CN114958823B - 一种利用静磁场辅助多粘类芽孢杆菌发酵生产胞外多糖的方法 - Google Patents

一种利用静磁场辅助多粘类芽孢杆菌发酵生产胞外多糖的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于发酵工程领域，具体公开了一种利用静磁场连续处理辅助多粘类芽孢杆菌发酵生产胞外多糖的半连续发酵方法，通过在发酵全过程中施加连续的静磁场处理，以提高胞外多糖的产量。本发明同时公开了一种配合该方法使用的静磁场发生装置，包括：用来放置离心管的支架，用来调节磁铁间距的滑轨，提供静磁场的条形磁铁。该装置轻便、小巧，可置入摇床进行震荡培养，通过滑轨调节实现离心管中心磁感应强度连续可调。经磁场处理得到的黏性多糖会粘附菌体，前一批次多糖发酵液排出后，部分菌体自截留于发酵体系底部，流加新鲜培养基即可实现半连续发酵，具有经济、节约、省时等优点。

Description

一种利用静磁场辅助多粘类芽孢杆菌发酵生产胞外多糖的 方法
技术领域
本发明属于发酵工程领域，具体公开了一种利用静磁场连续处理辅助多粘类芽孢杆菌发酵生产胞外多糖的方法。
背景技术
研究表明，多种多粘类芽孢杆菌产生的胞外多糖具有很强的体外和体内抗氧化活性，具有一定的UVC损伤保护作用，在紫外防护剂开发领域具有一定的研究潜力和应用前景。前期研究表明部分类芽孢杆菌产生的多糖粗提物对细胞具有紫外保护作用。分离纯化后的多粘类芽孢杆菌所产胞外多糖进行单细胞抗辐射研究，确定其在抗60Co-γ射线、抗UV和抗氮离子束辐射方面的优越性。为了满足生产的需要，提高多粘类芽孢杆菌功能性胞外多糖的产量的方法工艺和工艺参数的优化成为亟待解决的问题。
近年来，磁场对微生物的作用效应被越来越多科学研究所证实。磁场作用于生物细胞时具有物理“窗效应”，即生物细胞仅对特定参数的磁场才能够产生特异性应答。交变磁场对猴头菌生长及胞外多糖的产生具有一定的促进作用，但交变磁场的发生过程会向外辐射电磁波，对人体具有一定影响，如应用于工业化生产会存在潜在安全风险。利用静磁场处理小球藻，其产生的可溶性胞外多糖会随静磁场强度的增加而减少，而结合性胞外多糖则表现出相反的趋势，但其使用的静磁场发生装置不能解决好氧微生物或兼性厌氧微生物在生长发酵过程中需要配合使用摇床震荡通气的问题。因此，磁场对各类微生物及其代谢的作用效应值得进一步研究，而开发一种小型化并适用于摇床震荡的静磁场装置并将其应用于微生物及其代谢研究具有重大的价值。
半连续发酵，又称半连续培养、反复分批培养或换液培养，是指在分批培养的基础上，周期性地放出部分含有产物的发酵液，然后再补加相同体积的新鲜培养基的发酵方法。在实施半连续发酵的操作过程中，补充了新营养成分的反应体系的培养条件与分批培养条件相同，且反应器内培养液的总体积基本保持不变。因此，开发半连续发酵技术对工业生产和科学研究具有比较广泛的应用价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用静磁场连续处理辅助多粘类芽孢杆菌发酵生产胞外多糖的方法，设计静磁场发生装置产生恒定可调的静磁场，并且能够放入摇床，在多粘类芽孢杆菌培养的全过程中辅助其进行液态发酵，从而促进其胞外多糖的分泌，提高胞外多糖产量；同时提供了一种利用磁处理后粘度增加的多糖将菌体截留在发酵体系中以实现半连续发酵的工艺。重在寻找合适的静磁场条件来促进多粘类芽孢杆菌发酵产胞外多糖，快速筛选获得磁敏感微生物，该方法操作简单，通过较低的附加投入，可提高发酵产物的产量，缩短发酵时间。
本发明是通过以下技术方案实现的：
