JPH0471478A - 細胞培養用容器およびその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、動物細胞の培養に適し、且つ、有用な生理活
性物質を産生させ得る細胞培養用容器および当該容器を
利用したサイトカインの製造方法に関する。

（従来の技術） 生理活性物質をビニル重合体成型品の表面に固定化した
ものは細胞培養用容器、アフィニティークロマトグラフ
用吸着剤、治療用血液処理剤、抗菌性材料その他分析用
試薬などとして広く利用されており、今後さらに幅広い
応用が期待される重要な物質である。

細胞培養用容器には細胞の維持・成育に害をもたらさな
い性質のほか、細胞の状態を手軽に顕微鏡観察するため
、透明であることが求められる。

このため、現在用いられている細胞培養用容器の大半は
ポリスチレン成型品である。しかし、ポリスチレン成型
品は疎水性のため、細胞との親和性が低く、このままで
は組繊細胞の培養には使えない。最近ではこの点を改良
して、プラズマ処理等で表面に陽荷電を付与したり、コ
ラーゲンやビトロネクチンなどの細胞外マトリックスを
コートしたポリスチレン成型品が使われるようになった
。

しかし、これらは蛋白質であるため、製造の再現性が悪
く、腐敗する等の問題点がある。

ブロムシアン化セファローズビーズやアミドメチル化ポ
リスチレン繊維に、３個以上のアミノ基を持つ塩基性環
状ペプチドの一つであるポリミキシンＢを固定化したも
のは抗菌性材料（特開昭５６−１６１０４６）やエンド
トキシン吸着剤（特開昭５８−１３５１９）として知ら
れており、また、体外循環用材料（特開昭６Ｏ−５１６
６）としても用いられているが、細胞培養用容器として
は用いられていない。これらを細胞培養用容器として用
いるには、それぞれ、天然の蛋白質を併用していること
、ゲル状であるため取り扱い難いこと、透明性に欠ける
こと問題点がある。

（発明が解決しようとする課題） 本発明者らは、かかる従来技術の問題点に鑑み、毒性の
ない低分子化合物をビニル重合体成型品表面に固定化し
、これを動物細胞の培養用容器として使用できないか、
また、有用なサイトカイン等を産生させられないか種々
検討した結果、３個以上のアミノ基を持つ塩基性ペプチ
ドを固定化したものが単核球系細胞および線維芽細胞系
細胞等の細胞にインターロイキン−１、インターロイキ
ン６、ＴＮＦ、Ｇ−Ｃ８ＦおよびＧＭ−Ｃ８Ｆ等の有用
な生理活性物質を産生させ得ることを見出だし、本発明
に到達した。

すなわち、本発明は、動物細胞に作用してサイトカイン
等の有用物質を産生させ得る新規細胞培養用容器を提供
することを目的とするものである。

さらに、このような細胞培養用容器を使用したサイトカ
インの製造方法を提供することを目的とするものである
。

（課題を解決するための手段） このような目的を達成するための本発明の構成は、以下
の（１）〜（７）の技術的手段から構成される。

（１）ビニル重合体成型品の表面に３個以上のアミノ基
を持つ塩基性環状ペプチドを固定化して成り、且つ、５
００ナノメーターの波長の光に対する吸光度が１以下で
あることを特徴とする細胞培養用容器。

（２）成型品の形状が、シャーレ、瓶、膜、中空糸、管
またはこれ等を用いた組み立て品であることを特徴とす
る請求項第（１）項記載の細胞細胞培養用容器。

（３）動物細胞を請求項第（１）項記載の細胞培養用容
器と接触させることを特徴とするサイトカインの製造方
法。

（４）動物細胞が、白血球であることを特徴とする上記
（３）項記載のサイトカインの製造方法。

（５）動物細胞が、線維芽細胞系細胞であることを特徴
とする上記（３）項記載のサイトカインの製造方法。

（６〉サイトカインが、インターロイキン−１であるこ
とを特徴とする上記（４）項記載のサイトカインの製造
方法。

（７）サイトカインが、インターロイキン−６であるこ
とを特徴とする上記（５）項記載のサイトカインの製造
方法。

（８）表面にα−クロルアセトアミドメチル基を持つ芳
香族ビニル重合体成型品にポリミキシンをｐＨ９〜１２
で接触させることを特徴とする上記（１）項記載の細胞
培養用容器の製造方法。

