JPH03240485A

JPH03240485A - 血液細胞処理剤

Info

Publication number: JPH03240485A
Application number: JP2033945A
Authority: JP
Inventors: Kazuo Teramoto; 和雄寺本; Takayoshi Ogawa; 小川　恭喜; Noriko Nakamura; 紀子中村; Tetsuhisa Sudo; 哲央須藤
Original assignee: BIO MATERIAL KENKYUSHO KK
Current assignee: BIO MATERIAL KENKYUSHO KK
Priority date: 1990-02-16
Filing date: 1990-02-16
Publication date: 1991-10-25

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は、血液細胞に作用して有用物質を産生させ得る
血液細胞処理剤に関する。

（従来の技術）生理活性物質を不溶性担体に固定化したものはアフィニ
ティークロマトグラフ用吸着剤、治療用血液処理剤、抗
菌性材料その他分析用試薬などとして広く利用されてお
り、今後さらに幅広い応用が期待される重要な物質であ
る。

治療用血液処理剤のなかでも血液細胞を対象としたもの
としてはダラム陰性菌細胞壁由来のりボ多糖体を固定化
したちのく特開昭５９−２１１４５）やボークウッドマ
イトジェン等の植物レクチンを固定化したもの〔須賀原
はか、人口臓器　■（３）、１４０１　（１９８９））
等が知られているが、これ等は毒性の強い物質を固定化
したものである。従って、それらの使用時にこれらリガ
ンドの溶出があってはならないが、化学構造が複雑な天
然物を固定化したものであるため、その可能性が皆無で
ある補償がない欠点があり、また、リガンドが高分子で
あるためその分子の中に複数の活性部位を持ち、それ故
その作用が複雑である欠点がある。

（発明が解決しようとする課題）本発明者らは、かかる従来技術の問題点に鑑み、毒性の
ない低分子化合物を不溶性担体に固定化し、これを血液
細胞と接触させることによって有用なサイトカイン等を
産生させられないか検討した結果、リポ多糖体の構成成
分であるＮ−アセチルノイラミン酸を固定化したものが
単核球系細胞にインターロイキン−１、インターロイキ
ン−６、ＴＮＦ、Ｇ−Ｃ３ＦおよびＧＭ−Ｃ３Ｆ等を産
生させることを見出し、本発明に到達した。

（課題を解決するための手段）本発明は、以下の（１）〜（６）の技術的手段から構成
される。

（１）不溶性担体の表面にＮ−アセチルノイラミン酸を
アミド結合で固定化して成る血液細胞処理剤。

（２）不溶性担体が、シャーレ、瓶、膜、繊維、中空系
、粒状物またはこれ等を用いた組み立て品であることを
特徴とする上記（１）記載の血液細胞処理剤。

（３）白血球を上記（１）記載の血液細胞処理剤と接触
させることを特徴とするサイトカインの製造方法。

（４）サイトカインが、インターロイキン−１であるこ
とを特徴とする上記（３）記載のサイトカインの製造方
法。

（５）サイトカインが、コロニー刺激因子であることを
特徴とする上記（３）記載のサイトカインの製造方法。

（６）サイトカインが、インターロイキン−６であるこ
とを特徴とする請求項第（３）項記載のサイトカインの
製造方法。

（７）不溶性担体がスチレンまたはα−メチルスチレン
を主体とするビニル重合体成型品の表面にアミノメチル
基を導入したものであることを特徴とする上記（１）記
載の血液細胞処理剤。

本発明でいう不活性担体とは、実質上不溶性で、第１級
または第２級アミノ基を有し、かつ、Ｎ−アセチルノイ
ラミン酸をアミド結合で固定することのできる担体を意
味する。該不溶性担体の形状はシャーレ、瓶、管、膜、
繊維、中空糸、粒状物またはこれ等を用いた組み立て品
のいずれでもよいが、とりわけ、これ等に光透過性があ
ると細胞の観察が容易にでき、細胞の管理がしやすいの
で好ましい。

本発明でいう不溶性担体の具体例をあげると、■スチレ
ンまたはα−メチルスチレンの単独重合体もしくはこれ
らの主成分とする芳香族ビニル系共重合体をシャーレ、
試験管、管、フィルム、瓶、注射筒、カテーテルなどに
成型したものの表面にアミノメチル基を導入したもの、
■スチレン／エチレン・ブチレンのＡＢＡブロックコポ
リマの膜にアミノメチル基を導入したもの、■ポリプロ
ピレン補強ポリスチレン繊維の表面にアミノメチル基を
導入したもの、■ポリスチレンまたはスチレン・ジビニ
ルベンゼン共重合体ビーズに、アミノメチル基を芳香核
置換基として導入したもの、■アミノプロピル化ガラス
ピーズなどがあげられるが、これ等に限定されるもので
はない。また、これらのなかでも、■と■が光透過性が
高く、且つ、取り扱いやすいので、特に、好ましく用い
られる。

