KR102432434B1 - Rna 투여용 제형 - Google Patents

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KR102432434B1
KR102432434B1 KR1020197001180A KR20197001180A KR102432434B1 KR 102432434 B1 KR102432434 B1 KR 102432434B1 KR 1020197001180 A KR1020197001180 A KR 1020197001180A KR 20197001180 A KR20197001180 A KR 20197001180A KR 102432434 B1 KR102432434 B1 KR 102432434B1
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하인리히 하스
아네트 보겔
다니엘 주커
스테파니 에르바
커스틴 로이터
앤 슐레겔
세바스티안 회르너
세바스티안 크라이터
무스타파 디켄
조지 모레노 헤레로
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비온테크 에스이
트론-트란슬라셔날레 온콜로기 안 데어 유니버시태츠메디진 데어 요하네스 구텐베르크-유니버시태트 마인츠 게마인뉘치게 게엠베하
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Abstract

본 발명은 비경구 투여 후에, 특히 근육내 투여 후에 표적 기관 또는 표적 세포에 RNA를 전달하기 위한 폴리플렉스 제형을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 RNA 예컨대 자가-복제 RNA의 투여용 제형, 특히 근육내 주사에 의한 제형에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 제형은 단일가닥 RNA 및 폴리알킬렌이민으로부터의 폴리플렉스 입자를 포함한다. RNA는 목적 단백질, 예컨대 약학적 활성 단백질을 코딩할 수 있다. 또한, 본 발명은 인간 또는 동물에게 비경구 적용을 위한 상기 RNA 폴리플렉스 제형을 포함하는 의약품에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 선택적으로 무균여과, 동결 및 탈수의 단계를 포함하는, 이러한 의약품의 제조에 관한 것이다.

Description

RNA 투여용 제형
본 발명은 비경구 투여 후, 특히 근육내 투여 후에 표적 기관 또는 표적 세포에 RNA를 전달하기 위한 폴리플렉스 제형을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 자가-복제 RNA와 같은 RNA 투여용 제형, 특히 근육내 주사에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 폴리플렉스 입자는 단일가닥 RNA, 바람직하게는 자가-복제 또는 자가-증폭 RNA, 및 폴리알킬렌이민을 포함한다. RNA는 목적 단백질, 예컨대 약학적 활성 단백질을 코딩할 수 있다. RNA는 세포에 의해 흡수되고, RNA는 바람직하게 펩티드 또는 단백질로 번역되고, 이의 생리적 활성을 나타낼 수 있다. 본 발명의 조성물은 면역 반응을 유도 또는 향상시키기 위해 적용 가능하다. 이들은 또한 단백질과 같은 항원을 포함하는 질병의 예방적 및/또는 치료적 치료에 유용하다. 또한, 본 발명은 RNA-폴리플렉스 제형을 포함하는 안정한 조성물의 제조 방법에 관한 것으로, 상기 RNA-폴리플렉스 제형은 단일가닥 RNA 및 폴리알킬렌이민을 포함한다. 본원에 기재된 RNA-폴리플렉스 입자 제형은 제품 품질의 손실없이, 그리고 특히, RNA 활성의 상당한 손실 없이, 동결 및 해동, 또는 탈수 및 재수화될 수 있다. 특히, 본원에 기재된 RNA-폴리플렉스 입자 제형은 동결건조, 분무건조 또는 관련된 방법에 의해 동결 또는 탈수될 수 있으며, 액체 보관에 대해서 제품의 연장된 유통기한을 얻을 수 있다. 또한 RNA-본원에 기재된 RNA-폴리플렉스 입자 제형은 보다 구체적으로 GMP 제조 요건 및 비경구용 의약품 품질 요구 사항을 참조하여 의약품 요구 사항을 준수할 수 있다. 본원에 기재된 RNA-폴리플렉스 제형은 특히 예를 들어 감염성 질병에 대한 인간이나 동물의 백신접종에 유용하다.
예방적 및 치료적 목적을 위해 하나 이상의 폴리펩티드를 코딩하는 외래 핵산의 도입은 수년 동안 생물의학 연구의 목표였다. 선행 기술 접근법으로는 표적 세포 또는 유기체에 핵산 분자의 전달을 공유하지만, 핵산 분자 및/또는 전달 시스템의 유형이 상이하다: 데옥시리보핵산 (DNA) 분자의 사용과 관련된 안전 문제의 영향에 의해, 최근 몇 년간 리보핵산 (RNA) 분자가 주목을 받고 있다. 네이키드 RNA의 형태로, 또는 비-바이러스 또는 바이러스 운반체와 같은 복합체 형태 또는 팩킹된 형태로 단일가닥 또는 이중가닥 RNA를 투여하는 것을 포함하는 다양한 접근법이 제안되어 왔다. 바이러스 및 바이러스 운반체에서, 핵산은 전형적으로 단백질 및/또는 지질 (바이러스 입자)에 의해 캡슐화된다. 예를 들어, RNA 바이러스로부터 유래된 조작된 RNA 바이러스 입자는 식물 치료용 (WO 2000/053780 A2) 또는 포유류의 백신접종용 (Tubulekas et al., 1997, Gene, vol. 190, pp. 191-195) 전달 운반체로서 제안 되었다. 안전 문제를 고려하여, 의학계 및 수의학계는 RNA 바이러스 입자를 인간이나 동물에게 투여하는 것을 꺼린다. RNA에 적용할 수 있는 비-바이러스성 전달 운반체는 유전자 전달에 기초한 치료제 개발을 위해 광범위하게 연구되어왔다. 그러나, 다양한 이유로 임상 실시에서 비-바이러스성 유전자 전달 접근법의 변형은 그리 성공적이지 못했다. 이유는 불만족스러운 수준의 유전자 발현, 그러한 복잡한 제품의 의약품 개발과 관련된 기술 및 규제 문제 및 안전상의 이유와 관련된 것일 수 있다.
따라서, 환자와 동물에서 치료적 가치가 있는 단백질, 예컨대 백신을 코딩하는 RNA를 안전하고 효율적으로 전달하기 위한 의약품이 필요하다. 본원에 기재된 바와 같이, 본 발명의 양상 및 실시형태는 이러한 요구를 다루고 있다.
면역치료 전략은 예를 들어 감염성 질환 및 암 질환의 예방 및 치료를 위한 유망한 선택 사항이다. 병원균- 및 종양-관련 항원의 수가 증가함에 따라 면역요법에 적합한 표적이 광범위하게 수집하게 되었다. 본 발명은 질병의 예방 및 치료를위한 면역요법 치료에 적합한 항원의 효율적인 발현에 적합한 개선된 제제 및 방법을 포함한다.
일 양상에서, 본 발명은:
(a) 단일가닥 RNA; 및
(b) 폴리알킬렌이민을 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
다른 양상에서, 본 발명은 의약품으로 사용하기 위한
(a) 단일가닥 RNA; 및
(b) 폴리알킬렌이민을 포함하는 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 모든 양상 중 일 실시형태에서, 단일가닥 RNA에서 인원자(P) 수에 대한 폴리알킬렌이민에서의 질소원자(N) 수의 몰비(N:P 비율)는 1.0 내지 30, 바람직하게는 2.0 내지 15.0, 보다 바람직하게는 6.0 내지 12.0이다.
또 다른 양상에서, 본 발명은:
(a) 단일가닥 RNA; 및
(b) 폴리알킬렌이민을 포함하는 조성물에 관한 것이다.
여기서 단일가닥 RNA에서 인원자(P) 수에 대한 폴리알킬렌이민에서의 질소원자(N) 수의 몰비(N:P 비율)가 1.0 내지 30.0, 바람직하게는 2.0 내지 15.0, 보다 바람직하게는 6.0 내지 12.0이다.
본 발명의 모든 양상 중 일 실시형태에서, 조성물의 이온강도는 50 mM 이하이고, 바람직하게는 여기서 1가 양이온의 농도가 25 mM 이하이고, 자유형태의 양으로 하전된 2가 양이온의 농도가 20 μM 이하이다.
다른 양상에서, 본 발명은:
(a) 단일가닥 RNA; 및
(b) 폴리알킬렌이민을 포함하고, 여기서 이온강도가 50 mM 이하인 조성물에 관한 것이다.
일 실시형태에서, 양으로 하전된 1가 이온의 농도는 25 mM 이하이고, 양으로 하전된 2가 양이온의 농도는 20μM 이하이다.
본 발명의 모든 양상 중 일 실시형태에서, 조성물은 근육내 주사와 같은 근육내 투여용이다.
본 발명의 모든 양상 중 일 실시형태에서, 단일가닥 RNA 및 폴리알킬렌이민은 폴리플렉스 입자 중에 존재한다.
본 발명의 모든 양상 중 일 실시형태에서, 폴리알킬렌이민은 하기 화학식 (I)을 포함한다:
Figure 112019004151803-pct00001
여기서,
R이 H, 아실기 또는 하기 일반화학식 (II)을 포함하는 기이고:
Figure 112019004151803-pct00002
여기서 R1은 H, 또는 하기 일반화학식 (III)을 포함하는 기이고:
Figure 112019004151803-pct00003
n, m 및 l은 2 내지 10의 정수로부터 독립적으로 선택되고;
p, q 및 r은 정수이고, 여기서 p, q 및 r의 합은 중합체의 평균 분자량이 1.5·102 내지 107 Da, 바람직하게는 5000 내지 105 Da, 보다 바람직하게는 10000 내지 40000 Da, 보다 바람직하게는 15000 내지 30000 Da, 특히 바람직하게는 20000 내지 25000 Da이 되도록 한다.
일 실시형태에서, n, m 및 l은 독립적으로 2, 3, 4 및 5로부터 선택되고, 바람직하게는 2 및 3으로부터 선택된다. 일 실시형태에서, R1은 H이다. 일 실시형태에서, R은 H 또는 아실기이다.
본 발명의 모든 양상 중 일 실시형태에서, 폴리알킬렌이민은 폴리에틸렌이민 및/또는 폴리프로필렌이민, 바람직하게는 폴리에틸렌이민을 포함한다.
본 발명의 모든 양상 중 일 실시형태에서, 폴리알킬렌이민에서 N 원자의 적어도 92%는 양성자화가능한 것이다.
본 발명의 모든 양상 중 일 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 하나 이상의 첨가제를 포함한다. 일 실시형태에서, 하나 이상의 첨가제는 완충 물질, 당류, 안정화제, 동결방지제, 동결건조보호제, 및 킬레이트제로 이루어진 군으로부터 선택된다. 본 발명의 모든 양상 중 일 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 하나 이상의 중합체를 포함한다. 일 실시형태에서, 완충 물질은 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산 (HEPES), 2-(N-모폴리노)에탄술폰산 (MES), 3-모폴리노-2-하이드록시프로판술폰산 (MOPSO), 아세트산 완충 시스템 및 유사체, 인산 완충 시스템, 또는 시트르산 완충 시스템으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나를 포함한다. 본 발명의 모든 양상 중 일 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 pH 범위를 4 내지 8, 바람직하게는 5 내지 7.5로 완충하는 완충액을 포함한다. 이러한 완충 시스템의 예로는 아세테이트 완충액 또는 HEPES 완충액 또는 포스페이트 완충액 또는 아세트산 완충액을 들 수 있다. 일 실시형태에서, 당류는 단당류, 이당류, 삼당류, 올리고당류, 및 다당류로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하고, 바람직하게는 글루코스, 트레할로스, 사카로스 및 덱스트란다당류로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 포함한다. 일 실시형태에서, 첨가제는 1 kDa 내지 100 kDa의 평균 몰질량을 갖는 덱스트란이다. 일 실시형태에서, 동결방지제는 글리콜, 예컨대 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 및 글리세롤로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나를 포함한다. 일 실시형태에서, 킬레이트제는 EDTA를 포함한다. 일 실시형태에서, 지질은 양이온성 지질, 중성 지질, 및 음이온성 지질로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나를 포함한다. 일 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 에틸렌 옥사이드 및 프로필렌 옥사이드 빌딩 블록을 포함하는 하나 이상의 블록 공중합체를 포함한다. 일 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 에틸렌 디아민기를 포함하는 공중합체를 포함한다. 일 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 바람직하게는 양친성 블록 공중합체를 포함하고, 바람직하게는 에틸렌 산화물 및 프로필렌 산화물 빌딩 블록을 포함하고, 또한 선택적으로 에틸렌 디아민기를 포함한다.
본 발명의 모든 양상 중 일 실시형태에서, 조성물은 HEPES 완충된 글루코스 (HBG 또는 HBGx1), MES-완충된 글루코스 (MBG 또는 MBGx1) 또는 HEPES 완충된 트레할로스 (HBT 또는 HBTx1)를 포함한다. 본 발명의 모든 양상 중 일 실시형태에서, 조성물은 0.1 mM 내지 10 mM 범위의 농도를 갖는 아세트산 완충액에서 글루코스 또는 트레할로스 또는 사카로스를 포함한다. 본 발명의 모든 양상 중 일 실시형태에서, 조성물은 0.1 mM 내지 10 mM 범위의 농도를 갖는 포스페이트 완충액에서 글루코스 또는 트레할로스 또는 사카로스를 포함한다.
본 발명의 모든 양상 중 일 실시형태에서, 입자의 z-평균 크기는 200 nm 미만, 바람직하게는 150 nm 미만, 보다 바람직하게는 100 nm 미만이다. 일 실시형태에서, 입자의 z-평균 크기는 50 nm 내지 200 nm이다. 본 발명의 모든 양상 중 일 실시형태에서, 입자의 제타 전위는 20 mV 이상, 바람직하게는 25 내지 40 mV이다. 본 발명의 모든 양상 중 일 실시형태에서, 입자의 전기영동 이동도 (μ)는 1 내지 1.6 μm*cm/V*S이다. 본 발명의 모든 양상 중 일 실시형태에서, 입자의 z-평균 크기 및/또는 제타-전위 및/또는 전기영동 이동도는 폴리플렉스 입자 및 HEPES 완충된 글루코스 (HBG) 또는 HEPES 완충된 트레할로스 (HBT)를 포함하는 현탁액에서 측정된다. 일 실시형태에서, HBG는 5% 글루코스 (w/v) 및 10 mM HEPES, pH 7.1을 포함하거나 HBT는 10% 트레할로스 (w/v) 및 10 mM HEPES, pH 7.1을 포함한다. 일 실시형태에서, 입자의 z-평균 크기는 동적광산란 및 누율 알고리즘에 의한 데이터 분석에 의해 결정된다. 일 실시형태에서, 변환 확산 계수는 동적광산란에 의해 측정 된다. 그런 다음, z-평균을 계산하기 위해 Stock-Einstein 방정식을 사용한다. 일 실시형태에서, 전기영동 이동도는 레이저-도플러 전기영동에 의해 측정된다. 그런 다음, 제타 전위를 계산하기 위해 Henry 방정식 또는 Smoluchowski 방정식을 사용한다.
본 발명의 모든 양상 중 일 실시형태에서, 입자는 바람직하게는 생리적 pH 또는 4.5 내지 7.5의 pH에서 중성 또는 양전하이다.
본 발명의 모든 양상 중 일 실시형태에서, 단일가닥 RNA는 6000 내지 15000 염기, 바람직하게는 9000 내지 12000 염기의 분자이다. 본 발명의 모든 양상 중 일 실시형태에서, 단일가닥 RNA는 적어도 하나 목적 단백질을 암호화한다. 본 발명의 모든 양상 중 일 실시형태에서, 단일가닥 RNA는 레플리콘, 바람직하게는 레플리콘, 바람직하게는 자가-복제 또는 자가-증폭 RNA이다. 일 실시형태에서, 레플리콘은 알파바이러스로부터의 레플리카에 의해 복제될 수 있으며, 여기서 레플리콘은 바람직하게는 알파바이러스 또는 이의 변이체로부터 5' 복제인식서열 및 알파바이러스 또는 이의 변이체로부터의 3'복제인식서열을 포함한다. 본 발명의 모든 양상 중 일 실시형태에서, 단일가닥 RNA는 약학적 활성 펩티드 또는 단백질과 같은 목적 펩티드 또는 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함한다.
본 발명의 모든 양상 중 일 실시형태에서, 본원에 기재된 조성물은 치료에 사용하기 위한 것이다. 본 발명의 모든 양상 중 일 실시형태에서, 본원에 기재된 조성물은 백신 조성물이다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 특히, 세포 내에서 RNA를 발현하기 위해 세포 내로 RNA를 도입하기 위한 본원에 기재된 조성물의 용도에 관한 것이다. 일 실시형태에서, 세포는 근육 세포이다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 RNA의 근육내 투여를 위해 본원에 기재된 조성물의 용도에 관한 것이다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 본원에 기재된 조성물을 근육내 투여하는 단계를 포함하는 RNA의 근육내 투여 방법에 관한 것이다.
또 다른 양상에서, 본 발명은
(a) 단일가닥 RNA; 및
(b) 폴리알킬렌이민을 포함하는 동결, 동결건조 또는 분무건조된 조성물에 관한 것이고,
여기서 조성물은 동결방지제 및/또는 동결건조보호제, 바람직하게는 이당류 예컨대 트레할로스, 또는 다당류 예컨대 덱스트란을 포함한다.
일 실시형태에서, 조성물은 킬레이트제 예컨대 EDTA를 추가로 포함한다.
일 실시형태에서, 조성물은 5-20% (w/v)의 이당류 및 선택적으로 20 μM 내지 10 mM 예컨대 80 μM 내지 5 mM의 킬레이트제를 포함하는 수성 조성물로부터 제조된다. 일 실시형태에서, 수성 조성물은 트레할로스, HEPES, 및 EDTA 예컨대 10% 트레할로스 (w/v), 2.8 mM HEPES, 80 μM EDTA, pH 7.1을 포함한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 본원에 기재된 동결 조성물을 해동시키거나 본원에 기재된 동결건조 또는 분무건조된 조성물을 재용해시킴으로써 수득될 수 있는 수성 조성물에 관한 것이다.
또 다른 양상에서, 본 발명은:
(i) 단일가닥 RNA, 폴리알킬렌이민 및 동결방지제 및/또는 동결건조보호제, 바람직하게는 이당류 예컨대 트레할로스, 또는 다당류 예컨대 덱스트란을 포함하는 수성 조성물을 제조하는 단계;
(ii) 조성물을 동결, 동결건조하는 또는 분무건조하는 단계를 포함하는 동결, 동결건조 또는 분무건조된 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
일 실시형태에서, 수성 조성물은 킬레이트제 예컨대 EDTA를 추가로 포함한다. 일 실시형태에서, 수성 조성물은 5-20% (w/v)의 이당류 및 선택적으로 20 μM 내지 10 mM 예컨대 80 μM 내지 5 mM의 킬레이트제를 포함한다. 일 실시형태에서, 수성 조성물은 트레할로스, HEPES, 및 EDTA 예컨대 10% 트레할로스 (w/v), 2.8 mM HEPES, 80 μM EDTA, pH 7.1을 포함한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은:
(a) 단일가닥 RNA; 및
(b) 폴리알킬렌이민을 포함하는, 동결, 동결건조 또는 분무건조된 조성물을 제조하기 위해 동결방지제 및/또는 동결건조보호제, 바람직하게는 이당류 예컨대 트레할로스, 또는 다당류 예컨대 덱스트란의 용도에 관한 것이다.
일 실시형태에서, 이당류는 킬레이트제 예컨대 EDTA와 조합하여 사용된다.
동결 또는 동결건조 또는 분무건조된 조성물 또는 동결 또는 동결건조 또는 분무건조된 조성물을 제조하기 위한 수성 조성물은 이하 중 하나 이상을 포함할 수 있다:
(i) 비-수성 용매 예컨대 에틸렌 글리콜, 글리세롤, 디메틸설폭시드, 및 디메틸포름아미드.
(ii) 폴록사머, 폴록사민, 및 황산 도데실 나트륨으로 알려진 계면활성제 예컨대 Tween 80, Brij 35, Brij 30, Lubrol-px, Triton X-10; Pluronic F127 (폭리옥시에틸렌-폭리옥시프로필렌 공중합체).
(iii) 이당류 예컨대 트레할로스, 수크로스, 락토스, 및 말토오스.
(iv) 중합체 (다른 MW를 가질 수 있는) 예컨대 폴리에틸렌 글리콜, 덱스트란, 폴리(비닐 알코올), 하이드록시프로필 메틸셀룰로스, 젤라틴, 폴리비닐피롤리딘, 하이드록시에틸 셀룰로스, 피콜(Ficoll), 및 알부민.
(v) 아미노산 예컨대 글리신, 프롤린, 4-하이드록시프롤린, L-세린, 글루타메이트, 알라닌, 라이신, 사르코신, 및 감마-아미노부티르산.
또 다른 양상에서, 본 발명은 두 수성 유체는 연속 흐름 펌프 및 혼합 장치를 사용함으로써 RNA 폴리플렉스 제형의 연속 흐름 제조용 방법에 관한 것이고, 두 수성 유체는 mm 또는 μm 크기의 채널에 의해 혼합된다.
도 1의 A는 시험관내 HEK-293 세포에 유리 순수 PEI의 독성을 나타낸다. 질소의 IC50 = 77 μM (유리형태). B는 시험관내 HEK-293 세포에 PEI/레플리콘-RNA 폴리플렉스의 독성을 나타낸다. 질소의 IC50 = 542 μM (폴리플렉스 제형).
도 2는 1주 보관 후 다른 보관 조건에서 N/P 11.6에서 PEI/레플리콘-RNA 폴리플렉스와 인큐베이팅한 후 C2C12 근육 세포로부터의 상대 발광을 나타낸다.
도 3은 2주 보관 후 다른 보관 조건에서 N/P 11.6에서 PEI/레플리콘-RNA 폴리플렉스의 상대 RNA 무결성을 나타낸다.
도 4는 폴리(2-에틸-2-옥사졸린)이 개시제의 존재 하에 2-에틸-2-옥사졸린의 개환 이성질체화 중합에 의해 수득된 것을 나타낸다.
도 5는 산 가수분해에 의해 완전히 탈아실화된 선형 PEI22, PEI87, 및 PEI217의 합성을 나타낸다. 조건: (i) 24% (wt/vol) HCl, 110℃, 96 h; 50-kDa PEOZ에 대해 n=504, 200-kDa PEOZ에 대해 2,018, 및 500-kDa PEOZ에 대해 5,044.
도 6은 증가하는 염 농도에서 IVT (A) 및 레플리콘 (B) 폴리플렉스의 응집 역학을 나타낸다.
도 7은 여과 전 (초기)과 여과 후 (최종)에 폴리플렉스의 물리화학적 매개변수를 나타낸다. A 및 B는 폴리플렉스의 지름 및 다분산도를 DLS에 의해 측정하였다. C는 RNA를 헤파린에 의한 폴리플렉스로부터 방출하고, 260 nm에서 UV 흡수에 의해 측정하였다. D는 PEI 농도를 CuSO4 분석으로 측정하였다.
도 8은 고순도 PEI와 보통 순도 PEI의 화학 구조의 비교를 나타낸다. 25 kDa의 PEI에 대해 n=58. PEI 25 kD에서 -CH2CH2NH- 단량체의 평균 수는 581이며 이는 또한 잠재적으로 양성자화가능한 질소의 인접 직선의 길이이다. 보통 순도 PEI25에서 N-프로피오닐 잔기의 균일한 분포를 가정하면, 양성자화가능한 질소의 그 인접 직선은 겨우 64이다.
도 9는 상이한 N/P 비율에서 상이한 순도 수준의 PEI를 사용하여 제조된 레플리콘-RNA 폴리플렉스에 의한 시험관내 C2C12 근육 세포의 형질주입을 나타낸다.
도 10은 N/P 비율이 1 (-) 및 11.6 (+)인 레플리콘-RNA 폴리플렉스를 고순도 PEI (jetPEI) 및 보통 순도 PEI (25 kDa)로 제조한 것을 나타낸다. 유리형태 RNA가 대조군으로 사용하였다. 제형을 마우스의 뒷다리에 근육 주사하였다 (n=3). 발광 신호는 마우스의 근육으로부터 기록하였다.
도 11은 N/P 비율 7.7 및 11.6에서 레플리콘-RNA 폴리플렉스를 고순도 PEI: jetPEI (Polyplus사), PEI-Max 40000 (Polyscience사), 및 Exgen 500 (Eurodamex사)로 제조한 것을 나타낸다. 모든 제형은 HBTx1 완충액에서 제조된 동결건조 제형을 제외하고는 HBGx1 완충액에서 제조하였다. 제형을 마우스의 뒷다리에 근육 주사하였다 (n=3). 발광 신호는 마우스의 근육으로부터 기록하였다.
도 12는 N/P 11.6의 JetPEI/레플리콘-RNA 폴리플렉스의 동결건조 케이크는 다른 완충액으로 준비한 것을 나타낸다.
도 13은 루시퍼라아제를 코딩하는 IVT-RNA에 의해 C2C12 근육 세포를 시험관내 형질주입시켰다. RNA는 HBGx1 완충액에서 다른 N/P 비율로 JetPEI와 복합체화하였다. 형질주입 24시간 후 발광 신호를 측정하였다.
도 14는 N/P 비율 5.8 및 11.6에서 IVT- RNA 폴리플렉스를 HBGx1 완충액에서 순수한 PEI로 제조하였다. HBGx1 완충액 중의 유리형태 IVT-RNA를 대조군으로 사용하였다. 제형은 주사당 2-8 μg의 RNA 용량으로 마우스(n=3)의 뒷다리에 근육 주사하였다. 주사 6시간 후에 마우스의 근육으로부터 발광 신호를 기록하였다.
도 15는 레플리콘-RNA 및 jetPEI의 폴리플렉스를 HBGx1 완충액 중 N/P 비율 11.6에서 상이한 RNA 농도에서 제조하였다. DLS에 의한 크기 측정을 위해 폴리플렉스를 10 mg/l의 RNA 농도로 희석하였다.
도 16은 C2C12 근육 세포를 도 16으로부터의 폴리플렉스에 의해 시험관내 형질주입시킨 것을 나타낸다. 발광 신호를 형질주입 24시간 후에 측정하였다.
도 17은 N/P 비율 11.6에서 Rep-RNA 폴리플렉스를 도 16에서와 같이 상이한 RNA 농도로 HBGx1 완충액에서 순수한 PEI로 제조하였다. 제형을 2-8 μg의 RNA 용량으로 마우스(n=3)의 뒷다리에 근육 주사하였다. 발광 신호를 마우스의 근육으로부터 기록하였다.
도 18은 인간 수지상 세포 (DC) 및 마우스 근육 세포 (C2C12)에서 PEI/레플리콘-RNA 폴리플렉스를 이용한 시험관내 연구를 나타낸다. A는 독성(폴리플렉스 처리 후의 생존 세포의 %로 표시)을 나타낸다. B는 형질주입(폴리플렉스로 처리한 후 발광 방출로 표시)을 나타낸다. 형질주입 결과는 C2C12 세포에서만 나타난다.
도 19는 N/P 비율 11.6 또는 15.8에서 Rep-RNA 폴리플렉스를 HBGx1 또는 Hepes 10 mM 완충액 중 Polyplus 또는 Polytheragene로부터의 PEI로 제조하였다. 마우스에 주사하기 전에 폴리플렉스를 HBGx1 또는 Opti-MEM 완충액으로 희석시켰다. 제형을 주사당 2 μg의 RNA 용량으로 마우스(n=3)의 뒷다리에 근육 주사하였다. 발광 신호는 마우스의 근육으로부터 기록하였다.
도 20의 A)는 Balb/c 마우스의 후경골근에 2μg 비제형화된 (완충 용액) 또는 제형화된 레플리콘-RNA 코딩 루시퍼라아제의 근육내 (근육주사) 적용 후 4일, 7일 및 11일차에, 동물을 비침습성 생체내 생체발광 촬상을 실시한 것을 나타낸다. 루시퍼라아제 단백질로부터 유래된 광자를 1분에 걸쳐 수집하였고, 촬상된 마우스의 사진과 오버레이로 나타내었다. B)는 주사 부위에서 측정된 광자/초 (p/s)의 그래픽 표시를 도시한다.
도 21의 A)는 Balb/c 마우스의 등쪽 피부에 두 주사 부위에 2μg 비제형화된 (완충 용액) 또는 제형화된 레플리콘-RNA 코딩 루시페라아제의 진피내(피내) 적용 후 7일차에, 동물을 비침투성 생체내 생체발광 촬상을 실시한 것을 나타낸다. 루시퍼라아제 단백질로부터 유래된 광자를 1분에 걸쳐 수집하였고, 촬상된 마우스의 사진과 오버레이로 나타내었다. 검은 색 화살표는 주사 부위를 나타낸다. B)는 주사 부위에서 측정된 광자/초 (p/s)의 그래픽 표시를 도시한다.
도 22는 백신으로 레플리콘-RNA 제형의 유익한 효력을 나타낸다.
