CN109097317A

CN109097317A - 一种酸胁迫抗性提高的乳酸菌工程菌及其应用

Info

Publication number: CN109097317A
Application number: CN201811026830.6A
Authority: CN
Inventors: 张娟; 杨佩珊; 陈坚; 堵国成; 王逸凡; 刘为佳
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2018-09-04
Filing date: 2018-09-04
Publication date: 2018-12-28
Anticipated expiration: 2038-09-04
Also published as: CN109097317B

Abstract

本发明公开了一种酸胁迫抗性提高的乳酸菌工程菌及其应用，属于基因工程以及微生物工程技术领域。本发明以编码金属离子ABC转运蛋白通透酶ZitP(metal ABC transporter permease)的基因为目的基因，以乳酸菌为表达宿主，成功构建了一种可广泛应用于制备食品、药品、饲料以及化学品的乳酸菌工程菌；此乳酸菌工程菌的酸胁迫抗性得到了显著提高，较野生菌株最高提高了14.5倍。

Description

一种酸胁迫抗性提高的乳酸菌工程菌及其应用

技术领域

本发明涉及一种酸胁迫抗性提高的乳酸菌工程菌及其应用，属于基因工程以及微生物工程技术领域。

背景技术

乳酸菌是一类能利用可发酵碳水化合物产生大量乳酸的细菌的通称。这类细菌在自然界分布极为广泛，具有丰富的物种多样性。它们不仅是研究分类、生化、遗传、分子生物学和基因工程的理想材料，在理论上具有重要的学术价值，而且在工业、农牧业、食品和医药等与人类生活密切相关的重要领域应用价值也极高。

但是，在乳酸菌的工业化发酵生产过程中，常常存在酸胁迫的问题。

酸胁迫是由乳酸菌代谢产物乳酸、乙酸等酸性物质造成的，随着菌体的代谢生长过程，酸性物质也随之产生并积累，这些积累的乳酸、乙酸等酸性物质通过被动扩散进入细胞质，由于胞内的pH通常较胞外的pH高0.5～1.0，进入胞内的乳酸、乙酸等迅速解离，导致胞内pH的快速降低，使得细胞面临严重的酸胁迫，严重影响了细胞的生理活性，大大降低了乳酸菌食品微生物制造的效率，其中，以乳酸的积累导致的酸胁迫是最重要的胁迫之一。

对于酸胁迫，为维持乳酸菌发酵生产的稳定性并提高生产效率，过去，工业上常常通过在乳酸菌发酵的过程中添加外源中和剂来维持pH处于稳定的范围，例如，通过添加碱性物质(氨水或NaOH)来控制发酵环境的pH值。

然而，碱性物质的添加往往会导致副产物的积累，而副产物中形成的盐类会再次导致细胞处于高渗的环境，从而造成渗透压胁迫的产生，再次影响菌体的生长与代谢。

目前，提高乳酸菌的乳酸、乙酸等酸胁迫抗性的方法则主要有：(1)诱变育种，该方法具有简便、类型繁多等特点，但工作量大、效率低是其主要缺点；(2)生化工程策略，已有报道用过外源添加天冬氨酸以提高乳酸菌的酸胁迫耐受性，但该方法的使用造成了生产成本的增加；(3)代谢工程策略，目前利用代谢工程策略提高乳酸菌环境胁迫的方法主要包括构建新的代谢途径、拓展已有代谢途径和削弱已有代谢途径，但是，此方法存在成本高、成功率低的问题，

因此，急需找到一种新的效果优异、成本低、成功率高、操作简单、工作量少、效率高的可提高乳酸菌酸胁迫抗性的方法。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种酸胁迫抗性提高的乳酸菌工程菌及其应用。本发明以编码金属离子ABC转运蛋白通透酶ZitP(metal ABC transporter permease)的基因为目的基因，以乳酸菌为表达宿主，成功构建了一种可广泛应用于制备食品、药品、饲料以及化学品的乳酸菌工程菌；此乳酸菌工程菌的酸胁迫抗性得到了显著提高，较野生菌株最高提高了14.5倍。

