ
カエチレングリコールアクリレート、メトキシウンデカ
エチレングリコールアクリレート、メトキシドデカエチ
レングリコールアクリレート、メトキシトリデカエチレ
ングリコールアクリレート、メトキシテトラデカエチレ
ングリコールアクリレート、メトキシペンタデカエチレ
ングリコールアクリレート等の末端メトキシアクリレー
ト、及びメチル基の代わりに水素が結合した末端水酸基
を有するメタクリレート及びアクリレート、また末端に
１つ以上の重合性の官能基を有する繰り返し単位が２〜
１５００のポリエチレングリコール鎖を有するモノマー
全般をさす。更に、担体に直接結合させる場合、繰り返
し単位２〜１５００のポリエチレングリコール誘導体も
含まれる。親水性を与えるその他の置換基を有するモノ
マーの例を示すと、ビニルピロリドン等が挙げられるが
これに限定されるものではない。更に重合性官能基は１
つ以上幾つ存在しても良い。

【００１４】重合性の官能基 重合性の官能基とは、単独または２つ以上の官能基によ
って重合できる官能基を指し、例を挙げるとビニル基、
アセチレン基、ジエン基等の炭素多重結合、エポキシ
基、オキセタン基等の環構造、等が挙げられるがこれに
限定されるものではない。

【００１５】共存する官能基 更に、上記官能基と共に非イオン性官能基が存在しても
良くその例を挙げると、非イオン性官能基で特に親水性
の向上を目的にしたジメチルアミド基、ジエチルアミド
基、ジイソプロピルアミド基等のアミド基、ポリエチレ
ンテレフタレート鎖、ポリブチレンテレフタレート鎖等
の芳香族ポリエステル鎖及び脂肪族ポリエステル鎖等の
ポリエステル鎖、メチレングリコール鎖、プロピレング
リコール等のポリエーテル鎖、ポリカーボネート鎖、等
の非イオン性親水性官能基、または、疎水性付与を目的
としたアルキル鎖、弗化アルキル鎖、アリル鎖等の非イ
オン性官能基全般を含む。以上の何れの官能基が共存し
ても良いが、好ましくは、非イオン性親水性官能基を有
する場合良好なフィルターとなる。

【００１６】基材に親水性表面構造材を固定する方法と
して、共有結合、イオン結合、放射線やプラズマによる
グラフト法、物理吸着、包埋あるいは基材表面への沈澱
不溶化等あらゆる公知の方法を用いることもできる。従
って、高分子化合物やその単量体を放射線或いはプラズ
マ等を用いてグラフト重合したり、共有結合するなどの
公知の方法により表面改質（特開平１−２４９０６３
号、特開平３−５０２０９４号）を施す方法は本発明に
好適に用いられる。

【００１７】入口と出口を有する容器 本発明の細胞選択フィルター装置の容器形状としては、
血液の入口と出口を有する容器であれば特に限定はない
が、敢えて例を挙げると、フィルターを積層状に充填で
きる容器や、円柱状、三角柱状、四角柱状、六角柱状、
八角柱状、等の角柱状容器、更に、フィルターを円筒状
に巻きこれを充填できる容器、または、血液の流れが円
筒の外周より入り内側へと流れ、最も内側に集まり血液
流出口より出ることを特徴とする容器等が良好な形状と
なる。容器容量は、１ｍｌ以上３５０ｍｌ以下が好まし
く、１ｍｌ未満では繊維構造体の内容量が少なく実用上
好ましくない。一方、３５０ｍｌを超えると、カラムサ
イズが大きくなり、経済性或いは、プライミングボリウ
ムが大きくなり好ましくない。また、錘状等の断面積が
入口から出口に向かうに従って、小さくなる形状を有す
る容器等が用いられる。この時の容器の断面積と長さの
比（断面積／長さ、Ｓ／Ｄ）は、１ｃｍ以上５００ｃｍ
以下が良好なＳ／Ｄとなる。大量の検体を処理する場
合、必然的に大断面積のものとなってしまうため、圧力
損失を小さく保つために、厚みを厚くするという手段が
困難な場合、コンパクトな装置とするため、フィルター
が円筒状に巻かれて、その両端面がシールされており、
円筒状のフィルターの外側面に容器の血液入口が、円筒
状フィルターの内側面に容器の血液出口がそれぞれ通じ
ており、更に血液の入口と出口は円筒状にまかれたフィ
ルターによって隔てられている形状が特に好ましく用い
られる。

