CN104316475B - 一种基于分光光度法的活芽孢含量高通量检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种基于分光光度法的检测活芽孢含量的高通量检测方法，利用芽孢一旦遇到合适的环境，就会迅速萌发，从休眠状态转化为营养生长状态后芽孢折光性很强，而在萌发过程中，这些多层结构吸水膨胀、折光性消失，导致光吸收下降。本发明以光吸收下降作为芽孢萌发活性的表征，用于评价芽孢繁殖活力的大小，可以大大简化活芽孢含量检测流程，克服传统方法检测工作量大、周期长和成本高等问题。

Description

一种基于分光光度法的活芽孢含量高通量检测方法

技术领域

本发明涉及一种基于分光光度法的检测活芽孢含量的高通量检测方法，属于现代微生物学技术和发酵工程技术领域。

背景技术

芽孢是某些细菌在生长发育后期，在细胞内形成的圆形或椭圆形的抗逆性内生休眠体。芽孢对热、紫外线、电磁辐射和某些化学药品有很强抗性，可耐受各种不良甚至极端环境。

芽孢杆菌属是一个重要的与人类关系极为密切的微生物类群。芽孢杆菌包含许多有特殊功能的菌株，在工业、农业、医学等科学领域研究中有广泛的应用价值，越来越引起人们重视和研究。芽孢杆菌在农业有着广泛的应用，以蜡状芽孢杆菌为代表的诸多种类可做饲料用微生物添加剂，提高饲料利用率，降低饲料成本，减少牲畜疾病发生；很多生物农药也由芽孢杆菌制成，芽孢杆菌的许多种类是昆虫的病原菌或者具有杀虫活性，如蜡状芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、球形芽孢杆菌，尤其苏云金芽孢杆菌及其伴胞晶体是农业上良好的杀虫剂，已成为世界上产量最大的生物农药。另外，根据微生态学原理，对人体无害甚至有益的芽孢杆菌还可以作为保健品或药品服用，促进恢复菌群平衡，防治疾病和提高人类健康水平；很多芽孢杆菌尤其是嗜碱性芽孢杆菌在强碱性环境中具有出色的矿化能力，近年来还被用于建筑材料裂缝的修复与自修复研究。

由于芽孢具有对不良环境的抗逆性，芽孢杆菌生物制剂大都采用芽孢的形式制备，以确保在长时间内具有稳定的生物活性。而活芽孢含量是芽孢杆菌生物制剂质量的重要指标。

传统的检测活芽孢含量的方法是基于浓度梯度稀释和平板培养的活菌菌落计数法。然而，该方法需要进行大量的稀释、涂板、培养、计数等工作，存在工作量大、周期长、效率低和成本高等缺点。

芽孢一旦遇到合适的环境，就会迅速萌发，从休眠状态转化为营养生长状态。芽孢可以被诸如肌苷、L-丙氨酸、葡萄糖、十二烷胺等物质诱导萌发。芽孢的含水量低(40％)，具有厚而致密的多层结构，折光性很强，而在萌发过程中，这些多层结构吸水膨胀、折光性消失，导致光吸收下降。因此以光吸收下降作为芽孢萌发活性的表征，用于评价芽孢繁殖活力的大小，可以大大简化活芽孢含量检测流程，克服传统方法的固有缺点。

发明内容

为了克服检测活芽孢含量通常所采用的常规方法存在的工作量大、周期长和成本高等问题，本发明提供了一种基于非培养和酶标仪光吸收检测的高通量检测方法。

高通量检测活芽孢含量的方法如下：

采用合适的培养条件培养待测菌种，芽孢比率达到95％以上时，取发酵液4000-6000×g离心10-20min，加入去离子水，制备高存活率的萌发芽孢水悬液，通过调整加入去离子水的体积，调整其OD₄₉₀值为0.5-1.7；采用传统活菌菌落计数法检测该芽孢悬液的活芽孢浓度；