■の場合、成型品の厚みには特に制限はないが、実用に
耐える強度を維持するためには、通常、１００ミクロン
以上の厚みを持つものが好ましく用いられる。また、そ
の光透過性に関しては該成型品の底面または側面の反対
側に存在する物質の形を確認可能にするに十分な光透過
性を有することが望ましい。該成型品の光透過性は主と
して表面での散乱によって決まるので、表面が完全に平
滑でな４Ｊればならない。該成型品の場合、５００〜７
００ナノメーターの波長の光に対する吸光度が３以下で
あることが必要である。この吸光度が小さいほど該成型
品の光透過性が良（、吸光度が１以下であればさらに好
ましい。

本発明血液細胞処理剤の製造は、不溶性担体をに一アセ
チルノイラミン酸とカルボジイミドの混合溶液に加える
か、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルで代表され
る活性エステルの溶液中に浸漬することにより容易に達
成される。

本発明でいうサイトカインとはインターロイキン−１、
インターロイキン−２、インターロイキン−６等で代表
されるインターロイキン類、０ＭＣ３Ｆ、（、−Ｃ３Ｆ
等で代表されるコロニー刺激因子、インターフェロン、
ＴＮＦ等を意味する。

本発明で用いるＮ−アセチルノイラミン酸は動物界に広
く存在する炭素数が９個のα−ケト酸であるが、有機合
成の手段でも得ることができる。

水酸基をカルボン酸エステルにしたものも細胞が分泌す
る加水分解酵素によって容易に脱エステル化されるので
、同様に用いることができる。なお実施例３に示めされ
るように、この物は固定化しない状態ではサイトカイン
の誘導能は殆どない。

不溶性担体に固定化して初めて活性がでる。

コロニー刺激因子は軟寒天中で顆粒球、マクロファージ
の幹細胞を刺激して、成熟した顆粒球やマクロファージ
から成るコロニーを形成させる特異的刺激因子として知
られている糖蛋白質である。

コロニー刺激因子の中には、ＧＭ−Ｃ３Ｆ、ＧＣ３Ｆ、
Ｍ−Ｃ３Ｆ等があることが知られている。

また、これ等は単球、マクロファージ、線維芽細胞、血
管内皮細胞、骨髄ストローマ等によって産生されること
が知られている。ＧＭ−Ｃ３Ｆは白血球の数の増加だけ
でな（、顆粒球機能の亢進の作用もあることが知られて
おり、骨髄性白血病の治療、ＡＩＤＳや癌の化学療法後
の白血球減少症の治療のためにも使われている［実験医
学　１（１５）（増刊）１９８−２０３　（１９８９）
）。

また、Ｇ−Ｃ３Ｆも同様に重症感染症の予防や治療に用
いられる〔実験医学　ユ（１５）（増刊）１９１１９７
　（１９８９））。

インターロイキン−１は白血球が産生ずる発熱物質とし
て古くから知られているが、最近ではいろんな作用のあ
ることが知られており、特に抗腫瘍効果や造血促進作用
があり、臨床への利用が試みられている（実験医学　７
（１５）（増刊）１７０−１７７　（１９８９））。

血液細胞を本発明の血液細胞処理剤と接触させながら培
養すると、血液細胞は活性化されて、実施例３に示すよ
うに高濃度の種々のサイトカインを産生じた。この場合
、血液細胞の中から単球だけを取り出して処理すること
もできるし、いろんな血液細胞の混合物を処理する利用
方法もある。

産生されたサイトカインはｉｎ　ｖｉｖｏおよびｉｎ　
ｖｉｔｒ。

での白血球増加剤として利用できる。

本発明の血液細胞処理剤の利用としては血液回路、細胞
培養用器具、体外循環用カラム充填材料等への利用があ
げられる。

（発明の効果）本発明の血液細胞処理剤は、■サイトカイン等の有用物
の産生に用いることができること、■化学的に安定なア
ミド結合で固定化されているので、溶出の心配がないこ
と、■万一、溶出しても無毒な化合物であること、■細
胞を傷めない等の利点を有する。

以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。

なお、実施例中の評価方法は、以下に従った。

■、芳香族ビニル系重合体成型品の化学的解析成型品を
塩化メチレンでソックスレー抽出すると不溶性の膜状物
が得られるので、これを真空乾燥し、重量を量り、赤外
線吸収スペクトル測定等を行った。

