CN114470185A - 一种自组装多肽疫苗及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种自组装多肽疫苗，包括自组装多肽分子形成的纳米胶束，纳米胶束外部复合带负电的核酸类佐剂；由核酸类佐剂桥连纳米胶束形成复合胶束纳米颗粒疫苗；所述自组装多肽分子的结构为：X‑Linker1‑Neo‑Linker2‑Y；其中，X为含疏水区域的片段，Neo为抗原片段，Y为带正电的氨基酸片段，Linker1和Linker2均为连接氨基酸片段，所述Linker1和Linker2相同或不同。本发明疫苗具有较低的细胞毒性，具有很好的结构与分散稳定性，并且功能上能够满足同时共运输多肽和多种佐剂分子的目的。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药和药物制剂学领域，具体涉及一种自组装多肽疫苗及其制备方法。
背景技术
肿瘤免疫治疗是通过免疫学原理和方法，调动和激发机体抗肿瘤免疫应答，达到杀伤肿瘤和抑制肿瘤生长的目的。肿瘤免疫治疗由于其卓越的疗效和创新性在2013年被《Science》杂志评为年度最重要的科学突破。其中，基于新生抗原的肿瘤疫苗由于是以癌细胞突变产生的新生抗原作为靶点，因此它被认为是解决T细胞特异性识别肿瘤细胞的最具潜力的技术。
个体化的新生抗原多肽疫苗从临床结果来看，已经取得了鼓舞人心的进展。然而，游离形式的抗原多肽在机体内容易被降解和清除，因此多数情况下，裸肽只能取得非常有限的免疫响应。随着纳米技术的蓬勃发展，基于纳米载体的递送技术被认为可以提升抗原多肽的递送效率。传统的递送技术包括：纳米脂质体，高分子纳米颗粒，无机纳米颗粒等等。上述的传统递送技术往往制备复杂，周期长，涉及有机溶剂，而这无疑会延长药物的制备周期。
由于多肽分子由不同氨基酸组成，通过合理的设计多肽序列，可以实现多肽分子自发组装形成特定形貌的自组装结构。这样做的好处是，无需添加价格昂贵的赋形剂，最大程度简化了纳米疫苗的制备过程，缩短了制备周期，为患者争取了宝贵的时间。其中两亲性多肽设计策略是一种常见的方法，然而依据该原理方法形成的纳米疫苗理论上浓度必须高于临界胶束浓度，否则无法形成超分子结构。如何提升纳米胶束的结构稳定性是该领域的一个痛点。此外，共递送免疫佐剂可以进一步提升机体免疫应答。以何种结合形式有效实现抗原和佐剂的共递送也是一个必须思考的问题。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺陷和不足，本发明提供一种自组装多肽疫苗，包括自组装多肽分子形成的纳米胶束，纳米胶束外部复合带负电的核酸类佐剂；由核酸类佐剂桥连纳米胶束形成复合胶束纳米颗粒疫苗；所述自组装多肽分子的结构为：X-Linker1-Neo-Linker2-Y；其中，X为含疏水区域的片段，Neo为抗原片段，Y为带正电的氨基酸片段，Linker1和Linker2均为连接氨基酸片段，所述Linker1和Linker2相同或不同。
前述的自组装多肽疫苗，复合胶束纳米颗粒的粒径分布为20～200nm。处于此粒径分布范围的纳米颗粒更易进入淋巴系统，具有更高的疫苗淋巴器官靶向性，更易被抗原递呈细胞如DC细胞吞噬，从而更有效地激起免疫反应。
前述的自组装多肽疫苗，含疏水区域的片段为PamCys，Pam2Cys，Pam3Cys，十六烷酸，十四烷酸和十二烷酸中的任意一种。
前述的自组装多肽疫苗，抗原片段为多肽片段。
前述的自组装多肽疫苗，带正电的氨基酸片段为阳离子穿膜肽或碱性氨基酸片段。
前述的自组装多肽疫苗，阳离子穿模肽包括TAT：RKKRRQRRR，R8：RRRRRRRR，R9：RRRRRRRRR，R9-TAT：GRRRRRRRRRPPQ，Penetratin：RQIKIWFQNRRMKWKK中的任意一种。
前述的自组装多肽疫苗，碱性氨基酸片段为精氨酸、赖氨酸、组氨酸中的一种或多种组合；所述碱性氨基酸片段长度为1～10aa。
前述的自组装多肽疫苗，Linker1的序列为KK，SLVR，LLSVGG和CSSVVR中的任意一种；Linker2的序列为KK，SLVR，LLSVGG和CSSVVR中的任意一种。
前述的自组装多肽疫苗，核酸类佐剂为寡聚脱氧核苷酸链CpG ODN佐剂、双链RNA(dsRNA)、单链RNA佐剂(ssRNA)中的一种或多种的组合。
一种自组装多肽疫苗的制备方法，包括如下步骤：取自组装多肽完全溶于水中，自组装多肽形成纳米胶束后，加入核酸类佐剂与纳米胶束复合，形成复合胶束纳米颗粒疫苗。
前述的制备方法，所述自组装多肽与核酸类佐剂的投料质量比为1～20：1；
优选的，所述自组装多肽与核酸类佐剂的投料质量比为4～10：1。
本发明的有益之处在于：
创新地提出了一种自组装多肽疫苗及制备方法。该方法制备简单，绿色合成不涉及有机溶剂，具有一定的普适性。创新性地联合两亲性多肽自组装策略以及静电自组装策略，首次制备得到了粒径分布为20～200nm的复合胶束纳米颗粒疫苗(HMNP-Vac)。该疫苗具有较低的细胞毒性，很好的结构稳定性，并且功能上能够满足共运输多肽和多种佐剂分子的目的。制备得到的HMNP-Vac可以显著提高目标抗原肽的淋巴器官靶向性，同时能够提升树突状细胞(英文名称：Dendritic Cell，缩写：DC)对抗原多肽的内吞效率，能够激活更多的抗原特异性T细胞，即上调了体内抗原特异性T细胞比例，最重要的是，能够显著提升抑瘤效果。
附图说明
图1为HMNP-Vac复合胶束纳米颗粒疫苗的设计策略示意图。
图2是SAP1纳米胶束在溶液浓度下的相对荧光强度图。
图3是SAP1纳米胶束的冷冻电镜照片(a)和DLS粒径分析图(b)。
图4是实施例1的TEM图(a)以及DLS粒径分析图(b)。
图5是不同CpG添加量HMNP-Vac样品的表明Zeta电位图。
图6是SAP15/FAMCpG1-HMNP-Vac和SAP25/CpG1-HMNP-Vac的发射荧光光谱图。
图7是不同CpG添加量HMNP-Vac样品的粒径分布图。
图8是实施例1、实施例6～22的HMNP-Vac颗粒尺寸大小图。
图9是实施例22的原子力显微镜扫描照片。
图10是实施例22的粒径分布图。
图11是实施例5、实施例23以及实施例24的HMNP-Vac尺寸大小图。
图12(a)是淋巴结的荧光成像照片，(b)相对荧光强度分析图。
图13是细胞内吞实验的白光照片及荧光照片。
图14是T细胞激活试验中不同组的CMV pp65特异性CD8+T细胞比例。
图15是小鼠抑瘤试验的免疫时间表。
图16是小鼠在抑瘤试验中的体重变化曲线。