选择一种在待测菌种芽孢萌发条件下不能萌发的产芽孢菌种作为非萌发芽孢的来源，采用合适的培养条件进行培养，通过4000-6000×g离心10-20min，加入去离子水，制备两种不同芽孢浓度的非萌发芽孢水悬液：一种的OD₄₉₀与高存活率待测芽孢水悬液相同，用于制备标准曲线；另一种芽孢浓度高达1×10¹⁰-5×10¹⁰个/ml，用作待测样品的光密度调节剂。

将上述萌发芽孢水悬液和非萌发芽孢水悬液分别以0：10，1：9，2：8，4：6，6：4，8：2，10：0的体积比混匀，制备萌发芽孢比率占总芽孢比率分别为0％，10％，20％，40％，60％，80％，100％的芽孢悬浮液，若(a)步骤中所获得的萌发芽孢水悬液活芽孢浓度为A个/ml，以上梯度浓度芽孢悬液的活芽孢浓度依次为则0，0.1A，0.2A，0.4A，0.6A，0.8A，A。将以上芽孢悬浮液放入水浴锅热激处理，60-80℃加热10-30分钟。热激处理后分别取10-190μL加入多孔板中，再加入一定体积萌发缓冲液补足至200-300μL，混匀，制成萌发反应液，利用酶标仪检测反应液的初始OD₄₉₀值，之后将多孔板放于28-37℃恒温培养箱中反应1.5-3小时后，检测终点OD₄₉₀值，计算不同芽孢悬浮液的OD₄₉₀下降值，以OD₄₉₀下降值为横坐标，相应的活的萌发芽孢浓度作为纵坐标，绘制标准曲线，并拟合获得标准曲线公式。

若待测样品为粉剂，用去离子水在离心管或试管中将芽孢制成水悬液，通过调整去离子水的加入量，将芽孢悬液调至OD₄₉₀值与步骤高存活率萌发芽孢水悬液OD₄₉₀值相等；若待测样品为水悬液而且OD₄₉₀小于0.5，则向该芽孢悬液中加入光密度调节剂使其OD₄₉₀值与高存活率萌发芽孢水悬液OD₄₉₀值相等；若芽孢制品为水悬液而OD₄₉₀大于1.7，则向该芽孢悬液中加去离子水使其OD₄₉₀值与步骤高存活率萌发芽孢水悬液OD₄₉₀值相等。将盛有待测芽孢悬浮液的离心管或试管放入水浴锅，60-80℃加热10-30分钟。

分别取与标准曲线制备中芽孢悬浮液相同体积的该待测芽孢悬浮液加入多孔板中作为实验组；将剩余芽孢悬液4000-6000g离心5-15min，分别取等体积上清液加入多孔板中作为对照组；向各孔中加入一定体积芽孢萌发缓冲液，混匀。

光密度值检测与光密度下降值计算：利用酶标仪检测实验组和对照组中芽孢萌发反应液的初始OD₄₉₀值；检测完成后，将多孔板放于30℃恒温培养箱中培养1.5-3小时，期间每隔30分钟混匀1次。培养完成后，利用酶标仪检测实验组和对照组的芽孢萌发反应液的终点OD₄₉₀值。按照以下公式计算OD₄₉₀下降值ΔOD₄₉₀，将ΔOD₄₉₀值代入步骤c所获得的标准曲线公式，计算获得活芽孢含量。

ΔOD₄₉₀＝(ΔOD₁+ΔOD₂+ΔOD₃)÷3－(ΔOD_C1+ΔOD_C2+ΔOD_C3)÷3

其中ΔOD_n为实验组第n个孔中芽孢萌发反应液的初始OD₄₉₀值与终点初始OD₄₉₀的差值；ΔOD_Cn为对照组第n个孔中芽孢萌发反应液的初始OD₄₉₀值与终点初始OD₄₉₀的差值。