多粘类芽孢杆菌菌株，其保藏名称为多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)PYQ1，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.16444，保藏日期为2018年9月10日。所述的多粘类芽孢杆菌菌株PYQ1在专利号为ZL201811216217.0的发明中已经公布。
本发明提供了一种利用静磁场连续处理辅助多粘类芽孢杆菌生产胞外多糖的方法，其包括如下步骤：
(1)设置静磁场发生装置，所述静磁场发生装置包括：发酵离心管放置架、位于发酵离心管放置架左右两侧且水平设置的可移动滑轨、以及设置在可移动滑轨上的条形磁铁放置架；两侧可移动滑轨上的条形磁铁放置架可通过水平移动改变间距；
发酵液加入离心管后放置于发酵离心管放置架内；条形磁铁固定在条形磁铁放置架内，通过可移动滑轨调节两条形磁铁的间距来改变离心管中心的磁感应强度，实现离心管中心磁感应强度在0～150mT范围内连续可调，且整个静磁场发生装置可置入摇床进行震荡培养；
(2)菌种活化及种子液培养：选取冻存的多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)PYQ1原始菌株，接种于LB固体培养基，置于生化培养箱中进行活化培养；待长出单菌落后，挑取单菌落接种于液体种子培养基，置于摇床中，震荡培养，得到种子液；
(3)将步骤(2)得到的种子液接种至液体发酵培养基中，将液体发酵培养基置于发酵离心管内，将发酵离心管置于静磁场发生装置的离心管放置架中，整个静磁场发生装置置入摇床，在摇床中进行发酵培养；在发酵全过程中利用静磁场发生装置连续施加静磁场，磁感应强度为10～60mT，发酵培养30～72h；
(4)第一批次发酵结束后，倾倒出包含大量多糖的液体发酵物用于多糖提取，部分菌体因黏性多糖作用会截留于发酵离心管内壁，向离心管中加入新鲜液体发酵培养基在施加静磁场条件下进行第二批次发酵，后续批次发酵按此步骤进行，实现半连续发酵。
作为本发明的优选方案，所述发酵离心管放置架内设置离心管放置区，离心管放置区高90～100mm、直径31mm，两侧条形磁铁放置架内设置条形磁铁放置区，条形磁铁放置区高40～50mm，单侧可移动滑轨长40～60mm。
作为本发明的优选方案，所述静磁场发生装置可置入摇床，在菌体培养和发酵的全过程中提供连续的磁场刺激，且在震荡培养过程中磁场与发酵液没有相对运动。
作为本发明的优选方案，步骤(2)中所述生化培养箱内培养的温度控制在28～37℃，过夜培养。
作为本发明的优选方案，步骤(2)中所述摇床培养的温度为37℃，转速为180rpm，培养时间为10～13h，当种子液在波长600nm下用酶标仪测得吸光度为0.5-0.9，即可将种子液用于步骤(3)进行发酵培养。
作为本发明的优选方案，步骤(2)中所述LB固体培养基各成分分别为：5g酵母浸粉、10g胰蛋白胨、10g氯化钠、18g琼脂、蒸馏水1L，115℃高压蒸汽灭菌25min后倒平板。
作为本发明的优选方案，步骤(2)中所述液体种子培养基各成分为：20g蔗糖、5g酵母浸粉、5g胰蛋白胨、3gK2HPO4、1L蒸馏水，115℃高压蒸汽灭菌25min。
作为本发明的优选方案，步骤(3)中所述种子液接种至液体发酵培养基的接种量为发酵培养基的1％(v/v)；所述液体发酵培养基各成分为：50g蔗糖、5g酵母浸粉、5g胰蛋白胨、3gK2HPO4、蒸馏水1L，115℃高压蒸汽灭菌25min。
作为本发明的优选方案，步骤(3)中所述摇床发酵培养的温度条件为28℃，转速为180rpm，最佳磁感应强度为30mT。
作为本发明的优选方案，步骤(4)中利用静磁场辅助发酵得到的高粘度多糖截留菌体实现一次接种多次使用的半连续发酵，一批次发酵结束后在超净台中用注射器将发酵液吸出或直接倾倒出，发酵液用于多糖提取收集，此时离心管中只留下贴附管壁的絮状物；向离心管中加入已灭菌的新鲜发酵培养基，再次放入摇床，发酵培养，重复步骤(4)实现多批次半连续发酵。