本発明でいう３個以上のアミノ基を持つ塩基性環状ペプ
チドとは、４個以上のアミノ酸残基からなる環状ペプチ
ドで３個以上のアミノ基を持つ塩基性ペプチドならなん
でも良く、特に、制限はないが、製造の容易さや効果か
ら塩基性のアミノ基は３〜６個が良い。環状構造に直鎖
状ペプチドが結合していても良い。具体例を挙げると、
ポリミキシンＡ１ポリミキシンＢ１、ポリミキシンＢ２
、ポリミキシンＣ１ポリミキシンＤ１、ポリミキシンＤ
２、ポリミキシンＥＩ、ポリミキシンＥ２、および、こ
れらのアミノ酸を他のアミノ酸で置換したもの、および
、アミノ酸を増減させたもの等がある。これらは生物に
作らせることができるが、化学的に合成することもでき
る。

塩基性環状ペプチド中の親水性官能基と疎水性官能基の
バランスが重要である。同じ塩基性環状ペプチドでも２
個のアミノ基しか持たないグラミシジンＳは固定化して
も本発明の効果はない。グラミシジンＳを固定化しても
本発明の効果が出ないのは、ポリミキシンではアミノ基
１個に対する疎水性アミノ酸の数が１であるのに対し、
グラミシジンＳではアミノ基１個に対する疎水性アミノ
酸の数が４であるでためである。

本発明でいうビニル重合体成型品とは、スチレン、α−
メチルスチレンの単独重合体またはそれ等を主成分とす
る共重合体の成型品であって、その表面にアミノ基と反
応しうる活性ハロゲン原子またはカルボキシル基を有し
、且つ、光透過性のあるビニル重合体成型品を意味する
。該成型品の形状はシャーレ、瓶、管、膜、中空糸また
はこれ等を用いた組み立て品の中から使用目的に応じて
適宜選ばれる。

本発明でいうビニル重合体成型品の具体例をあげると、
■スチレンまたはα−メチルスチレンの単独重合体もし
くはこれらを主成分とする芳香族ビニル系共重合体をシ
ャーレ、試験管、管、フィルム、瓶、注射筒、カテーテ
ルなどに成型したものの表面にアミノメチル基を導入し
たもの、■スチレン／エチレン・ブチレンのＡＢＡブロ
ックコポリマの膜にα−ハロアセトアミドメチル基を導
入したもの、■ポリスチレン成型品の表面にクロルメチ
ルスチレン・スチレン共重合体をコートしたもの、■ポ
リスチレン成型品の表面に無水マレイン酸・スチレン共
重合体をコートしたもの、■ポリスチレン成型品の表面
にアクリル酸・スチレン共重合体をコートしたものなど
があげられるが、これ等に限定されるものではない。ま
た、これらのなかでも、■と■が製造が容易で、剥離の
心配がなく、且つ、取り扱いやすいので、特に、好まし
く用いられる。

■の場合、成型品の厚みには特に制限はないが、実用に
耐える強度を維持するためには、通常、１００ミクロン
以上の厚みを持つものが好ましく用いられる。また、そ
の光透過性に関しては該成型品の表面に存在する細胞の
形を確認可能にするに十分な光透過性を有することが望
ましい。該成型品の光透過性は主として表面での散乱に
よって決まるので、表面が完全に平滑でなければならな
いし、また、表面に凹凸があると、細胞がその凹凸を認
識して予期しない応答を示すことがある。

該成型品の場合、５００〜７００ナノメーターの波長の
光に対する吸光度が１以下であることが必要である。こ
の吸光度が小さいほど該成型品の光透過性が良く、吸光
度が０．１以下であればさらに好ましい。