所述待测样品可以是含有芽孢的发酵液，也可是粉状的生物制剂。

所述高存活率芽孢的发酵，根据待测菌种不同，需采用不同的培养基和培养条件。

所述非萌发芽孢菌种，根据待测菌种不同，需要从不同类群中选择，如若待测菌株为嗜碱性芽孢杆菌，则可选择嗜中性pH芽孢杆菌作为非萌发芽孢的来源；而若待测菌株为嗜中性pH芽孢杆菌，则可选择嗜碱性芽孢杆菌作为非萌发芽孢杆菌的来源；若待测菌株为嗜盐芽孢杆菌，则可选择不耐盐的芽孢杆菌作为非萌发芽孢杆菌来源。若待测菌株为不耐盐的芽孢杆菌，则可选择嗜盐芽孢杆菌作为非萌发芽孢杆菌来源；还可以将待测菌株芽孢以121℃灭菌15min的死芽孢作为非萌发芽孢；

所述芽孢萌发缓冲剂包括芽孢萌发剂、渗透调节剂、pH缓冲剂。

所述芽孢萌发剂为以下化合物之一，肌苷、黄苷、鸟苷、腺苷、丙氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、葡萄糖、果糖、肽聚糖、甘露醇、蔗糖、十二烷胺、溶菌酶、苔藓虫素、酵母粉、蛋白胨、牛肉膏、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、酪蛋白。

所述pH缓冲剂，根据待测菌种芽孢萌发对不同pH的依赖性，选择以下缓冲剂中可以提供最适萌发pH的缓冲剂：磷酸盐缓冲剂、硼酸盐缓冲剂、醋酸盐缓冲剂、草酸盐缓冲剂、酒石酸盐缓冲剂、苯二甲酸氢燕缓冲剂、甘氨酸缓冲液、碳酸盐缓冲液、氨-氯化铵缓冲液、AMP(2-氨基-2甲基-1-丙醇)、AMPD(2-氨基-2-甲基-1，3-丙二醇)、AMPSO(3-[(1.1-二甲基-2-羟乙基氨基]-2-羟基丙磺酸)、BES(N,N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸)、TRIS(三羟甲基氨基甲烷)、CAPS(3-(环己胺)-1-丙磺酸)、CAPSO(3-(环己胺)-2-羟基-1-丙磺酸)、CHES(2-(环已胺)-3-乙磺酸)、HEPPS(4-羟乙基哌嗪丙磺酸)、HEPPSO(3-(羟乙基哌嗪)-2-羟基丙磺酸)、HEPBS(N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-4-丁磺酸)、MOPS(3-吗啉丙磺酸)、、MOPSO(3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸)TAPS(N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙烷磺酸)、TAPSO(3-三羟甲基甲胺-2-羟基丙磺酸)。

渗透调节剂可以为以下化合物之一，氯化钠，氯化钾。

芽孢萌发剂浓度为1-100mM，pH缓冲剂浓度为20-2M，渗透调节剂浓度为10mM-6M。

所述渗透调节剂浓度，根据待测菌种芽孢萌发对盐度的依赖性，选择10mM-3M范围内合适的浓度；

所述芽孢萌发光吸收下降的检测波长为450nm-750nm。

所述多孔板包括6孔板、12孔板、24孔板、48孔板、96孔板、384孔板任意一种。

所述芽孢萌发缓冲剂与待测芽孢悬浮液体积比在1:9到9:1范围内。

本方法实现了活芽孢含量的高通量检测。以芽孢萌发引起的光吸收下降作为活芽孢含量的表征的新方法，不依赖培养，不需要无菌操作，而且利用酶标仪可以快速检测光吸收值。本发明新方法的效率高，速度快；反应和检测体系微型化，消耗试剂少，成本低；容易实现自动化操作，借助自动化高通量筛选工作站可以进一步大幅降低工作量，提高检测效率。

附图说明

图1.光吸收法检测活芽孢含量标准曲线；

图2.酵母粉浓度对活芽孢产量的影响；

图3.淀粉浓度对活芽孢产量的影响；

图4.氯化钠浓度对活芽孢产量的影响；

图5.装液量对活芽孢产量的影响；

图6.pH对活芽孢产量的影响。

在附图中：●，实心圆为光吸收法获得的活芽孢检测结果；〇，空心圆为传统活菌菌落计数法获得的活芽孢浓度检测结果。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明进行更为具体的说明，实施例中所提及的内容并非对本发明的限定。