도 23은 백신으로 레플리콘-RNA 제형의 유익한 효력을 나타낸다
도 24는 10% (w:v) 트레할로스에서 PEI로 제형화된 레플리콘-RNA의 분무건조 결과를 나타낸다.
도 25는 무균여과 전(미여과된) 및 무균여과 후 (멸균된), 다른 N/P 비율에서 PEI/레플리콘-RNA 폴리플렉스와의 인큐베이팅 후 C2C12 근육 세포로부터의 정규화된 발광을 나타낸다.
도 26은 실시예 16에 따른 시험관내 형질주입 효율에 대한 짧은 PEI와 긴 PEI의 조합의 효과를 나타낸다. 도 26 A)는 250 ng RNA/웰에서 짧은 선형 PEI 및 긴 PEI 폴리플렉스의 형질주입 효능을 나타낸다. 도 26 B)는 250 ng RNA/웰에서 짧은 분기형 PEI 및 긴 PEI 폴리플렉스의 형질주입 효능을 나타낸다. 기준점 생체내 Jet PEI 및 동일한 총 NP 비율과 비교하여, 상이한 시간 프레임에서 보다 높은 발현 수준을 짧은 PEI (도 26 A: 선형; 도 26 B: 분기형) 및 긴 PEI (예를 들어 생체내 jetPEI)의 조합으로 달성하였다.
도 27은 실시예 17에 따른 긴 Jet PEI + 짧은 PEI 폴리플렉스 대 기준점 (즉 생체내 JetPEI NP12)의 레플리콘-RNA 형질주입 효능을 나타낸다: 총 NP 12에 대하여 상이한 조합 (NP4 + NP8 또는 NP1,15 + NP11)에서의 짧은 PEI (분기형 1,8kDA) 및 긴 PEI.
도 28은 실시예 18에 따른 생체내 레플리콘 (saRNA)-RNA 형질주입 효율에 대한 염 변화(예를 들어 NaCl)의 효과를 나타낸다. 생체발광 신호가 3일차 (도 28A), 6일차 (도 28B), 9일차 (도 28C) 및 13일차 (도 28D)에서 감지된 것을 나타낸다. 신호 강도는 도 28E에서 비교하였다. PEI-레플리콘-RNA 폴리플렉스 (예를 들어 긴 PEI N/P 12) 및 저농도 (5 내지 10 mM) 염의 첨가를 받은 마우스에서 근육 주사 후 6일차에 마우스의 근육 영역에서 가장 강한 신호가 검출될 수 있다.
도 29는 실시예 18에 따른 레플리콘 (saRNA)-PEI 제형의 형질주입 효율에 대한 pH 조절의 효과를 나타낸다. 6.5 내지 7.1의 pH 값을 갖는 saRNA-PEI 폴리플렉스 제형으로 양호한 결과가 얻어졌다. 가장 강렬한 신호는 pH 6.5로 조정된 saRNA-긴 PEI NP12 제형으로 검출할 수 있다. 기준점으로서 비조정된 pH(BM) 또는 HBG (20 mM Hepes, pH 7.4, 5중량% 글루코스)를 갖는 saRNA-Jet PEI 폴리플렉스 NP12를 사용하였다.
도 30은 실시예 19에 따라 상이한 pH 값으로 조정된 생체내 jetPEI/레플리콘-RNA 폴리플렉스 (N/P 4)의 전기영동 이동도를 나타낸다.
도 31은 실시예 19에 따라 N/P 비율 4 및 상이한 pH 값(pH 6.5-pH 8.5)에서 생체내 jetPEI/레플리콘-RNA 폴리플렉스의 상이한 용량으로 인큐베이팅한 후 C2C12 근육 세포로부터의 정규화된 발광을 나타낸다.
도 32는 실시예 20에 따른 PEI 제형에서 상이한 양의 PEI/초과량의 양전하로 형질주입시킨 후의 루시퍼라아제 발현을 나타낸다.
도 33은 실시예 21에 따른 2 단계 복합체화를 이용함으로써 폴리플렉스 형질주입의 최적화를 나타낸다.
도 34는 HEPES-완충된 글루코스 (HBG)에 비하여 MES-완충된 글루코스 (MBG)로 제형화된 saRNA-폴리플렉스의 우수한 효과를 나타내는 실시예 22에 따른 면역화 실험을 나타낸다.
비록 본 발명을 하기에서 자세하게 설명할 것이나, 본 발명이 본 명세서에 기술된 특정 방법론, 프로토콜 및 시약에 한정되는 것으로 이해되어서는 안되며, 변화 가능할 수 있다. 또한 본원에 사용된 바와 같은 용어는 특정 구체적인 예를 설명하기 위함일 뿐이고, 첨부된 청구범위에 의해서만 제한되는 본 발명의 범위를 제한하고자 함이 아니다. 달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 사용된 기술 및 과학 용어는 당업계의 통상의 기술자가 일반적으로 이해하는 의미와 동일한 의미를 갖는다.
바람직하게는, 본 발명에서 사용된 용어는 문헌["A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)", H.G.W. Leuenberger, B. Nagel, and H. Koelbl, Eds., Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland, (1995)]에 설명된 바에 의하여 정의된다.
본 발명의 실시는 달리 명시하지 않는 한, 당 분야의 문헌에서 설명되는 화학, 생화학, 세포 생물학, 면역학 및 재조합 DNA 기술의 종래 방법을 사용할 것이다 (예를 들어, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, J. Sambrook et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989 참고).
이하, 본 발명의 구성요소에 대하여 설명한다. 이들 요소는 특정 구체적인 예와 함께 열거되지만, 추가 구체적인 예를 생성하기 위해 임의의 방식 및 임의의 수로 조합될 수 있다고 이해되어야 한다. 다양하게 기술된 구체적인 예들 및 바람직한 구체적인 예들은 명시적으로 설명된 구체적인 예들로만 제한하여 본 발명을 해석하지 않는다. 본 명세서는 본 명세서에 개시된 및/또는 바람직한 요소들과 명시적으로 설명된 예를 결합한 구체적인 예를 개시하고 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 나아가, 본 명세서에 기술된 모든 요소의 순열 및 조합은 문맥상 달리 나타내지 않는 한 본 출원의 명세서에 의해 개시되는 것으로 고려되어야 한다.
용어 "약"은 대략적으로 또는 거의를 의미하며, 본원에 기재된 수치 또는 범위와 관련하여 바람직하게는 열거되거나 청구된 수치 또는 범위의 +/- 10%를 의미한다.
본 발명을 설명하는 문맥에서(특히, 본 청구범위의 문맥상) 사용되는 용어 "하나"와 "한(부정관사)" 및 "정관사" 및 유사한 참조용어는 본원에서 달리 명시되지 않거나 문맥에 의해 분명하게 부정되지 않는 한, 단수와 복수 둘 모두를 포함하는 것으로 해석될 수 있다. 본 발명의 값들을 범위로 인용하는 것은 단지 해당 범위에 속하는 각각의 별개의 값들을 개별적으로 손쉽게 칭하기 위한 것이다. 본원에서 달리 명시되지 않으면, 각각의 개별 값은 본원에서 개별적으로 지칭되는 것처럼 본 명세서 내로 편입된 것으로 간주한다. 본원에서 설명되는 모든 방법은 본원에서 달리 명시되지 않거나 문맥에 의해 명백하게 부정되지 않으면, 적절한 임의의 순서로 수행될 수 있다. 본원에서 제공된, 임의 및 모든 실례, 또는 예시적 어법(가령, "예를 들면")의 이용은 단지 본 발명을 더욱 잘 조명하기 위해 의도된 것이고, 청구되는 본 발명의 범위에 한정을 달리 부가하는 것은 아니다. 본 명세서에서 어떠한 어법도 발명의 실시에 필수적인 임의의 청구되지 않은 구성 요소를 지칭하는 것으로 해석되어서는 안된다.
달리 명시하지 않는 한, "포함하는"이라는 용어는 본 명세서의 문맥에서 "포함하는" 것에 의해 도입된 목록의 구성원 이외에 추가적으로 구성원이 선택적으로 존재할 수 있음을 나타내기 위해 사용한다. 그러나, 본 발명의 특정 실시형태로서, "포함하는"이라는 용어는 더 이상의 추가적인 구성원이 존재하지 않을 가능성을 포함하는 것, 즉 이 실시형태의 목적 상 "포함한다"는 의미는 "구성한다"의 의미를 갖는 것으로 이해되어야 함을 고려할 수 있다.
본 명세서의 본문 전반에 걸쳐 몇가지 문헌들이 인용된다. 본원에서 인용된 각각의 상기 또는 하기 문헌들(모든 특허, 특허출원, 과학간행물, 제조업체의 설명서, 지침서 등)은 그 내용 전체가 그 이상 또는 그 이하를 불문하고 본원에 참조 병합된다. 이들 문헌들이 선행발명임을 이유로, 본 발명이 이러한 개시내용에 선행한다고 하지 못함을 인정하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
이하, 본 발명의 모든 측면에 적용되는 정의가 제공될 것이다.
본원에서 사용된 바와 같이 "감소" 또는 "억제"와 같은 용어는 전반적인 감소를 일으키는 능력을 의미하며, 그 수준에서 바람직하게는 5% 이상, 10% 이상, 20% 이상, 보다 바람직하게는 50% 이상, 가장 바람직하게는 75% 이상 감소시키는 능력을 의미한다. 용어 "억제" 또는 유사한 문구는 완전하거나 본질적으로 완전한 억제, 즉 제로로의 감소 또는 본질적으로 제로로의 감소를 포함한다.
"증가" 또는 "증진"과 같은 용어는 바람직하게는 적어도 약 10%, 바람직하게는 적어도 20%, 보다 바람직하게는 적어도 30%, 더욱 바람직하게는 적어도 40%, 더더욱 바람직하게는 적어도 50%, 특히 바람직하게는 적어도 80%, 및 가장 바람직하게는 적어도 100%로의 증가 또는 증진에 관한 것이다.
핵산 서열과 관련하여, "단편"은 핵산 서열의 일부, 즉 5'-말단 및/또는 3'-말단(들)에서 단축된 핵산 서열을 나타내는 서열에 관한 것이다. 바람직하게는, 핵산 서열의 단편은 상기 핵산 서열의 뉴클레오타이드 잔기의 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%를 포함한다. 본 발명에서, RNA 안정성 및/또는 번역 효율을 유지하는 RNA 분자의 단편이 바람직하다.
아미노산 서열(펩티드 또는 단백질)과 관련하여, "단편"은 아미노산 서열의 일부, 즉 N-말단 및/또는 C-말단에서 단축된 아미노산 서열을 나타내는 서열에 관한 것이다. C-말단에서 단축된 단편(N-말단 단편)은 예를 들어, 오픈 리딩 프레임의 3'-말단이 결여된 절단된 오픈 리딩 프레임의 번역에 의해 수득 가능한 것이다. N-말단에서 단축된 단편(C-말단 단편)은 예를 들어, 절단된 오픈 리딩 프레임이 번역을 개시하는 역할을 하는 시작코돈을 포함하는 한, 오픈 리딩 프레임의 5'-말단이 결여된 절단된 오픈 리딩 프레임의 번역에 의해 수득 가능한 것이다. 아미노산 서열의 단편은 예를 들어, 아미노산 서열로부터 적어도 1%, 적어도 2%, 적어도 3%, 적어도 4%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%의 아미노산 잔기를 포함한다.
용어 "이온강도"는 특정 용액에서 여러 종류의 이온 종의 수 및 이들 각각의 전하 사이의 수학적 관계에 관한 것이다. 따라서, 이온강도 I은 수학식에 의해 나타내고
Figure 112019004151803-pct00004
여기서 c는 특정 이온 종의 몰 농도이고, z는 이의 전하의 절대값이다. 총합 Σ는 용액에서 모든 다른 종류의 이온들(i)에 대해 취해진 것이다.
본 명세서에 기재된 조성물의 이온강도는 50 mM 이하, 바람직하게는 25 mM 이하, 바람직하게는 20 mM 이하, 19 mM 이하, 18 mM 이하, 17 mM 이하, 16 mM 이하, 15 mM 이하, 10 mM 이하, 또는 5 mM 이하인 것이 바람직하다. 바람직하게는, 본원에 기재된 조성물의 이온강도는 폴리플렉스 입자의 응집을 방지하기에 충분히 낮다.
본 발명에 따르면, 용어 "이온강도"는 바람직하게는 1가 이온의 존재에 관한 것이다. 2가 이온, 특히 2가 양이온의 존재에 관해서는, 킬레이트제의 존재로 인한 이들의 농도 또는 유효 농도 (자유 이온의 존재)는 바람직하게는 RNA의 분해를 방지하기에 충분히 낮다. 특히 바람직한 일 실시형태에서, 2가 이온의 농도 또는 유효 농도는 RNA 뉴클레오타이드들 간의 포스포디에스테르 결합의 가수분해에 대한 촉매 수준 미만이다. 특히 바람직한 일 실시형태에서, 자유 2가 이온의 농도는 20μM 이하이고, 바람직하게는 유리 2가 이온이 없거나 또는 본질적으로 없다.
본원에 기재된 조성물의 pH는 4 내지 8이고; 보다 바람직하게는 5.5 내지 8, 예를 들어 6 내지 7.5, 예를 들어 6.5 내지 7.1, 6.5 내지 7, 또는 6.5 내지 6.9인 것이 바람직하다.
용어 "이당류"는 글리코시드 결합에 의해 연결된 2개의 단당류 잔기로 구성된 탄수화물을 지칭한다. 이당류의 대표적인 예로는 트레할로스, 말토오스, 수크로스, 락토스, 락툴로스, 셀로비오스, 이소말토오스, 겐티비오즈(gentibiose), 라미나린 이당류 (라미나라비오즈(laminarabiose)), 키토비오스, 자이로비오스 (xylobiose), 이눌린 이당류 및 만노비오스 슈가를 들 수 있다. 본원에 기재된 조성물에서 이당류의 바람직한 함량은 5-20% (w/v) 예컨대 5-15% (w/v), 7-15% (w/v) 또는 8-12% (w/v)이다. 본 발명에 따르면 높은 유리 전이 온도를 갖는 이당류인 것이 바람직하다.
용어 "킬레이트제"는 금속 이온, 바람직하게는 2가 또는 다가 금속 이온과 킬레이트를 형성하는 화합물을 의미한다. 킬레이트제는 금속 이온과 고리 구조를 형성할 수 있는 다수의 잔기, 예를 들어 OH, -COOH를 갖는다. 킬레이트제의 예로는 에틸렌 디아민 테트라아세트산 (EDTA), 디에틸렌 트리아민 펜타아세트산 (DTPA), 트랜스-1,2-디아미노-사이클로헥산 테트라아세트산 모노하이드레이트, N-하이드록시에틸에틸렌 디아민 트리아세트산 (HEDTA) 시트르산, 및 인산 킬레이트제 (예를 들어, Dequest 2000)을 들 수 있다. 에틸렌 디아민 테트라아세트산 (EDTA)은 본 발명에 따라 바람직하다. 킬레이트제는 본원에 기재된 조성물에 적어도 20 μM, 적어도 40 μM, 적어도 60 μM, 또는 적어도 80 μM의 농도로 존재하는 것이 바람직하다. 킬레이트제가 본원에 기재된 조성물에 10 mM 이하, 5 mM 이하, 2 mM 이하, 1 mM 이하, 0.5 mM 이하, 0.2 mM 이하 또는 0.1 mM 이하의 농도로 존재하는 것이 바람직하다.
용어 "동결"은 일반적으로 열을 제거하여 액체의 고체화하는 것을 지칭한다.
용어 "동결건조하는" 또는 "동결건조"는 물질을 동결시킨 다음 물질의 동결된 매체가 고체상에서 기체상으로 직접 승화되도록 주변 압력을 감소시켜 동결건조시키는 것을 지칭한다.
용어 "분무건조"는 용기(분무건조기) 내에서 세분화(분무)된 유체와 (가열된) 기체를 혼합하여 물질을 분무건조하는 것을 말하며, 형성된 액적으로부터의 용매가 증발하여 건조 분말이 된다.
용어 "동결방지제"는 동결 단계에서 활성 성분을 보호하기 위해 제형에 첨가되는 물질을 지칭한다.
용어 "동결건조보호제"는 건조 단계에서 활성 성분을 보호하기 위해 제형에 첨가되는 물질을 지칭한다.
용어 "재용해"는 물과 같은 용매를 건조된 제품에 첨가하여 원래의 액체 상태와 같은 액체 상태로 되돌려 놓는 것을 지칭한다.
용어 "자가(autologous)"는 동일한 대상체로부터 유래된 것을 설명하는 데 사용한다. 예를 들어, "자가 세포(autologous cell)"는 동일한 대상체로부터 유래된 세포를 지칭한다. 대상체 내에 자가 세포를 도입하는 것은, 이들 세포가 별도로 거부 반응을 일으키는 면역 장벽을 극복하기 때문에 유리하다.
용어 "동종이계(allogeneic)"는 동일한 종의 다른 개체로부터 유래된 것을 설명하는 데 사용된다. 하나 이상의 유전자좌에서의 유전자가 동일하지 않은 경우 둘 이상의 개체가 서로 동종이계에 있다고 한다.
용어 "동계(syngeneic)"는 동일한 유전자형을 갖는 개체 또는 조직, 일란성 쌍생아 또는 동일한 동계교배의 동물 또는 이들의 조직 또는 세포로부터 유래한 것을 설명하는 데 사용된다.
용어 "이종(heterologous)"은 다양한 다른 요소로 구성된 것을 설명하기 위해 사용된다. 예를 들어 한 개체의 세포를 다른 개체에 도입하는 것은 이종 이식한 것이 된다. 이종 유전자는 대상체 이외의 공급원으로부터 유래된 유전자이다.
본 발명에 따르면, 비보호된 RNA의 불안정성 때문에, 복합체 형태로 RNA 분자를 제공하는 것이 유리하다. 특히, 일부 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 RNA 및 폴리알킬렌이민을 포함하는 입자를 포함한다.
본 발명에 따른 시스템이 미립자 제형으로 제형화되는 경우, 각 RNA 종 (예를 들어, 레플리콘, 복제효소 구성체, 및 IFN을 저해하기에 적합한 단백질을 코딩하는 RNA와 같은 임의의 부가적인 RNA 종)을 개별 미립자 제형으로서 별도로 제형화할 수 있다. 이 경우에, 각각의 개별 미립자 제형은 하나의 RNA 종을 포함할 것이다. 개별 미립자 제형은 별도의 실체, 예를 들면 별도의 용기에 존재할 수 있다. 이러한 제형은 입자 형성 제제와 함께 각각의 RNA 종을 개별적으로 (전형적으로 RNA-함유 용액의 형태로 각각) 제공하여 입자의 형성을 가능하게 함으로써 수득할 수 있다. 각각의 입자는 입자가 형성될 때 제공되는 특정 RNA 종을 독점적으로 함유할 것이다 (개별 미립자 제형).
일 실시형태에서, 본 발명에 따른 조성물은 둘 이상의 개별 입자 제형을 포함한다. 각각의 조성물은 혼합된 미립자 제형을 지칭한다. 본 발명에 따른 혼합된 미립자 제형은 개별 미립자 제형을 혼합한 후, 상기한 바와 같이 개별 미립자 제형을 개별적으로 형성함으로써 수득할 수 있다. 혼합 공정으로 RNA-함유 입자의 혼합 모집단을 포함하는 제형을 수득한다 (예를 들어, 입자의 첫 번째 모집단은 레플리콘을 포함할 수 있고 입자의 두 번째 제형은 복제효소 구성체를 포함할 수 있다). 개별 미립자 집단은 하나의 용기 내에 함께 존재할 수 있으며, 개별 미립자 제형의 혼합된 집단을 포함한다.
대안적으로, 조성물의 모든 RNA 종 (예를 들어 레플리콘, 복제효소 구성체, 및 IFN을 저해하기에 적합한 단백질을 코딩하는 RNA와 같은 임의의 부가적인 RNA 종)은 조합된 미립자 제형으로서 함께 제형화되는 것이 가능하다. 이러한 제형은 모든 RNA 종의 조합된 제형 (전형적으로 혼합된 용액)을 입자-형성 제제와 함께 제공하여 입자의 형성을 가능하게 함으로써 수득할 수 있다. 혼합된 미립자 제제와는 대조적으로, 조합된 미립자 제형은 전형적으로 둘 이상의 RNA 종을 포함하는 입자를 포함할 것이다. 조합된 미립자 조성물에서, 상이한 RNA 종은 전형적으로 단일 입자에 함께 존재한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 미립자 제형은 나노미립자 제형이다. 이 실시형태에서, 본 발명에 따른 조성물은 나노입자 형태로 RNA를 포함한다.
일반적인 정의에서, 용어 "나노입자"는 지름이 1 nm 내지 1000 나노미터 (nm)인 임의의 입자를 지칭한다.
본 발명의 문맥 상에서, 용어 "입자"는 분자 또는 분자 복합체에 의해 형성된 구조화된 실체를 지칭한다. 일 실시형태에서, 용어 "입자"는 마이크로 또는 나노 크기 구조체, 예컨대 마이크로 또는 나노 크기의 치밀 구조체에 관한 것이다.
용어 "생체내-jetPEITM", "생체내 jetPEITM", "생체내 jetPEI", "jetPEI", "jet PEI", 및 "JetPEI"은 모두 시판되어 입수 가능한 Polyplus-Transfection SA (Illkirch, France)사 로부터의 생체내-jetPEITM 시약, Cat. # 201-50G을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이 용어 "폴리플렉스"는 중합체와 핵산 예컨대 정전기 상호작용을 통해 형성된 RNA의 복합체를 지칭한다. 폴리플렉스가 RNA를 포함하는 경우, "RNA 복합체" 또는 "RNA 폴리플렉스"라고도 지칭할 수 있다.
본 발명은 적어도 하나 단일가닥 RNA 및 적어도 하나 폴리알킬렌이민으로부터 형성된 폴리플렉스 입자에 관한 것이다.
일 실시형태에서, 본원에 기재된 입자는 약 200 nm 미만, 바람직하게는 약 150 nm 미만, 보다 바람직하게는 약 100 nm 미만의 평균 지름을 갖는다. 일 실시예에서, 본원에 기재된 입자는 평균 지름이 적어도 약 30 nm, 적어도 약 40 nm, 적어도 약 50 nm, 적어도 약 60 nm, 적어도 약 70 nm, 적어도 약 80 nm, 적어도 약 90 nm, 또는 적어도 약 100 nm이다.
용어 "평균 지름"은 결과적으로 길이의 치수에 소위 Zaverage을 제공하는 소위 누율 알고리즘(cumulant algorithm), 및 무한한 다분산지수 (PI)를 사용하여 데이터 분석으로 동적광산란에 의해 측정된 입자의 평균 유체역학적 지름을 지칭한다 (Koppel, D., J. Chem. Phys. 57, 1972, pp 4814-4820, ISO 13321). 여기에서 입자의 "평균 지름", "지름" 또는 "크기"는 Zaverage의 이 값과 동의어로 사용된다.
용어 "순전하"는 전하, 예컨대 양전하 및 음전하의 총합을 지칭한다. 예를 들어 입자가 양전하보다 더 많은 수의 음전하를 포함하면 입자의 순전하는 음수이다. 입자가 음전하보다 많은 수의 양전하를 포함하면 입자의 순전하는 양수이다. 입자가 같은 수의 양전하 및 음전하를 포함하면 입자의 순전하는 중성, 특히 전기중립이다. 따라서, 본 발명에 따른 입자의 순전하는 음수, 양수 또는 중성일 수 있다. 일 실시형태에서, 입자의 순전하는 양수이다. 일 실시형태에서, 입자의 순전하가 음수이다.
"하전된", "순전하", "음전하를 띤" 또는 "양전하를 띤"과 같은 용어는 적절한 pH (예를 들어, 7.1)에서 수성 완충액에 용해되거나 현탁될 때 주어진 화합물 또는 입자의 전기적 순전하를 지칭한다.
본 발명에 따르면, 용어 "N/P 비율", "NP 비율", "N:P 비율", "N/P" 및 "NP"는 RNA에서의 인원자(P)에 대한 폴리에틸렌이민에서의 질소원자(N)의 몰비를 지칭한다.
본 발명에 있어서, RNA에서의 인원자(P)의 수에 대한 폴리에틸렌이민에서의 질소원자(N)의 수의 몰비(N/P 비율)는 바람직하게는 2.0 내지 15.0, 바람직하게는 8.0 내지 12.0, 6.0 내지 14.0 또는 6.0 내지 12.0이다.
본 발명에 따르면, 본원에 기재된 조성물을 1단계 초과, 예컨대 2, 3, 4단계 이상에서 최종 N/P 비율로 조정하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 조성물은 첫 번째 단계에서 예를 들어, 긴 폴리알킬렌이민을 사용하여 최종 N/P 비율보다 낮은 첫 번째 N/P 비율로 조정될 수 있다. 추가의 폴리알킬렌이민, 예를 들면, 짧은 폴리알킬렌이민 또는 긴 폴리알킬렌이민, 예컨대 첫 번째 단계에서 사용된 긴 폴리알킬렌이민을 첨가함으로써, N/P 비율은 최종 N/P 비율로 조정될 수 있다. 일 실시형태에서, 최종 N/P 비율은 8 내지 16, 예를 들어 9 내지 14, 예를 들어 10 내지 12이다. 일 실시형태에서, 첫 번째 단계에서 나온 N/P 비율은 1 내지 6, 예컨대 2 내지 5, 예컨대 3 또는 4이다.
폴리알킬렌이민
본원에서 사용된 바와 같이 폴리알킬렌이민은 바람직하게는 하기 일반화학식 (I)을 포함한다:
Figure 112019004151803-pct00005
여기서
R은 H, 아실기 또는 하기 일반화학식 (II)을 포함하는 기이다:
Figure 112019004151803-pct00006
여기서,
R1은 H 또는 하기 일반화학식 (III)을 포함하는 기이다:
Figure 112019004151803-pct00007
n, m, 및 l은 2 내지 10의 정수로부터 독립적으로 선택되고;
p, q, 및 r은 정수이고, 여기서 p, q, 및 r의 합은 중합체의 평균 분자량이 1.5·102 내지 107 Da, 바람직하게는 5000 내지 105 Da, 보다 바람직하게는 10000 내지 40000 Da, 보다 바람직하게는 15000 내지 30000 Da, 특히 바람직하게는 20000 내지 25000 Da이 되도록 한다.
일 실시형태에서, n, m, 및 l은 독립적으로 2, 3, 4, 및 5로부터 선택되고, 바람직하게는 2 및 3으로부터 선택되고, 보다 바람직하게는 2이다. 일 실시형태에서, R1은 H이다. 일 실시형태에서, R은 H 또는 아실기이다.
일 실시형태에서, 폴리알킬렌이민은 폴리에틸렌이민 및/또는 폴리프로필렌이민을 포함하고, 바람직하게는 폴리에틸렌이민을 포함한다. 바람직한 폴리알킬렌이민은 폴리에틸렌이민 (PEI)이다. PEI의 평균 분자량은 바람직하게는 1.5·102 내지 107 Da, 바람직하게는 5000 내지 105 Da, 보다 바람직하게는 10000 내지 40000 Da, 보다 바람직하게는 15000 내지 30000 Da, 특히 바람직하게는 20000 내지 25000 Da이다.
본 발명에 따르면 선형 폴리알킬렌이민 예컨대 선형 폴리에틸렌이민 (PEI)인 것이 바람직하다. 일 실시형태에서, 선형 PEI는 2-에틸-2-옥사졸린의 개환 이성질체화 중합에 의해 수득되어 폴리(2-에틸-2-옥사졸린) (PEOX; N-프로피오닐-PEI)을 수득하고 나서, 산-가수분해되어 N-프로피오닐기를 절단하여 PEI를 수득한다.
본 발명에 따르면 선형 PEI는 PEOX의 완전하거나 본질적으로 완전한 탈아실화에 의해 얻어지는 것이 바람직하다. 예를 들어, 50 kDa 의 분자량을 갖는 PEOX 는 22 kDa의 분자량을 갖는 선형 PEI를 제공한다. 폴리알킬렌이민 예컨대 폴리에틸렌이민에서의 질소원자의 치환기 중 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 본질적으로 100%가 수소인 것이 바람직하다 (즉, 상기 화학식에서 R은 H이다). 따라서, 폴리알킬렌이민 예컨대 폴리에틸렌이민에서의 질소원자 중 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 본질적으로 100%가 양성자화가능한 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 바람직한 폴리알킬렌이민은 폴리에틸렌이민 (PEI), 특히 선형 폴리에틸렌이민이다. 이러한 선형 폴리에틸렌이민은 바람직하게는 15 kDa 내지 30 kDa의 몰질량을 갖고, 바람직하게는 자가-복제 또는 자가-증폭 RNA와 조합하여 사용하며, N/P 비율은 바람직하게는 6 내지 15이고, 선형 폴리에틸렌이민 및 자가-복제 또는 자가-증폭 RNA는 200 nm 미만, 바람직하게는 150 nm 미만, 특히 바람직하게는 100 nm 미만의 크기를 갖는 폴리플렉스 입자에 존재하는 것이 바람직하다.