本発明の血液細胞処理剤の製造は、活性ハロゲン基を持
つビニル重合体成型品を塩基性環状ペプチドの溶液中に
浸漬するか、カルボキシル基を持つビニル重合体成型品
を塩基性環状ペプチドとカルボジイミドの混合溶液に加
えることにより容易に達成される。この反応において、
溶液のｐＨが１２．５以上であると、ペプチドが急激に
加水分解し、また、逆にｐＨが低すぎると、反応が進ま
ないので、溶液のｐＨは９以上、１２以下であることが
必要である。

本発明でいうサイトカインとはインターロイキン−１、
インターロイキン−２、インターロイキン−６等で代表
されるインターロイキン類、ＧＭ−Ｃ５Ｆ、Ｇ−Ｃ８Ｆ
等で代表されるコロニー刺激因子、インターフェロン、
ＴＮＦ等を意味する。

本発明で用いる塩基性環状ペプチドは実施例２に示され
るように１．固定化しない状態ではサイトカインの誘導
能はない。不溶性担体に固定化して初めて活性が得られ
ることが判明した。

コロニー刺激因子は軟寒天中で顆粒球、マクロファージ
の幹細胞を刺激して、成熟した顆粒球やマクロファージ
から成るコロニーを形成させる特異的刺激因子として知
られている糖蛋白質である。

コロニー刺激因子の中には、ＧＭ−Ｃ３Ｆ、Ｇ−Ｃ８Ｆ
、Ｍ−Ｃ８Ｆ等があることが知られている。

また、これ等は単球、マクロファージ、線維芽細胞、血
管内皮細胞、骨髄ストローマ等によって産生されること
が知られている。ＧＭ−Ｃ８Ｆは白血球の数の増加だけ
でなく、顆粒球機能の亢進の作用もあることが知られて
おり、骨髄性白血病の治療、ＡＩＤＳや癌の化学療法後
の白血球減少症の治療のためにも使われている（実験医
学　７（１５）（増刊）１９８−２０３　（１９８９）
）。

また、Ｇ−Ｃ８Ｆも同様に重症感染症の予防や治療に用
いられる（実験医学　７（１５）（増刊）１９１−１９
７　（１９８９））。

インターロイキン−１は白血球が産生ずる発熱物質とし
て古くから知られているが、最近ではいろんな作用のあ
ることが知られており、特に抗腫瘍効果や造血促進作用
があり、臨床への利用が試みられている（実験医学　７
（１５）（増刊）１７０−１７７　（１９８９））。ま
た、インターロイキン−６は種々の細胞に作用して、細
胞の分化や増殖を誘導することが知られているが、特に
、造血幹細胞に対する作用のあることで注目されている
（実験医学　７（１５）（増刊）９０−９５　（１９８
９））。

血液から取り出した単球を本発明の細胞培養用成型品と
接触させながら培養すると、単球は活性化されて、実施
例３と同様にして前記した種類の高濃度のサイトカイン
を産生ずることが判明した。

産生されたサイトカインは、例えば１ｎ　ｖｉｖ□およ
び１ｎ　ｖｉｔｒｏでの白血球増加剤等として利用でき
る。

また、線維芽細胞系細胞を本発明の細胞培養用成型品上
で培養すると、細胞は活性化されて、インターロイキン
−６を産生ずることが判明した。

（発明の効果） 本発明の細胞培養用成型品は、■サイトカイン等の有用
物の産生に用いることができること、■化学的に安定な
化学結合で固定化されているので、溶出の心配がないこ
と、■低分子化合物を用いているので保守管理が容易で
あること等の利点を有する。

以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。

なお、実施例中の評価方法は、以下に従った。

１、芳香族ビニル系重合体成型品の化学的解析成型品を
塩化メチレンでソックスレー抽出すると不溶性の膜状物
が得られるので、これを真空乾燥し、重量を量り、赤外
線吸収スペクトル測定等を行った。