酵母粉浓度对Bacillus sp.H4活芽孢产量的影响，比较常规菌落计数方法和本发明所述方法获得的结果，以验证分光光度法的可行性。

待测菌株Bacillus sp.H4为一株嗜碱芽孢杆菌，选择嗜中性pH的菌株Bacillussubtilis ATCC6051作为非萌发芽孢的来源。将Bacillus sp.H4以8mm间距点接种于碱性全酵母固体培养基上，培养7-10天。将Bacillus subtilis ATCC6051以8mm间距点接种于全酵母固体培养基上，培养7-10天。用灭菌牙签将固体培养基上的Bacillus subtilisATCC6051菌落挑入灭菌去离子水中，制备成2种不同芽孢浓度的芽孢悬浮液，一种OD₄₉₀为1.7的非萌发芽孢悬浮液，另一种采用YK-Heber型细菌计数板计数细胞浓度调整浓度至2×10¹⁰个/ml，作为光密度调节剂；用灭菌牙签将固体培养基上的Bacillus sp.H4菌落挑入灭菌去离子水中，制备成萌发芽孢悬浮液，使其OD₄₉₀为1.7，采用热激处理(60℃水浴30min)、菌落计数法和碱性全酵母固体培养基检测该芽孢悬浮液的活芽孢浓度。

按下表将非萌发芽孢悬浮液(OD₄₉₀为1.7的Bacillus subtilisATCC6051芽孢悬浮液)和萌发芽孢悬浮液(OD₄₉₀为1.7Bacillus sp.H4芽孢悬浮液)，按不同比率配制成含有不同浓度Bacillus sp.H4芽孢，但Bacillus subtilis ATCC6051芽孢与Bacillus sp.H4芽孢的总和相同的8种芽孢悬浮液。该表中8种芽孢悬浮液进行热激处理，60℃水浴加热30min，之后每种各取25μL分别加入96孔板的5个孔中，再用300μL多通道移液器迅速向每个孔中加入萌发缓冲剂175μL并混匀。利用酶标仪检测每个孔的OD₄₉₀值，检测完成后将96孔板放于30℃的恒温培养箱中反应2小时后，用300μL多通道移液器混匀，迅速放于酶标仪中检测每个孔的OD₄₉₀值，计算获得OD₄₉₀下降值，以这8种芽孢悬浮液的OD₄₉₀下降值为横坐标，以相应的Bacillus sp.H4活芽孢含量为横坐标，绘制如图1所示的活芽孢含量-OD₄₉₀下降值标准曲线。8种芽孢悬浮液的活芽孢含量分别为各自Bacillus sp.H4芽孢百分比与OD₄₉₀为1.7的萌发芽孢悬浮液活芽孢含量的乘积。

将在碱性LB培养液中150rpm 30℃震荡培养16小时的Bacillus sp.H4按8％接种量分别接种于含有不同酵母粉浓度的MMN培养基(硝酸盐无机培养基)，如图2所示，酵母粉浓度分别为0、0.5、1、2、3、4、6、8、10g/L，150rpm，30℃发酵7-10天；如图3所示，将以上16小时种子培养物接种于MMN发酵液装液量分别为25、50、75、100、125、150ml的250ml三角瓶中，150rpm，30℃发酵7-10天；将以上16小时种子培养物按8％接种量接种于不同pH的MMN发酵液，如图4所示，pH分别为10.95、10.36、9.99、9.64、9.16，，150rpm，30℃发酵7-10天；将以上16小时种子培养物按8％接种量接种于不同淀粉浓度的MMN培养基，如图5所示，淀粉浓度分别为1、2、4、6、10、15、20g/L，150rpm，30℃发酵7-10天；将以上16小时种子培养物按8％接种量接种于不同氯化钠含量的MMN培养基，如图6所示，氯化钠浓度分别为0、4、8、16、32、64、128g/L，150rpm，30℃发酵7-10天。