【００１８】滅菌方法 本発明の細胞選択フィルター装置は公知の何れの方法で
滅菌しても良いが、リガンドの安定性より好ましくは、
γ線、電子線等の放射線滅菌、或いはＵＶ等の紫外線滅
菌、エチレンオキサイドガス等のガス滅菌等が挙げられ
るがこれに限定されるものではない。更に好ましくは、
経済性或いはリガンドの安定性よりγ線、電子線等の放
射線滅菌が良好に用いられる。

【００１９】分離装置 白血球含有液を分離する装置は、細胞選択フィルター装
置を含んでいれば特に限定はないが、敢えて例を挙げる
と、少なくとも血液の採取手段、血液の送液手段、血液
の分離手段、血液が通過する回路を有することが好まし
い。この他に血液の返血手段或いは血液の回収手段、前
濾過、遠心分離等の血液を前処理する手段、血液を保存
する手段、抗凝固剤等を加える手段、血液回路中の泡を
除く手段等が１つ以上加えられても良好に用いられる。

【００２０】分離方法 白血球含有液を分離する方法は、本発明の細胞選択フィ
ルター装置を用い、少なくとも５００ｍｍＨｇ以下の差
圧で、白血球含有液を流速０．１〜２００ｍｌ／分で送
液する。細胞へのストレスを少なくするため好ましいカ
ラム内の差圧は４００ｍｍＨｇ以下更に好ましくは３０
０ｍｍＨｇ以下の時更に良好に分離ができる。また、白
血球含有液の実用上最も好ましい流速は５〜２００ｍｌ
／分である。白血球含有液を流速０．１ｍｌ／分未満で
流すと、細胞の非特異的な粘着が起こりやすくなり、更
に処理時間の面で実用上好ましくない。一方、２００ｍ
ｌ／分を超えた流速で送液すると、フィルターでの圧損
が上昇し、カラム内での細胞の接触時間が短くなり特異
性が低下することより好ましくない。送液は連続的に血
液の採取手段、血液の送液手段、血液の分離手段、血液
の返血手段或いは血液の回収手段等を通過させても良好
に用いられるが、何れか或いは数回断続的に血液を処理
することもできる。

【００２１】細胞選択フィルター装置の用途 本発明の細胞選択フィルター装置は細胞の選択除去或い
は回収や細胞選択除去を目的とする体外循環治療用とし
て有効に用いられる。これら細胞選択フィルター装置を
用いて、白血球、リンパ球、単球、顆粒球等の各分画細
胞の選択分離または吸着、除去等に有効に活用できる。
特に吸着性が低いリンパ球を選択的に処理する場合特に
有効に用いられる。

【００２２】白血球含有液 本発明の細胞選択フィルター装置は、何れの白血球含有
液においても有効に用いることができるが、敢えて好ま
しい例を挙げると、血液、リンパ球浮遊液、単核球浮遊
液、骨髄液、バフィーコート等の遠心処理をした液、血
小板濃厚液、赤血球濃厚液等が挙げられる。更に体外循
環や、Ｇ−ＣＳＦ等の造血因子を投与した抹消血等につ
いても良好に用いることができる。また、これらに必要
に応じて抗凝固剤や血液保存液等を加えて良好に用いら
れる。以下に実施例を示し、本発明を詳細に説明する。

【００２３】

【実施例１】ガラス製のフラスコにＮ−ヒドロキシメチ
ルヨードアセトアミド２．１５ｇ及びスルホラン１００
ｍｌを加え攪拌し、トリフルオロメタンスルホン酸２５
ｇを加え攪拌した。これにポリスチレンからなる不織布
（表面積当たりの空隙容積が８．７×１０^-4ｃｍ³ ／ｃ
ｍ² 、平均繊維直径４．５μｍ）０．１ｇを入れ４時間
反応した。４時間反応後不織布を取り出し、純水にて洗
浄し、これを真空乾燥して、目的の不織布を得た。この
不織布を直径０．９ｃｍの円に切断し、ＰＢＳ（−）に
溶解した抗ヒトＣＤ４液（７２μｇ／５００μｌ）に
２．５時間浸し、抗体を固定した。２．５時間後、ＰＢ
Ｓ（−）で洗浄した。入口と出口を有する容量１ｍｌの
容器に２枚充填し（充填密度０．０６）、カラムを作成
した。 実験用検体 血液より公知の遠心分離器及び比重遠心法で分離採取し
た単核球浮遊液をＰＢＳ（−）により希釈し、１．０×
１０⁶ 個／５ｍｌに調整した。この単核球浮遊液を検体
として用いた。 実験操作 該単核球浮遊液５ｍｌをペリスタポンプを用いて流速
０．１ｍｌ／分で送液し、カラムの入口より流した。カ
ラム出口より処理後の液を回収した。この時のＣＤ４
（＋）細胞の回収率は、公知のフローサイトメトリー法
で測定した。この時のＣＤ４（＋）細胞の除去率は、８
０％であった。この時他の細胞のＣＤ８（＋）細胞の回
収率は１００％であった。またこの時のＢリンパ球の回
収率は９７％であった。