본 발명의 일 실시형태에서, 폴리알킬렌이민은 0.6 내지 11 kDa, 바람직하게는 1 내지 6 kDa 또는 1 내지 4 kDa 예컨대 1 내지 3 kDa (선형 및/또는 분기형)의 짧은 폴리알킬렌이민, 예컨대 짧은 폴리에틸렌이민 및 20 내지 40 kDa (선형 및/또는 분기형)의 긴 폴리알킬렌이민, 예컨대 긴 폴리에틸렌이민의 조합물이고, 총 N/P 비율은 바람직하게는 바람직하게는 8 내지 16, 예컨대 9 내지 14, 예를 들어, 10 내지 12이다. 일 실시형태에서, 긴 폴리알킬렌이민과 RNA 간의 N/P 비율은 1 내지 6, 예컨대 2 내지 5, 예컨대 3 또는 4이다.
폴리에틸렌이민 (PEI)은 양이온-전하 밀도가 높은 유기 고분자이다. PEI는 세포 표면의 음이온성 프로테오글리칸과 상호작용하고 내포작용에 의한 입자의 침입을 촉진할 수 있는 양전하를 띤 입자로 핵산을 압축할 수 있다.
PEI에 대한 몇 가지 제조 방법이 있다. 본 발명에 따르면, 선형 폴리에틸렌이민은 바람직하게는 하기와 같은 방법에 의해 99% 이상의 순도로 단량체 2-에틸-2-옥사졸린의 결정된 양으로부터 상기 단량체의 양을 완전히 건조시키는 단계, 및 폴리(2-에틸-2-옥사졸린) (PEOX)을 얻기 위한 상기 단량체의 양을 중합하는 단계를 포함하는 방법에 의해 합성 및 제조된다:
- 소정량의 아세토니트릴을 완전히 건조시킨 후, 중합 반응의 완전히 건조된 개시제를 소정량 첨가하고, 이들 모두를 혼합하면서, 상기 양의 건조된 단량체에서 용매로서 상기 아세토니트릴을 사용하는 방법,
- 메탄올와 디에틸에테르 및 상응하는 여과로 3회 연속 세척/침전 단계를 수행하면서, 상기 수득된 PEOX를 증발시켜 상기 용매를 제거하는 방법,
상기 건조, 중합, 및 정제 조작은 (i) 1H NMR 시험, 상기 PEOX 중합체의 올바른 확인, <1.0% 수준의 단량체의 부재 확인 및 <5.0% 수준의 용매의 부재 확인을 수행함으로써 수득되고, (ⅱ) 상기 PEOX <1.5의 분자량 (Mw)> 23,000 Da 및 다분산도 (Mw/Mn)의 평균을 겔 투과 크로마토그래피로 수행함으로써 수득되도록 배열되고,
- 프로피온산 <5% 또는 잔류 측쇄의 양을 갖고 상기 PEI를 단일 피크로서 확인하도록 1H-NMR 테스트를 수행함으로써 상기 PEI를 충분히 효율적으로 수득하기 위해 상기 PEOX를 염산으로 가수분해하는 방법.
특정 양 단량체, 아세토니트릴 또는 개시제를 완전히 건조시킴으로써, 사용 직전에 물의 10 ppm 이하의 습도를 얻는 것을 이해해야 하며, 이는 48시간에 걸쳐 수소화칼슘으로 건조한 다음 증류 및 129℃ 이상의 온도에서 단량체를 수집한다.
이하의 특징 중 하나 이상이 본 발명에 따라 바람직하다:
(i) PEOX의 분자량 (Mw)의 평균은 예컨대 40,000 Da < Mw < 60,000 Da이고;
(ii) 단량체/개시제 비율은 약 500(대략적인 값은 ±5%로 이해해야 한다)이고;
(iii) 단량체/개시제의 비율은 480이고;
(iv) 단량체는 99.95% 이상의 순도이며;
(v) 개시제는 단량체에 첨가하기 전에 아세토니트릴과 혼합하며;
(vi) 중합은 85℃ 이상의 온도에서 20시간 초과 동안 수행시키며;
(vii) 중합 온도가 105℃이거나 그 이상이며;
(viii) 첫 번째 여과 후, 잔류물을 MeOH와 같은 용매로 거리낌없이 세척하고, 디에틸에테르를 첨가한 후, 폴리(2-에틸-2-옥사졸린)을 오일로서 용액으로부터 자연적으로 분리하고, 전체 용매를 붓고 진공 하에 건조시키기 전에 상기 세정 및 분리를 적어도 4회 반복하고;
(ix) 가수분해 단계는 1H-NMR 분광법에 의해 반응 공정을 모니터링하면서, 규칙적으로 및 적어도 1일 동안 공비 증류에 의해 수득되어 배출된 프로피온산을 반응 혼합물로부터 제거하는 단계를 포함하고;
(x) 반응 공정 종료 시에 수득된 잔류물을 물로 희석하고 적어도 3회 증발시켜 미량의 프로피온산을 제거한 다음, 동결건조 전에 잔류물을 다시 물에 용해시키고 여과시키고;
(xi) 여과물은 0.20 μm 내지 0.25 μm인 메쉬 치수를 갖는 멸균막, 특히 멸균 아세테이트 세포성 막을 통과하여 제공된다.
본 발명에 따른 사용된 바람직한 선형 PEI는 중간체 PEOX의 분자량 Mw이 예컨대 40,000 < Mw < 60,000 Da인 것을 특징으로 한다.
중합도는 단량체/개시제 비율 및 합성 수율에 의해 조절된다. 분자량 측정은 겔 투과 크로마토그래피(GPC)에 의해 수행될 수 있다.
본 발명에 따른 용어 "핵산"은 데옥시리보핵산 (DNA), 리보핵산 (RNA), 및 잠금 핵산 (LNA)을 포함한다. 본 발명에 따르면, 핵산은 게놈 DNA, cDNA, mRNA, 바이러스 RNA, 재조합적으로 제조된 분자 및 화학적으로 합성된 분자를 포함한다. 본 발명에 따르면, 핵산은 단일가닥 또는 이중가닥 및 선형 또는 공유적으로 폐쇄된 원형 분자의 형태일 수 있다. 본 발명에 따른 용어 "핵산"은 또한 뉴클레오타이드 염기, 당 또는 포스페이트 상의 핵산, 및 비-자연성 뉴클레오타이드와 뉴클레오타이드 유사체를 함유하는 핵산의 화학적 유도체화를 포함한다. 기재된 핵산은 분리된 핵산 및/또는 재조합 핵산일 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "분리된"은 다른 분자, 예컨대 다른 세포 물질이 실질적으로 존재하지 않는 분자를 의미한다. "분리된 핵산"이라는 용어는 본 발명에 따르면 핵산이 (i) 시험관내, 예를 들면 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 증폭되거나, (ii) 클로닝에 의해 재조합적으로 생산되거나, (iii) 예를 들면 절단 및 겔-전기천공 분획화에 의해 정제되거나, 또는 (iv) 예를 들어 화학 합성법에 의해 합성된 핵산을 의미한다. 분리된 핵산은 재조합 기술에 의해 조작 가능한 핵산이다.
본 발명의 문맥상 용어 "재조합"은 "유전자 조작을 통해 제조됨"을 의미한다. 바람직하게는, 본 발명의 문맥상 "재조합 물체"는 자연적으로 발생하지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이 용어 "자연적으로 발생하는"은 대상이 자연계에서 발견될 수 있다는 사실을 의미한다. 예를 들어, 유기체(바이러스를 포함함)에 존재하고 자연계 원천으로부터 분리할 수 있고 인간에 의해 실험실에서 인위적으로 변형된 바 없는 펩티드 또는 핵산은 자연 발생적이다. "자연계에서 발견된"이란 용어는 "자연에 존재하는"을 의미하며, 공지된 물질뿐만 아니라 자연계에서 아직 발견된 바 및/또는 분리된 바 없지만, 미래에 자연 원천으로부터 발견될 수 있고/있거나 분리될 수 있는 물질을 포함한다.
본 발명에 따르면, "핵산 서열"은 핵산, 예를 들어 리보핵산(RNA) 또는 데옥시리보핵산(DNA)에서의 뉴클레오타이드 서열을 지칭한다. 상기 용어는 전체 핵산 분자(예를 들어, 전체 핵산 분자의 단일가닥) 또는 그의 일부(예를 들어, 단편)를 지칭할 수 있다.
"핵산의 3'-말단"은 본 발명에 따라 자유 수산기를 갖는 말단을 지칭한다. 이중가닥 핵산, 특히 DNA의 도식적 표현에서, 3'-말단은 항상 우측면상에 있다. "핵산의 5'-말단"은 본 발명에 따라 유리 포스페이트기를 갖는 말단을 지칭한다. 이중가닥 핵산, 특히 DNA의 도식적 표현에서, 5'-말단은 항상 좌측면상에 있다.
5' 말단 5'--P-NNNNNNN-OH-3' 3' 말단
3'-HO-NNNNNNN-P--5'
"상류"는 핵산 분자의 제 2 요소에 대한 핵산 분자의 제 1 요소의 상대적인 위치를 나타내며, 여기서 두 요소는 동일한 핵산 분자에 포함되며, 제 1 요소는 제 2 요소보다 핵산 분자의 5' 말단에 위치한다. 따라서 제 2 요소는 해당 핵산 분자의 제 1 요소의 "하류"인 것으로 지칭한다. 제 2 요소의 "상류"에 위치한 요소는 해당 제 2 요소의 "5'"에 있는 것과 동의어라고 할 수 있다. 이중가닥 핵산 분자의 경우, "상류" 및 "하류"와 같은 표시는 (+) 가닥에 대해 부여된다.
본 발명에 따르면, 용어 "유전자"는 하나 이상의 세포 생성물을 생산하고/하거나 하나 이상의 세포 간 또는 세포 내 기능을 달성하기 위한 특정 핵산 서열을 지칭한다. 보다 구체적으로, 상기 용어는 특정 단백질 또는 기능적 또는 구조적 RNA 분자에 대해 코딩하는 핵산을 포함하는 핵산 섹션(DNA 또는 RNA)을 지칭한다.
용어 "벡터"는 가장 일반적인 의미로 본원에서 사용되며, 예를 들어 상기 핵산을 원핵 및/또는 진핵 숙주세포 내로 도입시킬 수 있고, 적절한 경우, 게놈 내로 일체화할 수 있는 핵산에 대한 여하한 중간체 운반체를 포함한다. 이러한 벡터는 바람직하게는 세포 내에서 복제 및/또는 발현된다. 벡터는 플라스미드, 파지미드, 바이러스 게놈 및 이들의 일부를 포함한다.
본 발명의 문맥상, 용어 "RNA"는 리보뉴클레오타이드 잔기를 포함하는 분자에 관한 것이고, 바람직하게는 완전히 또는 대체로 리보뉴클레오타이드 잔기로 이루어진 분자에 관한 것이며, 본원에 기재된 모든 RNA 타입을 포함한다. 용어 "리보뉴클레오타이드"는 β-D-리보푸라노실기의 2'-위치에 수산기를 갖는 뉴클레오타이드를 지칭한다. 용어 "RNA"는 이중가닥 RNA, 단일가닥 RNA, 분리된 RNA, 예컨대 부분적으로 또는 완전히 정제된 RNA, 본질적으로 순수한 RNA, 합성 RNA, 및 재조합적으로 발생된 RNA, 예컨대 하나 이상의 뉴클레오타이드의 부가, 결실, 치환 및/또는 변경에 의해 자연적으로 발생된 RNA와 상이한 변형된 RNA를 포함한다. 이러한 변경은 예를 들어, RNA 중 하나 이상의 뉴클레오타이드에서, RNA의 말단(들)에 또는 내부적으로, 비-뉴클레오타이드 물질을 첨가하는 것을 포함할 수 있다. 또한, RNA 분자의 뉴클레오타이드는 비-표준 뉴클레오타이드, 예컨대 비-자연 발생 뉴클레오타이드 또는 화학적으로 합성된 뉴클레오타이드 또는 데옥시뉴클레오타이드도 포함할 수 있다. 이들 변경된 RNA는 유사체, 특히 자연 발생 RNA의 유사체로 지칭할 수 있다. 본 발명에 따라 사용된 RNA는 공지된 조성을 가질 수 있거나 RNA의 조성은 부분적으로 또는 전체적으로 알려지지 않은 것일 수 있다.
RNA의 "안정성"이라는 용어는 RNA의 "반감기"에 관한 것이다. "반감기"는 분자의 활성, 양, 또는 수의 절반을 제거하는 데 필요한 시간을 말한다. 본 발명의 문맥 상에서, RNA의 반감기는 상기 RNA의 안정성을 나타낸다. RNA의 반감기는 RNA의 "발현 지속"에 영향을 줄 수 있다. 반감기가 긴 RNA는 장시간에 걸쳐 발현될 것으로 예상될 수 있다.
용어 "번역 효율"은 특정 기간 내에 RNA 분자에 의해 제공된 번역 산물의 양을 의미한다.
본 발명에 따르면, "이중가닥 RNA" 또는 "dsRNA"는 부분적으로 또는 완전히 상보적인 2개의 가닥을 갖는 RNA를 의미한다.
본 발명에 따르면, RNA는 단일가닥 RNA (ssRNA)인 것이 바람직하다. 용어 "단일가닥 RNA"는 일반적으로 상보적인 핵산 분자(전형적으로 상보적인 RNA 분자 없음)가 결합되지 않은 RNA 분자를 지칭한다. 단일가닥 RNA는 RNA의 일부를 되접어서 형성된 자체-상보 서열 및 제한 없이 염기쌍, 스템, 스템루프 및 벌지(bulges)를 포함한 2차 구조 모티프를 형성하도록 허용된 자체-상보 서열을 포함할 수 있다. 단일가닥 RNA는 마이너스 가닥 [(-) 가닥] 또는 플러스 가닥 [(+) 가닥]으로 존재할 수 있다. (+) 가닥은 유전 정보를 포함하거나 코딩하는 가닥이다. 유전 정보는 예를 들어 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열일 수 있다. (+) 가닥 RNA가 단백질을 코딩할 때, (+) 가닥은 번역(단백질 합성)을 위한 주형으로 직접 작용할 수 있다. (-) 가닥은 (+) 가닥의 상보체이다. 이중가닥 RNA의 경우, (+) 가닥 및 (-) 가닥은 2개의 분리된 RNA 분자이며, 이들 두 RNA 분자는 서로 결합하여 이중가닥 RNA("듀플렉스 RNA")를 형성한다.
본 발명에 따르면 특히 바람직한 단일가닥 RNA는 mRNA 및 레플리콘-RNA 예컨대 자가-복제 RNA이다. 본 발명에 따르면, RNA는 코딩 RNA, 즉 펩티드 또는 단백질을 코딩하는 RNA일 수 있다. 바람직하게는, RNA는 약학적 활성 RNA이다.
"약학적 활성 RNA"는 약학적 활성 펩티드 또는 단백질 예컨대 항원 또는 면역학적 활성 화합물 (항원을 코딩하지 않음)을 코딩하는 RNA이거나, 그 자체로 약학적 활성이 있으며, 예를 들어, 하나 이상의 약학적 활성 예컨대 약학적 활성 단백질에 대해 기술된 활성을 갖는다.
본 발명에 따르면, 용어 "펩티드 또는 단백질을 코딩하는 RNA"는 RNA가 적절한 환경, 바람직하게는 세포 내에 존재한다면 번역 과정에서 펩티드 또는 단백질을 생산하기 위해 아미노산의 조립을 지시할 수 있음을 의미한다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 코딩 RNA는 세포 번역 기구와 상호작용하여 코딩 RNA의 번역을 허용하여 펩티드 또는 단백질을 생산할 수 있다.
본 발명에 따르면, 용어 "mRNA"는 "메신저-RNA"를 의미하며 전형적으로 DNA 주형을 이용하여 생성되고 펩티드 또는 단백질을 코딩하는 전사체에 관한 것이다. 전형적으로, mRNA는 5'-UTR, 단백질 코딩 영역, 3'-UTR, 및 폴리(A) 서열을 포함한다. mRNA는 DNA 주형으로부터 시험관내 전사에 의해 생성될 수 있다. 시험관내 전사 방법론은 통상의 기술자에게 잘 알려져 있는 것이다. 예를 들어, 시험관내 전사 키트가 시중에 다양하게 판매되고 있다. 본 발명에 따르면, mRNA는 변형 및 캡핑을 안정화시킴으로서 변형시킬 수도 있다.
용어 "비번역 영역" 또는 "UTR"은 전사되지만 아미노산 서열로 번역되지 않는 DNA 분자 내의 영역에 관한 것이거나 mRNA 분자와 같은 RNA 분자 내의 상응하는 영역에 관한 것이다. 비번역 영역(UTR)은 오픈 리딩 프레임의 5'(상류)(5'-UTR) 및/또는 오픈 리딩 프레임의 3'(하류)(3'-UTR)에 존재할 수 있다.
3'-UTR은 존재하는 경우 단백질 코딩 영역의 종결 코돈의 하류에 유전자의 3'-말단에 위치하지만, 용어 "3'-UTR"은 바람직하게는 폴리(A) 꼬리를 포함하지 않는다. 따라서, 3'-UTR은 폴리(A) 꼬리의 상류, 예를 들어 폴리(A) 꼬리에 직접 인접하여 있다(존재한다면). 5'-UTR은 존재하는 경우 단백질-코딩 영역의 시작코돈의 상류에 유전자의 5' 말단에 위치한다. 5'-UTR은 5'-캡의 하류, 예를 들어 5'-캡 바로 옆에 있다(존재한다면). 본 발명에 따르면, 5'- 및/또는 3'-비번역 영역은 오픈 리딩 프레임과 기능적으로 연결될 수 있어서, 이들 영역이 오픈 리딩 프레임과 관련되어 안정성 및/또는 상기 오픈 리딩 프레임을 포함하는 RNA의 번역 효율이 증가된다.
본 발명에 따르면, 용어 "폴리(A) 서열" 또는 "폴리(A) 꼬리"는 전형적으로 RNA 분자의 3'-말단에 위치하는 연속되거나 중단된 아데닐레이트 잔기 서열을 지칭한다. 연속적인 서열은 연속적인 아데닐레이트 잔기를 특징으로 한다. 사실상, 연속적인 폴리(A) 서열이 전형적인 것이다. 폴리(A) 서열은 전사 후 주형-독립적 RNA 중합효소에 의해 RNA의 자유 3'-말단에 세포 핵에서 진핵세포 전사 중에 부착되지만, 통상적으로 진핵세포 DNA에서 암호화되지 않은 반면, 본 발명은 DNA에 의해 코딩된 폴리(A) 서열을 포함한다.
"5'-캡", "캡", "5'-캡 구조", "캡 구조"라는 용어는 일부 진핵세포의 1차 전사체, 예컨대 전구체 메신저 RNA의 5' 말단에서 발견되는 디뉴클레오타이드를 지칭하는 것으로 동의어로 사용된다. 5'-캡은 5' 트리포스페이트 결합(또는 특정 캡 유사체의 경우 변형된 트리포스페이트 결합)에서 5'을 통해 mRNA 분자의 첫 번째 뉴클레오타이드에 (임의로 변형된) 구아노신이 결합된 구조이다. 용어는 종래의 캡 또는 캡 유사체를 지칭할 수 있다.
본 발명에 따른 RNA 분자는 5'-캡, 5'-UTR, 3'-UTR, 폴리(A) 서열, 및/또는 코돈 사용의 변형(adaptation)을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 따라 사용된 RNA 분자는 바람직하게는 2000개 초과의 염기, 바람직하게는 3000개 초과의 염기, 4000개 초과의 염기, 5000개 초과의 염기, 6000개 초과의 염기, 7000개 초과의 염기, 8000개 초과의 염기, 9000개 초과의 염기, 또는 10000개 초과의 염기의 크기를 갖는다. 본 발명에 따라 사용된 RNA 분자는 바람직하게는 6000 내지 20000개의 염기, 바람직하게는 6000 내지 15000개의 염기, 바람직하게는 9000 내지 12000개의 염기 크기를 갖는다.
본 발명에 따르면, 용어 "발현"은 그의 가장 일반적인 의미로 사용되며, RNA의 생산 또는 RNA 및 단백질의 생산을 포함한다. 이것은 또한 핵산의 부분적 발현을 포함한다. 뿐만 아니라, 발현은 일시적이거나 안정한 것일 수 있다. RNA와 관련하여, "발현" 또는 "번역"이라는 용어는 세포의 리포좀 내에서 코딩 RNA(예를 들어 메신저 RNA)의 한 가닥이 아미노산 서열의 조립을 지시하여 펩티드 또는 단백질을 만드는 과정에 관한 것이다.
전사" 및 "전사하는"이라는 용어는 특정 핵산 서열을 갖는 핵산 분자("핵산 주형")가 RNA 중합효소에 의해 판독되어 RNA 중합효소가 단일가닥 RNA 분자를 생성하는 과정을 일컫는다. 전사 과정에서 핵산 주형의 유전 정보가 전사된다. 핵산 주형은 DNA일 수 있으나; 예를 들면, 알파바이러스 핵산 주형으로부터 전사되는 경우에는 주형이 전형적으로 RNA일 수 있다. 이어서, 전사된 RNA는 단백질로 번역될 수 있다. 본 발명에 따르면, 용어 "전사"는 "시험관내 전사"를 포함하며, 여기서 용어 "시험관내 전사"는 RNA, 특히 mRNA가 무세포 시스템에서 시험관내 합성되는 과정에 관한 것이다. 바람직하게는, 클로닝 벡터(cloning vector)는 전사체의 생성을 위해 적용된다. 이러한 클로닝 벡터는 일반적으로 전사 벡터로 명시되며, 본 발명에 따르면 용어 "벡터"에 포함된다. 클로닝 벡터는 바람직하게는 플라스미드이다. 본 발명에 따르면, RNA는 바람직하게는 시험관내 전사된 RNA(IVT-RNA)이고 적절한 DNA 주형의 시험관내 전사에 의해 수득될 수 있다. 전사를 제어하기 위한 프로모터는 임의의 RNA 중합효소에 대한 임의의 프로모터일 수 있다. 시험관내 전사를 위한 DNA 주형은 핵산, 특히 cDNA의 클로닝에 의해 수득되고, 시험관내 전사를 위한 적절한 벡터 내로 도입함으로써 수득할 수 있다. cDNA는 RNA의 역전사에 의해 수득될 수 있다.
전사 동안 생산된 단일가닥 핵산 분자는 전형적으로 주형의 상보적인 서열 인 핵산 서열을 갖는다.
본 발명에 따르면, 용어 "주형" 또는 "핵산 주형" 또는 "주형 핵산"은 일반적으로 복제되거나 전사될 수 있는 핵산 서열을 지칭한다.
용어 "발현 제어 서열"은 본 발명에 따라 프로모터, 리보솜-결합 서열 및 유전자의 전사 또는 유도된 RNA의 번역을 제어하는 다른 제어 요소를 포함한다. 본 발명의 특정 실시형태에서, 발현 제어 서열을 조절할 수 있다. 발현 제어 서열의 정확한 구조는 종 또는 세포 유형에 따라 다를 수 있지만, 일반적으로 전사 및 번역 개시에 관련된 5'-비전사 및 5'- 및 3'-비번역 서열을 각각 포함한다. 보다 구체적으로, 5'-비전사 발현 제어 서열은 기능적으로 연결된 유전자의 전사 제어를 위한 프로모터 서열을 포괄하는 프로모터 영역을 포함한다. 발현 제어 서열은 또한 인핸서 서열 또는 상류 활성자 서열을 포함할 수 있다. DNA 분자의 발현 제어 서열은 일반적으로 TATA 박스, 캡핑 서열, 및 CAAT 서열 등과 같은 5'-비전사 서열 및 5'- 및 3'-비번역 서열을 포함한다. 알파바이러스 RNA의 발현 제어 서열은 서브게놈 프로모터 및/또는 하나 이상의 보존서열구성(들)을 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 특정 발현 제어 서열은 본원에 기재된 바와 같이 알파바이러스의 서브게놈 프로모터이다.
용어 "프로모터" 또는 "프로모터 영역"은 RNA 중합효소에 대한 인식 및 결합 부위를 제공함으로써, 전사체, 예를 들어 코딩 서열을 포함하는 전사체의 합성을 제어하는 핵산 서열을 말한다. 프로모터 영역은 상기 유전자의 전사 조절에 관여하는 추가 인자에 대한 추가적인 인식 부위 또는 결합 부위를 포함할 수 있다. 프로모터는 원핵 또는 진핵 유전자의 전사를 제어할 수 있다. 프로모터는 "유도성"일 수 있고 유도인자에 반응하여 전사를 개시할 수 있으며, 전사가 유도인자에 의해 조절되지 않으면 "항시성(constitutive)"일 수 있다. 유도성 프로모터는 매우 적은 정도로만 발현되거나 유도인자가 없는 경우에는 전혀 발현되지 않는다. 유도인자가 있으면 유전자가 "스위치 온"되거나 전사 수준이 증가한다. 이것은 대체로 특정 전사 인자의 결합에 의해 매개된다. 본 발명에 따른 특정 프로모터는 본원에 기재된 바와 같이 알파바이러스의 서브게놈 프로모터이다. 다른 특정 프로모터는 알파바이러스의 게놈 양성-가닥 또는 음성-가닥 프로모터이다.
용어 "코어 프로모터"는 프로모터에 포함되는 핵산 서열을 의미한다. 코어 프로모터는 전형적으로 전사를 적절히 개시하는데 필요한 프로모터의 최소 부분이다. 코어 프로모터는 전형적으로 전사 개시 부위 및 RNA 중합효소에 대한 결합 부위를 포함한다.
본원에서 명시된 핵산 서열, 특히 전사 가능한 서열 및 코딩 핵산 서열은 임의의 발현 제어 서열, 특히 상기 핵산 서열과 동종이거나 이종일 수 있는 프로모터와 조합될 수 있으며, 용어 "동종"은 핵산 서열이 또한 기능적으로 발현 제어 서열에 자연적으로 연결되어 있다는 사실을 일컫고, 용어 "이종"은 핵산 서열이 발현 제어 서열에 자연적으로 기능적으로 연결되어 있지 않다는 사실을 일컫는다.
핵산 서열, 특히 펩티드 또는 단백질을 코딩하는 핵산 서열 및 발현 제어 서열은 이들이 서로 공유 결합되어 전사 가능한 및/또는 코딩 핵산 서열의 전사 또는 발현이 발현 제어 서열의 영향 하에 있거나 제어 하에 있는 경우에, 서로 "기능적으로" 결합되어 있는 것이다.
본 발명에 따르면, "기능적 결합" 또는 "기능적으로 결합된"은 기능적 관계로 연결된 것에 관한 것이다. 핵산은 다른 핵산 서열과 기능적으로 관련이 있다면 "기능적으로 결합"되어 있는 것이다. 예를 들어, 프로모터가 코딩 서열의 전사에 영향을 준다면 프로모터는 상기 코딩 서열에 기능적으로 결합된다. 기능적으로 결합된 핵산은 전형적으로 다른 핵산 서열에 의해 적절하게 분리되어 서로에 인접한다.
특정 실시형태에서, 핵산은 본 발명에 따라 핵산에 대해 동종이거나 이종일 수 있는 발현 제어 서열에 기능적으로 결합된다.
"중합효소"는 일반적으로 단량체 빌딩 블록으로부터 중합체 분자의 합성을 촉매할 수 있는 분자 실체를 지칭한다. "RNA 중합효소"는 리보뉴클레오타이드 빌딩 블록으로부터 RNA 분자의 합성을 촉매할 수 있는 분자 실체이다. "DNA 중합효소"는 데옥시리보뉴클레오타이드 빌딩 블록으로부터 DNA 분자의 합성을 촉매할 수 있는 분자 실체이다. DNA 중합효소 및 RNA 중합효소의 경우, 분자 실체는 전형적으로 단백질 또는 복수의 단백질의 집합체 또는 복합체이다. 전형적으로, DNA 중합효소는 전형적으로 DNA 분자인 주형 핵산을 기반으로 DNA 분자를 합성한다. 전형적으로, RNA 중합효소는 주형 핵산을 기반으로 RNA 분자를 합성하고, 주형 핵산은 DNA 분자(RNA 중합효소가 DNA 의존성 RNA 중합효소, DdRP인 경우)이거나 RNA 분자이다(RNA 중합효소가 RNA 의존성 RNA 중합효소인 RdRP인 경우).