本发明的技术方案如下：

本发明提供了一种酸胁迫抗性提高的乳酸菌工程菌，所述工程菌包含重组质粒与表达宿主；所述重组质粒包含目的基因以及表达载体；所述目的基因为编码金属离子ABC转运蛋白通透酶ZitP(metal ABC transporter permease)的基因；所述表达宿主为乳酸菌。

在本发明的一种实施方式中，所述乳酸菌为乳酸乳球菌。

在本发明的一种实施方式中，所述乳酸菌为乳酸乳球菌Lactococcus lactisNZ9000。

在本发明的一种实施方式中，所述金属离子ABC转运蛋白通透酶ZitP来源于乳酸乳球菌Lactococcus lactis NZ9000。

在本发明的一种实施方式中，编码所述金属离子ABC转运蛋白通透酶ZitP的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述金属离子ABC转运蛋白通透酶ZitP的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在本发明的一种实施方式中，所述表达载体为pNZ8148。

本发明提供了一种提高乳酸菌酸胁迫抗性的方法，所述方法为在乳酸菌中过量表达金属离子ABC转运蛋白通透酶ZitP。

在本发明的一种实施方式中，所述乳酸菌为乳酸乳球菌。

在本发明的一种实施方式中，所述编码金属离子ABC转运蛋白通透酶ZitP的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述过量表达为先通过编码金属离子ABC转运蛋白通透酶ZitP的基因与表达载体构建含有编码金属离子ABC转运蛋白通透酶ZitP的基因重组质粒，再将重组质粒导入乳酸菌中。

在本发明的一种实施方式中，所述表达载体为pNZ8148。

本发明提供了利用上述一种提高乳酸菌酸胁迫抗性的方法制备得到的酸胁迫抗性提高的乳酸菌。

在本发明的一种实施方式中，所述酸胁迫抗性提高的乳酸菌包含重组质粒与表达宿主；所述重组质粒包含目的基因以及表达载体；所述目的基因为编码金属离子ABC转运蛋白通透酶ZitP的基因；所述表达宿主为乳酸菌。

在本发明的一种实施方式中，所述乳酸菌为乳酸乳球菌。

在本发明的一种实施方式中，所述表达载体为pNZ8148。

本发明提供了上述一种提高乳酸菌酸胁迫抗性的方法在提高乳酸菌酸胁迫抗性方面的应用。

本发明提供了上述一种酸胁迫抗性提高的乳酸菌工程菌或上述一种提高乳酸菌酸胁迫抗性的方法在制备食品、药品、饲料以及化学品方面的应用。

有益效果：

(1)本发明首次发现在乳酸菌中过量表达ZitP蛋白可显著提高乳酸菌的酸胁迫抗性；

(2)本发明通过在乳酸乳球菌中过量表达ZitP蛋白，得到了酸胁迫抗性显著提高的重组乳酸乳球菌Lactococcus lactis NZ9000(pNZ8148/zitP)；

(3)利用本发明的方法得到的重组乳酸乳球菌Lactococcus lactis NZ9000(pNZ8148/zitP)对酸胁迫的抗性较野生型有了明显的提高，其对乳酸的抗性较野生型提高了14.5倍。

附图说明

图1：重组质粒pNZ8148/zitP的结构图；

图2：重组质粒pNZ8148/zitQ的结构图；

图3：重组质粒pNZ8148/bglF的结构图；

图4：重组质粒pNZ8148/ganP的结构图；

图5：重组菌株L lactis NZ9000(pNZ8148/zitP)、L lactis NZ9000(pNZ8148/zitQ)和对照菌株的生长曲线；

图6：重组菌株L lactis NZ9000(pNZ8148/bglF)、L lactis NZ9000(pNZ8148/ganP)和对照菌株的生长曲线；

图7：pH 4.0(乳酸调节)条件下重组菌株L lactis NZ9000(pNZ8148/zitP)与对照菌株的存活率对比；

图8：pH 4.0(乳酸调节)条件下重组菌株L lactis NZ9000(pNZ8148/zitQ)与对照菌株的存活率对比；

图9：重组菌株L lactis NZ9000(pNZ8148/zitP)、L lactis NZ9000(pNZ8148/zitQ)和对照菌株酸胁迫前后的胞内谷氨酸含量对比；