【００２４】

【比較例１】ポリスチレン不織布をそのまま用いた以外
は全く実施例１と同様の実験操作を行ったところ、この
時のＣＤ４（＋）細胞の回収率は、１０％であった。こ
の時他の細胞のＣＤ８（＋）細胞の回収率は１０％であ
り細胞の選択性は認められなかった。

【００２５】

【実施例２】ガラス製のフラスコにＮ−ヒドロキシメチ
ルブロモアセトアミド２．１５ｇ及びスルホラン１００
ｍｌを加え攪拌し、トリフルオロメタンスルホン酸２５
ｇを加え攪拌した。これにポリスチレンからなる不織布
（表面積当たりの空隙容積が８．７×１０^-4ｃｍ³ ／ｃ
ｍ² 、平均繊維直径４．５μｍ）０．１ｇを入れ４時間
反応した。４時間反応後不織布を取り出し、純水にて洗
浄し、これを真空乾燥して、目的の不織布を得た。この
不織布を直径０．９ｃｍの円に切断し、ＰＢＳ（−）に
溶解した抗ヒトＣＤ４液（７２μｇ／５００μｌ）に
２．５時間浸し、抗体を固定した。２．５時間後、ＰＢ
Ｓ（−）で洗浄した。更に２．５時間アルブミン液を加
え固定し、ＰＢＳ（−）で洗浄した。入口と出口を有す
る容量１ｍｌの容器に２枚充填し（充填密度０．０
６）、カラムを作成した。 実験用検体 血液より公知の遠心分離器及び比重遠心法で分離採取し
た単核球浮遊液をＰＢＳ（−）により希釈し、１．０×
１０⁶ 個／５ｍｌに調整した。この単核球浮遊液を検体
として用いた。 実験操作 該単核球浮遊液５ｍｌをペリスタポンプを用いて流速
０．１ｍｌ／分で送液し、カラムの入口より流した。カ
ラム出口より処理後の液を回収した。この時のＣＤ４
（＋）細胞の回収率は、公知のフローサイトメトリー法
で測定した。この時のＣＤ４（＋）細胞の除去率は、８
０％であった。この時他の細胞のＣＤ８（＋）細胞の回
収率は１００％であった。またこの時のＢリンパ球の回
収率は９９％であった。

【００２６】

【比較例２】ポリスチレンからなる不織布（表面積当た
りの空隙容積が３．７×１０^-4ｃｍ³ ／ｃｍ² 、平均繊
維直径２．３μｍ）を用いた以外は全く実施例２と同様
の実験操作を行ったところ、この時のＣＤ４（＋）細胞
の除去率は、８５％であった。この時他の細胞のＣＤ８
（＋）細胞の除去率は７５％であり、Ｂ細胞の除去率は
９０％であり細胞の選択性は認められなかった。

【００２７】

【実施例３】ガラス製のフラスコにＮ−ヒドロキシメチ
ルブロモアセトアミド２．１５ｇ及びスルホラン１００
ｍｌを加え攪拌し、トリフルオロメタンスルホン酸２５
ｇを加え攪拌した。これにポリスチレンからなる不織布
（表面積当たりの空隙容積が４．６×１０^-4ｃｍ³ ／ｃ
ｍ² 、平均繊維直径３．３μｍ）０．１ｇを入れ４時間
反応した。４時間反応後不織布を取り出し、純水にて洗
浄し、これを真空乾燥して、目的の不織布を得た。この
不織布を直径０．９ｃｍの円に切断し、ＰＢＳ（−）に
溶解した抗ヒトＣＤ４液（７２μｇ／５００μｌ）に
２．５時間浸し、抗体を固定した。２．５時間後、ＰＢ
Ｓ（−）で洗浄した。更に２．５時間アルブミン液を加
え固定し、ＰＢＳ（−）で洗浄した。入口と出口を有す
る容量１ｍｌの容器に２枚充填し（充填密度０．０
６）、カラムを作成した。 実験用検体 血液より公知の遠心分離器及び比重遠心法で分離採取し
た単核球浮遊液をＰＢＳ（−）により希釈し、２．０×
１０⁶ 個／５ｍｌに調整した。この単核球浮遊液を検体
として用いた。 実験操作 該単核球浮遊液５ｍｌをペリスタポンプを用いて流速
０．１ｍｌ／分で送液し、カラムの入口より流した。カ
ラム出口より処理後の液を回収した。この時のＣＤ４
（＋）細胞の回収率は、公知のフローサイトメトリー法
で測定した。この時のＣＤ４（＋）細胞の除去率は、９
４％であった。この時他の細胞のＣＤ８（＋）細胞の除
去率は１％であった。またこの時のＢリンパ球の除去率
は１１％であった。