２、赤外線吸収スペクトル 島津フーリエ変換赤外分光光度計ＦＴ　Ｉ　Ｒ−４３０
０を用いＫＢｒ錠剤法で測定した。

３、成型品の光透過性の測定 島津分光光度計ＵＶ２１００を用い、５００ナノメータ
ーで板状成型品に垂直方向の吸光度を測定した。対照と
して同じ厚さのポリスチレン板状成型品の吸光度を測定
し、両者の差をＡ５ｏｏとした。従って、その値が小さ
いほど成型品の光透過性が高いことになる。

４、ペプチドの定量 固定化成型品を６Ｎ−ＨＣＬで加水分解（封管中、１２
０℃　２０ｈｒ）したのち、日立自動アミノ酸分析計（
特殊アミノ酸分析法／ニンヒドリン発色）で分析した。

アミノ酸組成比を求め、α。

γ−ジアミノ酪酸またはロイシンの回収率から定量した
。

５、サイトカインの定量 ＧＭ−Ｃ８Ｆ、Ｇ−Ｃ８Ｆ、インターロイキン−１はＭ
ＴＴ法（Ｔ、　Ｍｏ５ａ＋ａｎ、ジャーナル　オブザ　
イミュノロジカル　メソッズ　６５５５〜６３　（１９
８３））により分析した。インターロイキン−６はイン
ターロイキン−６依存性細胞の増殖率により分析した。

ＴＮＦはＬ９２９をインジケーターセルとした殺細胞能
により定量した。

実施例１゜ １−二トロプロパン５００ｍ１と硫酸２７２ｍ１の混合
溶液を０℃に冷却し、２０．４ｇのＮ−メチロールーα
−クロルアセトアミドを加え、０〜１０℃で溶解した。

この溶液を１０℃に昇温したのち、φ３．５ｃｍＸ１．
ＱｍｍＨのポリスチレン製培養皿（厚み１ｍｍ）７０個
に７ｍｌずつ入れ、室温でｌｈｒ反応させた。反応液を
捨て、培養皿を零下２０℃のメタノールに浸し、さらに
メタノ−および水で洗った後、真空乾燥して、内部表面
だけクロルアセトアミドメチル化された成型品Ａを得た
。この成型品のＡ、。。は０．０５０であった。

上記で得た成型品Ａ１個を、塩化メチレンでソックスレ
ー抽出したところ、薄膜状の不溶物３．２Ｉｌ１ｇが得
られた。培養皿の反応面の表面積は１７．６ｃｄである
ので、反応部の厚みは大体１．８μと考えられる。また
、この不溶物の赤外線吸収スペクトルでは、１６５９ｃ
ｍ−’（アミド−Ｉ）　、１５２９ｃｍ＝（アミド−■
）および３２９７ｃｍ−１（Ｎ−Ｈ）にアミド基の強い
吸収が認められたことがらその構造を確認した。

上記で得た成型品Ａ４０個を、２０００ｍ１の１０％ジ
メチルアミノエタノール・ジメチルスルホキサイド溶液
中に浸し、室温で１８ｈｒ静置した後、２０００ｍ１の
１０％ジメチルアミノエタノール水溶液中、７０℃で２
ｈｒ加熱した。成型品を水洗後、乾燥して、アミノメチ
ル化成型品Ｂを得た。

上記本発明の成型品８１個を塩化メチレンでソックスレ
ー抽出したところ、薄膜状の不溶物２．３１ｇが得られ
た。この不溶物の赤外線吸収スペクトルでは、成型品Ａ
で認められた１６５９ｃｍ−１（アミド−■）および１
５２９ｃｍ−’（７ミＦ−■）の第一級アミド基の強い
吸収が完全に消失していたことからその構造を確認した
。

硫酸ポリミキシンＢ（シグマ　ケミカル　カンパニー）
の０．　２ａ＋ｇ／ｍｌ水溶液５００ｍ１に６ｍｇの酸
化マグネシウムを加え、超音波振動を施して、均一溶液
とし、ポリミキシン溶液を調製した。