"RNA-의존성 RNA 중합효소" 또는 "RdRP"는 RNA 주형으로부터 RNA의 전사를 촉매하는 효소이다. 알파바이러스 RNA 의존성 RNA 중합효소의 경우, 게놈 RNA 및 (+) 가닥 게놈 RNA의 (-) 가닥 상보체의 순차적 합성은 RNA 복제로 이어진다. 알파바이러스 RNA 의존성 RNA 중합효소는 "RNA 복제효소"와 동의어로 사용된다. 일반적으로 RNA 의존성 RNA 중합효소는 레트로바이러스를 제외한 모든 RNA 바이러스에 의해 코딩된다. RNA 의존성 RNA 중합효소를 코딩하는 바이러스의 전형적인 대표는 알파바이러스이다.
본 발명에 따르면, "RNA 복제"는 일반적으로 주어진 RNA 분자(주형 RNA 분자)의 뉴클레오타이드 서열에 기초하여 합성된 RNA 분자를 지칭한다. 합성되는 RNA 분자는 예를 들어, 주형 RNA 분자에 동일하거나 상보적일 수 있다. 일반적으로, RNA 복제는 DNA 중간체의 합성을 통해 일어날 수 있거나, RNA 의존성 RNA 중합효소(RdRP)에 의해 매개되는 RNA 의존적 RNA 복제에 의해 직접적으로 발생할 수 있다. 알파바이러스의 경우 RNA 복제는 DNA 중간체를 통해 일어나지 않지만 RNA 의존성 RNA 중합효소(RdRP)에 의해 매개된다: 주형 RNA 가닥(제 1 RNA 가닥) 또는 그 일부가 제 1 RNA 가닥 또는 그의 일부에 상보적인 제 2 RNA 가닥의 합성을 위해 주형으로써 작용한다. 제 2 RNA 가닥 또는 그의 일부는 순서대로 선택적으로 제 2 RNA 가닥 또는 그의 일부에 상보적인 제 3 RNA 가닥의 주형으로 작용할 수 있다. 그로 인해, 제 3 RNA 가닥은 제 1 RNA 가닥 또는 그의 일부와 동일하다. 따라서, RNA 의존성 RNA 중합효소는 주형의 상보적인 RNA 가닥을 직접 합성 가능하고, (상보적인 중간체 가닥을 통해) 동일한 RNA 가닥을 간접적으로 합성할 수 있다.
본 발명에 따르면, 용어 "주형 RNA"는 RNA 의존성 RNA 중합효소에 의해 전사되거나 복제될 수 있는 RNA를 지칭한다.
본 발명의 바람직한 일 실시형태에서, 본 발명에 따라 사용된 RNA는 레플리콘 RNA 또는 단순히 "레플리콘", 특히 자가-복제 RNA이다. 특히 바람직한 일 실시형태에서, 레플리콘 또는 자가-복제 RNA는 ssRNA 바이러스, 특히 양성-가닥 ssRNA 바이러스 예컨대 알파바이러스로부터 유래된 것이거나 이로부터 유래된 요소를 포함한다.
일반적으로, RNA 바이러스는 RNA 게놈을 가진 다양한 종류의 감염성 입자이다. RNA 바이러스는 단일가닥 RNA (ssRNA) 및 이중가닥 RNA (dsRNA) 바이러스로 세분화될 수 있으며, ssRNA 바이러스는 일반적으로 양성-가닥 [(+) 가닥] 및/또는 음성-가닥 [(-) 가닥] 바이러스로 추가적으로 분류될 수 있다. 양성 가닥 RNA 바이러스는 이들의 RNA가 숙주세포에서 번역을 위한 주형으로 직접 작용할 수 있기 때문에 생의약품 전달 시스템으로서 매력적인 것이다.
알파바이러스는 양성-가닥 RNA 바이러스에서 전형적으로 대표하는 것이다. 알파바이러스의 숙주는 곤충, 어류 및 포유류, 예를 들어, 가축 동물 및 인간 을 포함하는 광범위한 유기체를 포함한다. 알파바이러스는 감염된 세포의 세포질에서 복제한다 (알파바이러스 생활주기의 검토는 문헌[Jose et al., uture Microbiol., 2009, vol. 4, pp. 837-856] 참조). 많은 알파바이러스의 전체 게놈 길이는 전형적으로 11,000 내지 12,000개의 뉴클레오타이드 범위이고, 게놈 RNA는 전형적으로 5'-캡 및 3' 폴리(A) 꼬리를 갖는다. 알파바이러스의 게놈은 비구조성 단백질 (바이러스 RNA의 전사, 변형 및 복제, 및 단백질 변형에 관여한다) 및 구조 단백질 (바이러스 입자를 형성한다)을 코딩한다. 게놈에는 일반적으로 두개의 오픈 리딩 프레임 (ORF)이 있다. 4개의 비구조성 단백질 (nsP1-nsP4)은 전형적으로 게놈의 5' 말단 근처에서 시작하는 첫 번째 ORF에 의해 함께 코딩되는 반면, 알파바이러스 구조 단백질이 첫 번째 ORF의 하류에서 발견되고 게놈의 3'-말단 근처에서 연장되는 두 번째 ORF에 의해 함께 코딩된다. 전형적으로, 첫 번째 ORF는 두 번째 ORF보다 크며, 그 비율은 대략 2:1이다.
알파바이러스에 감염된 세포에서, 구조 단백질을 코딩하는 유전 정보는 진핵세포의 메신저 RNA와 유사한 RNA 분자인 서브게놈 전사체에서 번역될 수 있는 반면, 비구조성 단백질을 코딩하는 핵산 서열만이 게놈 RNA로부터 번역된다 (mRNA; Gould et al., 2010, Antiviral Res., vol. 87 pp. 111-124). 감염 후, 즉 바이러스 생활주기의 초기 단계에서, (+) 가닥의 게놈 RNA는 비구조성 폴리-단백질 (nsP1234)을 코딩하는 오픈 리딩 프레임의 번역을 위한 메신저 RNA처럼 직접적으로 작용한다. 일부 알파바이러스에서는, nsP3과 nsP4의 코딩 서열 사이에 opal 종결 코돈이 있다: nsP1, nsP2 및 nsP3을 함유하는 폴리단백질 P123은 번역이 opal 종결 코돈에서 종결될 때 생성되며, nsP4를 추가로 포함하는 폴리단백질 P1234는 opal 종결 코돈의 번역초과시 생성된다 (Strauss & Strauss, Microbiol. Rev., 1994, vol. 58, pp. 491-562; Rupp et al., 2015, J. Gen. Virology, vol. 96, pp. 2483-2500). nsP1234는 단편 nsP123과 nsP4로 자가단백질분해적으로 절단된다. 폴리펩티드 nsP123 및 nsP4는 (+) 가닥의 게놈 RNA를 주형으로 사용하여 (-) 가닥 RNA를 전사하는 (-) 가닥 복제효소 복합체를 형성하도록 결합한다. 전형적으로 후기 단계에서 nsP123 단편은 개별 단백질 nsP1, nsP2 및 nsP3으로 완전히 절단된다 (Shirako & Strauss, 1994, J. Virol., vol. 68, pp. 1874-1885). 네개의 모든 단백질은 주형으로서 게놈 RNA의 (-) 가닥 상보체를 사용하여 새로운 (+) 가닥 게놈을 합성하는 (+) 가닥 복제효소 복합체를 형성한다 (Kim et al., 2004, Virology, vol. 323, pp. 153-163, Vasiljeva et al., 2003, J. Biol. Chem. vol. 278, pp. 41636-41645).
감염된 세포에서, 새로운 게놈 RNA뿐만 아니라 서브게놈 RNA는 nsP1에 의해 5'-캡을 제공하고(Pettersson et al. 1980, Eur. J. Biochem. 105, 435-443; Rozanov et al., 1992, J. Gen. Virology, vol. 73, pp. 2129-2134), nsP4에 의해 폴리-아데닐레이트 [폴리(A)] 꼬리를 제공한다(Rubach et al., Virology, 2009, vol. 384, pp. 201-208). 따라서, 서브게놈 RNA와 게놈 RNA는 모두 메신저 RNA (mRNA)와 유사하다.
알파바이러스 구조 단백질은 일반적으로 서브게놈 프로모터의 제어 하에 하나의 단일 오픈 리딩 프레임에 의해 암호화된다 (Strauss & Strauss, Microbiol. Rev., 1994, vol. 58, pp. 491-562). 서브게놈 프로모터는 시스로 작용하는 알파바이러스 비구조성 단백질에 의해 인식된다. 특히, 알파바이러스 복제효소는 주형으로서 게놈 RNA의 (-) 가닥 상보체를 사용하여 (+) 가닥의 서브게놈 전사체를 합성한다. (+) 가닥 서브게놈 전사체는 알파바이러스 구조 단백질을 암호화한다 (Kim et al., 2004, Virology, vol. 323, pp. 153-163, Vasiljeva et al., 2003, J. Biol. Chem. vol. 278, pp. 41636-41645). 서브게놈 RNA 전사체는 하나의 폴리-단백질로서 구조 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프레임의 번역을 위한 주형으로서 작용하고, 폴리-단백질은 절단되어 구조 단백질을 생성한다. 숙주세포에서의 알파바이러스 감염 후기에, nsP2의 코딩 서열 내에 위치하는 패키징 신호는 구조 단백질에 의해 패키징되어 출아하는 비리온으로의 게놈 RNA의 선택적 패키징을 보장한다 (White et al., 1998, J. Virol., vol. 72, pp. 4320-4326).
감염된 세포에서, (-) 가닥 RNA 합성은 전형적으로 감염 후 처음 3-4시간에서만 관찰되며 후기 단계에서는 발견되지 않으며, 이때 (+) 가닥 RNA (게놈 및 서브게놈 모두)의 합성은 후기 단계에 관찰 가능하다. 문헌[Frolov et al., 2001, RNA, vol. 7, pp. 1638-1651]에 따르면, RNA 합성 조절에 대한 지배적인 모델은 비구조적 폴리-단백질의 처리에 대한 의존성을 제시한다: 비구조적 폴리-단백질 nsP1234의 초기 절단으로 nsP123 및 nsP4를 생성하고; nsP4는 (-) 가닥 합성에는 활성이지만 (+) 가닥 RNA 생성에는 비효율적인 RNA 의존성 RNA 중합 효소 (RdRp)로서 작용한다. 작용한다. nsP2/nsP3 접합부에서의 절단을 포함하는 폴리단백질 nsP123의 추가 가공은 (+) 가닥 RNA의 합성을 증가시키고 (-) 가닥 RNA의 합성을 감소시키거나 종료시키기 위해 복제효소의 주형 특이성을 변화시킨다.
알파바이러스 RNA의 합성은 또한 4개의 보존서열구성을 포함하는 시스-작용 RNA 요소에 의해 조절된다 (CSE들; Strauss & Strauss, Microbiol. Rev., 1994, vol. 58, pp. 491-562; 및 Frolov, 2001, RNA, vol. 7, pp. 1638-1651).
일반적으로, 알파바이러스 게놈의 5' 복제인식서열은 상이한 알파바이러스들 사이의 전반적으로 낮은 상동성을 특징으로 하지만, 보존되고 예측된 2차 구조체를 갖는다. 알파바이러스 게놈의 5' 복제인식서열은 번역 개시에만 관여할뿐만 아니라, 바이러스 RNA, CSE 1 및 CSE 2의 합성에 관여하는 2개의 보존서열구성을 포함하는 5' 복제인식서열을 또한 포함한다. CSE 1 및 2의 기능에 대해서, 2차 구조체는 선형 서열보다 더 중요하다고 여겨진다 (Strauss & Strauss, Microbiol. Rev., 1994, vol. 58, pp. 491-562).
대조적으로, 알파바이러스 게놈의 3'-말단 서열, 즉 폴리(A) 서열의 바로 상류의 서열은 보존된 일차 구조, 특히 보존서열구성 4 (CSE 4)를 특징으로 하고, (-) 가닥 합성의 개시에 중요한 "19-nt 보존서열"이라고도 한다.
"접합 서열"이라고도 불리는 CSE 3는 알파바이러스 게놈 RNA의 (+) 가닥에 보존서열구성이며, (-) 가닥 상의 CSE 3의 상보체는 서브게놈 RNA 전사를 위한 프로모터로서 작용한다 (Strauss & Strauss, Microbiol. Rev., 1994, vol. 58, pp. 491-562; Frolov et al., 2001, RNA, vol. 7, pp. 1638-1651). CSE 3은 전형적으로 nsP4의 C-말단 단편을 코딩하는 영역과 중첩된다.
또한, 알파바이러스 단백질 외에도, 숙주세포 인자, 아마도 단백질은 보존서열구성에 결합할 수 있다 (Strauss & Strauss, 상기).
알파바이러스-유래된 벡터는 외래 유전자 정보를 표적 세포 또는 표적 유기체로 전달하기 위해 제안되어왔다. 간단한 접근법에서, 알파바이러스 구조 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프레임은 목적 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프레임으로 대체된다. 알파바이러스 기반의 트랜스-복제 시스템은 2개의 분리된 핵산 분자 상의 알파바이러스 뉴클레오타이드 서열 요소에 의존한다: 하나의 핵산 분자는 바이러스 복제효소 (전형적으로 폴리-단백질 nsP1234로서)를 코딩하고, 다른 핵산 분자는 상기 복제효소에 의해 트랜스로 복제되는 것이 가능하다 (따라서 트랜스-복제 시스템 지칭). 트랜스-복제는 주어진 숙주세포에서 이들 핵산 분자 모두의 존재를 필요로 한다. 복제효소에 의해 트랜스로 복제될 수 있는 핵산 분자는 알파바이러스 복제효소에 의한 인식 및 RNA 합성을 허용하는 특정 알파바이러스 서열 요소를 포함해야 한다.
본 발명에 따르면, 용어 "알파바이러스"는 광범위하게 이해되어야 하며, 알파바이러스의 특징을 갖는 임의의 바이러스 입자를 포함한다. 알파바이러스의 특성은 RNA 중합효소 활성을 포함하여 숙주세포에서의 복제에 적합한 유전 정보를 코딩하는 (+) 가닥 RNA의 존재를 포함한다. 많은 알파바이러스의 추가적인 특성은 예를 들어 문헌[Strauss & Strauss, Microbiol. Rev., 1994, vol. 58, pp. 491-562]에 기재되어 있다. 용어 "알파바이러스"는 자연계에서 발견되는 알파바이러스뿐만 아니라 임의의 변이체 또는 이의 유도체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 변이체 또는 유도체는 자연계에서 발견되지 않는다.
일 실시형태에서, 알파바이러스는 자연계에서 발견되는 알파바이러스이다. 전형적으로, 자연계에서 발견되는 알파바이러스는 동물(인간과 같은 척추동물 및 곤충과 같은 절지동물을 포함한다)과 같은 임의의 하나 이상의 진핵 생물체에 대해 감염성이 있다.
자연계에서 발견되는 알파바이러스는 바람직하게는 이하와 같이 이루어진 군으로부터 선택된다: Barmah Forest 바이러스 복합체 (Barmah Forest 바이러스를 포함한다); 동부형 마뇌염(Eastern equine encephalitis) 복합체 (동부형 마뇌염 바이러스의 7가지 항원 유형을 포함한다); Middelburg 바이러스 복합체 (Middelburg 바이러스를 포함한다); Ndumu 바이러스 복합체 (Ndumu 바이러스를 포함한다); Semliki Forest 바이러스 복합체 (Bebaru 바이러스, Chikungunya 바이러스, Mayaro 바이러스 및 그 아류형 Una 바이러스, O'Nyong Nyong 바이러스, 및 그 아류형 Igbo-Ora 바이러스, Ross River 바이러스 및 그 아류형 Bebaru 바이러스, Getah 바이러스, Sagiyama 바이러스, Semliki Forest 바이러스 및 그 아류형 Me Tri 바이러스를 포함한다); 베네수엘라 마뇌염(Venezuelan equine encephalitis) 복합체 (Cabassou 바이러스, Everglades 바이러스, Mosso das Pedras 바이러스, Mucambo 바이러스, Paramana 바이러스, Pixuna 바이러스, Rio Negro 바이러스, Trocara 바이러스 및 그 아류형 Bijou Bridge 바이러스, 베네수엘라 마뇌염 바이러스를 포함한다); 서부형 마뇌염(WWestern equine encephalitis) 복합체 (Aura 바이러스, Babanki 바이러스, Kyzylagach 바이러스, Sindbis 바이러스, Ockelbo 바이러스, Whataroa 바이러스, Buggy Creek 바이러스, Fort Morgan 바이러스, Highlands J 바이러스, 서부형 마뇌염 바이러스를 포함한다); 및 연어류 췌장병 바이러스(Salmon pancreas disease virus); 수면 질환 바이러스(Sleeping Disease virus); 남방코끼리바다표범 바이러스(Southern elephant seal virus); Tonate 바이러스를 포함하는 일부 미분류된 바이러스를 들 수 있다. 보다 바람직하게는, 알파바이러스는 Semliki Forest 바이러스 복합체 (Semliki Forest 바이러스를 포함하고, 상기한 바와 같은 바이러스 유형을 포함한다), 서부형 마뇌염 복합체 (Sindbis 바이러스를 포함하고, 상기한 바와 같은 바이러스 유형을 포함한다), 동부형 마뇌염 바이러스 (상기한 바와 같은 바이러스 유형을 포함한다), 베네수엘라 마뇌염 복합체 (베네수엘라 마뇌염 바이러스를 포함하고, 상기한 바와 같은 바이러스 유형을 포함한다)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
보다 바람직한 일 실시형태에서, 알파바이러스는 Semliki Forest 바이러스이다. 더욱 바람직한 일 실시형태에서, 알파바이러스는 Sindbis 바이러스이다. 더욱 바람직한 일 실시형태에서, 알파바이러스는 베네수엘라 마뇌염 바이러스이다.
본 발명의 일부 실시형태에서, 알파바이러스는 자연계에서 발견되는 알파바이러스가 아니다. 전형적으로 자연계에 존재하지 않는 알파바이러스는 자연계에서 발견되는 알파바이러스의 변이체 또는 유도체이며, 뉴클레오타이드 서열, 즉 게놈 RNA에서 적어도 하나의 돌연변이에 의해 자연계에서 발견되는 알파바이러스와 구별된다. 뉴클레오타이드 서열의 돌연변이는 자연계에서 발견되는 알파바이러스와 비교하여 하나 이상의 뉴클레오타이드의 삽입, 치환 또는 결실로부터 선택될 수 있다. 뉴클레오타이드 서열에서의 돌연변이는 뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩된 폴리펩티드 또는 단백질에서의 돌연변이와 관련되거나 관련 없을 수 있다. 예를 들어, 자연계에 존재하지 않는 알파바이러스는 약독 알파바이러스일 수 있다. 자연계에 존재하지 않는 약독 알파바이러스는 전형적으로 자연계에서 발견되는 알파바이러스와 구별되어 그 뉴클레오타이드 서열에 적어도 하나의 돌연변이를 갖는 알파바이러스이며, 이는 감염성이 전혀 없거나 감염성이 있지만 질병 발생력이 약화되어 있거나 질병 발생력이 전혀 없는 알파바이러스이다. 일례로서, TC83은 자연계에서 발견되는 베네수엘라 마뇌염 바이러스 (VEEV)와 구별되는 약독 알파바이러스이다(McKinney et al., 1963, Am. J. Trop. Med. Hyg., 1963, vol. 12; pp. 597-603).
또한, 알파바이러스 속의 구성은 인간에서의 상대적인 임상 특징에 의거하여 분류될 수도 있다: 주로 뇌염과 관련된 알파바이러스, 주로 발열, 발진 및 다발성관절염과 관련된 알파바이러스를 들 수 있다.
용어 "알파바이러스"는 알파바이러스에서 발견되거나 예를 들어 유전공학적 조작에 의해 알파바이러스로부터 유래되거나 알파바이러스로부터 유도된 것을 의미한다.
본 발명에 따르면, "SFV"는 Semliki Forest 바이러스를 나타낸다. 본 발명에 따르면, "SIN" 또는 "SINV"는 Sindbis 바이러스를 나타낸다. 본 발명에 따르면, "VEE" 또는 "VEEV"는 베네수엘라 마뇌염 바이러스를 나타낸다.
본 발명에 따르면, "알파바이러스" 또는 "알파바이러스로부터 유래된"이라는 용어는 알파바이러스로부터 기원된 개체를 나타낸다. 예를 들어, 알파바이러스의 단백질은 알파바이러스에서 발견되는 단백질 및/또는 알파바이러스에 의해 코딩된 단백질을 지칭할 수 있고; 알파바이러스의 핵산 서열은 알파바이러스에서 발견되는 핵산 서열 및/또는 알파바이러스에 의해 코딩된 핵산 서열을 지칭할 수 있다. 바람직하게는, "알파바이러스의" 핵산 서열은 "알파바이러스의 게놈의" 핵산 서열 및/또는 "알파바이러스의 게놈 RNA의" 핵산 서열을 지칭한다.
본 발명에 따르면, 용어 "알파바이러스 RNA"는 알파바이러스 게놈 RNA (즉, (+) 가닥), 알파바이러스 게놈 RNA (즉, (-) 가닥)의 상보체 및 서브게놈 전사체 (즉 (+) 가닥) 또는 이의 임의의 단편을 지칭한다.
본 발명에 따르면, "알파바이러스 게놈"은 알파바이러스의 게놈 (+) 가닥 RNA를 지칭한다.
본 발명에 따르면, 용어 "자연성 알파바이러스 서열" 및 유사한 용어는 전형적으로 자연-발생 알파바이러스(자연계에서 발견되는 알파바이러스)의 (예를 들어 핵산) 서열을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 용어 "자연성 알파바이러스 서열"은 또한 약독 알파바이러스의 서열을 포함한다.
본 발명에 따르면, 용어 "5' 복제인식서열"은 바람직하게는 알파바이러스 게놈의 5' 단편과 동일하거나 상동인 연속적인 핵산 서열, 바람직하게는 리보핵산 서열을 지칭한다. "5' 복제인식서열"은 알파바이러스 복제효소에 의해 인식될 수 있는 핵산 서열이다. 용어 5' 복제인식서열은 자연성 5' 복제인식서열뿐만 아니라 그의 기능적 등가물, 예를 들어 자연계에서 발견되는 알파바이러스의 5' 복제인식서열의 기능적 변이체를 포함한다. 5' 복제인식서열은 알파바이러스 게놈 RNA의 (-) 가닥 상보체의 합성에 필요하며, (-) 가닥 주형에 기반으로 (+) 가닥 바이러스 게놈 RNA의 합성에 필요하다. 자연성 5' 복제인식서열은 전형적으로 적어도 nsP1의 N-말단 단편을 코딩하지만; nsP1234를 코딩하는 전체 오픈 리딩 프레임을 포함하지는 않는다. 자연성 5' 복제인식서열은 전형적으로 적어도 nsP1의 N-말단 단편을 코딩한다는 사실을 고려하여, 자연성 5' 복제인식서열은 전형적으로 적어도 하나의 개시코돈, 전형적으로 AUG를 포함한다. 일 실시형태에서, 5' 복제인식서열은 알파바이러스 게놈의 보존서열구성 1 (CSE 1) 또는 이의 변이체 및 알파바이러스 게놈의 보존서열구성 2 (CSE 2) 또는 이의 변이체를 포함한다. 5' 복제인식서열은 전형적으로 4개의 스템루프(SL), 즉 SL1, SL2, SL3, SL4를 형성할 수 있다. 이들 스템루프의 번호 매김은 5' 복제인식서열의 5' 말단에서 시작한다.
본 발명에 따르면, 용어 "3' 복제인식서열"은 알파바이러스 게놈의 3' 단편 과 동일하거나 상동인 연속적인 핵산 서열, 바람직하게는 리보핵산 서열을 지칭한다. "3' 복제인식서열"은 알파바이러스 복제효소에 의해 인식될 수 있는 핵산 서열이다. 용어 3' 복제인식서열은 자연성 3' 복제인식서열뿐만 아니라 그의 기능적 등가물, 예를 들어 자연계에서 발견되는 알파바이러스의 3' 복제인식서열의 기능적 변이체를 포함한다. 3' 복제인식서열은 알파바이러스 게놈 RNA의 (-) 가닥 상보체의 합성에 필요하다. 일 실시형태에서, 3' 복제인식서열은 알파바이러스 게놈의 보존서열구성 4 (CSE 4) 또는 이의 변이체 및 선택적으로 알파바이러스 게놈의 폴리(A) 꼬리를 포함한다.
"보존서열구성" 또는 "CSE"라는 용어는 알파바이러스 RNA에서 발견되는 뉴클레오타이드 서열을 지칭한다. 이종상동성이 상이한 알파바이러스의 게놈에 존재하고 상이한 알파바이러스의 이종상동한 CSE가 높은 서열 동일성 백분율 및/또는 유사한 2차 또는 3차 구조의 높은 비율을 공유하는 것이 바람직하기 때문에 이들 서열 요소는 "보전된 것"으로 지칭한다. 용어 CSE는 CSE 1, CSE 2, CSE 3 및 CSE 4을 포함한다.
본 발명에 따르면, 용어 "CSE 1" 또는 "44-nt CSE"는 (-) 가닥 주형으로부터 (+) 가닥 합성에 필요한 뉴클레오타이드 서열을 동의적으로 지칭한다. 용어 "CSE 1"은 (+) 가닥 상에 있는 서열을 지칭하고; ((-) 가닥 상에) CSE 1의 상보적인 서열은 (+) 가닥 합성을 위한 프로모터로서 기능한다. 바람직하게는, 용어 CSE 1은 알파바이러스 게놈의 5' 뉴클레오타이드를 포함한다. CSE 1은 전형적으로 보존된 스템-루프 구조를 형성한다. 특정 이론에 결부되기를 바라는 것 없이, CSE 1의 경우, 2차 구조체는 1차 구조체, 즉 선형 서열보다 더 중요한 것으로 여겨진다. 모델 알파바이러스 Sindbis 바이러스의 게놈 RNA에서, CSE 1은 44개 뉴클레오타이드의 연속적인 서열로 구성되어 있고, 게놈 RNA의 가장 5'의 44개의 뉴클레오타이드에 의해 형성된다(Strauss & Strauss, Microbiol. Rev., 1994, vol. 58, pp. 491-562).
본 발명에 따르면, 용어 "CSE 2" 또는 "51-nt CSE"는 (+) 가닥 주형으로부터 (-) 가닥 합성에 필요한 뉴클레오타이드 서열을 동의적으로 지칭한다. (+) 가닥 주형은 전형적으로 알파바이러스 게놈 RNA 또는 RNA 레플리콘이다(CSE 2를 포함하지 않는 서브게놈 RNA 전사체가 (-) 가닥 합성을 위한 주형으로 작용하지 않는다). 알파바이러스 게놈 RNA에서, CSE 2는 전형적으로 nsP1에 대한 코딩 서열 내에 위치한다. 모델 알파바이러스 Sindbis 바이러스의 게놈 RNA에서, 51-nt CSE는 게놈 RNA의 155-205 위치에 있다(Frolov et al., 2001, RNA, vol. 7, pp. 1638-1651). CSE 2는 전형적으로 두개의 보존된 스템루프 구조를 형성한다. 이들 스템루프 구조는 이들이 알파바이러스 게놈 RNA의 5' 말단에서부터 계산된 알파바이러스 게놈 RNA의 세 번째 및 네 번째 보존 스템루프이기 때문에 스템루프 3 (SL3) 및 스템루프 4 (SL4)로 표기한다. 특정 이론에 결부되기를 바라는 것 없이, CSE 2의 경우, 2차 구조체는 1차 구조체, 즉 선형 서열보다 더 중요한 것으로 여겨진다.
본 발명에 따르면, 용어 "CSE 3" 또는 "접합 서열"은 알파바이러스 게놈 RNA로부터 유도되고 서브게놈 RNA의 개시 부위를 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 동의적으로 지칭한다. (-) 가닥에서 이 서열의 상보체는 서브게놈 RNA 전사를 촉진시키는 역할을 한다. 알파바이러스 게놈 RNA에서, CSE 3은 전형적으로 nsP4의 C-말단 단편을 코딩하는 영역과 중첩되며, 구조 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프레임의 상류에 위치한 짧은 비-코팅 영역까지 연장된다.
본 발명에 따르면, 용어 "CSE 4" 또는 "19-nt 보존서열" 또는 "19-nt CSE"는 알파바이러스 게놈의 3' 비번역 영역에서 폴리(A) 서열의 바로 상류인 알파바이러스 게놈 RNA로부터의 뉴클레오타이드 서열을 동의적으로 지칭한다. CSE 4는 전형적으로 19개의 연속적인 뉴클레오타이드로 구성된다. 특정 이론에 결부되기를 바라는 것 없이, CSE 4는 (-) 가닥 합성의 개시를 위한 코어 프로모터로서 기능하는 것으로 이해되거나(Jose et al., Future Microbiol., 2009, vol. 4, pp. 837-856); 및/또는 알파바이러스 게놈 RNA의 CSE 4 및 폴리(A) 꼬리는 효율적인 (-) 가닥 합성을 위해 함께 작용하는 것으로 이해된다(Hardy & Rice, J. Virol., 2005, vol. 79, pp. 4630-4639).