图17是小鼠的肿瘤生长曲线。
图18是小鼠抑瘤试验中不同实验组淋巴结内的CD8+T细胞比例图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售产品。其中，部分试剂和原料购买情况如下：
多肽：南京源肽生物科技公司及金斯瑞生物科技公司定制，自组装多肽(英文：Self-Assembly Peptide，简写：SAP)序列及简写如下：
Pam2Cys-KK-NLVPMVATVKKPKYVKQNTLKLAT-KK-RRRRRRRR(简写SAP1，SEQ NO 01)
Pam2Cys-K(FITC)K-NLVPMVATVKKPKYVKQNTLKLAT-KK-RRRRRRRR(简写SAP2，SEQ NO02)
Pam2Cys-KK-MTEYKLVVVGAVGVGKSALTIQLIQNH-LLSVGGRRRRRRRR(简写SAP3，SEQ NO03)
Pam2Cys-KKFMERDPDELRFNTIALSAAK-LLSVGGRRRRRRRR(简写SAP4，SEQ NO 04)
Pam2Cys-KPLRRNNSYTSYIMAICGMPLDSFRK-LLSVGGRRRRRRRR(简写SAP5，SEQ NO 05)
Pam2Cys-SLVR-NLVPMVATVKKPKYVKQNTLKLAT-SLVR-RRRRRRRR(SAP6，SEQ NO 06)
Pam2Cys-KK-IAHMILGYRYWTGIGVLQSCESALKKK-LLSVGGRRRRRRRR(SAP7，SEQ NO 07)
Pam2Cys-KK-VNYIKGFRYELYCLARTARTPLK-LLSVGGRRRRRRRR(SAP8，SEQ NO 08)
Pam2Cys-SLVR-SIINFEKL-SLVR-RRRRRRRR(SAP9，SEQ NO 09)
Pam2Cys-SLVR-ICLTSTVQLIMQLMPFGCLLD-KK-RRRRRRRR(SAP10，SEQ NO 10)
Pam2Cys-SLVR-VKTPQHVKITDFGRAKLLGAEEKEYHAEG-KK-RRRRRRRR(SAP11,SEQ NO11)
Pam3Cys-KK-ICLTSTVQLIMQLMPFGCLLD-LLSVGGRRRRRRRR(SAP12，SEQ NO 12)
PamCys-KK-NLVPMVATVKKPKYVKQNTLKLAT-KK-RRRRRRRR(SAP13，SEQ NO 13)
C16-SLVR-NLVPMVATVKKQYIKANSKFIGITEL-KKKK(SAP14，SEQ NO 14)
C16-SLVR-SIINFEKLISQAVHAAHAEINEAGR-KKKKKKK(SAP15，SEQ NO 15)
Pam2Cys-SLVR-SIINFEKL-KK-RKKRRQRRR(TAT)(SAP16，SEQ NO 16)
Pam2Cys-SLVR-SIINFEKL-KK-GRRRRRRRRRPPQ(R9-TAT)(SAP17，SEQ NO 17)
Pam2Cys-KK-SIINFEKL-KK-RQIKIWFQNRRMKWKK(Penetratin)(SAP18，SEQ NO 18)
Pam2Cys-SLVR-SIINFEKL-KK-RKKRRRESRKKRRRES(DPV3)(SAP19，SEQ NO 19)
本发明的制备原理如下:如图1所示，自组装多肽分子溶解于水后，由于其一端携带的疏水片段，与水发生疏水相互作用，从而形成纳米胶束；自组装多肽分子另一端为带正电的氨基酸片段，从而使得纳米胶束的外部呈正电；在加入带负电的核酸类佐剂后，纳米胶束外部的正电与核酸类佐剂产生静电相互作用从而吸附在一起形成了复合胶束纳米颗粒。
下述样品命名规则为：SAPX代表所选用多肽名称，X为1-19中任一数字，CpG或polyI:C代表选用的核酸类佐剂名称，SAPX与核酸类佐剂名称各自的下标代表相互间的投料质量比。
实施例一、三、四和五中改变了SAP1和核酸类佐剂CpG的投料质量比。实施例六至十四中在自组装多肽序列中使用了不同的Neo段序列和linker段序列组合。实施例十五至十七中改变了自组装多肽序列中的X段序列。实施例十八至二十一中改变了自组装多肽序列中的Y段序列。
实施例一、一种自组装多肽疫苗的制备方法(SAP110/CpG1-HMNP-Vac)。具体通过如下步骤制备：
纳米胶束溶液制备：用移液枪取1ml生理盐水加入到封装有1mg SAP1多肽的西林瓶中，超声辅助溶解，得到1mg/ml的SAP1纳米胶束溶液。
HMNP-Vac纳米疫苗制备：使用移液枪取1ml PBS加入到封装有1mg CpG的样品瓶中，超声辅助溶解，得到1mg/ml的CpG溶液。取500μl SAP1纳米胶束溶液加入到500μl水中，之后加入50μl上述CpG溶液，通过静电相互作用，形成复合胶束纳米颗粒疫苗(SAP110/CpG1-HMNP-Vac)。将样品放于2-8℃冰箱存储，以备后续实验。
实施例二、一种带有FITC荧光标签的自组装多肽疫苗的制备方法(SAP25/CpG1-HMNP-Vac)。具体通过如下步骤制备：
纳米胶束溶液制备：用移液枪取1ml生理盐水加入到封装有1mg SAP2多肽的西林瓶中，超声辅助溶解，得到1mg/ml的SAP2纳米胶束溶液。
HMNP-Vac纳米疫苗制备：使用移液枪取1ml PBS加入到封装有1mg CpG的样品瓶中，超声辅助溶解，得到1mg/ml的CpG溶液。取500μl SAP2纳米胶束溶液加入到500μl水中，之后加入100μl上述CpG溶液，通过静电相互作用，形成复合胶束纳米颗粒疫苗(SAP25/CpG1-HMNP-Vac)。将样品放于2-8℃冰箱存储，以备后续实验。
实施例三、一种自组装多肽疫苗的制备方法(SAP120/CpG1-HMNP-Vac)。具体通过如下步骤制备：
纳米胶束溶液制备：用移液枪取1ml生理盐水加入到封装有1mg SAP1多肽的西林瓶中，超声辅助溶解，得到1mg/ml的SAP1纳米胶束溶液。
HMNP-Vac纳米疫苗制备：使用移液枪取1ml PBS加入到封装有1mg CpG的样品瓶中，超声辅助溶解，得到1mg/ml的CpG溶液。取500μl SAP1纳米胶束溶液加入到500μl水中，之后加入25μl上述CpG溶液，通过静电相互作用，形成复合胶束纳米颗粒疫苗(SAP120/CpG1-HMNP-Vac)。将样品放于2-8℃冰箱存储，以备后续实验。
实施例四、一种自组装多肽疫苗的制备方法(SAP115/CpG1-HMNP-Vac)。具体通过如下步骤制备：