图10：重组菌株L lactis NZ9000(pNZ8148/zitP)、L lactis NZ9000(pNZ8148/zitQ)和对照菌株酸胁迫前后的胞内精氨酸含量对比；

图11：重组菌株L lactis NZ9000(pNZ8148/zitP)、L lactis NZ9000(pNZ8148/zitQ)和对照菌株酸胁迫前后的胞内天冬氨酸含量对比。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步的阐述。

下述实施例中涉及的乳酸乳球菌Lactococcus lactis NZ9000来源于荷兰NIZO研究所。

下述实施例中涉及的培养基如下：

氯霉素平板：蛋白胨(英国Oxoid公司)1％(m/v)、酵母粉(Oxoid)0.5％(m/v)、氯化钠1％(m/v)及2％(m/v)琼脂条，灭菌后添加终浓度10μg/mL氯霉素。

GM17液体培养基：在M17培养基(Oxoid)中补充5‰(m/v)的葡萄糖(Glucose)。

GM17氯霉素平板：在M17培养基(Oxoid)中补充5‰(m/v)的葡萄糖(Glucose)及2％(m/v)琼脂条，灭菌后添加终浓度10μg/mL氯霉素。

实施例1：重组菌株的构建

具体步骤如下：

(1)从NCBI数据库的中得到如SEQ ID NO.1所示的zitP基因序列、如SEQ ID NO.3所示的zitQ基因序列、如SEQ ID NO.4所示的bglF基因序列、如SEQ ID NO.5所示的ganP基因序列，根据的基因序列设计分别如表1所示的引物；

(2)以L.lactis NZ9000的基因组为模板，分别以表1中的引物通过PCR扩增获得SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5所示的基因片段；

(3)将PCR产物和载体pNZ8148分别用表1中的限制性内切酶进行双酶切，酶切产物经纯化后，进行连接；

(4)将连接产物转化大肠杆菌MC1061(商业化菌株)感受态，氯霉素平板上筛选阳性克隆，经菌落PCR验证和酶切验证，片段大小正确后再进行测序鉴定，最终获得含有正确序列的重组质粒pNZ8148/zitP(结构如图1所示)、pNZ8148/zitQ(结构如图2所示)、pNZ8148/bglF(结构如图3所示)、pNZ8148/ganP(结构如图4所示)；

(5)从重组E.coli MC1061中提取重组质粒，电转化感受态L.lactis NZ9000细胞，氯霉素平板上筛选阳性克隆，经菌落PCR验证和酶切验证，片段大小正确后，最终获得含有正确重组质粒的菌株L lactis NZ9000(pNZ8148/zitP)、L lactis NZ9000(pNZ8148/zitQ)、L lactis NZ9000(pNZ8148/bglF)、L lactis NZ9000(pNZ8148/ganP)。其中，电转化条件为：1μL质粒中与40μ的感受态细胞混合，移入预冷的电转杯中，冰上放置10min；调节电压2000V，电容25μf，电阻200Ω进行电击；电击完毕后，立即向电转杯中加入含有20mMMgCl₂和2mM CaCl₂的GM17培养基(培养基配方：M17broth培养基+0.5％glucose)；然后置于30℃静置培养1.5h，涂布于含有氯霉素的GM17平板上，培养36h，挑取转化子验证。

表1引物与酶切位点

实施例2：重组菌株的生长性能试验

具体步骤如下：

(1)将菌株L lactis NZ9000(pNZ8148)(对照)和实施例1得到的菌株L lactisNZ9000(pNZ8148/zitP)、L lactis NZ9000(pNZ8148/zitQ)、L lactis NZ9000(pNZ8148/bglF)、L lactis NZ9000(pNZ8148/ganP)分别接种于加了10μg/mL氯霉素的GM17液体培养基中进行活化，放在30℃培养箱中静置培养过夜；

(2)分别以2％的接种量将上述得到的种子液转接至新鲜的氯霉素(10μg/mL)GM17液体培养基中，30℃静置培养；

(3)在培养过程中，每隔一定时间取样，测定600nm波长下的OD值；

(4)培养至OD₆₀₀ 0.4时加入10ng/mL的nisin诱导表达转运蛋白，以时间为横坐标，OD₆₀₀值为纵坐标，绘制生长曲线(绘制得到的生长曲线如图5与图6所示)。