この溶液４ｍｌずつを１０個の成型品Ａに入れ、室温で
３０間静置した。溶液、を捨て、成型品を水で１０回洗
浄して、ポリミキシンを固定化した本発明成型品Ｉを得
た。

本発明成型品Ｉには１．２μｇのポリミキシンが固定化
されていることが、アミノ酸分析の結果、わかった。ま
た、ジアミノ酪酸の回収率が３６％であったことから、
ポリミキシン分子は５個の塩基性アミノ基のうちの４個
で成型品（クロルアセチル基と反応）と結合しているこ
とがわかった。

実施例２゜ １−ニトロプロパン５００ｍ１と硫酸２７２ｍｇの混合
溶液を０℃に冷却し、２０．４ｇのＮ−メチロール−α
−クロルアセトアミドを加え、０〜１０℃で溶解した。

この溶液を１０℃に昇温したのち、φ５．２ｃｍＸ１．
３ｍｍＨのポリスチレン製培養皿（厚み１ｍｍ）４０個
に１０　ｍ　Ｉずつ入れ、室温で１ｈｒ反応させた。反
応液を捨て、培養皿を零下２０℃のメタノールに浸し、
さらにメタノ−および水で洗った後、真空乾燥して、内
部表面だけクロルアセトアミドメチル化された成型品Ｃ
を得た。この成型品のＡ３００は０．０３０であった。

上記で得た成型品Ｃ１０個を、１０１００Ｏの１０％ジ
メチルアミノエタノール・ジメチルスルホキサイド溶液
中に浸し、室温で１８ｈｒ静置した後、１０１００Ｏの
１０％ジメチルアミノエタノール水溶液中、７０℃で２
ｈｒ加熱した。成型品を水洗後、乾燥して、アミノメチ
ル化成型品りを得た。

実施例１と同様にして赤外線吸収スペクトルによってこ
れらの構造を確認した。

実施例１のポリミキシン溶液１０ｍ１ずつを１０個の成
型品Ｃに入れ、室温で３日間静置した。溶液を捨て、成
型品を水で１０回洗浄して、ポリミキシンを固定化した
本発明成型品■を得た。

本発明成型品■には１２．２μｇのポリミキシンが固定
化されていることが、アミノ酸分析の結果かられかった
。また、ジアミノ酪酸の回収率が３０％であったことか
ら、ポリミキシン分子は５個の塩基性アミノ基のうちの
約４個で成型品（クロルアセチル基と反応）と結合して
いることがわかった。

実施例３゜ マウスマクロファージ株ＴＭＥ９　（小川恭喜ほか、　
日本免疫学会総会・学術集会記録、１７５９９　（１９
８７））を３Ｘ１０−５Ｍの２−メルカプトエタノール
、５０Ｕ／ｍｌのペニシリン（万有）、５０μｇ　／　
ｍｌのストレプトマイシン（明治製菓）およびウシ胎児
血清を１０％含むＲＰＭ１１６４０（Ｇｉｂｃｏ　　社
）に３×１０５個／ｍｌ浮遊したものを、実施例１で得
られた本発明成型品１１グラミシジンＳ固定化成型品、
および、成型品ＡおよびＢ（いずれも紫外線照射滅菌）
に２ｍｌずつ入れ、インキュベーター中（３７℃、５％
Ｃ０２）で２０ｈｒ培養した。培養上清を取ってその中
のサイトカインを調べたところ、ポリミキシンを固定化
したもの（本発明成型品Ｉ）ではインターロイキン−１
は１３．５Ｕ／ｍｌ、Ｇ−Ｃ８Ｆは１１、　８Ｕ／ｍｌ
、インターロイキン−６は４８４０Ｕ／ｍｌ、といずれ
も高い活性が認められた。また、ＴＮＦは２．　３　Ｕ
／ｍｌ、　ＧＭ　−ＣＳ　Ｆは１．９Ｕ　／　ｍｌとい
ずれも活性が認められた。一方、グラミシジンＳ固定化
成型品、成型品Ｂではインターロイキン−１は１Ｕ／ｍ
ｌ以下、Ｇ−Ｃ８Ｆは１゜２　Ｕ　／　ｍｌ以下、ＴＮ
Ｆは２　Ｕ　／　ｍ１以下、ＧＭ−Ｃ８Ｆは１．６Ｕ／
ｍ１以下といずれも活性が認められ無かった。また、成
型品Ａではインターロイキン−１はＩＵ／ｍ１以下、Ｔ
ＮＦはＩＵ／ｍ１以下といずれも活性が認められ無かっ
た。また、インターロイキン−６は、グラミシジンＳ固
定化成型品では５２Ｕ／ｍｌ、成型品Ｂでは９Ｕ／ｍｌ
と低い活性しか認められ無かった。