采用热处理-传统活菌菌落计数法检测以上不同MMN培养液中活芽孢含量。

采用新发明方法检测以上不同MMN培养液中活芽孢含量：发酵液采用6000×g离心15min，加入等体积去离子水，取1.5ml该芽孢悬浮液加入比色皿中，用721型分光光度计检测OD₄₉₀值，向OD₄₉₀低于1.7的发酵液中加光密度调节剂，使其OD₄₉₀达到1.7，向OD₄₉₀高于1.7的发酵液中加去离子水，使其OD₄₉₀减小到1.7(芽孢发酵收获的芽孢悬液OD₄₉₀一般不会超过1.7)。将调整好OD₄₉₀值的芽孢悬浮液进行热激处理，60℃水浴加热30min，之后每种各取25μL分别加入96孔板的5个孔中，再用300μL多通道移液器迅速向每个孔中加入萌发缓冲剂175μL并混匀。利用酶标仪检测每个孔的OD₄₉₀值，检测完成后将96孔板放于30℃的恒温培养箱中反应2小时后，用300μL多通道移液器混匀，迅速放于酶标仪中检测每个孔的OD₄₉₀值，计算获得OD₄₉₀下降值，将OD₄₉₀下降值带入标准曲线公式，求出活芽孢含量。

两种方法所测得不同浓度酵母粉发酵液中活芽孢含量如图2所示；两种方法所测得不同装液量条件下发酵液中活芽孢含量如图3所示；两种方法所测得不同pH条件下发酵液中活芽孢含量如图4所示；两种方法所测得不同淀粉含量的发酵液中活芽孢含量如图5所示；两种方法所测得不同浓度氯化钠发酵液中活芽孢含量如图6所示。由图示可知，两种方法所得测试结果基本保持一致，说明本发明所述的方法有效且准确。

本实施例所用碱性LB培养基的组分和制备方法如下，酵母粉5g/L，胰蛋白胨10g/L，碳酸钠5.3g/L，碳酸氢钠4.2g/L，；按以上浓度称量酵母粉和胰蛋白胨溶解于900ml水中；称量碳酸钠和碳酸钠溶解于100ml水中；若培养基为固体培养基，则需加琼脂15g/L于溶解有酵母粉和胰蛋白胨两种营养物质的溶液中；灭菌后于无菌超净工作台中混匀即可使用。

本实施例所用碱性全酵母粉固体培养基组分和制备方法如下，酵母粉15g/L，碳酸钠5.3g/L，碳酸氢钠4.2g/L，琼脂15g/L；按以上浓度称量酵母粉和琼脂溶解于900ml水中；称量碳酸钠和碳酸氢钠溶解于100ml水中；灭菌后于无菌超净工作台中混匀倒平板即可。

本实施例所用全酵母固体培养基组分和制备方法如下，酵母粉15g/L，氯化钠5g/L，琼脂15g/L；按以上浓度称量酵母粉、氯化钠和琼脂溶解于1000ml水中；灭菌后于无菌超净工作台中混匀倒平板即可。

本实施例所用MMN培养基组分和制备方法如下，淀粉1g/L，酵母粉3g/L，硝酸钾3.75mM，氯化铵3.7mM，磷酸二氢钾0.15mM，氯化钙1.53mM，氯化钾2.68mM，氯化镁1mM，乳酸钠10mM，碳酸钠50mM，碳酸氢钠50mM。按以上浓度称量碳酸钠和碳酸氢钠溶解于100ml去离子水中；称量其它成分溶解于900ml去离子水中；灭菌后在三角瓶中混匀即可使用。