结果如图5所示，经生长性能试验分析，重组菌株L lactis NZ9000(pNZ8148/zitP)和L lactis NZ9000(pNZ8148/zitQ)的生物量与对照菌株没有太大差距，说明在Llactis NZ9000中过量表达ZitP和ZitQ蛋白对菌株的生长性能没有影响。

如图6所示，经生长性能试验分析，重组菌株L lactis NZ9000(pNZ8148/bglF)和Llactis NZ9000(pNZ8148/ganP)的生物量明显低于对照菌株，说明在L lactis NZ9000中过量表达BglF和GanP蛋白影响菌株的正常生长。因此后续实验对能正常生长的重组菌株Llactis NZ9000(pNZ8148/zitP)和L lactis NZ9000(pNZ8148/zitQ)的耐酸性能进行试验。

实施例3：重组菌株在乳酸胁迫条件下的耐受性试验

具体步骤如下：

将菌株L lactis NZ9000(pNZ8148)(对照)和实施例1得到的菌株L lactisNZ9000(pNZ8148/zitP)、lactis NZ9000(pNZ8148/zitQ)分别诱导培养6h，离心收集细胞，经0.85％的生理盐水洗涤两次后重悬于等体积的新鲜的pH 4.0(乳酸调节)的GM17(含有氯霉素10μg/mL)中，胁迫不同时间；将胁迫后的菌悬液洗涤两次后重悬于等体积的生理盐水中，取10μL重悬液，稀释不同梯度点种于GM17氯霉素平板上测定活菌数和存活率(结果如图7和图8所示)。

如图7和图8所示，经耐受性实验分析，在pH 4.0的GM17中胁迫4h后，重组菌株Llactis NZ9000(pNZ8148/zitP)和lactis NZ9000(pNZ8148/zitQ)的存活率分别为对照的14.5倍和9.4倍，说明重组菌株L lactis NZ9000(pNZ8148/zitP)和lactis NZ9000(pNZ8148/zitQ)对酸胁迫的耐受性显著提高。

实施例4：重组菌株胞内氨基酸含量的测定

具体步骤如下：

将菌株L lactis NZ9000(pNZ8148)(对照)和实施例1得到的菌株L lactisNZ9000(pNZ8148/zitP)、lactis NZ9000(pNZ8148/zitQ)分别诱导培养6h，用等体积磷酸缓冲液(200mmol·L^-1，pH 7.0)洗涤2次重悬于等体积的新鲜的pH 4.0(乳酸调节)的GM17(含有氯霉素10μg/mL)中，胁迫不同时间，取10.0mL菌液、离心、洗涤，收集菌体并用液氮预冻液氮预冻，保存备用。应用高效液相色谱仪对重组菌株胞内氨基酸含量进行检测。

高效液相色谱仪检测样品的制备：取1mL磷酸缓冲液重悬菌体，菌悬液转移至破碎管，使用FastPrep-24振荡破碎细胞(4.0m·s^-1)至菌悬液澄清；离心，取上清500μL，加等体积5％(m/v)的三氯乙酸(TCA)，静止放置30min去除可溶性蛋白；离心，取上清液，用水系滤膜(0.2μm)过滤到干净的样品瓶中备用。

高效液相色谱仪分析方法：OPA和硼酸进行柱前衍生；柱温设定为40.0℃；流速设定为1.0mL·min^-1；紫外检测器的波长为338nm；色谱柱选用ODS HYPERSIL(250.0mm×4.6mm×5.0μm)。

重组菌株胞内谷氨酸含量如图9所示，酸胁迫前后重组菌株胞内谷氨酸含量均高于对照菌株，谷氨酸在谷氨酸脱羧酶的作用下，消耗H⁺，生成γ-氨基丁酸和CO₂，从而维持胞内pH(pH_i)稳态。