但し、グラミシジンＳ固定化成型品は、成型品Ａに４ｍ
ｌの０．２ｍｇ／ｍｌグラミシジンＳ−エタノール溶液
（酸化マグネシウム添加）を加え４日間反応させて調製
した。固定化示は１２．７μｇで、オルニチン回収率が
５０％であったことから、グラミシジンＳは２個のアミ
ノ基のうち１個で成型品と結合していることがわかった
。

実施例４ マウス線維芽細胞系細胞株５Ｔ−２（須藤哲央はか、メ
ディカル　イミュノロジー　１９３１（１９９０））を
５Ｘ１０−’Ｍの２−メルカプトエタノール、５０Ｕ／
ｍｌのペニシリン（万有）、５０μｇ　／　ｍｌのスト
レプトマイシン（明治製菓）およびウシ胎児血清を５％
含むＲＰＭ１１６４０（Ｇｉｂｃｏ　　社）に４．２×
１０５個／ｍｌ浮遊したものを、実施例２で得られた本
発明成型品■、グラミシジンＳ固定化成型品、および、
成型品ＣおよびＤ（いずれも紫外線照射滅菌）に４．２
ｍｌずつ入れ、インキュベーター中（３７℃、５％Ｃ０
２）で２４ｈｒ培養した。培養上清を取ってその中のサ
イトカインを調べたところ、ポリミキシンを固定化した
もの（本発明成型品■）ではインターロイキン−６は４
０８Ｕ／ｍｌと活性が認められた。

一方、グラミシジンＳ固定化成型品、成型品Ｃ１成型品
りでは、それぞれ、インターロイキン−６は７　Ｕ／ｍ
ｌ、　１０　Ｕ／ｍｌ、　１０　Ｕ／ｍｌといずれも低
い活性しか認められ無かった。

また、市販の培養用シャーレ（ＦＡＬＣＯＮ１００８）
を用いた場合は、インターロイキン−６は７　Ｕ　／　
ｍｌと低い活性であった。

代　理　人　　弁理士　遠山俊−

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. （１）ビニル重合体成型品の表面に３個以上のアミノ基
   を持つ塩基性環状ペプチドを固定化して成り、且つ、５
   ００ナノメーターの波長の光に対する吸光度が１以下で
   あることを特徴とする細胞培養用容器。
2. （２）成型品の形状が、シャーレ、瓶、膜、中空糸、管
   またはこれ等を用いた組み立て品であることを特徴とす
   る請求項第（１）項記載の細胞細胞培養用容器。
3. （３）動物細胞を請求項第（１）項記載の細胞培養用容
   器と接触させることを特徴とするサイトカインの製造方
   法。
4. （４）動物細胞が、白血球であることを特徴とする請求
   項第（３）項記載のサイトカインの製造方法。
5. （５）動物細胞が、線維芽細胞系細胞であることを特徴
   とする請求項第（３）項記載のサイトカインの製造方法
   。
6. （６）サイトカインが、インターロイキン−１であるこ
   とを特徴とする請求項第（４）項記載のサイトカインの
   製造方法。
7. （７）サイトカインが、インターロイキン−６であるこ
   とを特徴とする請求項第（５）項記載のサイトカインの
   製造方法。
8. （８）表面にα−クロルアセトアミドメチル基を持つ芳
   香族ビニル重合体成型品にポリミキシンをｐＨ９〜１２
   で接触させることを特徴とする請求項第（１）項記載の
   細胞培養用容器の製造方法。