本实施例所用不同酵母粉浓度的MMN培养基的制备，只需在上述MMN培养基的900ml组分中加入相应浓度酵母粉即可，其它同MMN培养基组分和制备。

本实施例所用不同淀粉浓度的MMN培养基的制备，只需在上述MMN培养基的900ml组分中分别加入相应浓度淀粉即可，其它同MMN培养基组分和制备。

本实施例所用不同氯化钠浓度的MMN培养基的制备，只需在上述MMN培养基的900ml组分中分别加入相应浓度氯化钠即可，其它同MMN培养基组分和制备。

本实施例所用不同pH的MMN培养基的制备，只需将上述MMN培养基的100ml碳酸钠-碳酸氢钠组分用6M氢氧化钠溶液或6M盐酸溶液将其pH值调至所需pH即可，其它同MMN培养基组分和制备。

本实施例所用萌发缓冲剂组分及制备方法如下，CAPS 114.3mM，肌苷17.1mM，氯化钠228.6mM，按以上浓度称量CAPS，肌苷，氯化钠溶于30ml去离子水中即可，现配现用。

以上数据说明：

本发明以上实施例以微孔板为操作平台，基于光吸收检测的活芽孢含量测定方法的建立，为活芽孢含量检测过程实现高通量奠定了基础。基于微孔板体系的检测方法具有微量化、小型化和平行化的特点，因此采用高通量策略检测活芽孢含量能同时处理大量样品，节省人力、物力及时间，大幅提高筛选效率。

本发明以上实施例高通量筛选方法以96孔板作为检测容器，每孔装液200μL，节省培养基，成本大幅降低；

本发明以上实施例的高通量筛选方法以多通道移液器(6通道，8通道或12通道移液器)进行接种取样稀释等操作，每次操作可以相应完成6-12个样品的接种、取样或稀释，实现操作的批量化，提高了操作效率；

本发明以上实施例高通量检测方法每个样品只需要反应2小时左右，每板96个样品检测时间只需要30s，大大缩短了检测周期，提高了检测效率。

Claims (8)

1.一种基于分光光度法的活芽孢含量高通量检测方法，其步骤是：

a)高存活率萌发芽孢的制备：针对待测菌种，采用合适的培养条件进行培养并制备高存活率的萌发芽孢水悬液，调整其OD₄₉₀值为0.5-1.7；采用传统活菌菌落计数法检测该芽孢悬液的活芽孢浓度；

b)非萌发芽孢的制备：选择一种在待测菌种芽孢萌发条件下不能萌发的产芽孢菌种作为非萌发芽孢的来源，进行培养，制备两种不同芽孢浓度的非萌发芽孢水悬液：一种的OD₄₉₀与高存活率待测芽孢水悬液相同，用于制备标准曲线；另一种芽孢浓度高达1×10¹⁰-5×10¹⁰个/ml，用作待测样品的光密度调节剂；

c)标准曲线的制备：将上述萌发芽孢水悬液和非萌发芽孢水悬液以不同体积比混匀，制备含有梯度浓度萌发芽孢的芽孢悬浮液，其活的萌发芽孢浓度根据体积比与(a)步骤中所获得的萌发芽孢水悬液活芽孢浓度计算获得，将以上含有梯度浓度萌发芽孢的不同芽孢悬浮液放入水浴锅热激处理，60-80℃加热10-30分钟，热激处理后分别取50-150μL加入多孔板中，再加入一定体积萌发缓冲液，混匀，制成萌发反应液，利用酶标仪检测反应液的初始OD₄₉₀值，之后将多孔板放于28-37℃恒温培养箱中反应1.5-3小时后，检测终点OD₄₉₀值，计算不同浓度萌发芽孢的芽孢悬浮液的OD₄₉₀下降值，以OD₄₉₀下降值为横坐标，相应的活的萌发芽孢浓度作为纵坐标，绘制标准曲线，并拟合获得标准曲线公式；

d)待测样品的预处理：若待测样品为粉剂，用去离子水在离心管或试管中将芽孢制成水悬液，通过调整去离子水的加入量，将芽孢悬液调至OD₄₉₀值与步骤(a)中高存活率萌发芽孢水悬液OD₄₉₀值相等；若待测样品为水悬液而且OD₄₉₀小于0.5，则向该芽孢悬液中加入光密度调节剂使其OD₄₉₀值与步骤(a)中高存活率萌发芽孢水悬液OD₄₉₀值相等；若芽孢制品为水悬液而OD₄₉₀大于1.7，则向该芽孢悬液中加去离子水使其OD₄₉₀值与步骤(a)中高存活率萌发芽孢水悬液OD₄₉₀值相等，将盛有待测芽孢悬浮液的离心管或试管放入水浴锅，60-80℃加热10-30分钟；