纳米胶束溶液制备：用移液枪取1ml生理盐水加入到封装有1mg SAP1多肽的西林瓶中，超声辅助溶解，得到1mg/ml的SAP1纳米胶束溶液。
HMNP-Vac纳米疫苗制备：使用移液枪取1ml PBS加入到封装有1mg CpG的样品瓶中，超声辅助溶解，得到1mg/ml的CpG溶液。取500μl SAP1纳米胶束溶液加入到500μl水中，之后加入33μl上述CpG溶液，通过静电相互作用，形成复合胶束纳米颗粒疫苗(SAP115/CpG1-HMNP-Vac)。将样品放于2-8℃冰箱存储，以备后续实验。
实施例五、一种自组装多肽疫苗的制备方法(SAP15/CpG1-HMNP-Vac)。具体通过如下步骤制备：
纳米胶束溶液制备：用移液枪取1ml生理盐水加入到封装有1mg SAP1多肽的西林瓶中，超声辅助溶解，得到1mg/ml的SAP1纳米胶束溶液。
HMNP-Vac纳米疫苗制备：使用移液枪取1ml PBS加入到封装有1mg CpG的样品瓶中，超声辅助溶解，得到1mg/ml的CpG溶液。取500μl SAP1纳米胶束溶液加入到500μl水中，之后加入100μl上述CpG溶液，通过静电相互作用，形成复合胶束纳米颗粒疫苗(SAP15/CpG1-HMNP-Vac)。将样品放于2-8℃冰箱存储，以备后续实验。
实施例六、一种自组装多肽疫苗的制备方法(SAP36/CpG1-HMNP-Vac)。具体通过如下步骤制备：
纳米胶束溶液制备：用移液枪取1ml生理盐水加入到封装有1mg SAP3多肽的西林瓶中，超声辅助溶解，得到1mg/ml的SAP3纳米胶束溶液。
HMNP-Vac纳米疫苗制备：使用移液枪取1ml PBS加入到封装有1mg CpG的样品瓶中，超声辅助溶解，得到1mg/ml的CpG溶液。取500μl SAP3纳米胶束溶液加入到500μl水中，之后加入83μl上述CpG溶液，通过静电相互作用，形成复合胶束纳米颗粒疫苗(SAP36/CpG1-HMNP-Vac)。将样品放于2-8℃冰箱存储，以备后续实验。
实施例七、一种自组装多肽疫苗的制备方法(SAP46/CpG1-HMNP-Vac)。具体通过如下步骤制备：
纳米胶束溶液制备：用移液枪取1ml生理盐水加入到封装有1mg SAP4多肽的西林瓶中，超声辅助溶解，得到1mg/ml的SAP4纳米胶束溶液。
HMNP-Vac纳米疫苗制备：使用移液枪取1ml PBS加入到封装有1mg CpG的样品瓶中，超声辅助溶解，得到1mg/ml的CpG溶液。取500μl SAP4纳米胶束溶液加入到500μl水中，之后加入83μl上述CpG溶液，通过静电相互作用，形成复合胶束纳米颗粒疫苗(SAP46/CpG1-HMNP-Vac)。将样品放于2-8℃冰箱存储，以备后续实验。
实施例八、一种自组装多肽疫苗的制备方法(SAP56/CpG1-HMNP-Vac)。具体通过如下步骤制备：
纳米胶束溶液制备：用移液枪取1ml生理盐水加入到封装有1mg SAP5多肽的西林瓶中，超声辅助溶解，得到1mg/ml的SAP5纳米胶束溶液。
HMNP-Vac纳米疫苗制备：使用移液枪取1ml PBS加入到封装有1mg CpG的样品瓶中，超声辅助溶解，得到1mg/ml的CpG溶液。取500μl SAP5纳米胶束溶液加入到500μl水中，之后加入83μl上述CpG溶液，通过静电相互作用，形成复合胶束纳米颗粒疫苗(SAP56/CpG1-HMNP-Vac)。将样品放于2-8℃冰箱存储，以备后续实验。
实施例九、一种自组装多肽疫苗的制备方法(SAP76/CpG1-HMNP-Vac)。具体通过如下步骤制备：
纳米胶束溶液制备：用移液枪取1ml生理盐水加入到封装有1mg SAP7多肽的西林瓶中，超声辅助溶解，得到1mg/ml的SAP7纳米胶束溶液。
HMNP-Vac纳米疫苗制备：使用移液枪取1ml PBS加入到封装有1mg CpG的样品瓶中，超声辅助溶解，得到1mg/ml的CpG溶液。取500μl SAP7纳米胶束溶液加入到500μl水中，之后加入83μl上述CpG溶液，通过静电相互作用，形成复合胶束纳米颗粒疫苗(SAP76/CpG1-HMNP-Vac)。将样品放于2-8℃冰箱存储，以备后续实验。
实施例十、一种自组装多肽疫苗的制备方法(SAP86/CpG1-HMNP-Vac)。具体通过如下步骤制备：
纳米胶束溶液制备：用移液枪取1ml生理盐水加入到封装有1mg SAP8多肽的西林瓶中，超声辅助溶解，得到1mg/ml的SAP8纳米胶束溶液。
HMNP-Vac纳米疫苗制备：使用移液枪取1ml PBS加入到封装有1mg CpG的样品瓶中，超声辅助溶解，得到1mg/ml的CpG溶液。取500μl SAP8纳米胶束溶液加入到500μl水中，之后加入83μl上述CpG溶液，通过静电相互作用，形成复合胶束纳米颗粒疫苗(SAP86/CpG1-HMNP-Vac)。将样品放于2-8℃冰箱存储，以备后续实验。
实施例十一、一种自组装多肽疫苗的制备方法(SAP96/CpG1-HMNP-Vac)。具体通过如下步骤制备：
纳米胶束溶液制备：用移液枪取1ml生理盐水加入到封装有1mg SAP9多肽的西林瓶中，超声辅助溶解，得到1mg/ml的SAP9纳米胶束溶液。
HMNP-Vac纳米疫苗制备：使用移液枪取1ml PBS加入到封装有1mg CpG的样品瓶中，超声辅助溶解，得到1mg/ml的CpG溶液。取500μl SAP9纳米胶束溶液加入到500μl水中，之后加入83μl上述CpG溶液，通过静电相互作用，形成复合胶束纳米颗粒疫苗(SAP96/CpG1-HMNP-Vac)。将样品放于2-8℃冰箱存储，以备后续实验。
实施例十二、一种自组装多肽疫苗的制备方法(SAP106/CpG1-HMNP-Vac)。具体通过如下步骤制备：
纳米胶束溶液制备：用移液枪取1ml生理盐水加入到封装有1mg SAP10多肽的西林瓶中，超声辅助溶解，得到1mg/ml的SAP10纳米胶束溶液。
HMNP-Vac纳米疫苗制备：使用移液枪取1ml PBS加入到封装有1mg CpG的样品瓶中，超声辅助溶解，得到1mg/ml的CpG溶液。取500μl SAP10纳米胶束溶液加入到500μl水中，之后加入83μl上述CpG溶液，通过静电相互作用，形成复合胶束纳米颗粒疫苗(SAP106/CpG1-HMNP-Vac)。将样品放于2-8℃冰箱存储，以备后续实验。
实施例十三、一种自组装多肽疫苗的制备方法(SAP116/CpG1-HMNP-Vac)。具体通过如下步骤制备：
纳米胶束溶液制备：用移液枪取1ml生理盐水加入到封装有1mg SAP11多肽的西林瓶中，超声辅助溶解，得到1mg/ml的SAP11纳米胶束溶液。