２、赤外線吸収スペクトル島津フーリエ変換赤外分光光度針ＦＴＩＲ４３００を用
いＫＢｒ錠剤法で測定した。

３、成型品の光透過性の測定島津分光光度計ＵＶ２１００を用い、５００ナノメータ
ーで板状成型品に垂直方向の吸光度を測０定した。対照として同じ厚さのポリスチレン板状成型品
の吸光度を測定し、両者の差をＡ　Ｓ　０１１とした。

従って、その値が小さいほど成型品の光透過性が高いこ
とになる。

４、Ｎ−アセチルノイラミン酸の定量シアル酸の定量法（生化学実験法　２３　１！蛋白質実
験法　１７頁　学会出版センター）にもとづいて、蛍光
標識１．２−ジアミノ−４５−メチレンジオキシベンゼ
ンを反応させ、高速液体クロマトグラフィーで定量した
。

５、サイトカインの定量ＣＭ−Ｃ３Ｆ、Ｇ−Ｃ３Ｆ、インターロイキン１はＭＴ
Ｔ法（Ｔ８Ｍｏｓｍａｎ＋ジャーナル　オブザ　イミュ
ノロジカル　メソツズ　６５５５〜６３　（１９８３）
）により分析した。

インターロイキン−６はインターロイキン−６依存性細
胞の増殖率により分析した。

ＴＮＦはＬ９２９をインジケーターセルとした殺細胞能
により定量した。

実施例１゜１−二トロプロパン５００ｍと硫酸２７２ｍ１の混合溶
液を０°Ｃに冷却し、２０．４　ｇのＮ−メチロール−
α−クロルアセトアミドを加え、０〜１０°Ｃで溶解し
た。

この溶液を１０°Ｃに昇温したのち、φ３．５ｃｍＸ１
．２ｍｍＨのポリスチレン製培養皿（厚み１ｍｍ）に１
１ｍ２ずつ入れ、室温でｌｈｒ反応させた。反応液を捨
て、培養皿を零下２０°Ｃのメタノールに浸し、さらに
メタノールおよび水で洗った後、真空乾燥して、内部表
面だけクロルアセトアミドメチル化された成型品Ａを得
た。この成型品のＡ　５００は０．０５０であった。

上記で得た成型品Ａ１個を、塩化メチレンでソックスレ
ー抽出したところ、薄膜状の不溶物３．１ｍｇが得られ
た。培養皿の反応面は表面積は２１ｃｍ２であるので、
反応部の厚みは大体１．２μと考えられる。また、この
不溶物の赤外線吸収スペクトルでは、１６５９ｃｍ”（
アミド−■）、１５２９ｃｍ”（アミド−■）および３
２９７ｃｍ−’　（Ｎ−Ｈ）にアミド基の強い吸収が認
めら１２れたことからその構造を確認した。

上記で得た成型品Ａ４０個を、２０００ｄの１０％ジメ
チルアミノエタノール・ジメチルスルホキサイド溶液中
に浸し、室温で１８ｈｒ静置した後、２０００ｄの１０
％ジメチルアミノエタノール水溶液中、７０°Ｃで２ｈ
ｒ加熱した。成型品を水洗後、乾燥して、アミノメチル
化成型品Ｂを得た。

この成型品のＡ５゜。は０．０５であった。

上記本発明の成型品Ｂ１個を、塩化メチレンでソックス
レー抽出したところ、薄膜状の不溶物２、３　ｍ　ｇが
得られた。この不溶物の赤外線吸収スペクトルでは、成
型品Ａで認められた１６５９ｃｍ−’（アミド−■）お
よび１５２９ｃｍ−’（アミド−■）の第一級アミド基
の強い吸収ｃ　ｍ−’が完全に消失していたことからそ
の構造を確認した。

上記本発明の成型品８１０個を５００　ｍｆｌの水に浸
し、Ｎ／１００−塩酸でＰＨ５〜６に調整した後、成型
品Ｂの内部に０．２ｍｇ／ｍ１ＯＮ−アセチルノイラミ
ン酸水溶液４ｍβと１−エチル−３＝（３−ジメチルア
ミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩８ｍｇを加え、室
温で４８ｈｒ静置した。

反応液を捨て、水洗して、本発明の血液細胞処理剤であ
る成型品Ｃを得た。母液中のＮ−アセチルノイラミン酸
の濃度から０．０２２　ｍ　ｇ固定化されたことが確認
された。また、成型品上のＮ〜ルアセチルノイラミンは
Ｎ／４Ｏ−ＮａＯＨで洗浄しても溶出のないことを確認
した。