본 발명에 따르면, "서브게놈 프로모터" 또는 "SGP"라는 용어는 핵산 서열 (예컨대 코딩 서열)의 핵산 서열 상류(5')를 지칭하며, RNA 중합효소, 전형적으로 RNA 의존성 RNA 중합효소, 특히 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질에 대한 결합 부위 및 인식 부위를 제공함으로써 상기 핵산 서열의 전사를 제어한다. SGP는 추가적인 인자에 대한 추가적인 인식 또는 결합 부위를 포함할 수 있다. 서브게놈 프로모터는 전형적으로 알파바이러스와 같은 양성 가닥 RNA 바이러스의 유전적 요소이다. 알파바이러스의 서브게놈 프로모터는 바이러스 게놈 RNA에 포함된 핵산 서열이다. 서브게놈 프로모터는 일반적으로 RNA 의존성 RNA 중합효소, 예를 들어 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질의 존재 하에서 전사(RNA 합성)의 개시를 허용하는 것을 특징으로 한다. RNA (-) 가닥, 즉 알파바이러스 게놈 RNA의 상보체는 (+) 가닥 서브게놈 전사체의 합성을 위한 주형으로서 작용하고, (+) 가닥 서브게놈 전사체의 합성은 전형적으로 서브게놈 프로모터에서 또는 그 근처에서 개시된다. 본원에서 사용되는 바와 같이 "서브게놈 프로모터"라는 용어는 그러한 서브게놈 프로모터를 포함하는 핵산에서 임의의 특정 위치에 국한되지 않는다. 일부 실시형태에서, SGP는 CSE 3과 동일하거나 CSE 3과 중첩되거나 CSE 3을 포함한다.
용어 "서브게놈 전사체" 또는 "서브게놈 RNA"는 RNA 분자를 주형("주형 RNA")으로 사용한 전사의 결과로서 얻을 수 있는 RNA 분자를 동의적으로 지칭하며, 여기서 주형 RNA는 서브게놈 전사체의 전사를 제어하는 서브게놈 프로모터를 포함한다. 서브게놈 전사체는 RNA 의존성 RNA 중합효소, 특히 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질의 존재 하에 수득 가능하다. 예를 들어, "서브게놈 전사체"라는 용어는 알파바이러스 게놈 RNA의 (-) 가닥 상보체를 주형으로 사용하여, 알파바이러스에 감염된 세포에서 제조된 RNA 전사체를 지칭할 수 있다. 그러나, 본 명세서에서 사용된 바와 같은 "서브게놈 전사체"라는 용어는 이에 한정되지 않고, 이형 RNA를 주형으로 사용함으로써 수득 가능한 전사체를 포함한다. 예를 들어, 서브게놈 전사체는 또한 본 발명에 따른 SGP-함유 레플리콘의 (-) 가닥 상보체를 주형으로 사용하여 수득할 수 있다. 따라서, 용어 "서브게놈 전사체"는 알파바이러스 게놈 RNA의 단편을 전사시킴으로써 수득할 수 있는 RNA 분자뿐만 아니라 본 발명에 따른 레플리콘의 단편을 전사시킴으로써 수득할 수 있는 RNA 분자를 지칭할 수 있다.
본 발명에 따르면, 복제효소, 바람직하게는 알파바이러스 복제효소에 의해 복제될 수 있는 핵산 구조물은 레플리콘으로 불린다. 본 발명에 따르면, 용어 "레플리콘"은 RNA 의존성 RNA 중합효소에 의해 복제될 수 있는 RNA 분자를 정의하며, DNA 중간체 없이 하나 또는 다수의 동일하거나 본질적으로 동일한 RNA 레플리콘의 복사본을 생성한다. "DNA 중간체 없다"는 것은 RNA 레플리콘의 레플리콘을 형성하는 과정에서 레플리콘의 데옥시리보핵산(DNA) 복사본 또는 레플리콘의 상보체가 RNA 레플리콘의 복사본을 형성하는 과정에서 형성되지 않고, 및/또는 데옥시리보핵산(DNA) 분자가 RNA 레플리콘, 또는 이의 상보체의 복사본을 형성하는 과정에서 주형으로 사용되지 않는 것을 의미한다. 복제효소 기능은 전형적으로 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질에 의해 제공된다.
본 발명에 따르면, 용어 "복제될 수 있다" 및 "복제되는 것이 가능하다"는 일반적으로 핵산의 하나 이상의 동일하거나 본질적으로 동일한 복사본이 제조될 수 있음을 설명한다. "복제효소에 의해 복제되는 것이 가능하다"에서 용어 "복제효소"와 함께 사용하는 경우, 용어 "복제될 수 있다" 및 "복제되는 것이 가능하다"는 복제효소에 대해 핵산 분자, 예를 들어 RNA 레플리콘의 기능적 특성을 설명하는 것이다. 이러한 기능적 특성은 (i) 복제효소가 레플리콘을 인식할 수 있고 (ii) 복제효소가 RNA 의존성 RNA 중합효소(RdRP)로서 작용할 수 있는 것 중 적어도 하나를 포함한다. 바람직하게는, 복제효소는 (i) 레플리콘을 인식할 수 있고 (ii) RNA 의존성 RNA 중합효소로서 작용할 수 있다.
"인식할 수 있는"이라는 표현은 복제효소가 레플리콘과 물리적으로 결합할 수 있으며, 바람직하게는 복제효소가 전형적으로 비공유 결합으로 레플리콘에 결합할 수 있는 것을 설명한다. "결합"이라는 용어는 복제효소가 임의의 하나 이상의 보존서열구성 1 (CSE 1) 또는 이의 상보 서열(레플리콘에 포함되는 경우), 보존서열구성 2 (CSE 2) 또는 이의 상보 서열(레플리콘에 포함되는 경우), 보존서열구성 3 (CSE 3) 또는 이의 상보 서열(레플리콘에 포함되는 경우), 보존서열구성 4 (CSE 4) 또는 상보 서열(레플리콘에 포함되는 경우)에 대해 결합 능력이 있음을 의미할 수 있다. 바람직하게는, 복제효소는 CSE 2 [즉, (+) 가닥에] 및/또는 CSE 4 [즉, (+) 가닥에]에 결합할 수 있거나, CSE 1의 상보체 [즉, (-) 가닥에] 및/또는 CSE 3의 상보체 [즉, (-) 가닥에]에 결합할 수 있다.
"RdRP로서 작용할 수 있다"는 표현은 복제효소가 알파바이러스 게놈 (+) 가닥 RNA의 (-) 가닥 상보체의 합성을 촉매할 수 있음을 의미하고, 여기서 (+) 가닥 RNA는 주형 기능을 가지며, 및/또는 복제효소가 (+) 가닥 알파바이러스 게놈 RNA의 합성을 촉매할 수 잇음을 의미하고, 여기서 (-) 가닥 RNA는 주형 기능을 갖는다. 일반적으로, "RdRP로서 작용할 수 있는"이라는 표현은 또한 복제효소가 (+) 가닥 서브게놈 전사체의 합성을 촉매할 수 잇음을 의미하고, 여기서 (-) 가닥 RNA는 주형 기능을 가지며, (+) 가닥 서브게놈 전사체의 합성은 전형적으로 알파바이러스 서브게놈 프로모터에서 개시된다.
"결합할 수 있는" 및 "RdRP로 작용할 수 있는"이라는 표현은 정상적인 생리 조건에서의 능력을 지칭한다. 특히, 이들은 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질을 발현하거나 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질을 코딩하는 핵산으로 형질주입된 세포 내 조건을 지칭한다. 세포는 바람직하게는 진핵세포이다. 결합 능력 및/또는 RdRP로서 작용하는 능력은 실험적으로 예를 들어 무세포 시험관내 시스템 또는 진핵세포 내에서 시험할 수 있다. 선택적으로, 상기 진핵세포는 복제효소의 기원을 나타내는 특정 알파바이러스가 감염되는 종으로부터 유래된 세포이다. 예를 들어, 사람에게 감염되는 특정 알파바이러스의 알파바이러스 복제효소를 사용하는 경우, 정상적인 생리 조건은 인간 세포에서의 상태이다. 보다 바람직하게는, 진핵세포(일례로 인간 세포)는 복제효소의 기원을 나타내는 특정 알파바이러스가 감염된 동일한 조직 또는 기관에서 유래한 것이다.
본 발명에 따르면, "자연성 알파바이러스 서열과 비교" 및 유사한 용어는 자연성 알파바이러스 서열의 변이체인 서열을 지칭한다. 이 변이체는 전형적으로 자연성 알파바이러스 서열 자체는 아니다.
일 실시형태에 있어서, RNA 레플리콘은 복제인식서열 예컨대 5' 복제인식서열 및 3' 복제인식서열을 포함한다. 복제인식서열은 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질에 의해 인식될 수 있는 핵산 서열이다. 즉, 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질은 복제인식서열을 인식할 수 있다. 바람직하게는, 5' 복제인식서열은 레플리콘의 5' 말단에 위치한다. 일 실시형태에서, 5' 복제인식서열은 CSE 1 및 2로 이루어지거나 포함한다. 바람직하게는, 3' 복제인식서열은 레플리콘의 3' 말단(레플리콘이 폴리(A) 꼬리를 포함하지 않는 경우) 또는 폴리(A) 꼬리의 바로 상류에 위치한다(레플리콘이 폴리(A) 꼬리를 포함하는 경우). 일 실시형태에서, 3' 복제인식서열은 CSE 4로 이루어지거나 포함한다.
일 실시형태에서, 5' 복제인식서열 및 3' 복제인식서열은 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질의 존재 하에 RNA 레플리콘의 복제를 지시할 수 있다. 따라서, 단독으로 또는 바람직하게 함께 존재할 때, 이들 인식 서열은 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질의 존재 하에 RNA 레플리콘의 복제를 지시한다.
기능성 알파바이러스 비구조성 단백질이 시스(레플리콘 상의 오픈 리딩 프레임에 의해 목적 단백질로서 코딩됨) 또는 트랜스(별도의 복제효소 구성체 상의 오픈 리딩 프레임에 의해 목적 단백질로서 코딩됨)로 제공되고, 레플리콘의 5' 복제인식서열 및 3' 복제인식서열 모두를 인식할 수 있는 것이 바람직하다. 일 실시형태에서, 이는 5' 및 3' 복제인식서열이 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질이 유래된 알파바이러스에 고유한 것인 경우에 달성된다. 고유한이란 이들 서열의 자연적 기원이 동일한 알파바이러스임을 의미한다. 또 다른 실시형태에서, 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질이 레플리콘의 5' 복제인식서열 및 3' 복제인식서열 모두를 인식할 수 있는 경우, 5' 복제인식서열 및/또는 3' 복제인식서열은 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질이 유래된 알파바이러스에 고유하지 않은 것이다. 즉, 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질은 5' 복제인식서열 및 3' 복제인식서열에 호환할 수 있다. 비-자연성 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질이 각각의 서열 또는 서열 요소를 인식할 수 있는 경우, 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질은 호환한다고 한다(바이러스 간 호환성). 바이러스 간 호환성이 존재하는 한, 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질과 각각 (3'/5') 복제인식서열 및 CSE의 임의의 조합이 가능하다. RNA와 함께 시험할 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질을 인큐베이팅함으로써 본 발명을 수행하는 당업자는 바이러스 간 호환성을 용이하게 시험할 수 있고, 여기서 RNA는 RNA 복제에 적합한 조건, 예를 들어 적합한 숙주세포에서 시험할 3'- 및 5' 복제인식서열을 갖는다. 복제가 발생하면, (3'/5') 복제인식서열 및 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질은 호환할 수 있는 것으로 결정된다.
본 발명의 일 실시형태에서, 레플리콘은 트랜스-복제 시스템의 일부이며 따라서 레플리콘은 트랜스-레플리콘이다. 이 실시형태에서, RNA 레플리콘은 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함하지 않는 것이 바람직하다. 따라서, 이 실시형태에서, 본 발명은 2개의 핵산 분자를 포함하는 시스템을 제공한다: 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질(즉, 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질을 코딩하는)을 발현시키는 제 1 RNA 구조체; 및 제 2 RNA 분자인 RNA 레플리콘을 포함한다. 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질을 발현시키기 위한 RNA 구조체는 본 명세서에서 "기능성 알파바이러스 비구조성 단백질을 발현시키기 위한 RNA 구조체" 또는 "복제효소 구성체"와 동의어로 지칭한다. 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질은 상기 정의된 바와 같으며 전형적으로 복제효소 구성체에 포함된 오픈 리딩 프레임에 의해 코딩된다. 복제효소 구성체에 의해 코딩된 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질은 레플리콘을 복제할 수 있는 임의의 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질일 수 있다. 본 발명에 따르면, 복제효소 구성체는 동일한 조성물, 예를 들어, 혼합된 미립자 제형 또는 조합된 미립자 제형으로서, 또는 개별적일 조성물 내에 레플리콘(들)과 함께 존재할 수 있다. 본 발명의 시스템이 세포, 바람직하게는 진핵세포 내에 도입되는 경우에, 기능적 알파바이러스 비구조성 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프레임은 번역될 수 있다. 번역 후, 기능적 알파바이러스 비구조성 단백질은 개별적인 RNA 분자 (RNA 레플리콘)를 트랜스로 복제할 수 있다.
여기서, 트랜스(예를 들어, 트랜스-작용, 트랜스-조절과 관련하여)는 일반적으로 "상이한 분자로부터의 작용"(즉, 분자간)을 의미한다. 그것은 일반적으로 "동일한 분자에서 작용"(즉, 분자내)을 의미하는 시스(예를 들어 시스-작용, 시스-조절과 관련하여)의 반대말이다. RNA 합성(전사 및 RNA 복제 포함)과 관련하여, 트랜스-작용 요소는 RNA 합성이 가능한 효소(RNA 중합효소)를 코딩하는 유전자를 함유하는 핵산 서열을 포함한다. RNA 중합효소는 RNA 합성을 위한 주형으로서 제 2 핵산 분자, 즉 그것이 코딩되는 것 이외의 핵산 분자를 사용한다. RNA 중합효소 및 RNA 중합효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 핵산 서열 모두는 제 2 핵산 분자 상에서 "트랜스로 작용한다"고 지칭한다. 본 발명의 문맥 상에서, 트랜스-작용 RNA에 의해 코딩된 RNA 중합효소는 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질일 수 있다. 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질은 RNA 레플리콘의 복제를 포함하여 RNA 레플리콘인 제 2 핵산 분자를 합성용 또는 RNA의 주형으로 사용할 수 있다. 본 발명에 따라 복제효소에 의해 트랜스로 복제될 수 있는 RNA 레플리콘은 본원에서 동의어로 "트랜스-레플리콘"으로 지칭된다.
본 발명에 따르면, 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질의 역할은 서브게놈 프로모터가 레플리콘 상에 존재하는 경우 레플리콘을 증폭시키고 서브게놈 전사체를 제조하는 것이다. 레플리콘이 발현을 위한 목적 유전자를 코딩하는 경우, 목적 유전자의 발현 수준 및/또는 발현 지속 시간은 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질의 수준을 변형시킴으로써 트랜스로 조절될 수 있다.
본 발명의 트랜스-복제 시스템은 적어도 2개의 핵산 분자를 포함한다. 바람직한 일 실시형태에서, 시스템은 정확히 2개의 RNA 분자, 레플리콘 및 복제효소 구성체로 구성된다. 바람직한 다른 실시형태에서, 시스템은 둘 이상의 레플리콘을 포함하고, 각각은 바람직하게는 적어도 하나의 목적 단백질을 코딩하고, 또한 복제효소 구성체를 포함한다. 이들 실시형태에서, 복제효소 구성체에 의해 코딩된 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질은 각각의 레플리콘으로 작용하여 복제 및 선택적으로 서브게놈 전사체의 생산을 각각 유도할 수 있다. 예를 들어, 각각의 레플리콘은 약학적 활성 펩티드 또는 단백질을 코딩할 수 있다. 이는 여러 다른 항원에 대한 대상체의 백신접종이 필요한 경우 유리하다.
바람직하게는, 복제효소 구성체는 (+) 가닥 주형에 기반한 (-) 가닥 합성 및/또는 (-) 가닥 주형에 기반한 (+) 가닥 합성에 필요한 적어도 하나의 보존서열구성 (CSE)이 부족하다. 보다 바람직하게는, 복제효소 구성체는 어떠한 알파바이러스 보존서열구성 (CSE)도 포함하지 않는다. 특히, 알파바이러스의 4개 CSE(Strauss & Strauss, Microbiol. Rev., 1994, vol. 58, pp. 491-562; Jose et al., Future Microbiol., 2009, vol. 4, pp. 837-856)에서, 하기 CSE 중 임의의 하나 이상이 바람직하게는 복제효소 구성체 상에 존재하지 않는다: CSE 1; CSE 2; CSE 3; CSE 4. 특히 하나 이상의 임의의 알파바이러스 CSE가 없는 경우, 본 발명의 복제효소 구성체는 알파바이러스 게놈 RNA와 유사한 것보다 전형적인 진핵세포 mRNA와 매우 유사하다.
본 발명의 복제효소 구성체는 바람직하게는 자가 복제가 불가능하다는 점 및/또는 서브게놈 프로모터의 제어 하에서 오픈 리딩 프레임을 포함하지 않는다는 점에서 알파바이러스 게놈 RNA와 구별된다. 또한, 자가 복제가 불가능한 경우, 복제효소 구성체는 "자살 구성체(suicide construct)"라고도 불릴 수 있다.
본 발명에 따른 복제효소 구성체는 바람직하게는 단일가닥 RNA 분자이다. 본 발명에 따른 복제효소 구성체는 전형적으로 (+) 가닥 RNA 분자이다. 일 실시형태에서, 본 발명의 복제효소 구성체는 분리된 핵산 분자이다.
일 실시형태에서, RNA 예컨대 본 발명에 따른 레플리콘은 목적 펩티드 또는 목적 단백질을 코딩하는 적어도 하나 오픈 리딩 프레임을 포함한다. 다양한 실시형태에서, 펩티드 또는 목적 단백질은 이종 핵산 서열에 의해 코딩된다. 본 발명에 따르면, 용어 "이종"은 핵산 서열이 알파바이러스 핵산 서열과 같은 핵산 서열에 자연적으로 기능적으로 또는 구조적으로 연결되어 있지 않다는 사실을 일컫는다.
본 발명에 따른 RNA는 단일 폴리펩티드 또는 다중 폴리펩티드를 코딩할 수 있다. 다중 폴리펩티드는 단일 폴리펩티드 (융합 폴리펩티드) 또는 별도의 폴리펩티드로서 코딩될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명에 따른 RNA는 하나를 초과하는 오픈 리딩 프레임을 포함할 수 있으며, 레플리콘의 경우 이들 각각은 서브게놈 프로모터의 제어 하에 있는지 아닌지를 독립적으로 선택될 수 있다. 또는, 폴리-단백질 또는 융합 폴리펩티드는 선택적으로 자가촉매성 프로테아제 절단 부위 (예를 들어 구제역 바이러스 2A 단백질)에 의해 분리된 개개의 폴리펩티드, 또는 인테인을 포함한다.
목적 단백질은 예를 들어, 리포터 단백질, 약학적 활성 펩티드 또는 단백질, 세포내 인터페론(IFN) 신호전달의 억제제 및 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명에 따르면, 용어 "펩티드"는 올리고- 및 폴리펩티드를 포함하고, 2개 이상, 바람직하게는 3개 이상, 바람직하게는 4개 이상, 바람직하게는 6개 이상, 바람직하게는 8개 이상, 바람직하게는 10개 이상, 바람직하게는 13개 이상, 바람직하게는 16개 이상, 바람직하게는 20개 이상, 바람직하게는 50개 이하, 바람직하게는 100개 이하 또는 바람직하게는 150개 이하의 펩티드결합을 통해 다른 하나와 연결된 연속적인 아미노산을 포함하는 물질을 지칭한다. 용어 "단백질"은 큰 펩티드, 바람직하게는 적어도 151개의 아미노산을 갖는 펩티드를 지칭하지만, 용어 "펩티드" 및 "단백질"은 본원에서 일반적으로 동의어로 사용된다.
용어 "펩티드" 및 "단백질"은 본 발명에 따라 아미노산 성분뿐만 아니라 당 및 포스페이트 구조와 같은 비-아미노산 성분을 함유하는 물질을 포함하고, 또한 에스터, 티오에테르 또는 이황화결합과 같은 결합을 함유하는 물질을 포함한다.
본 발명에 따르면, 예를 들어 핵산 및 아미노산 서열에 관한 용어 "변이체"는 임의의 변이체, 특히 돌연변이체, 바이러스 균주 변이체, 스플라이스 변이체, 입체배좌체, 이소형체, 대립형질 변이체, 종 변이체 및 종 상동체, 특히 자연적으로 존재하는 것들을 포함한다. 대립형질 변이체는 유전자의 정상 서열에서의 변경에 관한 것이고, 그 중요성은 종종 불분명하다. 완전한 유전자 시퀀싱은 종종 주어진 유전자에 대한 수많은 대립형질 변이체를 동정한다. 핵산 분자와 관련하여, 용어 "변이체"는 축퇴성 핵산 서열을 포함하며, 여기서 본 발명에 따른 축퇴성 핵산은 유전 암호의 축퇴성 때문에(예를 들어 코돈 사용의 적용으로 인해) 코돈 서열에서 기준 핵산과 상이한 핵산이다. 종 상동체는 주어진 핵산 또는 아미노산 서열과는 다른 종의 기원을 갖는 핵산 또는 아미노산 서열이다. 바이러스 상동체는 주어진 핵산 또는 아미노산 서열과는 다른 바이러스의 기원을 갖는 핵산 또는 아미노산 서열이다.
본 발명에 따르면, 핵산 변이체는 기준 핵산과 비교하여 단일 또는 다중 뉴클레오타이드 결실, 부가, 돌연변이, 치환 및/또는 삽입을 포함한다. 결실은 기준 핵산으로부터 하나 이상의 뉴클레오타이드를 제거하는 것을 포함한다. 첨가 변이체는 하나 이상의 뉴클레오타이드, 예컨대 1, 2, 3, 5, 10, 20, 30, 50개 이상의 뉴클레오타이드의 5'- 및/또는 3'-말단 융합체를 포함한다. 치환의 경우, 서열 중 적어도 하나의 뉴클레오타이드가 제거되고 적어도 하나의 다른 뉴클레오타이드가 그 자리에 삽입된다(예컨대 전환 및 전이). 돌연변이는 일염기 부위, 가교 부위, 및 화학적으로 변경되거나 변형된 염기를 포함한다. 삽입은 기준 핵산 내에 하나 이상의 뉴클레오타이드를 첨가하는 것을 포함한다.
본 발명에 따르면, "뉴클레오타이드 변화"는 기준 핵산과 비교하여 단일 또는 다중 뉴클레오타이드 결실, 첨가, 돌연변이, 치환 및/또는 삽입을 의미할 수 있다. 일부 실시형태에서, "뉴클레오타이드 변화"는 기준 핵산과 비교하여 단일 뉴클레오타이드의 결실, 단일 뉴클레오타이드의 첨가, 단일 뉴클레오타이드의 돌연변이, 단일 뉴클레오타이드의 치환 및/또는 단일 뉴클레오타이드의 삽입으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 본 발명에 따르면, 핵산 변이체는 기준 핵산과 비교하여 하나 이상의 뉴클레오타이드 변화를 포함할 수 있다.
특정 핵산 서열의 변이체는 바람직하게는 상기 특정 서열의 적어도 하나의 기능적 특성을 가지며, 바람직하게는 상기 특정 서열, 예를 들어 특정 핵산 서열과 동일한 또는 유사한 특성을 나타내는 핵산 서열과 기능적으로 동등하다.
바람직하게는 주어진 핵산 서열과 상기 주어진 핵산 서열의 변이체인 핵산 서열 사이의 동일성 정도가 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 75%, 보다 바람직하게는 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 85%, 더더욱 바람직하게는 적어도 90% 또는 가장 바람직하게는 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%일 수 있다. 동일성 정도는 적어도 약 30, 적어도 약 50, 적어도 약 70, 적어도 약 90, 적어도 약 100, 적어도 약 150, 적어도 약 200, 적어도 약 250, 적어도 약 300, 또는 적어도 약 400개의 뉴클레오타이드의 영역에 대하여 주어지는 것이 바람직하다. 바람직한 실시형태에서, 동일성 정도는 기준 핵산 서열의 전장에 대하여 부여된다.
"서열 유사성"은 동일하거나 보존적 아미노산 치환을 나타내는 아미노산의 백분율을 나타낸다. 두 폴리펩티드 또는 핵산 서열들 간의 "서열 동일성"은 서열들 간에 동일한 아미노산 또는 뉴클레오타이드의 백분율을 나타낸다.
용어 "동일성 백분율(% 동일성)"은 특히 비교하고자 하는 2개 서열들 간 최적 정렬 시 동일한 뉴클레오타이드들의 백분율을 일컫는 것이며, 상기 백분율은 순수하게 통계적인 것이고, 2개 서열들 간의 차이는 서열 전장에 걸쳐 무작위적으로 분포된 것일 수 있고 비교하고자 하는 서열은 2개 서열들 간에 최적 정렬을 달성하기 위해, 기준 서열과 비교시 부가 또는 결실을 포함하는 것일 수 있다. 2개 서열들의 비교는 대개 대응하는 서열들의 국소 영역들을 동정하기 위해, 세그먼트 또는 "비교 윈도우"와 관련하여 최적 정렬시킨 후, 상기 서열들을 비교함으로써 수행된다. 비교를 위한 최적 정렬은 수동으로 또는 문헌 [Smith and Waterman, 1981, Ads App. Math. 2, 482]에 따른 국소 상동성 알고리즘에 의하거나, 또는 문헌 [Needleman and Wunsch, 1970, J.　Mol. Biol. 48, 443]에 따른 국소 상동성 알고리즘에 의하거나, 또는 문헌 [Pearson and Lipman, 1988, Proc. Natl Acad. Sci. USA 85, 2444]에 따른 유사성 검색 알고리즘에 의하거나 또는 상기 알고리즘(GAP, BESTFIT, FASTA, BLAST P, BLAST N 및 TFASTA in Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575　Science Drive, Madison, Wis.)을 이용한 컴퓨터 프로그램의 도움을 받아 수행될 수 있다.
동일성 백분율은 비교될 2개의 서열 간의 동일한 위치의 수를 결정하고, 이 수를 비교된 위치의 수로 나누고, 얻어진 결과에 100을 곱하여 이들 두 서열 간의 동일성 백분율을 수득함으로써 계산된다.
예를 들면, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/wblast2.cgi 웹 사이트에서 이용 가능한 BLAST 프로그램인 "BBLAST 2 sequences"가 이용될 수 있다.
만일 두 서열들이 서로 상보적이라면 하나의 핵산은 또 다른 핵산에 "혼성화할 수 있거나" 또는 "혼성화"한다. 하나의 핵산은 또 다른 핵산에 만일 이들 두 서열들이 서로 안정한 듀플렉스를 형성할 수 있다면 그 다른 핵산에 대해 "상보적"이다. 본 발명에 따르면, 혼성화는 폴리뉴클레오타이드들 간에 특이적인 혼성화를 허락하는 조건(엄격한 조건) 하에서 수행되는 것이 좋다. 엄격한 조건은 예를 들면, 문헌 [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook et al., Editors, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989] 또는 [Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., Editors, John Wiley & Sons, Inc., New York]에 기재되어 있으며, 예를 들면 혼성화 완충액(3.5 x SSC, 0.02% Ficoll, 0.02% 폴리비닐피롤리돈, 0.02% 소 혈청 알부민, 2.5 mM NaH2PO4 (pH 7), 0.5% SDS, 2 mM EDTA) 중 65℃에서의 혼성화를 가리킨다. SSC는 0.15 M 염화나트륨/0.15 M 구연산나트륨, pH 7이다. 혼성화 후, DNA가 이송되는 막을 예컨대 실온에서 2 Х SSC로 세척한 다음 68℃ 이하의 온도에서 0.1-0.5 Х SSC/0.1 Х SDS로 세척한다.