HMNP-Vac纳米疫苗制备：使用移液枪取1ml PBS加入到封装有1mg CpG的样品瓶中，超声辅助溶解，得到1mg/ml的CpG溶液。取500μl SAP11纳米胶束溶液加入到500μl水中，之后加入83μl上述CpG溶液，通过静电相互作用，形成复合胶束纳米颗粒疫苗(SAP116/CpG1-HMNP-Vac)。将样品放于2-8℃冰箱存储，以备后续实验。
实施例十四、一种自组装多肽疫苗的制备方法(SAP66/CpG1-HMNP-Vac)。具体通过如下步骤制备：
纳米胶束溶液制备：用移液枪取1ml生理盐水加入到封装有1mg SAP6多肽的西林瓶中，超声辅助溶解，得到1mg/ml的SAP6纳米胶束溶液。
HMNP-Vac纳米疫苗制备：使用移液枪取1ml PBS加入到封装有1mg CpG的样品瓶中，超声辅助溶解，得到1mg/ml的CpG溶液。取500μl SAP6纳米胶束溶液加入到500μl水中，之后加入83μl上述CpG溶液，通过静电相互作用，形成复合胶束纳米颗粒疫苗(SAP66/CpG1-HMNP-Vac)。将样品放于2-8℃冰箱存储，以备后续实验。
实施例十五、一种自组装多肽疫苗的制备方法(SAP1210/CpG1-HMNP-Vac)。具体通过如下步骤制备：
纳米胶束溶液制备：用移液枪取1ml生理盐水加入到封装有1mg SAP12多肽的西林瓶中，超声辅助溶解，得到1mg/ml的SAP12纳米胶束溶液。
HMNP-Vac纳米疫苗制备：使用移液枪取1ml PBS加入到封装有1mg CpG的样品瓶中，超声辅助溶解，得到1mg/ml的CpG溶液。取500μl SAP12纳米胶束溶液加入到500μl水中，之后加入50μl上述CpG溶液，通过静电相互作用，形成复合胶束纳米颗粒疫苗(SAP1210/CpG1-HMNP-Vac)。将样品放于2-8℃冰箱存储，以备后续实验。
实施例十六、一种自组装多肽疫苗的制备方法(SAP1310/CpG1-HMNP-Vac)。具体通过如下步骤制备：
纳米胶束溶液制备：用移液枪取1ml生理盐水加入到封装有1mg SAP13多肽的西林瓶中，超声辅助溶解，得到1mg/ml的SAP13纳米胶束溶液。
HMNP-Vac纳米疫苗制备：使用移液枪取1ml PBS加入到封装有1mg CpG的样品瓶中，超声辅助溶解，得到1mg/ml的CpG溶液。取500μl SAP13纳米胶束溶液加入到500μl水中，之后加入50μl上述CpG溶液，通过静电相互作用，形成复合胶束纳米颗粒疫苗(SAP1310/CpG1-HMNP-Vac)。将样品放于2-8℃冰箱存储，以备后续实验。
实施例十七、一种自组装多肽疫苗的制备方法(SAP1410/CpG1-HMNP-Vac)。具体通过如下步骤制备：
纳米胶束溶液制备：用移液枪取1ml生理盐水加入到封装有1mg SAP14多肽的西林瓶中，超声辅助溶解，得到1mg/ml的SAP14纳米胶束溶液。
HMNP-Vac纳米疫苗制备：使用移液枪取1ml PBS加入到封装有1mg CpG的样品瓶中，超声辅助溶解，得到1mg/ml的CpG溶液。取500μl SAP14纳米胶束溶液加入到500μl水中，之后加入50μl上述CpG溶液，通过静电相互作用，形成复合胶束纳米颗粒疫苗(SAP1410/CpG1-HMNP-Vac)。将样品放于2-8℃冰箱存储，以备后续实验。
实施例十八、一种自组装多肽疫苗的制备方法(SAP1610/CpG1-HMNP-Vac)。具体通过如下步骤制备：
纳米胶束溶液制备：用移液枪取1ml生理盐水加入到封装有1mg SAP16多肽的西林瓶中，超声辅助溶解，得到1mg/ml的SAP16纳米胶束溶液。
HMNP-Vac纳米疫苗制备：使用移液枪取1ml PBS加入到封装有1mg CpG的样品瓶中，超声辅助溶解，得到1mg/ml的CpG溶液。取500μl SAP16纳米胶束溶液加入到500μl水中，之后加入50μl上述CpG溶液，通过静电相互作用，形成复合胶束纳米颗粒疫苗(SAP1610/CpG1-HMNP-Vac)。将样品放于2-8℃冰箱存储，以备后续实验。
实施例十九、一种自组装多肽疫苗的制备方法(SAP1710/CpG1-HMNP-Vac)。具体通过如下步骤制备：
纳米胶束溶液制备：用移液枪取1ml生理盐水加入到封装有1mg SAP17多肽的西林瓶中，超声辅助溶解，得到1mg/ml的SAP17纳米胶束溶液。
HMNP-Vac纳米疫苗制备：使用移液枪取1ml PBS加入到封装有1mg CpG的样品瓶中，超声辅助溶解，得到1mg/ml的CpG溶液。取500μl SAP17纳米胶束溶液加入到500μl水中，之后加入50μl上述CpG溶液，通过静电相互作用，形成复合胶束纳米颗粒疫苗(SAP1710/CpG1-HMNP-Vac)。将样品放于2-8℃冰箱存储，以备后续实验。
实施例二十、一种自组装多肽疫苗的制备方法(SAP1810/CpG1-HMNP-Vac)。具体通过如下步骤制备：
纳米胶束溶液制备：用移液枪取1ml生理盐水加入到封装有1mg SAP18多肽的西林瓶中，超声辅助溶解，得到1mg/ml的SAP18纳米胶束溶液。
HMNP-Vac纳米疫苗制备：使用移液枪取1ml PBS加入到封装有1mg CpG的样品瓶中，超声辅助溶解，得到1mg/ml的CpG溶液。取500μl SAP18纳米胶束溶液加入到500μl水中，之后加入50μl上述CpG溶液，通过静电相互作用，形成复合胶束纳米颗粒疫苗(SAP1810/CpG1-HMNP-Vac)。将样品放于2-8℃冰箱存储，以备后续实验。
实施例二十一、一种自组装多肽疫苗的制备方法(SAP1910/CpG1-HMNP-Vac)。具体通过如下步骤制备：
纳米胶束溶液制备：用移液枪取1ml生理盐水加入到封装有1mg SAP19多肽的西林瓶中，超声辅助溶解，得到1mg/ml的SAP19纳米胶束溶液。
HMNP-Vac纳米疫苗制备：使用移液枪取1ml PBS加入到封装有1mg CpG的样品瓶中，超声辅助溶解，得到1mg/ml的CpG溶液。取500μl SAP19纳米胶束溶液加入到500μl水中，之后加入50μl上述CpG溶液，通过静电相互作用，形成复合胶束纳米颗粒疫苗(SAP1910/CpG1-HMNP-Vac)。将样品放于2-8℃冰箱存储，以备后续实验。
实施例二十二、一种混合了多种自组装多肽的自组装多肽疫苗的制备方法(SAP4/5/7/85/CpG1-HMNP-Vac)。具体通过如下步骤制备：
纳米胶束溶液制备：用移液枪分别取1ml生理盐水分别溶解1mg SAP4多肽、1mgSAP5多肽、1mg SAP7多肽、1mg SAP8多肽，超声辅助溶解，得到1mg/ml的SAP4、SAP5、SAP7、SAP8纳米胶束溶液。