【００２８】

【比較例３】ポリスチレンからなる不織布（表面積当た
りの空隙容積が３．６×１０^-4ｃｍ³ ／ｃｍ² 、平均繊
維直径１．７μｍ）をそのまま用いた以外は全く実施例
２と同様の実験操作を行ったところ、この時のＣＤ４
（＋）細胞の除去率は、９７％であった。この時他の細
胞のＣＤ８（＋）細胞の除去率は９６％であり、Ｂ細胞
の除去率は９８％であり細胞の選択性は認められなかっ
た。

【００２９】

【実施例４】ガラス製のフラスコにＮ−ヒドロキシメチ
ルブロモアセトアミド２．１５ｇ及びスルホラン１００
ｍｌを加え攪拌し、トリフルオロメタンスルホン酸２５
ｇを加え攪拌した。これにポリスチレンからなる不織布
（表面積当たりの空隙容積が８．７×１０^-4ｃｍ³ ／ｃ
ｍ² 、平均繊維直径４．５μｍ）０．１ｇを入れ４時間
反応した。４時間反応後不織布を取り出し、純水にて洗
浄し、これを真空乾燥して、目的の不織布を得た。この
不織布を直径０．６ｃｍの円に切断し、ＰＢＳ（−）に
溶解した抗ヒトＣＤ４液２００μＬ（７２μｇ／５００
μｌ）に２．５時間浸し、抗体を固定した。２．５時間
後、ＰＢＳ（−）で洗浄した。更に２．５時間アルブミ
ン液を加え固定し、ＰＢＳ（−）で洗浄した。入口と出
口を有する容量１ｍｌの容器に５枚充填し（充填密度
０．１）、カラムを作成した。 実験用検体 血液より公知の遠心分離器及び比重遠心法で分離採取し
た単核球浮遊液をＰＢＳ（−）により希釈し、１．０×
１０⁶ 個／５ｍｌに調整した。この単核球浮遊液を検体
として用いた。 実験操作 該単核球浮遊液５ｍｌをペリスタポンプを用いて流速
０．１ｍｌ／分で送液し、カラムの入口より流した。カ
ラム出口より処理後の液を回収した。この時のＣＤ４
（＋）細胞の回収率は、公知のフローサイトメトリー法
で測定した。この時のＣＤ４（＋）細胞の除去率は、８
０％であった。この時他の細胞のＣＤ８（＋）細胞の回
収率は１００％であった。またこの時のＢリンパ球の回
収率は９９％であった。

【００３０】

【実施例５】ガラス製のフラスコにＮ−ヒドロキシメチ
ルブロモアセトアミド２．１５ｇ及びスルホラン１００
ｍｌを加え攪拌し、トリフルオロメタンスルホン酸２５
ｇを加え攪拌した。これにポリスチレンからなる不織布
（表面積当たりの空隙容積が８．７×１０^-4ｃｍ³ ／ｃ
ｍ² 、平均繊維直径４．５μｍ）０．１ｇを入れ４時間
反応した。４時間反応後不織布を取り出し、純水にて洗
浄し、これを真空乾燥して、目的の不織布を得た。この
不織布を直径０．６ｃｍの円に切断し、ＰＢＳ（−）に
溶解した抗ヒトＣＤ４液２００μＬ（７２μｇ／５００
μｌ）に２．５時間浸し、抗体を固定した。２．５時間
後、ＰＢＳ（−）で洗浄した。更に２．５時間アルブミ
ン液を加え固定し、ＰＢＳ（−）で洗浄した。入口と出
口を有する容量１ｍｌの容器に５枚充填し（充填密度
０．１）、カラムを作成した。 実験操作 ＡＣＤ−Ａ加ヒト全血３ｍｌ（全血：ＡＣＤ−Ａ＝８：
１）をシリンジポンプを用いて流速１ｍｌ／分で送液
し、カラムの入口より流した。カラム出口より処理後の
液を回収した。この時のＣＤ４（＋）細胞の回収率は、
公知のフローサイトメトリー法で測定した。この時のＣ
Ｄ４（＋）細胞の除去率は、７０％であった。この時他
の細胞のＣＤ８（＋）細胞の除去率は２％であった。ま
たこの時のＢリンパ球の除去率は８％であった。この時
の血小板の除去率は４０％であった。