重组菌株胞内精氨酸含量如图10所示，酸胁迫前后重组菌株胞内精氨酸含量均高于对照菌株，低pH和精氨酸存在的条件下，精氨酸被逐步降解，代谢产物包含NH₃、CO₂和鸟氨酸(ornithine)，并生成ATP。NH₃可以中和胞内的H⁺，维持pH_i的相对平衡；生成的ATP供细胞抵御胁迫压力各种生命活动所需，可以保证细胞的基础代谢和存活能力。

重组菌株胞内天冬氨酸含量如图11所示，酸胁迫前后重组菌株胞内天冬氨酸含量均高于对照菌株，天冬氨酸在天冬氨酸脱羧酶的作用下，消耗H⁺，脱掉β位置的羧基，生成丙氨酸和CO₂，有效维持pH_i的相对平衡。重组菌株通过调节氨基酸代谢，消耗胞内H⁺，生成碱性物质，从而维持胞内pH的稳态，进而帮助细胞抵御酸胁迫。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110> 江南大学

<120> 一种酸胁迫抗性提高的乳酸菌工程菌及其应用

<160> 14

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 810

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgtttgaat tattccagta tgattttatg aggaatgctc tcttagcagc gacagcaatt 60

tcaattttct cgccattact tggtgtattt cttgtcctgc gtagacaaag tctaatgtcg 120

gacacattat cgcatgtttc tttagcgggt gttgcctttg gcgtgctatt aagttggaat 180

ccaacgatta ctactttaat taccgtagtg attgctgcag tttttctaga atatttgaga 240

acgatttatc ataattacat ggaaattgcg acggcgattt tgatgtcggc gggtcttgct 300

attgctttat taattttaaa ttcttccaaa ggagcaacct ctgtaagttt agagcaatat 360

ttgtttggtt caattatcac aatttcactt tcgcaagtaa ttatgctctt tgttttggct 420

gcagttgttc tactcggatt tattctattt ttacgtccgc tttatgtgat gacatttgat 480

gaagatacgg catttgttga tggacttcca gttcgttgga tttcaattgc ctttaatatt 540

gtgacaggga ttgcgattgc actgatgatt ccggcagcgg gagctctatt ggtatcagcg 600

atcatggtgt taccagcttc gattgcgatg cgattaggaa aatctttcaa ggctgtgctt 660

tttatctcag ttattgttag ttttattggg ttaaatgctg gtttgattgc ttcttattat 720

atggatgcgc cagcctctgc cgcaataact ttgattttca ttgttctttt cttagttact 780

tcaagtttaa aacgattaat tagagggtaa 810

<210> 2

<211> 269

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Phe Glu Leu Phe Gln Tyr Asp Phe Met Arg Asn Ala Leu Leu Ala