HMNP-Vac纳米疫苗制备：使用移液枪取1ml PBS加入到封装有1mg CpG的样品瓶中，超声辅助溶解，得到1mg/ml的CpG溶液。取125μl SAP4、125μl SAP5、125μl SAP7、125μlSAP8纳米胶束溶液共计500μl加入到500μl水中，之后加入100μl上述CpG溶液，通过静电相互作用，形成复合胶束纳米颗粒疫苗(SAP4/5/7/85/CpG1-HMNP-Vac)。将样品放于2-8℃冰箱存储，以备后续实验。
实施例二十三、一种负载了polyI:C的自组装多肽疫苗的制备方法(SAP15/polyI:C1-HMNP-Vac)。具体通过如下步骤制备：
纳米胶束溶液制备：用移液枪取1ml生理盐水加入到封装有1mg SAP1多肽的西林瓶中，超声辅助溶解，得到1mg/ml的SAP1纳米胶束溶液。
HMNP-Vac纳米疫苗制备：使用移液枪取1ml PBS加入到封装有1mg polyI:C的样品瓶中，超声辅助溶解，得到1mg/ml的polyI:C溶液。取500μl SAP1纳米胶束溶液加入到500μl水中，之后加入100μl上述polyI:C溶液，通过静电相互作用，形成复合胶束纳米颗粒疫苗(SAP15/polyI:C1-HMNP-Vac)。将样品放于2-8℃冰箱存储，以备后续实验。
实施例二十四、一种同时负载了CpG和polyI:C的自组装多肽疫苗的制备方法(SAP110/CpG1/polyI:C1-HMNP-Vac)。具体通过如下步骤制备：
纳米胶束溶液制备：用移液枪取1ml生理盐水加入到封装有1mg SAP1多肽的西林瓶中，超声辅助溶解，得到1mg/ml的SAP1纳米胶束溶液。
HMNP-Vac纳米疫苗制备：使用移液枪取1ml PBS加入到封装有1mg polyI:C的样品瓶中，超声辅助溶解，得到1mg/ml的polyI:C溶液。使用移液枪取1ml PBS加入到封装有1mgCpG的样品瓶中，超声辅助溶解，得到1mg/ml的CpG溶液。将上述PolyI:C及CpG溶液混合，得到1mg/ml的CpG/PolyI:C溶液。取500μl SAP1纳米胶束溶液加入到500μl水中，之后加入100μl上述CpG/PolyI:C溶液，通过静电相互作用，形成复合胶束纳米颗粒疫苗(SAP110/CpG1/polyI:C1-HMNP-Vac)。将样品放于2-8℃冰箱存储，以备后续实验。
实验一：
实验名称：HMNP-Vac制备方法可行性及机理验证
实验设备：粒径分析数据以及表面Zeta电位数据由马尔文动态光散射仪(DLS)测得。冷冻样品由FEI Vitrobot冷冻样品制备仪制备，冷冻电镜照片由Talos F200C 200kV冷冻透射电镜(Cyro-TEM)拍摄。普通透射电镜由型号为FEI Tecnai G2 F20的透射电镜拍摄。荧光分光光度计型号为岛津RF-5301PC。
实验材料：SAP1纳米胶束水溶液(500μg/ml)，实施例一中的SAP110/CpG1-HMNP-Vac，实施例二中的SAP25/CpG1-HMNP-Vac，SAP15/FAMCpG1-HMNP-Vac，实施例四中的SAP115/CpG1-HMNP-Vac,实施例五中的SAP15/CpG1-HMNP-Vac。
实验过程：1)检测纳米胶束临界胶束浓度。配制浓度为1.3*10-5M的含芘的水溶液10ml。取1ml上述水溶液溶解不同质量的多肽得到浓度为3.90625、7.8125、15.625、31.25、62.5、125、250及500μg/ml的SAP1溶液。在避光室温环境下，将不同浓度的SAP1溶液振荡4小时。之后采用荧光分光光度计测试对应的SAP1溶液的光强度。其中荧光分光光度计的设置参数为激发波长335nm，发射波长为360-400nm，发射和激发带宽均为2.5nm。通过对比不同浓度SAP1样品在383nm波长下的荧光强度，得到SAP1样品的临界胶束浓度(CMC point)。2)冷冻电镜形貌拍摄。将3μl样品溶液(SAP1纳米胶束水溶液)滴加在TEM铜网上，使用冷冻样品制备仪blot2次，每次blot时间为5秒，之后在乙烷介质中玻璃化，温度为-180℃。将玻璃化之后的样品保存至液氮中(77K)，之后用Talos F200C 200kV冷冻电镜进行样品形貌的拍摄。3)粒径分析测试。：用规格为10mm*10mm*40mm的石英比色皿做样品皿，用DLS测试样品(SAP1纳米胶束水溶液、实施例一、稀释20倍的实施例一溶液)溶液的粒径大小及分布，测试连续测试2次，间隔30s，最终取两次测试的平均值做最终数据。4)普通透射电镜拍摄。取实施例一样品溶液10μl加到TEM grids上面，真空抽干溶剂，最后通过TEM进行明场拍摄。5)表面zata电位拍摄。分别取1ml样品(实施例一、实施例四、实施例5、以及SAP1纳米胶束溶液)加入到PS材质的电位皿中，连续测试3次，间隔30s，最终取三次测试的平均值做最终数据。6)荧光定性标准纳米疫苗组分。分别将样品(实施例2以及SAP15/FAMCpG1-HMNP-Vac)通过高速离心得到纳米颗粒沉淀物，之后将该沉淀物重新分散到新鲜水溶液中，加入10mm*10mm*40mm的石英比色皿做样品皿中，进行荧光测试。
实验结果：为了证明本发明提出了SAP多肽可以在水溶液中自组装形成纳米胶束，首先我们通过荧光探针分子的测试方法定量的测试其临界胶束浓度。如图2所示，我们测试了不同浓度的SAP1多肽溶液的荧光强度，同时我们选择了373nm的峰值进行归一化处理，结果显示SAP1浓度为62.5μg/ml时候，探针分子的荧光强度发生突变，因此该数值即为SAP1的临界胶束浓度。之后为了测定纳米胶束的形貌，我们对纳米胶束进行了冷冻电镜及DLS的表征。如图3所示，冷冻电镜显示SAP1纳米胶束为球形结构，大小约5nm，而DLS显示，SAP1纳米胶束具有均一的尺寸分布，其水合直径约10nm。然而该纳米胶束不仅尺寸过小，在体内循环的时候极易被肝脏代谢，而且胶束本身结构不稳定的特点包括相对较大的CMC值，都会影响纳米胶束疫苗的递送效果。得益于SAP巧妙的结构设计，所形成的纳米胶束外层为带正电荷的氨基酸区域，因此我们可以继续添加核酸类佐剂，以此通过静电相互作用复合佐剂分子，形成复合胶束纳米颗粒疫苗。如图4(a)，实施例一的SAP110/CpG1-HMNP-Vac具有30～100nm的颗粒尺寸，且形貌为近似球形。图4(b)显示该纳米疫苗具有100纳米左右的水合直径，该数值比SAP1纳米胶束增长至10倍。