e)待测样品的萌发反应：分别取与标准曲线制备中芽孢悬浮液相同体积的该待测芽孢悬浮液加入多孔板中作为实验组；将剩余芽孢悬液4000-6000g离心5-15min，分别取等体积上清液加入多孔板中作为对照组；向各孔中加入一定体积芽孢萌发缓冲液，混匀；

f)光密度值检测与光密度下降值计算：利用酶标仪检测实验组和对照组中芽孢萌发反应液的初始OD₄₉₀值；检测完成后，将多孔板放于30℃恒温培养箱中培养1.5-3小时，期间每隔30分钟混匀1次，培养完成后，利用酶标仪检测实验组和对照组的芽孢萌发反应液的终点OD₄₉₀值，按照以下公式计算OD₄₉₀下降值ΔOD₄₉₀，将ΔOD₄₉₀值代入步骤c所获得的标准曲线公式，计算获得活芽孢含量；

ΔOD₄₉₀＝(ΔOD₁+ΔOD₂+ΔOD₃)÷3－(ΔOD_C1+ΔOD_C2+ΔOD_C3)÷3

其中ΔOD_n为实验组第n个孔中芽孢萌发反应液的初始OD₄₉₀值与终点初始OD₄₉₀的差值；ΔOD_Cn为对照组第n个孔中芽孢萌发反应液的初始OD₄₉₀值与终点初始OD₄₉₀的差值。

2.如权利要求1所述的基于分光光度法的活芽孢含量高通量检测方法，其特征在于芽孢萌发缓冲液包括芽孢萌发剂、pH缓冲剂、渗透调节剂。

3.如权利要求2所述的基于分光光度法的活芽孢含量高通量检测方法，其特征在于芽孢萌发剂浓度为1-100mM，pH缓冲剂浓度为20-100mM，渗透调节剂浓度为50-600mM。

4.如权利要求3所述的基于分光光度法的活芽孢含量高通量检测方法，其特征在于pH缓冲剂为磷酸盐缓冲剂、硼酸盐缓冲剂、醋酸盐缓冲剂、草酸盐缓冲剂、酒石酸盐缓冲剂、苯二甲酸氢燕缓冲剂、甘氨酸缓冲液、碳酸盐缓冲液、氨-氯化铵缓冲液、2-氨基-2-甲基-1-丙醇、2-氨基-2-甲基-1，3-丙二醇、奎诺二甲基丙烯酯、N,N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸、三羟甲基氨基甲烷、3-(环己胺)-1-丙磺酸、3-(环己胺)-2-羟基-1-丙磺酸、2-环已胺基乙磺酸、4-(2-羟乙基哌)-1-哌嗪丙磺酸、4-(2-羟乙基)哌嗪-1-2-羟基丙磺酸、N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-4-丁磺酸、3-(N-吗啡啉)丙磺酸、3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸、N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸、3[N-三(羟甲基)甲胺]-2-羟基丙磺酸其中任意一种。

5.如权利要求4所述的基于分光光度法的活芽孢含量高通量检测方法，其特征在于渗透调节剂为氯化钠、氯化钾其中任意一种。

6.如权利要求1所述的基于分光光度法的活芽孢含量高通量检测方法，其特征在于检测芽孢萌发的光吸收波长为450nm-750nm。

7.如权利要求1所述的基于分光光度法的活芽孢含量高通量检测方法，其特征在于多孔板包括6孔板、12孔板、24孔板、48孔板、96孔板、384孔板其中任意一种。

8.如权利要求1所述的基于分光光度法的活芽孢含量高通量检测方法，其特征在于芽孢萌发缓冲剂与待测芽孢悬浮液体积比在1:9到9:1范围内。