1 5 10 15

Ala Thr Ala Ile Ser Ile Phe Ser Pro Leu Leu Gly Val Phe Leu Val

20 25 30

Leu Arg Arg Gln Ser Leu Met Ser Asp Thr Leu Ser His Val Ser Leu

35 40 45

Ala Gly Val Ala Phe Gly Val Leu Leu Ser Trp Asn Pro Thr Ile Thr

50 55 60

Thr Leu Ile Thr Val Val Ile Ala Ala Val Phe Leu Glu Tyr Leu Arg

65 70 75 80

Thr Ile Tyr His Asn Tyr Met Glu Ile Ala Thr Ala Ile Leu Met Ser

85 90 95

Ala Gly Leu Ala Ile Ala Leu Leu Ile Leu Asn Ser Ser Lys Gly Ala

100 105 110

Thr Ser Val Ser Leu Glu Gln Tyr Leu Phe Gly Ser Ile Ile Thr Ile

115 120 125

Ser Leu Ser Gln Val Ile Met Leu Phe Val Leu Ala Ala Val Val Leu

130 135 140

Leu Gly Phe Ile Leu Phe Leu Arg Pro Leu Tyr Val Met Thr Phe Asp

145 150 155 160

Glu Asp Thr Ala Phe Val Asp Gly Leu Pro Val Arg Trp Ile Ser Ile

165 170 175

Ala Phe Asn Ile Val Thr Gly Ile Ala Ile Ala Leu Met Ile Pro Ala

180 185 190

Ala Gly Ala Leu Leu Val Ser Ala Ile Met Val Leu Pro Ala Ser Ile

195 200 205

Ala Met Arg Leu Gly Lys Ser Phe Lys Ala Val Leu Phe Ile Ser Val

210 215 220

Ile Val Ser Phe Ile Gly Leu Asn Ala Gly Leu Ile Ala Ser Tyr Tyr

225 230 235 240

Met Asp Ala Pro Ala Ser Ala Ala Ile Thr Leu Ile Phe Ile Val Leu

245 250 255

Phe Leu Val Thr Ser Ser Leu Lys Arg Leu Ile Arg Gly

260 265

<210> 3

<211> 738

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atgagatata tcaatgttga aaatctgacc ttctactatg atagagagcc agtgttagaa 60

aatattagct accatgtgga ctctggtgaa tttgtcacct taactggaga aaatggagcg 120

gcaaaatcaa ctttaattaa aacaactttg ggtattttaa aaccaaagaa agggaaaata 180

acgatttctt ctaaaaataa tagaggagaa aagttacgga ttgcctacct tccgcagcaa 240

gttgcaagtt ttaacgcagg atttccgagt tctgttcatg aatttgtcat gagtggacgc 300

tatccaagac aggggtggtt taaaaaaatg ggcgctcatg atttagaaca tgtcaaggca 360

gctcttgatt cagttggtat gtgggactat cgcgataaac ggattggtga actttcggga 420

ggtcaaaagc aaaggattgc tattgcgaga atgtttgcta gtgaccctga tttatttatc 480

cttgatgaac cgacaactgg tatggatgat gtatcaagta gtgattttta tcagttgatg 540

catcatgcgg cccataagca tgggaaagca gtcctaatgg tcactcatga tcctgaggaa 600

gtgaaagatt tcgctgaccg taacattcat ctattaaaag acaaaaatgg aaagtttgct 660

tgttttgatt tgcatactga ccgtgataga gttctccaag aagagcaaga agaattagag 720

gagaaagcaa atgtttga 738

<210> 4

<211> 1566

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atggcaaatt attcacaact tgcgacagaa attatcgcaa atgtaggtgg cgctgagaat 60