由此证明了核酸类佐剂的添加，可以使纳米胶束形成复合胶束纳米颗粒。相较于传统的自组装纳米胶束，例如SAP1溶液(500μg/ml)，自组装分子之间仅仅存在较弱的相互作用力，自组装胶束形貌的保持依赖于高浓度溶液。得益于多点的静电相互作用，使得到的HMNP-Vac具有很好的结构稳定性,突破了纳米胶束临界浓度的限制。通过将实施例一中的SAP110/CpG1-HMNP-Vac在水溶液中稀释20倍至24μg/ml，并通过高速离心的方式，成功收集得到了复合胶束纳米颗粒沉淀，并且该浓度下的颗粒尺寸与未稀释样品几乎一致(图4b)。为了证明本专利方法制备纳米疫苗的原理，我们还对纳米胶束SAP1进行了表面zeta电位的表征，如图5所示，SAP1纳米胶束具表面带有正电荷，数值为21.9mv，而随着CpG的添加量逐渐增加，HNMP-Vac的表面电荷逐渐被中和，这说明核酸类佐剂有效的复合到了纳米胶束表面。同时表面正电荷的降低，也极大的降低了纳米疫苗的细胞毒性。另外，通过使用荧光标记的SAP分子，我们对HNMP-Vac成分进行了定性的证明。如图6所示，SAP15/FAMCpG1-HMNP-Vac和SAP25/CpG1-HMNP-Vac具有与游离药物分子相同的荧光发射谱图，定性的证明了HMNP-Vac具有多肽组分以及核酸类佐剂组分，而相对的峰位移是常见的由于分子间相互作用导致的。
上述实验表明，本专利方法创新性的提出联合两亲性多肽自组装策略和静电自组装策略，可以有效的复合核酸类佐剂和纳米胶束，形成复合胶束纳米颗粒疫苗(HMNP-Vac)。此外核酸类佐剂的添加，不仅中和了纳米胶束表面的正电荷，理论上纳米疫苗的细胞毒性，提高了颗粒的结构稳定性，并且功能上满足共运输多肽和核酸类佐剂分子的目的。
实验二：
实验名称：调控多肽/核酸类佐剂比例实现纳米颗粒稳定分散
实验设备：粒径分析数据由马尔文动态光散射仪(DLS)测得；
实验材料：实施例1、实施例3、实施例4、和实施例5的样品。
实验过程：粒径分析实验过程：用规格为10mm*10mm*40mm的石英比色皿做样品皿，用DLS测试实施例1、实施例3、实施例4、和实施例5的样品溶液的粒径大小及分布，测试连续测试2次，间隔30s，最终取两次测试的平均值做最终数据。
实验结果：本专利方法提出了自组装多肽纳米疫苗制备方法可以通过调控SAP多肽/核酸类佐剂的质量比实现稳定纳米颗粒的制备。如图7所示，在相同浓度的SAP纳米胶束溶液中分别添加1/20、1/15、1/10、1/5质量比的CpG佐剂分子，均能够得到均匀的HMNP-Vac，其尺寸约为80～100nm。值得一提的是，对于实施例三SAP120/CpG1-HMNP-Vac样品，较少的CpG添加量,不足以使所有的纳米胶束都能够参与反应形成复合胶束纳米颗粒，证据如图7所述，除了约100nm的主峰之外，该曲线还存在一个较小的约10nm的小峰，而这个小峰对应的颗粒大小正好对应了SAP1纳米胶束的大小。而提高CpG添加量至多肽质量的1/15，小峰逐渐不明显，最终在1/10多肽添加量下，小峰完全消失。
上述实验表明，通过调控多肽/核酸类佐剂比例可以实现纳米颗粒稳定分散，制备得到的HMNP-Vac具有20～200nm区间的颗粒尺寸。
实验三：
实验名称：方法普适性验证
实验设备：粒径分析数据由马尔文动态光散射仪(DLS)测得，型号ZS90；原子力显微镜(AFM)数据由牛津Cypher ES高分子版原子力显微镜拍摄得到。
实验材料：实施例1、实施例6～22的样品。
实验过程：粒径分析实验过程：用规格为10mm*10mm*40mm的石英比色皿做样品皿，用DLS测试实施例1、实施例6～22的样品溶液的粒径大小及分布，测试连续测试2次，间隔30s，最终取两次测试的平均值做最终数据。
实验结果：本专利方法提出的两亲性多肽分子，具有明显的三段式结构，即疏水区域、抗原序列部分、以及亲水区域，这样的设计结构可以帮助SAP分子通过疏水作用力在水溶液中自组装形成纳米胶束结构。同时，为了提高该种纳米胶束的稳定性，我们提出了联合静电自组装策略的方法，核酸类佐剂分子的加入，有效的与纳米胶束表面进行复合。相对较小的纳米胶束通过核酸类佐剂分子的媒介组装形成较大的复合纳米胶束颗粒。得益于SAP分子X段具有较强的疏水性，以及Y段具有较强的亲水性。由该两亲性分子制备HMNP-Vac具有一定的普适性。如图8所示，以实施例1以及实施例6～13为例，我们改变了SAP分子中Neo区域的抗原序列，均可以得到20～200nm左右的HMNP-Vac。以实施例1、实施例6、实施例12和实施例14为例，改变了SAP分子中氨基酸链接片段(Linker)，对于同种linker或者两种linker相组合的方式，均可以制备得到HMNP-Vac。接着还尝试了改变SAP分子的X段，如图8所示，对于有着与Pam2Cys类似结构的PamCys、Pam3Cy3以及十六烷酸(C16)修饰，均能够得到HMNP-Vac，推测其原因可能是由于上述X段修饰结构均包含有长链饱和烷烃，相对较强的疏水驱动力，赋予了该方法一定的普适性。接着还尝试了改变SAP分子的Y段，正如预期，由于选用的CPP(细胞穿膜肽)分子或者碱性氨基酸片段具有一致的带电荷属性，并且具有接近的氨基酸片段长度，因此在核酸类佐剂的桥连下，纳米胶束结构可以迭代，制备得到复合胶束纳米颗粒结构。得益于本专利方法的普适性，成功尝试了含多条多肽的MultiPep-HMNP-Vac制备。以实施例22为例，该实施例为含有4条多肽的MultiPep-HMNP-Vac，通过原子力显微镜(图9)所示，纳米疫苗具有较理想的尺寸大小，约30～100nm，保持近似球形颗粒形貌。同时对于该样品，还进行了DLS测试，如图10所示，MultiPep-HMNP-Vac具有均一的尺寸分布，其水合直径约60纳米。
上述实验表明本专利文件提出的复合纳米胶束颗粒疫苗(HMNP-Vac)制备方法对于不同抗原序列的SAP分子，具有一定的普适性。得益于此，作为概念验证实验，含多条多肽的MultiPep-HMNP-Vac得以成功制备。对于一些应用场景例如，新生抗原多肽疫苗的应用，往往需要多条多肽分组一起使用。通过如上的MultiPep-HMNP-Vac的制备例子，充分说明了本专利方法可以实现多条多肽的同时负载，进一步扩宽了多肽纳米疫苗的应用前景。
实验四：
实验名称：HMNP-Vac中共负载多种佐剂分子的验证
实验设备：粒径分析数据由马尔文动态光散射仪(DLS)测得，型号为ZS90。
实验材料：实施例5(SAP15/CpG1-HMNP-Vac)、实施例23(SAP15/polyI:C1-HMNP-Vac)和实施例24(SAP110/CpG1/polyI:C1-HMNP-Vac)中的自组装多肽疫苗样品。