상보성 백분율은 핵산 분자에서 제 2 핵산 서열과 수소결합(예컨대, 왓슨-크릭 염기 결합형성)을 형성할 수 있는 인접 잔기들의 백분율을 나타낸다 (예컨대, 10개 중 5, 6, 7, 8, 9, 10개이면 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 및 100% 상동성임). "완전히 상보적" 또는 "전적으로 상보적"이라 함은 핵산 서열 내 모든 인접 잔기들이 제2의 핵산 서열에서의 동일한 갯수의 인접 잔기들과 수소결합을 형성함을 의미한다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 상보성 정도는 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 75%, 보다 바람직하게는 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 85%, 더더욱 바람직하게는 적어도 90% 또는 가장 바람직하게는 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%이다. 가장 바람직하게는, 본 발명에 따른 상보성 정도는 100%이다.
"유도체(derivative)"라는 용어는 뉴클레오타이드 염기, 당 또는 포스페이트 상에서 핵산의 여하한 화학적 유도화를 포함한다. "유도체"라는 용어는 또한 자연적으로 발생하지 않는 뉴클레오타이드들 및 뉴클레오타이드 유사체들을 함유하는 핵산도 포괄한다. 핵산의 유도체화는 바람직하게는 그의 안정성을 증가시킨다.
본 발명에 따르면, "핵산 서열로부터 유래된 핵산 서열"은 그것이 유래된 핵산의 변이체일 수 있는 핵산을 지칭한다.
일 실시형태에서, 오픈 리딩 프레임은 리포터 단백질을 코딩한다. 이 실시형태에서, 오픈 리딩 프레임은 리포터 유전자를 포함한다. 특정 유전자는 이들이 세포 또는 유기체에 부여하는 특성을 용이하게 확인하고 측정할 수 있거나 선택표지이기 때문에 리포터로 선택될 수 있다. 리포터 유전자는 종종 특정 유전자가 세포 또는 유기체 집단에 의해 흡수되거나 발현되었는지 여부를 나타내는 지표로 사용된다. 바람직하게는, 리포터 유전자의 발현 산물을 시각적으로 검출할 수 있다. 일반적으로 시각적으로 검출 가능한 리포터 단백질은 전형적으로 형광 또는 발광 단백질을 가지고 있다. 특정 리포터 유전자의 예로는 이를 발현하는 세포가 청색광 하에서 녹색을 발산하게 하는 해파리 녹색 형광 단백질 (GFP), 루시페린과 반응하여 빛을 생성하는 효소 루시퍼라아제, 및 적색 형광 단백질 (RFP)을 코딩하는 유전자를 포함한다. 변이체가 시각적으로 검출 가능한 특성을 갖는 한, 이러한 특정 리포터 유전자의 임의의 변이체가 가능하다. 예를 들어, eGFP는 GFP의 점돌연변이 변이체이다.
본 발명에 따르면, 일 실시형태에서, RNA는 약학적 활성 RNA를 포함하거나 이로부터 구성된다. "약학적 활성 RNA"는 약학적 활성 펩티드 또는 단백질을 코딩하는 RNA일 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 RNA는 약학적 활성 펩티드 또는 단백질을 코딩한다. 바람직하게는, 오픈 리딩 프레임은 약학적 활성 펩티드 또는 단백질을 코딩한다. 바람직하게는, RNA는 RNA 레플리콘의 경우에 임의로 서브게놈 프로모터의 제어 하에서 약학적 활성 펩티드 또는 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함한다.
"약학적 활성 펩티드 또는 단백질"은 대상체에게 치료적 유효량으로 투여될 때 대상체의 상태 또는 질병 상태에 긍정적이거나 유리한 효과를 갖는다. 바람직하게는, 약학적 활성 펩티드 또는 단백질은 치유적 또는 완화된 성질을 가지며, 하나 이상의 질병 또는 장애 증상의 발병을 개선, 완화, 경감, 역전, 지연하거나 중증도를 줄이기 위해 투여될 수 있다. 약학적 활성 펩티드 또는 단백질은 예방적 특성을 가질 수 있으며, 질병의 발병을 지연시키거나 그러한 질병 또는 병리학적 상태의 중증도를 줄이기 위해 사용될 수 있다. 용어 "약학적 활성 펩티드 또는 단백질"은 전체 단백질 또는 폴리펩티드를 포함하며, 그의 약학적 활성 단편을 지칭할 수도 있다. 또한 펩티드 또는 단백질의 약학적 활성 유사체를 포함할 수 있다. "약학적 활성 펩티드 또는 단백질"이라는 용어는 항원인 펩티드 및 단백질을 포함하고, 즉, 펩티드 또는 단백질은 치료적으로 또는 부분적으로 또는 완전히 보호할 수 있는 대상체에서 면역 반응을 유도한다.
일 실시형태에서, 약학적 활성 펩티드 또는 단백질은 면역학적 활성 화합물 또는 항원 또는 에피토프이거나 이를 포함한다.
본 발명에 따르면, 용어 "면역학적 활성 화합물"은 바람직하게는 면역 세포의 성숙을 유도 및/또는 억제하고, 사이토카인 생합성을 유도 및/또는 억제하고, 및/또는 B 세포에 의한 항체 생산을 자극함으로써 체액성 면역을 변화시킴으로써 면역 반응을 변화시키는 임의의 화합물에 관한 것이다. 일 실시형태에서, 면역 반응은 항체 반응 (대체로 면역글로불린 G(IgG)를 포함한다) 및/또는 세포 반응 예컨대 T 세포 반응의 자극을 포함한다. 면역학적 활성 화합물은 항 바이러스 및 항암 활성을 포함하지만 이에 제한되지 않는 강력한 면역 자극 활성을 보유할 수 있고, 또한 면역 반응을 TH2 면역 반응으로부터 멀리 이동시키는 것과 같은 면역 반응의 다른 측면을 하향 조절할 수 있으며, 이는 광범위한 TH2 매개성 질병 치료에 유용하다.
본 발명에 따르면, 용어 "항원" 또는 "면역원"은 면역 반응을 유도하는 임의의 물질을 포함한다. 특히, "항원"은 항체 또는 T-림프구 (T-세포)와 특이적으로 반응하는 임의의 물질에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 용어 "항원"은 하나 이상의 에피토프를 포함하는 임의의 분자를 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 문맥에서의 항원은 임의로 가공 후, 바람직하게 항원에 특이적인 면역 반응을 유도하는 분자이다. 본 발명에 따르면, 면역 반응의 후보인 임의의 적합한 항원이 사용될 수 있으며, 여기서 면역 반응은 체액성 반응뿐만 아니라 세포성 면역 반응일 수 있다. 본 발명의 실시형태와 관련하여, 항원은 바람직하게는 MHC 분자와 관련하여 세포, 항원에 대한 면역 반응을 일으키는 세포, 바람직하게는 항원 제시 세포에 의해 제시된다. 항원은 바람직하게는 자연 발생 항원에 상응한 것 또는 이로부터 유래된 생성물이다. 그러한 자연 발생 항원은 알러젠, 바이러스, 박테리아, 진균류, 기생충 및 기타 감염 인자 및 병원균을 포함하거나 이로부터 유도될 수 있거나 항원은 또한 종양 항원일 수 있다. 본 발명에 따르면, 항원은 자연 발생 산물, 예를 들면, 바이러스 단백질 또는 그의 일부에 상응할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 항원은 표면 폴리펩티드, 즉 세포, 병원균, 박테리아, 바이러스, 진균류, 기생충, 알러젠 또는 종양의 표면 상에 자연적으로 전시된 폴리펩티드이다. 항원은 세포, 병원균, 박테리아, 바이러스, 균류, 기생충, 알레르기 항원 또는 종양에 대한 면역 반응을 유도할 수 있다.
"질병-관련 항원"이라는 용어는 질병과 관련된 임의의 항원을 지칭하는 가장 광범위한 의미로 사용된다. 질병-관련 항원은 숙주의 면역계를 자극하여 세포 항원-특이적 면역 반응 및/또는 이 질환에 대한 체액성 항체 반응을 일으키는 에피토프를 함유하는 분자이다. 따라서 질병-관련 항원은 치료 목적으로 사용될 수 있다. 질병-관련 항원은 바람직하게는 미생물, 전형적으로 미생물 항원에 의한 감염과 관련되거나, 암, 전형적으로 종양과 관련된다.
"병원균"라는 용어는 유기체, 바람직하게는 척추 유기체에서 질병을 일으킬 수 있는 병원성 생물학적 물질을 의미한다. 병원균에는 박테리아, 단세포성 진핵세포 유기체(원생동물), 진균류와 같은 미생물뿐만 아니라 바이러스가 포함된다.
용어 "에피토프", "항원 펩티드", "항원 에피토프", "면역원성 펩티드" 및 "MHC 결합 펩티드"는 본원에서 상호 호환적으로 사용되며, 항원과 같은 분자 내의 항원 결정기, 즉 특히 MHC 분자와 관련하여 제시되는 경우 면역계에 의해 인식되는, 예를 들어 T 세포에 의해 인식되는 면역학적 활성 화합물의 일부 또는 단편을 의미한다. 단백질의 에피토프는 바람직하게는 상기 단백질의 연속 또는 불연속 부분을 포함하고, 길이가 바람직하게는 5 내지 100개, 바람직하게는 5 내지 50개, 보다 바람직하게는 8 내지 30개, 가장 바람직하게는 10 내지 25개인 아미노산이고, 예를 들면 에피토프는 길이가 바람직하게는 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개인 아미노산일 수 있다. 본 발명에 따른 에피토프는 세포 표면 상의 MHC 분자와 같은 MHC 분자에 결합할 수 있으며, 따라서 "MHC 결합 펩티드" 또는 "항원 펩티드"일 수 있다. 용어 "주요 조직 적합 유전자 복합체" 및 약어 "MHC"는 MHC 클래스 I 및 MHC 클래스 II 분자를 포함하고 모든 척추 동물에 존재하는 유전자의 복합체에 관한 것이다. MHC 단백질 또는 분자는 면역 반응에서 림프구와 항원 제시 세포 또는 질환 세포 사이의 신호전달에 중요하며, 여기서 MHC 단백질 또는 분자는 펩티드를 결합시키고 T 세포 수용체에 의한 인식을 위해 이들을 제시한다. MHC에 의해 코딩된 단백질은 세포 표면에서 발현되고, 자기 항원(세포 자체로부터의 펩티드 단편) 및 비-자기 항원(예를 들어, 침입하는 미생물의 단편) 모두를 T 세포에 제시한다. 그러한 바람직한 면역원성 부분은 MHC 클래스 I 또는 클래스 II 분자에 결합한다. 본원에 사용된 바와 같이, 이러한 결합이 해당 분야에 공지된 임의의 분석을 사용하여 검출 가능한 경우, 면역원 부분은 MHC클래스 I 또는 클래스 II 분자에 "결합"한다고 한다. 용어 "MHC 결합 펩티드"는 MHC 클래스 I 및/또는 MHC 클래스 II 분자에 결합하는 펩티드에 관한 것이다. 클래스 I MHC/펩티드 복합체의 경우, 결합 펩티드는 보다 길거나 보다 짧은 펩티드가 효과적일 수 있지만 일반적으로 8-10개의 아미노산 길이이다. 클래스 II MHC/펩티드 복합체의 경우, 결합 펩티드는 전형적으로 10-25개의 아미노산 길이이고, 특히 13-18개의 아미노산 길이인 반면, 보다 길고 보다 짧은 펩티드가 효과적일 수 있다.
일 실시형태에서, 본 발명에 따른 목적 단백질은 표적 유기체의 백신접종에 적합한 에피토프를 포함한다. 당업자는 면역생물학 및 백신접종의 원리 중 하나가 생물체를 항원으로 면역화함으로써 치료될 질병에 대하여 면역학적으로 적절한 질병에 대한 면역보호반응이 생성된다는 사실에 기초한다는 것을 알 것이다. 본 발명에 따르면, 항원은 자기 항원 및 비자기 항원을 포함하는 군으로부터 선택된다. 비자기 항원은 박테리아 항원, 바이러스 항원, 진균 항원, 알러젠 또는 기생충 항원인 것이 바람직하다. 항원은 표적 유기체에서 면역 반응을 유도할 수 있는 에피토프를 포함하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 에피토프는 박테리아, 바이러스, 곰팡이, 기생충, 알러젠 또는 종양에 대한 면역 반응을 유도할 수 있다.
일부 실시형태에서, 비자기 항원은 박테리아 항원이다. 일부 실시형태에서, 항원은 조류, 어류 및 가축을 비롯한 포유류를 포함한 동물을 감염시키는 박테리아에 대한 면역 반응을 유도한다. 바람직하게는, 면역 반응을 유발시키는 박테리아는 병원성 박테리아이다.
일부 실시형태에서, 비자기 항원은 바이러스 항원이다. 바이러스 항원은 예를 들어 바이러스 표면 단백질로부터의 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드, 예를 들어 막-결합 당단백질, 캡시드 단백질 또는 폴리펩티드 또는 스파이크 단백질 또는 폴리펩티드일 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원은 조류, 어류 및 가축을 비롯한 포유류를 포함한 동물을 감염시키는 바이러스에 대한 면역 반응을 유도한다. 바람직하게는, 면역 반응을 유발시키는 바이러스는 병원성 바이러스이다.
일부 실시형태에서, 비자기 항원은 진균류의 폴리펩티드 또는 단백질이다. 일부 실시형태에서, 항원은 조류, 어류 및 가축을 비롯한 포유류를 포함한 동물을 감염시키는 진균류에 대한 면역 반응을 유도한다. 바람직하게는, 면역 반응을 유발시키는 진균류는 병원성 진균류이다.
일부 실시형태에서, 비자기 항원은 단세포성 진핵세포 기생충의 폴리펩티드 또는 단백질이다. 일부 실시형태에서, 항원은 단세포성 진핵세포 기생충, 바람직하게는 병원성 단세포성 진핵세포 기생충에 대한 면역 반응을 유도한다. 병원성 단세포성 진핵세포 기생충은 예를 들어, Plasmodium 속, 예를 들어 P. falciparum, P. vivax, P. malariae 또는 P. ovale, Leishmania 속, 또는 Trypanosoma 속, 예를 들어 T. cruzi 또는 T. brucei에 속하는 것일 수 있다.
일부 실시형태에서, 비자기 항원은 알러젠성 폴리펩티드 또는 알러젠성 단백질이다. 알러젠성 단백질 또는 알러젠성 폴리펩티드는 알러젠 면역요법, 또한 탈감작요법에 적합한 것이다.
일부 실시형태에서 항원은 자기 항원, 특히 종양 항원이다. 종양 항원 및 그 결정기는 당업자에게 공지되어 있는 것이다.
본 발명의 문맥 상에서, 용어 "종양 항원" 또는 "종양-관련 항원"은 제한된 수의 조직 및/또는 기관에서 또는 특정 발달 단계에서 특이적으로 발현되는 정상 조건 하에 있는 단백질에 관한 것이고, 예를 들어, 상기 종양 항원은 위 조직, 바람직하게는 위 점막, 생식 기관, 예를 들어 고환, 영양막 조직, 예를 들어 태반 또는 생식선 세포에서 특이적으로 발현되는 정상 조건 하에 있는 단백질일 수 있고, 하나 이상의 종양 또는 암 조직에서 발현되거나 비정상적으로 발현되는 단백질에 관한 것이다. 이러한 맥락에서 "제한된 수"는 바람직하게는 3 이하, 보다 바람직하게는 2 이하를 의미한다. 본 발명의 문맥에서 종양 항원은 예를 들어 분화 항원, 바람직하게는 세포 유형 특이성 분화 항원, 즉 특정 분화 단계에서 특정 세포 유형으로 특이적으로 발현되는 정상 상태 하의 단백질, 암/고환 항원, 즉 정소 및 때로경우에 따라 태반에서 특이적으로 발현되는 정상 상태 하의 단백질, 및 생식선 특정 항원을 포함한다. 본 발명과 관련하여, 종양 항원은 바람직하게는 암세포의 세포 표면과 결합하고, 바람직하게는 정상 조직에서는 거의 또는 거의 발현되지 않는다. 바람직하게는, 종양 항원 또는 종양 항원의 이상 발현은 암세포를 확인한다. 본 발명과 관련하여, 대상체, 예를 들어, 암 질환을 앓고 있는 환자에서 암세포에 의해 발현되는 종양 항원은 바람직하게는 상기 대상체에서의 자가-단백질이다. 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 문맥에서의 종양 항원은 비필수적인 조직 또는 기관, 즉, 면역계에 의해 손상될 때 대상체의 죽음을 초래하지 않는 조직 또는 기관, 또는 면역계에 의해 거의 또는 전혀 접근 할 수 없는 신체의 장기 또는 구조에서 정상 조건 하에서 특이적으로 발현된다. 바람직하게는, 종양 항원의 아미노산 서열은 정상 조직에서 발현되는 종양 항원과 암 조직에서 발현되는 종양 항원 간에 동일하다.
본 발명에서 유용한 종양 항원의 예로서는 p53, ART-4, BAGE, 베타-카테닌/m, Bcr-abL CAMEL, 캡-1, CASP-8, CDC27/m, CDK4/m, CEA, 클라우딘 계열의 세포표면 단백질, 예컨대 CLAUDIN-6, CLAUDIN-18.2 및 CLAUDIN-12, c-MYC, CT, Cyp-B, DAM, ELF2M, ETV6-AML1, G250, GAGE, GnT-V, Gap100, HAGE, HER-2/neu, HPV-E7, HPV-E6, HAST-2, hTERT (또는 hTRT), LAGE, LDLR/FUT, MAGE-A, 바람직하게는 MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE-A7, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-A11, 또는 MAGE-A12, MAGE-B, MAGE-C, MART-1/Melan-A, MC1R, Myosin/m, MUC1, MUM-1, -2, -3, NA88-A, NF1, NY-ESO-1, NY-BR-1, p190 마이너 BCR-abL, Pm1/RARa, PRAME, 프로테이나제 3, PSA, PSM, RAGE, RU1 또는 RU2, SAGE, SART-1 또는 SART-3, SCGB3A2, SCP1, SCP2, SCP3, SSX, SURVIVIN, TEL/AML1, TPI/m, TRP-1, TRP-2, TRP-2/INT2, TPTE 및 WT를 들 수 있다. 특히 바람직한 종양 항원은 CLAUDIN-18.2 (CLDN18.2) 및 CLAUDIN-6 (CLDN6)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 약학적 활성 펩티드 또는 단백질이 면역 반응을 유도하는 항원일 필요는 없다. 적절한 약학적 활성 단백질 또는 펩티드는 사이토카인 및 면역계 활성 화합물 (예컨대 인터루킨, 콜로니 자극 인자(CSF), 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF), 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 에리스로포이에틴, 종양괴사인자(TNF), 인터페론, 인테그린, 주소단백질(addressins), 셀레틴(seletin), 귀소수용체, T 세포 수용체, 면역글로불린), 호르몬 (인슐린, 갑상선 호르몬, 카테콜라민, 생식선 자극 호르몬, 영양 호르몬(trophic hormones), 프로락틴, 옥시토신, 도파민, 소 소마토트로핀(bovine somatotropin), 및 렙틴 등), 성장 호르몬 (예컨대 인간 성장 호르몬), 성장 인자 (예컨대 표피생장인자, 신경성장인자, 및 인슐린-유사 성장인자 등), 성장 인자 수용체, 효소 (조직플라스미노겐활성제, 스트렙토키나제, 콜레스테롤 생합성 또는 분해성, 스테로이드 생성 효소, 키나아제, 포스포디에스테라아제, 메틸화효소, 디메틸화효소, 탈수소효소, 셀룰라아제, 프로테아제, 리파아제, 포스포리파제, 아로마타제, 시토크롬, 아데닐레이트 또는 구아닐고리화효소 및 뉴라미데이즈 등), 수용체 (스테로이드 호르몬 수용체, 펩티드 수용체), 결합 단백질 (성장 호르몬 또는 성장 인자 결합 단백질 등), 전사 및 번역 인자, 종양 성장 억제 단백질 (예를 들어, 혈관생성을 억제하는 단백질), 구조 단백질 (예컨대 콜라겐, 피브로인, 피브리노겐, 엘라스틴, 튜불린, 액틴 및 미오신), 혈액 단백질 (트롬빈, 혈청 알부민, 인자 VII, 인자 VIII, 인슐린, 인자 IX, 인자 X, 조직플라스미노겐활성제, 단백질 C, 폰빌레브란트 인자(von Wilebrand factor), 항트롬빈 III, 글루코세레브로시다아제, 콜로니 자극 인자 (GCSF) 또는 변형된 인자 VIII, 항응고제 등)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 일 실시형태에서, 본 발명에 따른 약학적 활성 단백질은 림프 항상성의 조절에 관여하는 사이토카인이고, 바람직하게는 T 세포의 발달, 초회항원자극(priming), 팽창, 분화 및/또는 생존에 관여하고 바람직하게는 이를 유도 및/또는 증가시키는 사이토카인이다. 일 실시형태에서, 사이토카인은 인터루킨, 예를 들어 IL-2, IL-7, IL-12, IL-15, 또는 IL-21이다.
오픈 리딩 프레임에 의해 코딩된 적합한 추가 단백질은 인터페론 (IFN) 신호전달의 억제제이다. 발현을 위해 RNA가 도입된 세포의 생존력이 감소될 수 있다고 보고되고 있지만, 특히 세포가 RNA로 수회 형질주입된 경우, IFN 억제제는 RNA가 존재해야 하는 세포의 생존력을 향상시키는 것으로 밝혀졌다(WO 2014/071963 A1). 바람직하게는, 억제제는 IFN 타입 I 신호전달의 억제제이다. 세포외 IFN에 의한 IFN 수용체의 결합을 방지하고 세포에서 세포내 IFN 신호전달을 억제함으로써 세포 내 RNA의 안정한 발현을 가능하게 한다. 또한, 세포외 IFN에 의한 IFN 수용체의 결합을 방지하고 세포내 IFN 신호전달을 억제함으로써, 특히 세포를 반복적으로 RNA로 형질주입시키는 경우, 세포의 생존은 향상된다. 이론에 결부되기를 바라는 것 없이, 세포내 IFN 신호전달이 번역 및/또는 RNA 분해의 억제를 초래할 수 있다고 생각된다. 이것은 하나 이상의 IFN-유도성 항바이러스 활성 이펙터 단백질을 억제함으로써 해결될 수 있다. IFN-유도성 항바이러스 활성 이펙터 단백질은 RNA 의존적 단백질 키나아제 (PKR), 2',5'-올리고아데닐레이트 합성효소(OAS) 및 RNaseL로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 세포내 IFN 신호전달을 저해하는 것은 PKR-의존성 경로 및/또는 OAS-의존성 경로를 억제하는 것을 포함할 수 있다. 적합한 목적 단백질은 PKR-의존성 경로 및/또는 OAS-의존성 경로를 억제할 수 있는 단백질이다. PKR-의존성 경로를 억제하는 것은 eIF2-알파 인산화를 억제하는 것을 포함할 수 있다. PKR을 억제하는 것은 세포를 적어도 하나의 PKR 억제제로 처리하는 것을 포함할 수 있다. PKR 억제제는 PKR의 바이러스 억제제일 수 있다. PKR의 바람직한 바이러스 억제제는 종두증 바이러스 E3이다. 펩티드 또는 단백질 (예컨대 E3, K3)이 세포내 IFN 신호전달을 억제하는 것이라면, 펩티드 또는 단백질의 세포내 발현이 바람직하다. 종두증 바이러스 E3는 PKR과 OAS의 활성화를 막기 위해 dsRNA에 결합하고 격리하는 25 kDa dsRNA-결합 단백질 (유전자 E3L에 의해 코딩됨)이다. E3는 PKR에 직접 결합하여 그 활성을 억제하여 eIF2-알파의 인산화를 감소시킨다. IFN 신호전달의 다른 적합한 억제제는 단순포진 바이러스 ICP34.5, 토스카나 바이러스 NSs, Bombyx mori 핵다각체병바이러스 PK2 및 HCV NS34A이다.
일 실시형태에서, 세포내 또는 세포외 IFN 신호전달의 억제제는 레플리콘에 의해 코딩된다. 레플리콘은 전형적으로 CSE 1, CSE 2 및 CSE 4의 알파바이러스 복제효소에 의한 복제를 허용하는 핵산 서열 요소; 바람직하게는 CSE 3을 전형적으로 포함하는 서브게놈 전사체, 즉 서브게놈 프로모터의 생산을 가능하게 하는 핵산 서열 요소를 포함한다. 레플리콘은 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 비폴리펩티드-서열 개질 변형, 예를 들어 캡, 폴리(A) 서열, 코돈 사용의 변형을 추가로 포함할 수 있다. 다수의 오픈 리딩 프레임이 레플리콘 상에 존재하는 경우, 세포내 IFN 신호전달의 억제제는 선택적으로 서브게놈 프로모터의 제어 하에 있는지 없는지 여부에 관계없이 이들 중 어느 하나에 의해 코딩될 수 있다. 바람직한 일 실시형태에서, 세포내 IFN 신호전달의 억제제는 RNA 레플리콘의 가장 상류의 오픈 리딩 프레임에 의해 코딩된다. 세포내 IFN 신호전달의 억제제가 RNA 레플리콘의 가장 상류 오픈 리딩 프레임에 의해 코딩될 때, 세포내 IFN 신호전달 억제제를 코딩하는 유전 정보는 RNA 레플리콘이 숙주세포에 도입된 후 일찍 번역될 것이며, 이어서 얻어진 단백질은 세포내 IFN 신호전달을 억제할 수 있다.
오픈 리딩 프레임에 의해 코딩된 적합한 추가 단백질은 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질이다. "알파바이러스 비구조성 단백질"이란 용어는 알파바이러스 비구조성 단백질의 탄수화물-개질된 형태 (예컨대 글리코실화됨) 및 지질-개질된 형태를 포함하여 각각의 동시- 또는 번역-후 변형된 형태를 포함한다.
일부 실시형태에서, 용어 "알파바이러스 비구조성 단백질"은 알파바이러스 기원의 개별적인 비구조성 단백질 (nsP1, nsP2, nsP3, nsP4) 중 임의의 하나 이상을 지칭하거나, 알파바이러스 유래의 하나를 초과하는 비구조성 단백질의 폴리펩티드 서열을 포함하는 폴리-단백질을 지칭한다. 일부 실시형태에서, "알파바이러스 비구조성 단백질"은 nsP123 및/또는 nsP4를 지칭한다. 다른 실시형태에서, "알파바이러스 비구조성 단백질"은 nsP1234를 지칭한다. 일 실시형태에서, 오픈 리딩 프레임에 의해 코딩된 목적 단백질은 단일의 선택적으로 절단 가능한 폴리-단백질 nsP1234로서 nsP1, nsP2, nsP3 및 nsP4 모두로 이루어진다. 일 실시형태에서, 오픈 리딩 프레임에 의해 코딩된 목적 단백질은 단일의 선택적으로 절단 가능한 폴리-단백질 nsP123으로서 nsP1, nsP2 및 nsP3로 이루어진다. 상기 실시형태에서, nsP4는 추가적인 목적 단백질일 수 있고, 또 추가적인 오픈 리딩 프레임에 의해 코딩될 수 있다.
일부 실시형태에서, 알파바이러스 비구조성 단백질은 예를 들어, 숙주세포에서 복합체 또는 결합체를 형성할 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, "알파바이러스 비구조성 단백질"은 nsP123 (동의어로 P123) 및 nsP4의 복합체 또는 결합체를 지칭한다. 일부 실시형태에서, "알파바이러스 비구조성 단백질"은 nsP1, nsP2 및 nsP3의 복합체 또는 결합체를 의미한다. 일부 실시형태에서, "알파바이러스 비구조성 단백질"은 nsP1, nsP2, nsP3 및 nsP4의 복합체 또는 결합체를 의미한다. 일부 실시형태에서, "알파바이러스 비구조성 단백질"은 nsP1, nsP2, nsP3 및 nsP4로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 복합체 또는 결합체를 의미한다. 일부 실시형태에서, 알파바이러스 비구조성 단백질은 적어도 nsP4를 포함한다.
용어 "복합체" 또는 "결합체"는 공간적으로 근접한 2개 이상의 동일하거나 상이한 단백질 분자를 지칭한다. 복합체의 단백질은 바람직하게는 서로 직접적 또는 간접적인 물리적 또는 물리화학적 접촉을 한다. 복합체 또는 결합체는 다수의 상이한 단백질(헤테로다합체(heteromultimer)) 및/또는 하나의 특정 단백질(호모다합체)의 다수 사본으로 이루어질 수 있다. 알파바이러스 비구조성 단백질과 관련하여, 용어 "복합체 또는 결합체"는 다수의 적어도 2개의 단백질 분자를 의미하며, 그 중 적어도 하나는 알파바이러스 비구조성 단백질이다. 복합체 또는 결합체는 하나의 특정 단백질 (호모다합체)의 다수 사본 및/또는 여러 다른 단백질(헤테로다합체)의 다수 사본으로 구성될 수 있다. 다합체와 관련하여, "다수(multi)"는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 10개 이상과 같은 하나 이상의 것을 의미한다.