gtcacaaaag ttattcactg tatcactcgt cttcgtttta ccttgaaaga caaagataaa 120

gcagatacgg cggcgattga agccttacct ggtgtcgctg gagctgttta taactcaaac 180

ttgaatcaat atcaagtagt tattggacaa gctgtagaag atgtttatga cgaggttgtt 240

gaacagcttg gagattcagt tgttgatgaa gatgcaacgg cgcaagcact tgctgcaaca 300

gcaccggcta gtggtaaaaa acaaaatcca attgttcatg ctttccaagt ggttattggg 360

acaattacag gttcgatgat tccaattatt ggtttacttg cggctggtgg gatgattaat 420

ggattattaa gtatctttgt taaaggaaat cgtttaattg aagtgattga ccctgcaagt 480

tcaacttacg tcattatctc aactctagca atgacaccat tttatttctt acctgtttta 540

gtaggatttt cagcagcaaa acaattagca cctaaagata ctgttttaca atttattggt 600

gctgctgttg gtggtttcat gattaatcca gggattacta acttggtaaa tgctcatgtt 660

ggaacaaatg cggccggtaa aaatgttgtt gttgaagcag cagctccagt agcaaatttc 720

cttggagtca cttttaatac aagttatttt ggaattccgg ttgctttgcc aagttatgct 780

tatacaattt tcccaatcat tgtggcggta gcaatcgcta aacctttgaa tgcttggttg 840

aaaaaggttt taccacttgc cttgcgtcca attttccaac cgatgattac tttcttcatc 900

actgcttcaa tcattttact cttggtcggt cctgttattt caacaatttc atctggtttg 960

tcattcgtta ttgaccatat cttgtcatta aacttaggga ttgcaagtat tatcgtcggt 1020

ggtttgtatc aatgtttggt tatatttggt ttgcactggt tggttgtacc acttatttca 1080

caagagttgg cagcaacagg agcaagctca cttaatatga ttgttagctt cacaatgctt 1140

gcgcaaggag ttggtgcctt gactgtcttc tttaaatcta aaaaagctga ccttaaagga 1200

ctttctgctc cagctgccat ttcggctttt tgtggagtaa ctgaacctgc catgtacgga 1260

attaacttga aatatgttcg cgtcttcatc atgtcttcaa ttggtgcagc aattggtgct 1320

gggattgccg gatttggtgg cttacaaatg tttggatttt cagggtcatt gattagtttt 1380

cctaacttta tctctaatcc attgacgcat catgcacctg cgggtaactt aatgctcttc 1440

tggattgcca ctgcggtatg tgctgttgcc actttcttat tagtttggtt ctttggttac 1500

aaggatactg atgtcatggg acaaggagtt gaacaaaaaa atgcatttaa ggatgctgta 1560

aaataa 1566

<210> 5

<211> 1383

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atgactaaaa agaaaaaaag aaaacaaacc gaaagtaatg tttctcctga agaaaaatct 60