实验过程：粒径分析实验过程：用规格为10mm*10mm*40mm的石英比色皿做样品皿，用DLS测试实施例5、实施例23以及实施例24的样品溶液的粒径大小及分布，测试连续测试2次，间隔30s，最终取两次测试的平均值做最终数据。
实验结果：由于SAP分子中X段(含疏水区域的片段)可以选择TLR2/6佐剂分子Pam2Cys，同时核酸类佐剂(CpG、dsRNA、ssRNA)可以有效复合到纳米胶束表面,因此本专利方法提出的HMNP-Vac可以有效共负载多种TLR佐剂分子。以SAP1为例子，其本身带有TLR2/6佐剂分子，在此基础之上与CpG(TLR9佐剂)复合形成SAP15/CpG1-HMNP-Vac(实施例5)，该纳米疫苗同时具有TLR2/6佐剂以及TLR9佐剂。作为最常见的dsRNA佐剂，聚肌苷酸-聚胞苷酸(PolyI:C),能够高效活化Toll样受体3。SAP1与PolyI:C复合，形成SAP15/polyI:C1-HMNP-Vac(实施例23)，该纳米疫苗同时具有TLR2/6佐剂以及TLR3佐剂。SAP1与CpG以及PolyI:C复合形成SAP110/CpG1/polyI:C1-HMNP-Vac(实施例24)，该纳米疫苗同时具有TLR2/6佐剂、TLR9佐剂以及TLR3佐剂。共负载多种佐剂分子可以更好的激起机体免疫反应，提升纳米疫苗的药效。同时我们通过DLS对上述三种纳米疫苗进行了粒径分析，如图11所示，SAP15/CpG1-HMNP-Vac(实施例5)具有约80nm左右的颗粒尺寸，SAP15/polyI:C1-HMNP-Vac(实施例23)具有约120nm左右的颗粒尺寸，而双核酸类佐剂疫苗SAP110/CpG1/polyI:C1-HMNP-Vac(实施例24)具有约100nm左右的颗粒尺寸。
上述实验表明本专利文件提出的HMNP-Vac制备方法可以有效的共负载多种佐剂分子，潜在的多种佐剂的协同作用有望进一步提升纳米疫苗的免疫激活效果。
实验五：
实验名称：HMNP-Vac靶向淋巴器官实验；
实验设备：IVIS Lumina LT活体成像仪
实验材料：SAP2纳米胶束溶液(454μg/ml)，实施例2中的SPA25/CpG1-HMNP-Vac，C57/BL6小鼠。
实验过程：实验设组：1)PBS阴性对照组；2)SAP2纳米胶束溶液；3)实施例2中的HMNP-Vac纳米疫苗组，每组小鼠3只。在第0小时，在C57/BL6小鼠尾根皮下给药，给药剂量为100μl/只。24小时之后，牺牲小鼠，解剖取出小鼠的腹股沟淋巴结。暂时放置在含有PBS的培养皿中保存，医用纱布将淋巴结上的PBS擦干，将淋巴结平整摆放，用活体成像仪拍摄。活体成像设置为荧光模式，荧光信号基团为FITC基团(激发波长488nm，发射波长525nm)。
实验结果：为了验证HMNP-Vac的制剂形式可以提升纳米疫苗对淋巴器官的靶向性，我们采用了FITC荧光分子标记的SAP2多肽分子作为研究模型。给药之后24小时，我们取出了小鼠的腹股沟淋巴结，如图12(a)所示，PBS阴性对照组，几乎没有荧光信号，SAP2纳米胶束组具有较弱的荧光信号，而HMNP-Vac组具有显著提升的荧光信号亮度。通过相对荧光强度定量分析(图12b)，对比相同剂量的给药量，HMNP-Vac组比SAP2纳米胶束组荧光信号强度提升了50％。
上述实验表明制剂形式从纳米胶束(micelle)到复合胶束纳米颗粒(HMNP-Vac)的转变，增大了纳米疫苗的颗粒尺寸及提高了稳定性，这样的尺寸有利于提高纳米疫苗对淋巴器官的靶向。
实验六：
实验名称：未成熟DC细胞(树突状细胞)内吞效率验证实验
实验设备：徕卡荧光倒置显微镜
实验材料：组1PBS空白对照、组2 SAP2纳米胶束溶液(浓度454μg/ml)、组3实施例2的复合胶束纳米疫苗(SPA25/CpG1-HMNP-Vac)
实验过程：步骤一，采集外周血，分离获得单个核细胞PBMC。步骤二，获取未成熟DC细胞：将PBMC离心弃去上清，采用CD14免疫磁珠分离试剂盒分离获得单核细胞(未成熟DC细胞)。骤三，各组未成熟DC细胞摄取不同的抗原肽：
收集未成熟DC细胞；按每孔8*105个/mL加入24孔板中，加1mL DC细胞培养基，共计设置3孔，分别为组1(PBS空白对照组)、组2(SAP2纳米胶束)、组3实施例2的纳米疫苗组(SPA25/CpG1-HMNP-Vac)，记为第一天；第五天将培养液吸弃，全换液使用不含自体血浆的DC细胞培养基，组2-3加入25μg/ml样品，组1加入等体积PBS溶液。步骤四，荧光显微镜显色检测：各组加入对应样品2h后，将培养液吸弃，PBS清洗两遍，加入1ml PBS荧光显微镜下拍照观察。
实验结果：如图13所示，实施例2的纳米复合疫苗(SPA25/CpG1-HMNP-Vac)在荧光的激发下可以产生明显的荧光信号，说明复合胶束纳米颗粒已经被内吞到DC细胞中。而空白对照组、SAP2纳米胶束组(图13a)、在相同的荧光激发条件下，均没有显著的荧光斑点产生。从上述的实验中，我们可以得出这样的结论：复合胶束纳米颗粒疫苗对比超小的(<10nm)纳米胶束药物形式，可以显著的增加DC细胞的内吞效率。
实验七：
实验名称：Tetramer法验证CD8+T细胞激活效果
实验材料：组1PBS空白对照、组2 SAP1纳米胶束溶液(浓度454μg/ml)、组3实施例5的复合胶束纳米疫苗(SPA15/CpG1-HMNP-Vac)；四聚体(tetramer)：HLA-A*02:01 CMV pp65Tetramer-NLVPMVATV-PE
实验过程：步骤一，采集志愿者外周血(HLA-A*02:01)，分离获得单个核细胞(PBMC)。步骤二，未成熟DC细胞获取。步骤三，刺激诱导未成熟DC细胞成熟。收集未成熟DC细胞；按5～10×106cell/瓶铺入培养瓶设为三组，每组加15ml DC培养基，48h后半量换液；再次培养48h后全换液，组1～3加入25μg/ml；24h后各组分别加入刺激物；24h后收集各组成熟DC细胞；对得到的成熟DC细胞表面标记物CD80/CD83/CD86/MHC I/MHC II以及成熟DC细胞的培养液中IL-12的浓度进行检测。步骤四，初始T细胞的分离纯化。将步骤二中T细胞计数，T细胞按1～3×106cell/ml种瓶，加入T细胞维持培养基后进行培养，视细胞生长情况半量换液；待收集完步骤三中成熟DC细胞后，再次对T细胞进行计数。步骤五，肿瘤新生抗原特异性T细胞的激活及流式检测。按照初始T细胞数量平均分为3组与各组成熟DC细胞分别计数；按照各组成熟DC细胞：初始T细胞＝1：30的比例共刺激培养，48h后获得共刺激培养后的细胞悬液。通过四聚体染色流式分析验证成熟DC细胞成功递呈肿瘤新生抗原和激活T细胞的能力。