【００３１】

【比較例４】ポリスチレンからなる不織布（表面積当た
りの空隙容積が２．１×１０^-4ｃｍ³ ／ｃｍ² 、平均繊
維直径１．２μｍ）を用いた以外は全く実施例５と同様
の実験操作を行ったところ、この時のＣＤ４（＋）細胞
の除去率は、９９％であった。この時他の細胞のＣＤ８
（＋）細胞の除去率は９９％であり、Ｂ細胞の除去率は
９９％であり細胞の選択性は認められなかった。

【００３２】

【実施例６】ガラス製のフラスコにＮ−ヒドロキシメチ
ルブロモアセトアミド２．１５ｇ及びスルホラン１００
ｍｌを加え攪拌し、トリフルオロメタンスルホン酸２５
ｇを加え攪拌した。これにポリスチレンからなる不織布
（表面積当たりの空隙容積が４．０×１０^-3ｃｍ³ ／ｃ
ｍ² 、平均繊維直径３．０μｍ）０．１ｇを入れ４時間
反応した。４時間反応後不織布を取り出し、純水にて洗
浄し、これを真空乾燥して、目的の不織布を得た。この
不織布を直径０．６ｃｍの円に切断し、ＰＢＳ（−）に
溶解した抗ヒトＣＤ４液２００μＬ（７２μｇ／５００
μｌ）に２．５時間浸し、抗体を固定した。２．５時間
後、ＰＢＳ（−）で洗浄した。更に２．５時間アルブミ
ン液を加え固定し、ＰＢＳ（−）で洗浄した。入口と出
口を有する容量１ｍｌの容器に１０枚充填し（充填密度
０．１）、カラムを作成した。 実験操作 ＡＣＤ−Ａ加ヒト全血３ｍｌ（全血：ＡＣＤ−Ａ＝８：
１）をシリンジポンプを用いて流速１ｍｌ／分で送液
し、カラムの入口より流した。カラム出口より処理後の
液を回収した。この時のＣＤ４（＋）細胞の回収率は、
公知のフローサイトメトリー法で測定した。この時のＣ
Ｄ４（＋）細胞の除去率は、７０％であった。この時他
の細胞のＣＤ８（＋）細胞の除去率は３％であった。ま
たこの時のＢリンパ球の除去率は６％であった。この時
の血小板の除去率は２０％であった。

【００３３】

【発明の効果】本発明によれば、リガンドが簡便に、安
定に、且つ高密度で大量に固定されるので、三次元的環
境下で目的細胞を効率的に分離できる。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 細胞表面蛋白と相補的なアミノ酸配列か
   らなるリガンドが、共有結合により、繊維構造体表面の
   カルボニル炭素のα位またはβ位に置換され、該繊維構
   造体の単位空隙容積が４．０×１０^-4ｃｍ³ ／ｃｍ² 以
   上４．０×１０^-3ｃｍ³ ／ｃｍ² 未満である細胞選択フ
   ィルター。
2. 【請求項２】 前記繊維構造体の表面が少なくとも前記
   リガンドと親水性表面修飾材の２成分を有する請求項１
   記載の細胞選択フィルター。
3. 【請求項３】 前記リガンドがリンパ球表面蛋白結合性
   の抗体である請求項１記載の細胞選択フィルター。
4. 【請求項４】 白血球含有液を請求項１記載のフィルタ
   ーを内蔵してなる、容量１ｍｌ以上３５０ｍｌ以下の、
   少なくとも入口と出口を備えた細胞選択フィルター装置
   に通液させ特定の細胞分画を分離する細胞分離方法。
5. 【請求項５】 白血球含有液を５００ｍｍＨｇ以下の差
   圧下で０．１ｍｌ／分以上２００ｍｌ／分以下で通液さ
   せる請求項４記載の細胞分離方法。