実施例２゜ポリスチレン製細胞培養用マルチプレート１２Ｆ（住友
ベークライト製）の各ウェルに実施例１のアミドメチル
化反応液を５戚ずつ入れ、室温で６０ｍ１ｎ、反応させ
た。反応液を捨て、零下２０°Ｃのメタノールに投じ、
実施例１と同様に処理して、内部表面だけクロルアセト
アミドメチル化された成型品りを得た。

これを実施例１と同様に１０％ジメチルアミノエタノー
ル・ジメチルスルホキサイド溶液および１０％ジメチル
アミノエタノール水溶液で処理して、内部表面だけアミ
ノメチル化された成型品Ｅを得た。

３４成型品Ｅを１０００戚の水に浸し、Ｎ／１００塩酸でｐ
　Ｈ５〜６に調整した後、風乾し、次に、成型品Ｅの６
個のウェルに０．２ｍｇ／ｍのＮ−アセチルノイラミン
酸水溶液２１ｎ１と１−エチル−３＝（３−ジメチルア
ミノプロピル）カルボイミド塩酸塩４　ｍ、　ｇを加え
、室温で４８ｈｒ静置した。

反応液を捨て、水洗して、本発明の血液細胞処理剤であ
る成型品Ｆを得た。母液中のＮ−アセチルノイラミン酸
の濃度から０．０２０ｍｇ固定化されたことが確認され
た。

実施例３マウスマクロファージ株ＴＭＥ９　（小川恭喜ほか、日
本免疫学会総会・学術集会記録、±１５９９（１９８７
））を３　Ｘ　１０−’Ｍの２−メルカプトエタノール
、５０Ｕ／ｄのペニシリン（万有）、５０μｇ　／　ｍ
ｆｌのストレプトマイシン（明治製菓）およびウシ胎児
血清を１０％含むＲＰＭ１１６４０（Ｇｉｂｃｏ）に３
Ｘ１０−５個／成浮遊したものを、実施例２で得られた
成型品Ｆ１個（紫外線照射滅菌）のＮ−アセチルノイラ
ミン酸を固定化した６個のウェルとＮ−アセチルノイラ
ミン酸を固定化しなかった６個のウェルとに１−ずつ入
れ、インキュベーター中（３７°Ｃ１５％Ｃ０２）で２
０ｈｒ培養した。細胞の様子を顕微鏡で観察したが、少
し傷害を受けている様子が認められた。培養上清を取っ
てその中のサイトカインを調べたところ、Ｎ−アセチル
ノイラミン酸を固定化した６個のウェルではＧＭ−Ｃ３
Ｆは８．２Ｕ／戒、Ｇ−Ｃ３Ｆは３０．３Ｕ／Ｉｎ１、
ＩＬ−１は１４．９Ｕ／ｄ、ＴＮＦは６．８Ｕ／ｄ、Ｉ
Ｌ−６は３．４Ｘ１０’Ｕ／ｄといずれも高い活性が認
められた。一方、Ｎ−アセチルノイラミン酸を固定化し
なかった６個のウェルではＧＭ−Ｃ３Ｆは１．６Ｕ／ｄ
以下、Ｇ−Ｃ３Ｆは１．２Ｕ／成以下、Ｉ　Ｌ　−１は
ＩＵ／ｄ以下、ＴＮＦは２Ｕ／ｄ以下ＩＬ−６は９Ｕ／
ｄといずれも活性が認められ無かった。また、市販の培
養用シャーレ（ＦＡＬＣＯＮ　　１００８）を用い、Ｎ
−アセチルノイラミン酸を３０μｇ　／　ｒｎ（ｌを加
えて、上記と同様に培養した系ではＧＭ−Ｃ３Ｆは１、
５　Ｕ／戚以下であった。

５６

Claims

【特許請求の範囲】

（１）不溶性担体の表面にＮ−アセチルノイラミン酸を
アミド結合で固定化して成る血液細胞処理剤。
（２）不溶性担体の形状が、シヤーレ、瓶、膜、繊維、
中空糸、粒状物またはこれ等を用いた組み立て品である
ことを特徴とする請求項第（１）項記載の血液細胞処理
剤。
（３）白血球を請求項第（１）項記載の血液細胞処理剤
と接触させることを特徴とするサイトカインの製造方法
。
（４）サイトカインが、インターロイキン−１であるこ
とを特徴とする請求項第（３）項記載のサイトカインの
製造方法。
（５）サイトカインが、コロニー刺激因子であることを
特徴とする請求項第（３）項記載のサイトカインの製造
方法。
（６）サイトカインが、インターロイキン−６であるこ
とを特徴とする請求項第（３）項記載のサイトカインの
製造方法。
（７）不溶性担体がスチレンまたはα−メチルスチレン
を主体とするビニル重合体成型品の表面にアミノメチル
基を導入したものであることを特徴とする請求項第（１
）項記載の血液細胞処理剤。