作为本发明的优选方案，步骤(3)中，摇床震荡培养的时间为48h。
进一步的，步骤(3)以体积比将1％接种量接种步骤(2)得到的种子液至盛有15mL液体发酵培养基的发酵用离心管中，静磁场发生装置调节发酵用离心管中心最佳磁感应强度为30mT，且能够实现有效的半连续发酵。
本发明具备的有益效果是：
本发明采用的静磁场的磁感应强度为10～60mT，这是为了促进多粘类芽孢杆菌在液态发酵过程中胞外多糖的产量提高。过低的磁感应强度对胞外多糖的产生影响小，过高的磁感应强度会有抑制胞外多糖产生的作用。多糖自截留菌体半连续发酵的方式得到的多糖总产量较常规分批发酵有明显提高，且无需每批都经过种子液培养，缩短了发酵时间，节省了原材料的使用。本发明的方法简单、高效、经济、环保，实现磁敏感微生物的快速筛选和最佳磁感应条件的高效获取，具备良好的应用前景。
附图说明
图1本发明方法设计制作的静磁场发生装置三维模型图；图中，1-发酵离心管放置架，2-条形磁铁放置架，3-可移动滑轨；
图2本发明方法多粘类芽孢杆菌在不同磁感应强度处理下的胞外多糖产量提高情况对比图；
图3本发明方法多粘类芽孢杆菌30mT磁处理-半连续发酵处理组和常规分批发酵对照组的胞外多糖产量对比图。
具体实施方式
下面结合实例对本发明进行详细描述，但本发明不局限于这些实施例。
如图1所示，本实施例的静磁场发生装置包括：发酵离心管放置架1、位于发酵离心管放置架左右两侧且水平设置的可移动滑轨3、以及设置在可移动滑轨上的条形磁铁放置架2；两侧可移动滑轨上的条形磁铁放置架可通过水平移动改变间距；发酵液加入离心管后放置于发酵离心管放置架内；条形磁铁固定在条形磁铁放置架内，通过可移动滑轨调节两条形磁铁的间距来改变离心管中心的磁感应强度，实现离心管中心磁感应强度在0～150mT范围内连续可调，且整个静磁场发生装置可置入摇床进行震荡培养。
在发酵之前，先进行菌种活化，从-80℃冰箱中取出冻存的多粘类芽孢杆菌PYQ1原始菌种，接种于固体LB培养基中，放置于37℃培养箱中进行活化培养。
实施例1：
种子培养基：20g蔗糖，5g酵母浸粉，5g胰蛋白胨，3gK2HPO4，蒸馏水1L，115℃高压蒸汽灭菌25min。
发酵培养基：50g蔗糖，5g酵母浸粉，5g胰蛋白胨，3gK2HPO4，蒸馏水1L，115℃高压蒸汽灭菌25min。
LB液体培养基：5g酵母浸粉，10g胰蛋白胨，10g氯化钠，蒸馏水1L，121℃高压蒸汽灭菌20min。
在过夜培养的多粘类芽孢杆菌PYQ1固体培养基中挑出单菌落，接种到50mL种子培养基中，在37℃、180rpm的条件下振荡培养10～13h，取200μL种子液在波长600nm下用酶标仪测得吸光度为0.6左右之后，以1％的接种量转移到装有发酵培养基(或LB液体培养基)的50ml离心管中。离心管固定在所设计的发酵装置上，且中心磁感应强度分别被调节为10mT、20mT、30mT、40mT、50mT、60mT，每组设置三个平行，对照组不加磁场。装置放入摇床，在28～30℃、180rmp的条件下连续发酵48h。发酵结束后，取发酵液经离心去除菌体，上清液再加入乙醇进行沉淀，完全沉淀后再次离心，去除上清液置于烘箱中干燥，之后加入蒸馏水使完全溶解，稀释到合适倍数，最后采用苯酚硫酸法测定产糖量，测定结果见表1、图2。
表1不同磁场强度、不同培养基条件下多粘类芽孢杆菌的胞外多糖产量
其中，—：未测试。
如表1和图2所示，当使用芽孢杆菌常规LB液体培养基作为发酵培养基时，多糖产量很低，在该培养基条件下施加磁场后显示，对照组和磁场处理组的多糖产量基本持平，磁场处理的促产糖效果不显著。