"기능성 알파바이러스 비구조성 단백질"이란 용어는 복제효소 기능을 갖는 알파바이러스 비구조성 단백질을 포함한다. 따라서, "기능성 알파바이러스 비구조성 단백질"은 알파바이러스 복제효소를 포함한다. "복제효소 기능"은 RNA 의존성 RNA 중합효소(RdRP), 즉 (+) 가닥 RNA 주형을 기반으로 (-) 가닥 RNA의 합성을 촉매할 수 있고, 및/또는 (-) 가닥 RNA 주형을 기반으로 한 (+) 가닥 RNA의 합성을 촉매할 수 있는 효소를 포함한다. 따라서, "기능성 알파바이러스 비구조성 단백질"이라는 용어는 (+) 가닥 (예컨대 게놈) RNA를 주형으로 사용하여 (-) 가닥 RNA를 합성하는 단백질 또는 복합체, 주형으로서 게놈 RNA의 (-) 가닥 상보체의 단편을 사용하여, 새로운 (+) 가닥 RNA을 합성하는 단백질 또는 복합체, 및/또는 주형으로서 게놈 RNA의 (-) 가닥 상보체의 단편을 사용하여, 서브게놈 전사체를 합성하는 단백질 또는 복합체를 지칭할 수 있다. 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질은 하나 이상의 추가 기능, 예컨대 프로테아제 (자가-절단을 위해), 헬리카제, 말단 아데닐릴 전이효소 (폴리(A) 꼬리 추가를 위해), 메틸전이효소 및 구아닐릴 전이효소 (5'-캡을 핵산에 제공하기 위해), 핵이행부위(nuclear localization sites), 트리포스파타아제를 추가로 가질 수 있다(Gould et al., 2010, Antiviral Res., vol. 87 pp. 111-124; Rupp et al., 2015, J. Gen. Virol., vol. 96, pp. 2483-500).
본 발명에 따르면, 용어 "알파바이러스 복제효소"는 자연 발생 알파바이러스 (자연계에서 발견되는 알파바이러스)로부터의 RNA 의존성 RNA 중합효소 및 알파바이러스의 변이체 또는 유도체, 예컨대 약독 알파바이러스로부터의 RNA 의존성 RNA 중합효소를 포함하는 알파바이러스 RNA 의존성 RNA 중합효소를 지칭한다. 본 발명의 문맥 상에서, 용어 "복제효소" 및 "알파바이러스 복제효소"는 임의의 특정 복제효소가 알파바이러스 복제효소가 아니라고 문맥이 지시하지 않는 한 상호 교환적으로 사용된다.
"복제효소"라는 용어는 알파바이러스-감염된 세포에 의해 발현되거나 알파바이러스 복제효소에 대해 코딩하는 핵산으로 형질주입된 세포에 의해 발현되는 알파 리 바이러스 복제효소의 모든 변이체, 특히 번역 후 변형된 변이체, 입체배좌체, 이소형체, 및 상동체를 포함한다. 또한, 용어 "복제효소"는 재조합 방법에 의해 생성되고 생산될 수 있는 모든 형태의 복제효소를 포함한다. 예를 들어, 실험실에서 복제효소의 검출 및/또는 정제를 용이하게 하는 태그를 포함하는 복제효소, 예를 들어 myc-태그, HA-태그 또는 올리고히스티딘 태그(His-태그)는 재조합 방법에 의해 제조될 수 있다.
선택적으로, 알파바이러스 복제효소는 알파바이러스 보존서열구성 1 (CSE 1) 또는 이의 상보 서열, 보존서열구성 2 (CSE 2) 또는 이의 상보 서열, 보존서열구성 3 (CSE 3) 또는 이의 상보 서열, 보존서열구성 4 (CSE 4) 또는 이의 상보 서열 중 임의의 하나 이상에 결합하는 능력에 의해 추가로 기능적으로 정의된다. 바람직하게는, 복제효소는 CSE 2 [즉, (+) 가닥에] 및/또는 CSE 4 [즉, (+) 가닥에]에 결합할 수 있거나, CSE 1의 상보체에 결합 [즉, (-) 가닥에] 및/또는 CSE 3의 상보체 [즉, (-) 가닥에]에 결합할 수 있다.
복제효소의 기원은 임의의 특정 알파바이러스에만 국한되지 않는다. 바람직한 일 실시형태에서, 알파바이러스 복제효소는 자연-발생 Semliki Forest 바이러스 및 약독 Semliki Forest 바이러스와 같은 Semliki Forest 바이러스의 변이체 또는 유도체를 포함하는, Semliki Forest 바이러스 유래 비구조성 단백질을 포함한다. 또 다른 바람직한 일 실시형태에서, 알파바이러스 복제효소는 자연 발생 Sindbis 바이러스 및 약독 Sindbis 바이러스와 같은 Sindbis 바이러스의 변이체 또는 유도체를 포함하는, Sindbis 바이러스 유래 비구조성 단백질을 포함한다. 또 다른 바람직한 일 실시형태에서, 알파바이러스 복제효소는 자연 발생 VEEV 및 VEEV의 변이체 또는 유도체, 예컨대 약독 VEEV를 포함하는 베네수엘라 마뇌염 바이러스 (VEEV) 유래 비구조성 단백질을 포함한다. 또 다른 바람직한 일 실시형태에서, 알파바이러스 복제효소는 자연 발생 CHIKV 및 약독 CHIKV와 같은 CHIKV의 변이체 또는 유도체를 포함하는, chikungunya 바이러스 (CHIKV) 유래 비구조성 단백질을 포함한다.
복제효소는 둘 이상의 알파바이러스의 비구조성 단백질을 포함할 수도 있다. 따라서, 알파바이러스 비구조성 단백질을 포함하고 복제효소 기능을 갖는 이종 복합체 또는 결합체는 본 발명에 의해 동등하게 포함된다. 예시만을 위해, 복제효소는 제 1 알파바이러스로부터의 하나 이상의 비구조성 단백질 (예컨대 nsP1, nsP2) 및 제 2 알파바이러스로부터의 하나 이상의 비구조성 단백질 (nsP3, nsP4)를 포함할 수 있다. 2개 이상의 상이한 알파바이러스로부터의 비구조성 단백질은 별도의 오픈 리딩 프레임에 의해 코딩될 수 있거나, 폴리-단백질, 예를 들어 nsP1234로서 단일 오픈 리딩 프레임에 의해 코딩될 수 있다.
일부 실시형태에서, 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질은 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질이 발현되는 세포에서 막성(membranous) 복제 복합체 및/또는 액포를 형성할 수 있다.
기능성 알파바이러스 비구조성 단백질, 즉 복제효소 기능을 갖는 알파바이러스 비구조성 단백질이 본 발명에 따른 핵산 분자에 의해 코딩된 경우, 레플리콘의 서브게놈 프로모터가 존재한다면 상기 복제효소와 양립하는 것이 바람직하다. 이러한 맥락에서 양립할 수 있는 것은, 알파바이러스 복제효소가 존재한다면 서브게놈 프로모터를 인식할 수 있다는 것을 의미한다. 일 실시형태에서, 이것은 서브게놈 프로모터가 복제효소를 유도하는 알파바이러스에 대해 고유한 경우, 즉 이들 서열의 자연 기원이 동일한 알파바이러스인 경우에 달성된다. 대안적인 실시형태에서, 알파바이러스 복제효소가 서브게놈 프로모터를 인식할 수 있다면, 서브게놈 프로모터는 알파바이러스 복제효소를 유도한 알파바이러스에 대해 고유하지 않다. 즉, 복제효소는 서브게놈 프로모터와 호환된다(바이러스 간 호환성). 상이한 알파바이러스로부터 유래하는 서브게놈 프로모터 및 복제효소에 관한 바이러스 간 호환성의 예로서는 당업계에 공지되어 있다. 바이러스 간 호환성이 존재하는 한 서브게놈 프로모터와 복제효소의 임의의 조합이 가능한다. RNA와 함께 시험할 복제효소를 인큐베이팅함으로써 본 발명을 수행하는 당업자는 바이러스 간 호환성을 용이하게 시험할 수 있고, 여기서 RNA는 서브게놈 프로모터로부터 RNA 합성에 적합한 조건에서 실험할 서브게놈 프로모터를 갖는다. 서브게놈 전사체가 준비되면, 서브게놈 프로모터와 복제효소는 양립할 수 있는 것으로 결정된다. 바이러스 간 호환성의 다양한 예가 공지되어 있다 (문헌[Strauss & Strauss, Microbiol. Rev., 1994, vol. 58, pp. 491-562]로 확인함).
본 발명에서, 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프레임은 RNA 레플리콘 상에 제공될 수 있거나, 대안적으로, 별도의 핵산 분자, 예를 들어 mRNA 분자로 제공될 수 있다. 별도의 mRNA 분자는 선택적으로 예를 들어, 캡, 5'-UTR, 3'-UTR, 폴리(A) 서열 및/또는 코돈 사용의 변형을 포함한다. 별도의 mRNA 분자는 본원에 기재된 바와 같이 트랜스로 제공될 수 있다.
기능성 알파바이러스 비구조성 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프레임이 RNA 레플리콘 상에 제공되는 경우, 레플리콘은 바람직하게는 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질에 의해 복제될 수 있다. 특히, 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질을 코딩하는 RNA 레플리콘은 레플리콘에 의해 코딩된 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질에 의해 복제될 수 있다. 이 실시형태는 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질을 코딩하는 핵산 분자가 트랜스로 제공되지 않는 경우에 매우 바람직하다. 이 실시형태에서, 레플리콘의 시스-복제를 목표로 한다. 바람직한 일 실시형태에서, RNA 레플리콘은 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프레임뿐만 아니라 목적 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 추가적인 오픈 리딩 프레임을 포함하고, 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질에 의해 복제될 수 있다.
다수의 오픈 리딩 프레임이 레플리콘 상에 존재한다면, 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질은 임의로 서브게놈 프로모터의 제어 하에 있는지 여부에 관계없이, 임의의 하나에 의해 코딩될 수 있고, 바람직하게는 서브게놈 프로모터의 제어 하에 있지 않은 것이다. 바람직한 일 실시형태에서, 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질은 RNA 레플리콘의 가장 상류의 오픈 리딩 프레임에 의해 코딩된다. 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질이 RNA 레플리콘의 가장 상류의 오픈 리딩 프레임에 의해 코딩될 때, 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질을 코딩하는 유전자 정보는 RNA 레플리콘을 숙주세포에 도입한 후 초기에 번역되고, 이어서 얻어진 단백질은 숙주세포에서 복제 및 임의로 서브게놈 전사체의 생산을 유도할 수 있다.
레플리콘에 포함되거나 트랜스로 제공되는 별도의 핵산 분자에 포함되는 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프레임의 존재는, 레플리콘이 복제될 수 있게 하여 결과적으로 임의로 서브게놈 프로모터의 제어 하에서 레플리콘에 의해 코딩된 목적 유전자를 높은 수준으로 발현하게 한다.
RNA 레플리콘은 임의로 서브게놈 프로모터의 제어 하에서 목적 펩티드 또는 목적 단백질을 코딩하는 하나 이상의 유전자의 발현에 적합하다. 다양한 실시형태가 가능하다. 목적 펩티드 또는 목적 단백질을 각각 코딩하는 하나 이상의 오픈 리딩 프레임이 RNA 레플리콘 상에 존재할 수 있다. RNA 레플리콘의 가장 상류의 오픈 리딩 프레임은 "제 1 오픈 리딩 프레임"로 지칭한다. 일부 실시형태에서, "제 1 오픈 리딩 프레임"은 RNA 레플리콘의 유일한 오픈 리딩 프레임이다. 선택적으로, 하나 이상의 또 다른 오픈 리딩 프레임이 제 1 오픈 리딩 프레임의 하류에 존재할 수 있다. 제 1 오픈 리딩 프레임의 하류에 하나 이상의 또 다른 오픈 리딩 프레임은 (5'에서 3')의 순서로 제 1 오픈 리딩 프레임의 하류에 존재하는 "제 2 오픈 리딩 프레임", "제 3 오픈 리딩 프레임" 등으로 지칭할 수 있다. 바람직하게는, 각각의 오픈 리딩 프레임은 ATG (각각의 DNA 분자 내)에 상응하는 개시코돈 (염기 삼중항), 전형적으로는 AUG (RNA 분자 내)를 포함한다.
레플리콘이 3' 복제인식서열을 포함하는 경우, 모든 오픈 리딩 프레임이 3' 복제인식서열의 상류에 위치하는 것이 바람직하다.
하나 이상의 오픈 리딩 프레임을 포함하는 RNA 레플리콘이 숙주세포에 도입될 때, 레플리콘은 제 1 오픈 리딩 프레임의 번역을 위한 주형으로 직접 작용할 수 있다. 바람직하게는, 레플리콘은 5'-캡을 포함한다. 이것은 레플리콘으로부터 직접적으로 제 1 오픈 리딩 프레임에 의해 코딩된 유전자의 발현에 도움이 된다.
일부 실시형태에서, 레플리콘의 적어도 하나의 오픈 리딩 프레임은 서브게놈 프로모터의 제어 하에, 바람직하게는 알파바이러스 서브게놈 프로모터의 제어 하에 있다. 알파바이러스 서브게놈 프로모터는 매우 효율적이어서 높은 수준의 이종 유전자 발현에 적합한다. 바람직하게는, 서브게놈 프로모터는 알파바이러스의 서브게놈 전사체에 대한 프로모터이다. 이는 서브게놈 프로모터가 알파바이러스에 고유한 것이고 바람직하게는 상기 알파바이러스에서 하나 이상의 구조 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프레임의 전사를 제어하는 것을 의미한다. 대안적으로, 서브게놈 프로모터는 알파바이러스의 서브게놈 프로모터의 변이체이고; 숙주세포에서 서브게놈 RNA 전사를 위한 프로모터로서 기능하는 임의의 변이체가 적합하다. 레플리콘이 서브게놈 프로모터를 포함하는 경우, 레플리콘은 보존서열구성 3 (CSE 3) 또는 이의 변이체를 포함하는 것이 바람직하다.
바람직하게는, 서브게놈 프로모터의 제어 하에 있는 적어도 하나의 오픈 리딩 프레임은 서브게놈 프로모터의 하류에 위치하고 있다. 바람직하게는, 서브게놈 프로모터는 오픈 리딩 프레임의 전사체를 포함하는 서브게놈 RNA의 생산을 제어한다.
일부 실시형태에서, 제 1 오픈 리딩 프레임은 서브게놈 프로모터의 제어 하에 있다. 제 1 오픈 리딩 프레임이 서브게놈 프로모터의 제어 하에 있을 때, 그 위치는 알파바이러스의 게놈에서 구조 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프레임의 위치와 유사하다. 제 1 오픈 리딩 프레임이 서브게놈 프로모터의 제어 하에 있을 때, 제 1 오픈 리딩 프레임에 의해 코딩된 유전자는 레플리콘뿐만 아니라 이의 서브게놈 전사체로부터 발현될 수 있는 것이 바람직하다 (후자는 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질의 존재할 때임). 각각 서브게놈 프로모터의 제어 하에서 하나 이상의 또 다른 오픈 리딩 프레임이 서브게놈 프로모터의 제어 하에 있는 제 1 오픈 리딩 프레임의 하류에 존재할 수 있다. 하나 이상의 또 다른 오픈 리딩 프레임, 예를 들어 제 2 오픈 리딩 프레임에 의해 코딩된 유전자는, 각각 서브게놈 프로모터의 제어 하에서 하나 이상의 서브게놈 전사체로부터 번역될 수 있다. 예를 들어, RNA 레플리콘은 제 2 목적 단백질을 코딩하는 전사체의 생성을 제어하는 서브게놈 프로모터를 포함할 수 있다.
다른 실시형태에서, 제 1 오픈 리딩 프레임은 서브게놈 프로모터의 제어 하에 있지 않다. 제 1 오픈 리딩 프레임이 서브게놈 프로모터의 제어 하에 있지 않을 때, 제 1 오픈 리딩 프레임에 의해 코딩된 유전자는 레플리콘으로부터 발현될 수 있다. 각각 서브게놈 프로모터의 제어 하에서 하나 이상의 또 다른 오픈 리딩 프레임이 제 1 오픈 리딩 프레임의 하류에 존재할 수 있다. 하나 이상의 또 다른 오픈 리딩 프레임에 의해 코딩된 유전자는 서브게놈 전사체로부터 발현될 수 있다.
본 발명에 따른 레플리콘을 포함하는 세포에서, 레플리콘은 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질에 의해 증폭될 수 있다. 또한, 레플리콘이 서브게놈 프로모터의 제어 하에 하나 이상의 오픈 리딩 프레임을 포함하는 경우, 하나 이상의 서브게놈 전사체는 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질에 의해 제조될 것으로 기대된다. 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질은 트랜스로 제공되거나, 레플리콘의 오픈 리딩 프레임에 의해 코딩될 수 있다.
레플리콘이 목적 단백질을 코딩하는 두개 이상의 오픈 리딩 프레임을 포함하는 경우, 각각의 오픈 리딩 프레임이 상이한 단백질, 예를 들어 다른 약학적 활성 펩티드 또는 단백질을 코딩하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 제 2 오픈 리딩 프레임에 의해 코딩된 단백질은 제 1 오픈 리딩 프레임에 의해 코딩된 단백질과 상이하다.
일부 실시형태에서, 제 1 및/또는 또 다른 오픈 리딩 프레임, 바람직하게는 제 1 오픈 리딩 프레임에 의해 코딩된 목적 단백질은, 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질 또는 IFN 신호전달의 억제제, 예를 들어 E3이다. 일부 실시형태에서, 제 1 및/또는 또 다른 오픈 리딩 프레임, 예를 들어 제 2 오픈 리딩 프레임에 의해 코딩된 목적 단백질은, 약학적 활성 펩티드 또는 단백질, 또는 리포터 단백질이다.
일 실시형태에서, 제 1 오픈 리딩 프레임에 의해 코딩된 목적 단백질은 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질이다. 이 실시형태에서, 레플리콘은 바람직하게는 5'-캡을 포함한다. 특히, 제 1 오픈 리딩 프레임에 의해 코딩된 목적 단백질이 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질이고, 바람직하게는 레플리콘이 5'-캡을 포함하는 경우, 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질을 코딩하는 핵산 서열은 레플리콘으로부터 효율적으로 번역될 수 있고, 이어서 얻어진 단백질은 레플리콘의 복제를 유도하고 서브게놈 전사체(들)의 합성을 유도할 수 있다. 이 실시형태는 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질을 코딩하는 추가적인 핵산 분자가 사용되지 않거나 레플리콘과 함께 존재하지 않을 때 바람직할 수 있다. 이 실시형태에서, 레플리콘의 시스-복제를 목표로 한다.
본원에 기재된 조성물은 본원에 기재된 것과 같은 질병, 예를 들어 투여된 RNA에 의해 코딩되는 항원과 관련된 질환을 치료하기 위해 투여될 수 있다.
용어 "질병"은 개체의 신체에 영향을 미치는 비정상적인 상태를 지칭한다. 질병은 종종 특정 증상 및 징후와 관련된 건강 상태로 해석된다. 질병은 감염성 질환과 같은 외부 원인에 기인한 인자에 의해 야기 될 수 있거나, 또는 자가면역 질환과 같은 내적 기능 장애에 의해 유발될 수 있다. 인간의 경우, "질병"은 통증, 기능 장애, 고통, 사회적 문제, 또는 고통 받는 개체에게 죽음을 초래하거나 개체과 접촉하는 사람들에게 유사한 문제를 초래하는 임의의 상태를 지칭하기 위해 더 광범위하게 사용된다. 이보다 넓은 의미에서 때로는 상해, 신체적 장애, 정신적 장애, 증후군, 감염, 고립된 증상, 비정상적인 행동, 구조와 기능의 비정형 변화를 포함하지만, 다른 맥락 또는 다른 목적을 위해 구별 가능한 범주로 간주될 수 있다. 질병은 대개 신체적으로뿐만 아니라 감정적으로도 개인에게 영향을 미치며, 많은 질병에 걸리고 질병과 삶을 사는 것은 삶에 대한 자신의 견해와 개인의 성격을 바꿀 수 있다.
"항원과 관련된 질병" 또는 "항원을 포함하는 질병"이란 용어는 항원과 관련된 임의의 질병, 예를 들어 항원의 존재를 특징으로 하는 질병을 의미한다. 항원과 관련된 질병은 감염성 질환, 자가면역 질환, 또는 암 질환 또는 단순히 암일 수 있다. 상기한 바와 같이, 항원은 질병-관련 항원, 예컨대 종양-관련 항원, 바이러스 항원, 또는 박테리아 항원일 수 있다.
"감염성 질환"이란 용어는 개체에서 개체로 또는 유기체에서 유기체로 전염될 수 있고 미생물 제제 (예를 들어 일반적인 감기)에 의해 유발되는 모든 질병을 지칭한다. 감염성 질환은 당 업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 바이러스 질환, 박테리아 질환 또는 기생병을 포함하며, 이들 질병은 각각 바이러스, 박테리아 및 기생충에 의해 유발된다. 이와 관련하여 감염성 질환은 예를 들어 간염, 성 전염성 질환 (예를 들어 클라미디아 또는 임질), 결핵, HIV/후천성 면역결핍 증후군 (AIDS), 디프테리아, B형 간염, C형 간염, 콜레라, 중증 급성 호흡기 증후군 (SARS), 조류 독감, 인플루엔자, 구제역과 같은 동물 질병, 가성우역(Peste de petits ruminants), 돼지번식 호흡장애 증후군, 바이러스 또는 기생충 질환 예컨대 샤가스병, 말라이아 및 기타 등등일 수 있다.
"자가면역 질환"이란 용어는 신체가 자체 조직의 일부 성분에 대해 면역원성 (즉, 면역계) 반응을 생성하는 임의의 질병을 의미한다. 즉, 면역계는 신체 내의 일부 조직이나 시스템을 자기 및 표적으로 인식하는 능력을 상실하고 마치 외래인 것처럼 공격한다. 자가면역 질환은 주로 한 가지 기관에 발생된 질환 (예를 들어 용혈성 빈혈 및 항-면역성 갑상선염)인 경우 및 자가면역 질환 과정이 많은 조직 (예를 들어 전신성 홍반 루푸스)을 통해 확산되는 경우로 분류할 수 있다. 예를 들어, 다발성 경화증은 T 세포가 뇌와 척수의 신경 섬유를 둘러싸고 있는 덮개를 공격함으로써 생기는 것으로 생각된다. 이로 인해 수족협조기능의 상실, 약화 및 흐린 시력이 야기된다. 자가면역 질환은 당 업계에 공지되어 있는 것이며, 예를 들어 하시모토병, 그레이브스병, 루푸스, 다양한 경화증, 류마티스성 관절염, 용혈성 빈혈, 항-면역성 갑상선염, 전신성 홍반성 루푸스, 셀리악병, 크론병, 대장염, 당뇨병, 피부경화증, 건선 등의 여러 질병을 포함한다.
용어 "암질환" 또는 "암"은 전형적으로 조절되지 않은 세포 성장인 것을 특징으로 하는 개체의 생리 조건을 지칭하거나 설명한다. 암의 예로서는 암종, 림프종, 모세포종, 육종 및 백혈병을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 더욱 상세하게는, 이러한 암의 예로서는 골암, 혈액암, 폐암, 간암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부(cutaneous) 또는 안구내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문부암, 위암, 결장암, 유방암, 전립선암, 자궁암, 성기 및 생식 기관의 암종, 호지킨병, 식도암, 소장암, 내분비계 암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 방광암, 신장암, 신장세포암종, 신우암, 중추신경 종양(CNS), 신경외배엽 암, 척추 축 종양, 신경교종, 뇌수막종 및 뇌하수체 선종이다. 본 발명에 따른 용어 "암"은 또한 암 전이를 포함한다.
용어 "면역 반응"은 예컨대 박테리아 또는 바이러스, 세포 또는 물질과 같은 면역원성 유기체에 대한 면역계의 반응에 관한 것이다. 용어 "면역 반응"은 선천 면역 반응 및 적응 면역 반응을 포함한다. 바람직하게는, 면역 반응은 면역 세포의 활성화, 사이토카인 생합성 및/또는 항체 생산의 유도와 관련이 있다.
본 발명의 조성물에 의해 유도된 면역 반응은 수지상 세포 및/또는 대식세포와 같은 항원 제시 세포의 활성화 단계, 상기 항원 제시 세포에 의한 항원 또는 이의 단편의 제시 및 이 제시로 인한 세포독성 T 세포의 활성화 단계를 포함하는 것이 바람직하다.
용어 "면역 세포"는 개체의 신체를 방어하는 면역계의 세포를 의미한다. "면역 세포"라는 용어는 면역 세포 및 그 전구체의 특정 유형을 포함하며, 백혈구 예컨대 대식세포, 단핵구(대식세포의 전구체), 과립구, 예컨대 호중구, 호산구 및 호염구, 수지상 세포, 비만세포 및 림프구, 예컨대 B 세포, T 세포 및 자연 살해 (NK)를 포함한다. 대식세포, 단핵구 (대식세포의 전구체), 호중구, 수지상 세포 및 비만세포는 식세포이다.
용어 "면역요법"은 면역 반응을 유도, 증진 또는 억제함으로써 질환 또는 상태의 치료에 관한 것이다. 면역 반응을 유도하거나 증폭하기 위해 고안된 면역요법은 활성화 면역요법으로 분류되는 반면, 면역 반응을 감소시키거나 억제하는 면역요법은 억제 면역요법으로 분류된다. "면역요법"은 항원 면역법 또는 항원 백신접종, 종양 면역법 또는 종양 백신접종을 포함한다. 또한 용어 "면역요법"은 류마티스성 관절염, 알레르기, 당뇨병 또는 다발성 경화증과 같은 자가면역 질환의 상황에서 부적절한 면역 반응이 보다 적절한 것으로 조정되도록 면역 반응의 조작과 관련이 있다.
용어 "면역화" 또는 "백신접종"은 예를 들어 치료적 또는 예방적 이유로 면역 반응을 유도할 목적으로 개체에게 항원을 투여하는 과정을 의미한다.
용어 "치료적 처치" 또는 단순히 "치료"는 건강 상태를 향상시키는 임의의 처치 및/또는 개체의 수명을 연장(증가)시키는 임의의 처치에 관한 것이다. 상기 치료는 개체에서의 질병을 제거하는 것, 개체에서의 질병의 발달을 막거나 저감시키는 것, 개체에서의 질병의 발달을 억제 또는 지연시키는 것, 개체에서의 증상의 빈도 또는 중증도를 감소시키는 것, 및/또는 현재 질병에 걸린 개체 또는 이전에 질병에 걸린 적이 있는 개체에서의 재발생을 감소시킬 수 있다.
용어 "예방적 치료" 또는 "방지적 치료"는 개체에서 발생하는 질병을 예방하려고 의도한 임의의 치료에 관한 것이다. 용어 "예방적 치료" 또는 "방지적 치료"는 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
용어 "보호하다", "예방하다", "예방적", "방지적", 또는 "방어적"은 개체에서 질병, 예를 들어 종양의 발생 및/또는 전파의 예방 또는 치료에 관한 것이다. 예를 들어, 면역요법의 예방적 투여는, 예를 들어 본 발명의 조성물을 투여함으로써, 수여 개체를 종양의 발생으로부터 보호할 수 있다. 예를 들어, 예를 들어 본 발명의 조성물을 투여함으로써 면역요법의 치료적 투여는 질환의 진행을 막을 수 있으며, 예를 들어 종양의 진행/성장의 억제를 유도할 수 있다. 이는 종양의 진행/성장의 감속, 특히 종양의 진행의 붕괴를 포함하며, 바람직하게 종양의 제거로 이끈다. 면역요법의 치료적 투여는 예를 들어 현존하는 종양의 파종 또는 전이로부터 개체를 보호할 수 있다.
"개체" 및 "대상체"라는 용어는 척추동물, 특히 포유류와 관련이 있다. 예를 들어, 본 발명의 맥락에서 포유류는 인간, 비인간 영장류, 가축 포유류, 예컨대 개, 고양이, 양, 소, 염소, 돼지, 말 등, 실험용 동물, 예컨대 마우스, 랫, 토끼, 기니아 피그 등뿐만 아니라, 감금된 동물, 예컨대 동물원의 동물이다. "대상체"라는 용어는 또한 조류 (특히 닭, 오리, 거위, 칠면조와 같은 가축화된 조류)와 같은 비포유류 척추동물 및 어류 (특히 연어나 메기와 같은 양식 어류)와 관련이 있다. 또한, 본원에서 사용된 용어 바와 같이 용어 "동물"은 인간도 포함한다.