实验结果：为了精确的评估T细胞的激活能力，我们采用四聚体标定的方法。试验共设置三组，分别为阴性对照组、SAP纳米胶束组以及HMNP-Vac复合胶束纳米颗粒组。如图14所示，HMNP-Vac复合胶束纳米颗粒组显示出2.0％左右的pp65 CMV特异性CD8+ T细胞比例，这数值对SAP纳米胶束组,提升了300％。这说明HMNP-Vac纳米制剂形式可以显著提升抗原的提呈，并显著激活CD8+T细胞免疫反应。
实验八：
实验名称：动物体内药效验证
实验材料：组1阴性对照组、组2游离多肽组(454μg/ml)、组3SAP纳米胶束组(浓度454μg/ml)、组4、实施例22中的SAP4/5/7/85/CpG1-HMNP-Vac。
实验过程：使用Balb/c小鼠做动物模型，肿瘤模型为CT26结肠癌细胞，每只小鼠接种7.5*10^4个肿瘤细胞，记第0天，之后第1、2、5、9、14和第21天给药。每次给药100μl/只，给药部位为小鼠尾根皮下注射。检测指标：统计体重、瘤径；组织(脾脏、淋巴结)；流式检测：CD3、CD4、CD8、CD69、PD-1、IFN-γ、Perforin、Granzyme；ELISpot检测：IFN-γ。
实验结果：为了对纳米复合疫苗的药效做客观评估，我们选用CT26结肠癌细胞做肿瘤细胞模型以及Balb/c小鼠做动物模型。如图15所示，在第0天接种肿瘤细胞，并在之后的第1、2、5、9、14以及21天通过尾基部皮下给药。为了评估纳米疫苗的安全性，我们每3天对小鼠进行体重的称量。如图16所示，四组小鼠包括阴性对照组、游离多肽组、SAP纳米胶束组以及HMNP-Vac复合胶束纳米颗粒疫苗组具有接近的体重增长曲线，这充分说明了本专利方法制备的纳米复合疫苗具有很好的安全性，对生物体无明显的毒副作用。在测量小鼠体重的同时，我们也测量了小鼠肿瘤的大小。通过肿瘤的生长曲线(图17)，HMNP-Vac复合胶束纳米颗粒疫苗组显示出了很好的抑瘤效果，在第21天，平均瘤体积约110mm3。而对比阴性对照组，在第21天时，肿瘤体积已经达到了约900mm3。游离多肽组以及SAP纳米胶束组具有一定的抑瘤作用，但是效果不及HMNP-Vac组。之后为了进一步从细胞层面解释小鼠抑瘤能力的差异，我们在第22天的时候，牺牲了每组6只小鼠，并且提取其淋巴结进行了T细胞流式分析检测。如图18所示，在淋巴结组织中，游离多肽组以及SAP纳米胶束组CD8+比例分别为10.3％和11.4％,令人鼓舞的是HMNP-Vac组的CD8+T细胞比例显著上升至22.5％，对比SAP纳米胶束组提升了97％。
我们通过小鼠体内药效试验，说明了HMNP-Vac复合胶束纳米颗粒疫苗具有较好的生物安全性，相较纳米胶束形式的制剂(SAP纳米胶束)，具有显著提升的抑瘤效果。通过流式分析等技术，阐明了良好的药效源于复合胶束纳米疫苗可以有效的提升CD8+T细胞的比例。综上所述，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。
本发明实施例方法创新性的联合两亲性多肽自组装策略以及静电自组装策略，首次制备得到了均匀尺寸的具有20～200nm的复合胶束纳米颗粒疫苗(HMNP-Vac)。该疫苗降低了细胞毒性，具有很好的结构与分散稳定性，并且功能上满足共运输多肽和多种佐剂分子的目的。制备得到的HMNP-Vac可以显著提高抗原肽的淋巴器官靶向性，同时提升了树突状细胞对抗原多肽的内吞效率，上调了抗原特异性T细胞比例，最重要的是，显著提升了抑瘤效果。
在本说明书的描述中，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
Claims (10)
1.一种自组装多肽疫苗，其特征在于：包括自组装多肽分子形成的纳米胶束，纳米胶束外部复合带负电的核酸类佐剂；由核酸类佐剂桥连纳米胶束形成复合胶束纳米颗粒疫苗；所述自组装多肽分子的结构为：X-Linker1-Neo-Linker2-Y；其中，X为含疏水区域的片段，Neo为抗原片段，Y为带正电的氨基酸片段，Linker1和Linker2均为连接氨基酸片段，所述Linker1和Linker2相同或不同。
2.根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于：所述的含疏水区域的片段包括PamCys，Pam2Cys，Pam3Cys，十六烷酸，十四烷酸和十二烷酸中的任意一种。
3.根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于：所述的抗原片段为多肽片段。
4.根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于：所述带正电的氨基酸片段为阳离子穿膜肽或碱性氨基酸片段。
5.根据权利要求4所述的疫苗，其特征在于：所述的阳离子穿模肽包括TAT：RKKRRQRRR，R8：RRRRRRRR，R9：RRRRRRRRR，R9-TAT：GRRRRRRRRRPPQ，Penetratin：RQIKIWFQNRRMKWKK中的任意一种。
6.根据权利要求4所述的疫苗，其特征在于：所述的碱性氨基酸片段为精氨酸、赖氨酸、组氨酸中的一种或多种组合；所述碱性氨基酸片段长度为1～10aa。
7.根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于：所述Linker1的序列为KK，SLVR，LLSVGG和CSSVVR中的任意一种；所述Linker2的序列为KK，SLVR，LLSVGG和CSSVVR中的任意一种。
8.根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于：所述核酸类佐剂为寡聚脱氧核苷酸链CpGODN佐剂、双链RNA佐剂、单链RNA佐剂的一种或多种的组合。
9.一种权利要求1所述的疫苗的制备方法，包括如下步骤：将自组装多肽完全溶于水中，自组装多肽分子形成纳米胶束后，加入带负电的核酸类佐剂与纳米胶束复合，形成复合胶束纳米颗粒疫苗。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于：所述自组装多肽与核酸类佐剂的投料质量比为1～20：1。
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