使用课题组优化后发酵培养基，与LB液体培养基培养相比，产糖量有了大幅提升，从3.93mg/mL提升至8.67mg/mL。同时，结合磁场处理，发酵产量在8.67mg/mL基础上得到进一步提升，分批发酵10mT处理组产糖量提高16.46％，20mT处理组提高22.00％，30mT处理组提高30.23％，40mT处理组产糖量提高4.74％，50mT处理组提高11.86％，60mT处理组提高5.36％。相对于对照组的8.67mg/mL，其中30mT处理组产糖量最高，可达11.29mg/mL。
苯酚硫酸法：配制不同浓度的葡萄糖溶液以多糖：苯酚：浓硫酸＝1：1：5的比例加入苯酚、缓慢滴加浓硫酸，混匀后在80℃下金属浴40min。分别取处理后的标准液于酶标板，在488nm下测定吸光值。以葡萄糖溶液浓度(mg/mL)为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制得到标准曲线。取样品以上述方法测定吸光度，根据所得的标准曲线计算产糖量。
实施例2：
选取实施例1得到的最佳磁感应强度30mT作为处理组进行多糖自截留菌体半连续发酵，对照组不施加磁场。半连续发酵处理组第一批按上述经种子液培养的发酵方式，发酵48h后取出离心管，能够观察到絮状物，即被多糖粘附在一起的菌体团。然后在超净台中用注射器小心将发酵液吸出，吸出的发酵液收集并保留，记为处理组发酵液1，此时离心管中只留下贴壁絮状物。向离心管中加入15mL已灭菌的新鲜发酵培养基，再次放入摇床，发酵培养48h后取出，记为处理组发酵液2。对照组仍然按照上述经种子液培养的分批发酵方式，发酵两批，测定两批的多糖产量，并与半连续发酵处理组比较。测定结果见表2、图3。
结果表明，经30mT磁处理后的多糖粘度显著提高，可将部分菌体粘附并截留于发酵体系管壁，实现半连续发酵，该方式得到的多糖总产量较常规分批发酵仍有明显提高，且无需经过种子液培养，缩短了发酵时间，节省了原材料的使用。
表2 30mT磁处理半连续发酵的胞外多糖产量提高情况
综上所述，本发明通过在多粘类芽孢杆菌发酵过程中，对其进行连续且恒定的静磁场出来了，以提高胞外多糖的发酵产量。经磁场处理得到的发酵液中部分菌体可被多糖粘附，自截留于发酵体系，向离心管中流加新鲜培养液即可实现半连续发酵，无需再经过菌种活化和种子液培养的步骤，实现了菌体的循环利用。磁场发生装置通过滑轨调整磁铁间的距离来实现发酵体系中心磁感应连续可调，结构简单且无需额外的设备产生能耗，能够置入摇床实现连续震荡培养。
说明：以上实施例仅用以说明本发明而并非限制本发明所描述的技术方案；因此，尽管本说明书参照上述的各个实施例对本发明已进行了详细的说明，但是本领域的普通技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或等同替换；而一切不脱离本发明的精神和范围的技术方案及其改进，其均应涵盖在本发明的权利要求范围内。

Claims (8)

1.一种利用静磁场连续处理辅助多粘类芽孢杆菌生产胞外多糖的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
（1）设置静磁场发生装置，所述静磁场发生装置包括：发酵离心管放置架、位于发酵离心管放置架左右两侧且水平设置的可移动滑轨、以及设置在可移动滑轨上的条形磁铁放置架；两侧可移动滑轨上的条形磁铁放置架可通过水平移动改变间距；条形磁铁固定在条形磁铁放置架内，通过可移动滑轨调节两条形磁铁的间距来改变离心管中心的磁感应强度，放入中央离心管，使用高斯计准确测定中央离心管的中心磁感应强度，达到磁场强度设定值后使用连接件的螺栓螺母固定条形磁铁放置架；该装置可实现离心管中心磁感应强度在0～150 mT范围内连续可调；发酵液加入发酵离心管后放置于离心管放置架内；整个静磁场发生装置置入摇床进行震荡培养；