attaaactac gtgaagtttt ccaaaaaggt aataccgtta caaaattaac tttcttcgtg 120

atgggcctga atcaaataaa aaacaaacag tgggtaaaag gatttacttt cttaattctt 180

gaaattgcat ttattggttg gcttcttttc tctggactta gtgctttttc tcttttgagt 240

agcttaggtc caaataaaac acttaaagaa acaacagacg ccaatggctt tccagttatt 300

attcaacccg atcactctgt tttgatttta ctttggggac tcattgcttg tcttgtcgtt 360

gttctcttta ttttacttta ctggttcaac tatcgttcaa acaaacatct ctactattta 420

gaacgggaag gcaaacatat ccctacaaat agagaagaac ttgcatccct acttgatgaa 480

aaactctatg cgacattaat ggctgttcct ttaattggag ttctagcttt cactgttttg 540

cctactgttt acatgatttc gatggctttc acaaactatg atcgtctaca tgctactgct 600

ttctcatgga ccggttttca agcctttggt aatgtcttaa ccggggattt agcgggaaca 660

ttcttccccg ttcttggttg gacattagta tgggcaattg tagcaacagc aacaacattt 720

ctcggtggtg ttttacttgc cttactcatt gagtcaactg gaattaaatt taaaggattc 780

tggagaacag tttttgttat cgtctttgcc gttccacaat ttgtaaccct attaatgatg 840

gcacaatttt tggaccaaca aggagctttt aatggaattt tgatgaatct tcatctaatt 900

tccaatccga tcaactttat tggtgcggct tctgacccaa tggttgcaag aatcactgtt 960

atatttgtta atatgtggat tggtatccct gtttcaatgc ttgtatctac agcaattatc 1020

caaaaccttc cccaagacca aatcgaagct gcacgtattg atggagcaaa tagtttaaat 1080

atcttccgtt ctatcacttt tcctcagatt ctctttgtta tgactcctgc attgattcaa 1140

caatttattg gtaacatcaa taacttcaat gttatttatc tactaacgca aggttggcca 1200

atgaatccaa actaccaagg agcaggttca accgaccttc ttgttacttg gctctacaac 1260

ctcgtctttg gtcaaactca acgttacaat gctgccgctg ttcttggtat cttgattttc 1320

attgttaatg catcaatttc attagtagca taccgtcgta ccaatgcatt taaggagggc 1380

taa 1383

<210> 6

<211> 245

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 6

Met Arg Tyr Ile Asn Val Glu Asn Leu Thr Phe Tyr Tyr Asp Arg Glu

1 5 10 15

Pro Val Leu Glu Asn Ile Ser Tyr His Val Asp Ser Gly Glu Phe Val

20 25 30

Thr Leu Thr Gly Glu Asn Gly Ala Ala Lys Ser Thr Leu Ile Lys Thr

35 40 45

Thr Leu Gly Ile Leu Lys Pro Lys Lys Gly Lys Ile Thr Ile Ser Ser

50 55 60

Lys Asn Asn Arg Gly Glu Lys Leu Arg Ile Ala Tyr Leu Pro Gln Gln

65 70 75 80

Val Ala Ser Phe Asn Ala Gly Phe Pro Ser Ser Val His Glu Phe Val

85 90 95

Met Ser Gly Arg Tyr Pro Arg Gln Gly Trp Phe Lys Lys Met Gly Ala

100 105 110

His Asp Leu Glu His Val Lys Ala Ala Leu Asp Ser Val Gly Met Trp

115 120 125

Asp Tyr Arg Asp Lys Arg Ile Gly Glu Leu Ser Gly Gly Gln Lys Gln

130 135 140

Arg Ile Ala Ile Ala Arg Met Phe Ala Ser Asp Pro Asp Leu Phe Ile

145 150 155 160

Leu Asp Glu Pro Thr Thr Gly Met Asp Asp Val Ser Ser Ser Asp Phe

165 170 175

Tyr Gln Leu Met His His Ala Ala His Lys His Gly Lys Ala Val Leu

180 185 190

Met Val Thr His Asp Pro Glu Glu Val Lys Asp Phe Ala Asp Arg Asn

195 200 205

Ile His Leu Leu Lys Asp Lys Asn Gly Lys Phe Ala Cys Phe Asp Leu

210 215 220

His Thr Asp Arg Asp Arg Val Leu Gln Glu Glu Gln Glu Glu Leu Glu

225 230 235 240

Glu Lys Ala Asn Val

245

<210> 7

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

catgccatgg ggatgtttga attattccag tatgat 36

<210> 8

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

cccaagcttt taccctctaa ttaatcgttt taaac 35

<210> 9

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

catgccatgg ggatgagata tatcaatgtt gaaaatc 37

<210> 10

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

cccaagcttt caaacatttg ctttctcct 29

<210> 11

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

catgccatgg ggatggcaaa ttattcacaa cttgcg 36

<210> 12

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

cccaagcttt tattttacag catccttaaa tgcat 35

<210> 13

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

catgccatgg ggatgactaa aaagaaaaaa agaaaac 37

<210> 14

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

cccaagcttt tagccctcct taaatgcatt g 31

Claims

1.一种酸胁迫抗性提高的乳酸菌工程菌，其特征在于，所述工程菌包含重组质粒与表达宿主；所述重组质粒包含目的基因以及表达载体；所述目的基因为编码金属离子ABC转运蛋白通透酶ZitP的基因；所述表达宿主为乳酸菌。

2.如权利要求1所述的一种酸胁迫抗性提高的乳酸菌工程菌，其特征在于，所述金属离子ABC转运蛋白通透酶ZitP来源于乳酸乳球菌Lactococcus lactis NZ9000。

3.如权利要求1或2所述的一种酸胁迫抗性提高的乳酸菌工程菌，其特征在于，编码所述金属离子ABC转运蛋白通透酶ZitP的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

4.如权利要求1-3任一所述的一种酸胁迫抗性提高的乳酸菌工程菌，其特征在于，所述表达载体为pNZ8148。

5.一种提高乳酸菌酸胁迫抗性的方法，其特征在于，所述方法为在乳酸菌中过量表达金属离子ABC转运蛋白通透酶ZitP。

6.如权利要求5所述的一种提高乳酸菌酸胁迫抗性的方法，其特征在于，所述金属离子ABC转运蛋白通透酶ZitP来源于乳酸乳球菌Lactococcus lactis NZ9000。

7.如权利要求5或6所述的一种提高乳酸菌酸胁迫抗性的方法，其特征在于，所述过量表达为先通过编码金属离子ABC转运蛋白通透酶ZitP的基因与表达载体构建含有编码金属离子ABC转运蛋白通透酶ZitP的基因重组质粒，再将重组质粒导入乳酸菌中。

8.利用权利要求5-7任一所述的一种提高乳酸菌酸胁迫抗性的方法制备得到的酸胁迫抗性提高的乳酸菌。

9.权利要求5-7任一所述的一种提高乳酸菌酸胁迫抗性的方法在提高乳酸菌酸胁迫抗性方面的应用。

10.权利要求1-4任一所述的一种酸胁迫抗性提高的乳酸菌工程菌或权利要求5-7任一所述的一种提高乳酸菌酸胁迫抗性的方法在制备食品、药品、饲料以及化学品方面的应用。