（2）菌种活化及种子液培养：选取冻存的多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）PYQ1原始菌株，接种于LB固体培养基，置于生化培养箱中进行活化培养；待长出单菌落后，挑取单菌落接种于液体种子培养基，震荡培养，得到种子液；所述多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）PYQ1保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.16444，保藏日期为2018年9月10日；
（3）将步骤（2）得到的种子液接种至液体发酵培养基中，将液体发酵培养基置于发酵离心管内，将发酵离心管置于静磁场发生装置的离心管放置架中，将整个静磁场发生装置置入摇床，开始发酵培养，且在震荡培养过程中磁场与发酵液没有相对运动；在发酵全过程中利用静磁场发生装置连续施加静磁场，磁感应强度为30 mT，发酵培养30~72 h；步骤（3）中所述种子液接种至液体发酵培养基的接种量为发酵培养基的1%（v/v）；所述液体发酵培养基各成分为：50 g蔗糖、5 g酵母浸粉、5 g胰蛋白胨、3 gK2HPO4、蒸馏水1 L，115 ℃高压蒸汽灭菌25 min；
（4）第一批次发酵结束后，倾倒出包含大量多糖的液体发酵物用于多糖提取，部分菌体因黏性多糖作用会截留于发酵离心管内壁，向离心管中加入新鲜液体发酵培养基在施加静磁场条件下进行第二批次发酵，后续批次发酵按此步骤进行，实现半连续发酵。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵离心管放置架内设置离心管放置区，离心管放置区高90～100 mm、直径31 mm，两侧条形磁铁放置架内设置条形磁铁放置区，条形磁铁放置区高40～50 mm，单侧可移动滑轨长40～60 mm。
3.根据权利要求1所述的一种利用静磁场连续处理辅助多粘类芽孢杆菌生产胞外多糖的方法，其特征在于，步骤（2）中所述生化培养箱内培养的温度控制在28～37 ℃，过夜培养。
4.根据权利要求1所述的一种利用静磁场连续处理辅助多粘类芽孢杆菌生产胞外多糖的方法，其特征在于，步骤（2）中所述震荡培养的温度为37 ℃，转速为180 rpm，培养时间为10～13 h，当种子液在波长600 nm下用酶标仪测得吸光度为0.5-0.9，即可将种子液用于步骤（3）进行发酵培养。
5.根据权利要求1所述的一种利用静磁场连续处理辅助多粘类芽孢杆菌生产胞外多糖的方法，其特征在于，步骤（2）中所述LB固体培养基各成分分别为：5 g酵母浸粉、10 g胰蛋白胨、10 g氯化钠、18 g琼脂、蒸馏水1 L，115 ℃高压蒸汽灭菌25 min后倒平板。
6.根据权利要求1所述的一种利用静磁场连续处理辅助多粘类芽孢杆菌生产胞外多糖的方法，其特征在于，步骤（2）中所述液体种子培养基各成分为：20 g蔗糖、5 g酵母浸粉、5g胰蛋白胨、3 gK2HPO4、1 L蒸馏水，115 ℃高压蒸汽灭菌25 min。
7.根据权利要求1所述的一种利用静磁场连续处理辅助多粘类芽孢杆菌生产胞外多糖的方法，其特征在于，步骤（3）中摇床发酵培养的温度条件为28 ℃，转速为180 rpm。
8.根据权利要求1所述的一种利用静磁场连续处理辅助多粘类芽孢杆菌生产胞外多糖的方法，其特征在于，步骤（4）中利用静磁场辅助发酵得到的高粘度多糖截留菌体实现一次接种多次使用的半连续发酵，一批次发酵结束后在超净台中用注射器将发酵液吸出或直接倾倒出，发酵液用于多糖提取收集，此时离心管中只留下贴附管壁的絮状物；向离心管中加入已灭菌的新鲜发酵培养基，再次放入摇床，发酵培养，重复步骤（4）实现多批次半连续发酵。
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