본원에 기재된 폴리플렉스 입자와 같은 제제는 임의의 적절한 약학 조성물의 형태로 투여될 수 있다. 용어 "약학 조성물"은 바람직하게는 완충제, 방부제 및 장성 변형제(tonicity modifier)와 같은 약제학적 부형제와 함께 치료적으로 효과적인 제제 또는 이의 염을 포함하는 제형에 관한 것이다. 상기 약학 조성물은 개체에 상기 약학 조성물을 투여함으로써 질환 또는 장애의 중증도를 치료, 예방 또는 감소시키는데 유용하다. 약학 조성물은 또한 약제학적 제형으로서 당 업계에 공지되어 있는 것이다. 약학 조성물은 국소적으로 또는 전신적으로 투여될 수 있다. 본 발명의 문맥상, 약학 조성물은 본원에 기재된 입자를 포함한다.
용어 "전신 투여"는 제제가 유의한 양으로 개체의 신체 내에서 광범위하게 분포되어 생물학적 효과를 발현하도록 하는 치료적으로 유효한 제제의 투여를 지칭한다. 본 발명에 따르면, 투여는 비경구 투여에 의한 것이 바람직하다.
용어 "비경구 투여"는 제제가 장을 통과하지 않도록 치료적으로 유효한 제제의 투여를 의미한다. 용어 "비경구 투여"는 정맥내 투여, 피하 투여, 진피내 투여 또는 동맥내 투여를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
특히 바람직한 일 실시형태에서, 본 발명에 따른 조성물은 골격근과 같은 근육 조직에 투여된다. 따라서, 근육내 투여 예컨대 근육내 주사는 바람직한 투여 경로이다.
투여는 다양한 방법으로 달성될 수 있다. 일 실시형태에서, 본 발명에 따른 조성물은 주사에 의해 투여된다. 바람직한 일 실시형태에서, 주사는 바늘을 통한 것이다. 무바늘 주사는 대안으로 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 적어도 하나의 보조제를 포함할 수 있다. 용어 "보조제"는 개체에게 항원 또는 항원 펩티드와 주합하여 투여되는 경우, 면역 반응을 연장 또는 증강 또는 촉진시키는 화합물에 관한 것이다. 보조제는 항원의 표면의 증가, 신체 내 항원 보유의 연장, 항원 방출의 지연, 대식세포에 대한 항원의 표적화, 항원 흡수의 증가, 항원 가공의 증가, 사이토카인 방출의 자극, 면역 세포 예컨대 B 세포, 대식세포, 수지상 세포, T 세포의 자극 및 활성화 및 면역 세포의 비특이적 활성화를 포함하는 하나 이상의 기작에 의해 이들 생물학적 활성을 발휘한다고 추정된다. 보조제는 오일 에멀젼 (예를 들어, 프로인트 보조제), 무기 화합물 (예컨대 명반), 박테리아 산물(예컨대 보르데텔라 페르투시스 독소), 또는 면역 자극 복합체와 같은 화합물의 이종 그룹을 포함한다. 보조제의 예로서는 사포닌, 불완전 프로인트 보조제, 완전 프로인트 보조제, 토코페롤 또는 명반을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 일반적으로 "약학적 유효량" 및 "제약상 허용 가능한 조제"로 적용된다.
용어 "약학적 유효량"은 목적하는 반응 또는 목적하는 효과를 단독으로 또는 추가 투여량과 함께 달성하는 양을 지칭한다. 특정 질환의 치료의 경우에, 목적하는 반응은 바람직하게는 질환의 경과의 억제에 관한 것이다. 이는 질병의 진행을 늦추고, 특히 질병의 진행을 방해하거나 역전시키는 것을 포함한다. 질병의 치료에서 목적하는 반응은 또한 발병 지연 또는 상기 질병 또는 상기 상태의 발병 예방일 수 있다. 본원에 기재된 조성물의 유효량은 치료될 상태, 질환의 중증도, 연령, 생리적 상태, 사이즈 및 중량을 포함하는 환자의 개인적인 매개변수, 치료 기간, 동반 요법의 유형(존재하는 경우), 특정 투여 경로, 및 유사 인자에 기반하여 좌우될 수 있다. 따라서, 본원에 기재된 조성물의 투여량은 이러한 매개변수의 다양성에 좌우될 수 있다. 환자에서의 반응이 초기 용량으로 불충분한 경우, 보다 많은 용량 (또는 보다 국소화된 상이한 투여 경로에 의해 달성되는 보다 효과적으로 높은 용량)이 사용될 수 있다.
용어 "제약상 허용 가능한"은 약학 조성물의 활성 성분의 작용과 상호 작용하지 않는 물질의 무독성을 지칭한다.
본 발명의 약학 조성물은 염, 완충제, 보존제, 담체 및 선택적으로 다른 치료제를 함유할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 약학 조성물은 하나 이상의 제약상 허용 가능한 담체, 희석제 및/또는 부형제를 포함한다.
용어 "부형제"는 결합제, 윤활제, 증점제, 표면 활성제, 방부제, 유화제, 완충제, 향료 또는 착색제와 같은 활성 성분이 아닌 약학 조성물 내의 모든 물질을 가리키는 것으로 의도된다.
용어 "희석제"는 희석시키는 제제 및/또는 감점제를 의미한다. 또한, 용어 "희석제"는 유체, 액체 또는 고체 현탁액 및/또는 혼합 매질 중 임의의 하나 이상을 포함한다.
용어 "담체"는 인간에 투여하기에 적합한 하나 이상의 상용성 고체 또는 액체 충전제 또는 희석제에 관한 것이다. 용어 "담체"는 활성 성분의 적용을 용이하게하기 위해 활성 성분과 조합된 천연 또는 합성 유기 또는 무기 성분에 관한 것이다. 바람직하게는, 담체 성분은 물 또는 오일과 같은 무균 액체이고, 이는 예컨대 미네랄 오일, 동물석 또는 식물성 오일, 예컨대 땅콩유, 콩기름, 참기름, 해바라기유 등으로부터 유래된 것을 포함한다. 염용액 및 수성 덱스트로스 및 글리세린 용액은 또한 수성 담체 화합물로서 사용될 수 있다.
치료적으로 사용될 제약상 허용 가능한 담체 또는 희석제는 의약학 분야에서 공지된 것이고, 예를 들어 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R Gennaro edit. 1985)]에 기재된 것이다. 적합한 담체의 예로는 탄산 마그네슘, 스테아린산 마그네슘, 활석, 설탕, 락토스, 펙틴, 덱스트린, 전분, 젤라틴, 트라가칸트, 메틸셀룰로스, 나트륨 카르복시메틸셀룰로스, 저융점 왁스, 및 코코아 버터 등을 포함한다. 적합한 희석제의 예로는 에탄올, 글리세롤 및 물을 포함한다.
약학적 담체, 부형제 또는 희석제는 의도된 투여 경로 및 표준 약학적 실무와 관련하여 선택될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 담체(들), 부형제(들) 또는 희석제(들)에 부가하여 임의의 적합한 결합제(들), 윤활제(들), 현탁제(들), 코팅제(들), 및/또는 가용화제(들)로서 포함할 수 있거나 이를 포함할 수 있다. 적합한 결합제의 예로는 전분, 젤라틴, 천연 설탕, 예컨대 글루코스, 무수 락토스, 자유 유동 유당, 베타-락토스, 옥수수 감미료, 천연 및 합성 검, 예컨대 아카시아, 트라가칸트 또는 나트륨 알지네이트, 카르복시메틸셀룰로스 및 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다. 적합한 윤활제의 예로는 나트륨 올레이트, 나트륨 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 벤조에이트, 나트륨 아세테이트, 및 나트륨 클로라이드 등이 포함된다. 방부제, 안정화제, 염료 및 향미제 조차도 약학 조성물에 제공될 수 있다. 방부제의 예로는 나트륨 벤조에이트, 소르브산 및 p-하이드록시 벤조산의 에스테르를 포함한다. 항산화제 및 현탁화제가 또한 사용될 수 있다.
일 실시형태에서, 조성물은 수성 조성물이다. 수성 조성물은 선택적으로 용질, 예를 들어 염을 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 조성물은 동결건조된 조성물의 형태이다. 동결건조된 조성물은 각각의 수성 조성물을 동결건조시킴으로써 얻을 수 있다.
본원에서 제공되는 제제 및 조성물은 단독으로 또는 수술, 방사선 조사, 화학요법 및/또는 골수 이식 (자가, 동계, 동종이계 또는 비관련)과 같은 다른 치료 요법과 조합하여 사용될 수 있다.
본 발명은 하기 도면과 실시예에 의해 예시되고 상세히 설명되며, 이는 단지 설명의 목적으로만 사용되며 한정하려는 것은 아니다. 상세한 설명 및 실시예들로 인해, 본 발명에 마찬가지로 포함되는 추가 실시형태들은 숙련된 기술자에게 이해하기 쉬운 것이다.
실시예
실시예 1: 폴리플렉스의 시험관내 독성
재료 및 방법
생체내-jetPEITM 시약, Cat. # 201-50G는 Polyplus-Transfection(Illkirch, France)에서 구입하였다. 생체내-jetPEITM는 멸균무균수에서 150 mM (질소 잔류물의 농도로 표시됨)으로 제공하였다. JetPEI를 HEPES 10 mM, pH 7.1, 글루코스 5% (HBGx1) 완충액에서 목적하는 농도 (질소 잔류물의 농도로 표시됨)로 희석하였다.
시험관내 세포독성 분석
HEK-293 세포를 웰당 2x104 세포의 농도로 96-웰 플레이트 (평평한 바닥)에 접종하였다. 세포는 37℃ 및 7.5% CO2에서 유지시켰다. 24시간 후, 상등액을 버리고 50 μL의 DMEM 배지 (+10% FCS)로 교체하였다. PEI를 10% FCS가 함유된 RPMI 배지에서 희석시키고 (1:5) 약 15분 동안 미리 인큐베이팅하였다. 그 다음 50 μl의 PEI 용액을 100 μl의 최종 배양액으로 세포에 첨가하였다. 추가 18시간 후, 메뉴얼 지침에 따라 XTT-Assay (XTT Cell Viability Kit # 9095, New England Biolabs GmbH, Frankfurt, Germany)를 수행하였다. PEI 농도의 함수로서의 세포 사멸 데이터는 S자형 방정식을 사용하여 적합하게 맞췄다:
Figure 112019004151803-pct00008
도 1A는 시험관내 HEK-293 세포 상에서 유리형태의 순수한 PEI의 독성을 보여준다. IC50 = 77 μM의 질소 (유리형태). 도 1B는 시험관내 HEK-293 세포 상에서PEI/레플리콘-RNA 폴리플렉스의 독성을 보여준다. IC50 = 542 μM의 질소 (폴리플렉스 제형).
결과 및 결론
유리형태의 PEI는 18 μM 이상의 질소 농도에서 세포 사멸을 유도한다 (도 1A). 독성 문제를 피하기 위해 세포 배지에서 유리형태 PEI의 최종 농도는 상기 제한값 이하이어야 한다.
폴리플렉스는 유리형태 PEI보다 적은 세포 사멸을 유발하지만 이들의 독성도 PEI 농도가 증가된 경우에 증가한다 (도 1B). 폴리플렉스를 추가한 후 세포 사멸은 방정식을 사용하여 계산할 수 있다:
세포 사멸 %=21.13 + 78.59/(1+10^((-0.27-log(농도))*3.13))
N/P 15.8의 폴리플렉스의 경우에 세포 사멸이 52.3%인데 반해, N/P 11.6의 폴리플렉스의 경우 (10 mg/l의 RNA 농도, PEI = 348 μM), 세포 사멸은 36.8%이다.
실시예 2: 폴리플렉스의 안정성 연구
재료 및 방법
실시예 1으로부터의 생체내-jetPEITM 시약을 사용하였다. 루시퍼라아제에 대해 코딩하는 RNA, 구조물 D1-824 레플리콘, ID R076 1는 RNA Biochemistry unit (BioNTech RNA Pharmaceuticals GmbH, Mainz, Germany)에서 제공한 것이었다.
폴리플렉스의 제조
제조 전에, 생체내 jetPEITM 및 설탕 용액을 실온에서 평형화시켰다. 생체내-jetPEITM/RNA 복합체의 제조는 멸균 설탕 용액을 사용하여 층류후드(laminar flow hood)에서 수행하였다 (표 1). 제형 중 설탕의 최종 농도는 5-10% w/v이었다.
모든 제형은 250mg/l의 RNA 농도 및 11.6의 N/P 비율로 제조하였다.
제조 단계는:
1. RNA는 희석 하여 농축된 설탕 완충액 (HBGx2, MBGx2 또는 HBTx2)을 사용하여 희석하여 최종 부피 ½의 용액을 제조하였다. 부드러운 볼텍싱을 적용하였다.
2. 생체내 jetPEITM 시약은 동일한 설탕 완충제 및 멸균수를 사용하여 희석하여 최종 부피 3/5의 용액을 제조하였다. 부드러운 볼텍싱을 적용하였다.
3. 희석된 생체내 jetPEITM으로부터 절반의 부피를 한번에 모든 희석된 RNA에 신속하게 첨가하고 부드럽게 볼텍싱을 적용하였다.
4. 폴리플렉스는 15 내지 20분 동안 실온에서 인큐베이팅하고 나서, 적절한 저장 조건으로 옮겼다.
Figure 112019004151803-pct00009
폴리플렉스의 동결건조
제형은 탁상용 냉동건조기 Epsilon 2-4 LSCplus (Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH, Osterode, Germany)에 넣었다.
시료는 1 ATM에서 -40℃ (~2℃/분)로 동결시켰다. 60-90분이 소요되었다.
-40℃에서 10분 동안 0.2 ATM로 압력을 감소시켰다.
시료를 0.2 ATM 및 -40℃에서 4시간 동안 건조시켰다.
시료를 0.2 ATM에서 -16℃로 2시간 동안 가온하였다(램프).
시료를 -16℃ & 0.2 ATM에서 4시간 동안 건조하도록 유지시켰다.
압력은 -16℃에서 10분 동안 0.01 ATM로 감소시켰다.
시료는 -16℃ & 0.01 ATM에서 4시간 동안 건조하도록 유지시켰다.
시료를 0.01 ATM에서 2시간 20℃로 가온하였다(램프).
시료를 20℃ & 0.01 ATM에서 8시간 동안 건조하도록 유지시켰다.
폴리플렉스로부터 RNA 방출
표 2에 따라 90 μl의 시료가 있는 12개의 시험관을 준비하였다.
Figure 112019004151803-pct00010
NaCl 500 mM 중 헤파린 50 g/l의 10 μL을 각각의 튜브에 첨가하였다. 진탕 속도 300 rpm으로 볼텍싱 기계에서 혼합물을 30℃에서 20분 동안 인큐베이션하였다.
RNA 무결성
방출된 RNA 5 μl를 Bioanalyzer 측정에 사용하였다. RNA를 5 μl의 포름아미드와 혼합하였다. RNA 무결성 정량화는 Agilent 2100 Bioanalyzer 장비로 수행하였다. Agilent RNA 6000 Nano Kit를 실온에서 30분간 평형을 유지시켰다. "나노 겔 매트릭스(Nano Gel Matrix)" 400 μl를 1500g에서 10분간 원심분리하였다. 상등액 65 μL를 잘 볼텍싱된 "나노 염료 농축액(Nano Dye Concentrate)" 1 μL와 혼합하고 15000g에서 10분간 원심분리하여 "겔-염료-믹스(Gel-Dye-Mix)"를 수득하였다. 준비한 시료를 70℃에서 10분간 가열함으로써 변성시키고, "나노 래더(Nano Ladder)"도 같은 온도에서 2분간 가열하였다. 칩은 마킹된 G 위치에 "겔-염료-믹스(Gel-Dye-Mix)" 9 μL를 첨가하고 30초 동안 칩을 가압함으로써 "프라이밍 스테이션(Priming Station)"을 사용하여 항원을 인식시켰다. 그 다음, 9 μL "겔-염료-믹스(Gel-Dye-Mix)"를 다른 두 G 위치에 추가하였다. "마커(Marker)" 7.5 μL를 래더 위치에 첨가하고 모든 시료 위치에 5 μL를 첨가하였다. 변성된 "나노 래더(Nano Ladder)" (1.5 μL)를 래더 위치에 추가한 후, 1 μL의 시료를 12개의 모든 시료 웰에 첨가하였다 (사용하지 않은 웰에 1 μL의 H2O를 첨가함). 칩을 IKA Vortex 장치에 놓고 2000 rpm에서 1분 동안 볼텍싱을 수행하였다. 이 칩을 계측기에서 측정하며, 레플리콘 RNA 피크를 47-57초에 감지하였다. RNA 무결성은 레플리콘 RNA 영역을 선택함으로써 Smear 분석을 사용하여 Expert 2100 소프트웨어에서 계산하였다.
상대 RNA 무결성 %는 다음 식을 사용하여 계산하였다:
Figure 112019004151803-pct00011
시험관내 형질주입 분석
C2C12 세포를 웰당 2x104 세포의 농도로 96-웰 플레이트 (평평한 바닥)에 접종하였다. 세포는 37℃ 및 7.5% CO2에서 유지시켰다. 24시간 후, 상등액을 버리고 50 μL의 DMEM 배지(+10% FCS)로 대체하였다. 폴리플렉스는 10% FCS와 DMEM 배지에서 희석(1:5)시키고 약 15분간 미리 인큐베이팅시켰다. 그런 다음 50 μl의 폴리플렉스 용액을 100 μl의 최종 배양액으로 세포에 첨가하였다. 추가 48시간 후 Bright-GloTM 루시퍼라아제 어세이 Cat.　#E2610, Promega GmbH, Mannheim, Germany)을 메뉴얼 지침에 따라 수행하였다.
상대 발광 %는 다음 식을 사용하여 계산하였다:
Figure 112019004151803-pct00012
도 2는 일주일 보관 후 상이한 보관 조건에서 N/P 11.6에서의 PEI/레플리콘-RNA 폴리플렉스로 인큐베이션한 후 C2C12 근육 세포로부터의 상대 발광율을 나타낸다.
도 3은 2주 보관 후 상이한 보관 조건에서 N/P 11.6에서의 PEI/레플리콘-RNA 폴리플렉스의 상대 RNA 무결성을 나타낸다.
결과 및 결론
폴리플렉스는 액체 상태(4℃ 및 25℃)에서 저장 안정성이 열악하다. 폴리플렉스의 안정성은 액체 상태보다 고체 상태 (동결 또는 동결건조)에서 상당히 우수하다. 고체 상태에서 HBT+EDTA 완충액 중 폴리플렉스의 보관 안정성은 HBGx1 완충액에서의 보관 안정성보다 상당히 우수하다.
HBGx1 중 폴리플렉스에 대하여 액체 상태 장기 보관 안정성이 거의 없지만, HBT+EDTA 중 폴리플렉스에 대하여, 고체 상태 장기 보관 안정성이 가능하다.
레플리콘-RNA를 갖는 폴리플렉스 제형은 트레할로스 5-20% (w/v), EDTA 80 μM-5 mM의 첨가에 의해 안정화될 수 있다.
실시예 3 : 선형 PEI의 Mw 계산에 대한 설명
선형 PEI는 두 단계로 2-에틸-2-옥사졸린으로부터 합성된다: 먼저, 개시제의 존재 하에 2-에틸-2-옥사졸린의 개환 이성질체화 중합에 의해 폴리(2-에틸-2-옥사졸린)을 수득하였다 (도 4). 그 후, PEOX (N-프로피오닐-PEI)를 산-가수분해시켜 N-프로피오닐기를 절단하여 PEI를 수득하였다 (도 5).
50 kDa의 분자량을 갖는 PEOX(N-프로피오닐-PEI)의 완전한 탈아실화는 22 kDa의 분자량을 갖는 선형 PEI를 제공하였다. 중간 산물 (PEOX)의 분자량의 측정은 시차 굴절 검출기(Refractive Index Detector) 또는 다중각 광산란 검출(Multi-angle Light Scattering Detector)로 겔 투과 크로마토그래피에 의해 수행하였다. 전체 기술 세부 사항은 미국 특허 출원 제12/671,312호의 발명자인 Adib, Abdennaji, Fabrice Stock, 및 Patrick Erbacher의 "Method for Manufacturing Linear Polyethylenimine (PEI) for Transfection Purpose and Linear PEI Obtained with Such Method."에 설명되어 있다.
본 발명에 따르면, 40-60 kDa의 MW 범위를 갖는 PEOX로부터 합성된 PEI는, 레플리콘-RNA를 위한 강력한 형질주입 시약이다.
본 발명에 따라 사용하기 위한 PEI는 Polyplus-Transfection SA (Illkirch-Graffenstaden, France): 생체내 JetPEI, Polysciences Europe GmbH (Eppelheim, Germany): PEI MAX 40000, 및 Euromedex (Souffelweyersheim, France): Exgen 500로부터 구입할 수 있다.
실시예 4: 폴리플렉스의 응집 역학
재료 및 방법
폴리플렉스는 실시예 2에서 상술한 바와 같이, HBGx1 중 200 mg/L의 RNA 농도에서 제조하였다. 이들은 HBGx1 및 포스페이트 완충된 식염수 pH 7.4 (PBS)에서 RNA 농도 10 mg/l로 희석하였다. PBS는 용액의 이온강도를 증가시키기 위해 사용하였다. 희석된 폴리플렉스를 플레이트에 첨가하기 전에 여과된 공기로 96 웰 플레이트를 세정하였다. 크기는 WYATT technology GmbH (Dernbach, Germany)의 DynaPro 플레이트 판독기 II 장비로 측정하였다. 누적 피트(cumulant fit)는 단일모드 시료의 크기 계산에 사용되는 반면, 정규화 피트(regularization fit)는 다중모드 시료에 적합한다.
도 6은 증가하는 염 농도에서 JetPEI를 사용한 IVT (A) 및 레플리콘 (B) 폴리플렉스의 응집 역학을 보여준다.
결과 및 결론
높은 이온강도는 폴리플렉스의 크기를 증가시킨다 (도 6). 폴리플렉스 제형의 이온강도는 폴리플렉스의 응집을 방지하기 위해 ≤20 mM이어야 한다.
실시예 5: 여과에 의한 폴리플렉스의 멸균
재료 및 방법
폴리플렉스는 "폴리플렉스의 안정성 연구" 섹션에서 이미 설명한 바와 같이 RNA 농도 100 mg/L 및 N/P 비율 11.5, 13.5 및 15.5에서 제조하였다.
RNA 농도 및 무결성
RNA는 헤파린과 인큐베이션하여 폴리플렉스로부터 방출시켰다. 90 μl의 유리형태 RNA (100 mg/l) 또는 폴리플렉스를 Hepes 10 mM, pH 7.4, EDTA 1 mM 중에서 헤파린 20 g/l의 10 μl와 혼합하였다. 혼합물을 볼텍싱 기계에서 30℃에서 20분 동안 인큐베이팅하였다. 이 혼합물 5 μl를 포름아미드 5 μl와 혼합하였다. 그 다음, RNA 무결성을 피코-칩이 장착된 Bioanalyzer에 의해 측정하였다. RNA 무결성을 실시예 2에서 설명한 바와 같이 계산하였다. RNA 농도는 "Quant-iT RiboGreen RNA Reagent and Kit" (Cat. # R11490, Thermo Fischer Scientific)으로 고감도 방법용 제조자 지침에 따라 Ribogreen 분석법에 의해 측정하였다. 간략하게, 헤파린과 폴리플렉스의 혼합물을 Tris 10 mM, pH 7.5, EDTA 1 mM 완충액 중 Ribogreen 발형광단과 함께 인큐베이팅하였다. Ribogreen의 형광을 여기 파장 485 nm 및 방출 535 nm에서 측정하였다.
PEI 농도
NaAcetate 0.1 M, pH 5.4 (CSS 시약) 100 ml 중 CuSO4 23 mg (무수) 용액을 준비하였다. CSS 시약 600 μl를 폴리플렉스와 혼합하고 주위 온도에서 5분 동안 인큐베이팅하였다. 각 용액의 흡수는 1 cm 큐벳을 사용하여 블랭크에 대해 UV 분광광도계에서 285 nm에서 측정하였다. 알려진 PEI 농도 (0-1.55 mM)를 갖는 검량선을 작성하고 미지 시료의 PEI 농도를 계산하는 데 사용하였다. 유리형태 RNA의 백그라운드 흡수값을 모든 시료로부터 뺐다.
전기영동 이동도 (μ)의 측정
폴리플렉스는 HBGx1 3.1 ml에서 RNA 농도 20 mg/l로 희석하였다. 그 다음, 이들을 600 g에서 2분간 원심분리하였다. 3개의 시료 1.05 ml를 플라스틱 큐벳에 각각의 제형에 대해 준비하였다. 폴리플렉스의 전기영동 이동도는 ζ-Wallis 장비 (Corduan technologies, France)로 레이저 도플러 전기영동(laser dopler electrophoresis)에 의해 측정하였다. 각 시료에 대해 10개 런닝 서열 중 1개 서열에 대해 중분해능 측정 (medium resolution measurement)을 사용하였다. 노이즈 비율에 대해 낮은 신호, 또는 극단적인 μ(>3 또는 <-3 μm*cm/V*S)인 측정은 최종 분석에서 제외시켰다. 모든 제형은 3회 측정하였다.
폴리플렉스의 여과
3개의 다른 N/P 비율에서 2.68 ml의 폴리플렉스를 갖는 3 개의 튜브를 준비하였다. 폴리플렉스 (1.34 ml)는 220 nm (Cat. # SLMPL25SS, Merck Millipore)의 공극을 갖는 무균 Millex-GP Med Syringe Filter Units을 통해 여과시켰다. 여과 전후에 물리화학적 성질을 측정하였다.
도 7은 여과 전(미여과된) 및 여과 후(여가된) 폴리플렉스의 물리화학적 파라미터를 나타낸다. 도 7의 A 및 B: 헤파린에 의해 폴리플렉스로부터 RNA를 방출시켰다. 그런 다음, 레플리콘-RNA 무결성 (A)을 bioanalyzer 장비로 모세관 전기영동법으로 측정하였다. 레플리콘-RNA 농도 (B)는 Ribogreen 형광에 의해 측정하였다. 도 7의 C: PEI 농도를 CuSO4 분석에 의해 측정하였다. 도 7의 D: 전기영동 이동도 (μ)는 레이저 도플러 전기영동에 의해 측정하였다.
결과 및 결론
실린지 필터 유닛(Syringe Filter Units)은 폴리플렉스의 멸균에 적합한 방법이다. 폴리플렉스는 여과로 멸균하기 위해 <120 nm보다 작아야 한다. N/P 비율 11.6에서, 폴리플렉스의 물리화학적 성질은 여과에 의해 변하지 않는다.
N/P 비율이 11.6 이상으로 증가하면 여과하는 동안 RNA가 손실된다.
실시예 6: 레플리콘-RNA/PEI 제형의 형질주입에 대한 PEI 순도의 영향
재료 및 방법
다음 고순도 PEI는 Polyplus-Transfection SA (Illkirch-Graffenstaden, France): 생체내 JetPEI 및 Polysciences Europe GmbH (Eppelheim, Germany): PEI MAX 40000에서 구입하였다.
다음의 보통-순도 PEI는 Polysciences Europe GmbH (Eppelheim, Germany): PEI 25000에서 구입하였다.
폴리플렉스는 실시예 2에서 상술된 바와 같이 HBGx1 중 100 mg/L의 RNA 농도에서 제조하였다.
생체내 형질주입
마우스를 이소플루레인으로 마취시키고 뒷다리의 후 측부를 면도하고 70% EtOH-용액으로 소독시켰다. 20 μL의 측정된 제형을 크기가 30G인 캐뉼라가 미리 장착된 인슐린-주사기로 후경골근 내에 주사하였다. 고통, 통증 및 고충의 징후에 대한 의식을 되찾을 때까지 마우스를 관찰하였다.
측정 당일에, 마우스에게 루시페린-용액을 복강주사로 주입하였다. 이어서, 마우스를 이소플루레인으로 마취시키고, 개별 마취 마스크를 통해 이소플루레인/산소를 일정하게 공급하는 IVIS® Spectrum (Perkin Elmer) 촬상 챔버 내에 가온 매트 (37℃) 상에 두었다. 루시페린 주입 5분 후, 카메라를 통해 1분 동안 생체 발광을 검출하였다. 결과 이미지는 소프트웨어 "LivingImage" (Perkin Elmer)를 사용하여 분석하였다.
도 8은 고순도 PEI 및 보통 순도 PEI의 화학 구조를 비교한 것이다. 25 kDa의 PEI에 대해 n=58이다. PEI 25 kD에서 -CH2CH2NH- 단량체의 평균 수는 581개이며 이는 또한 잠재적으로 양성자화가능한 질소의 인접 직선의 길이이다. 보통 순도 PEI25에서 N-프로피오닐 잔기의 균일한 분포를 가정하면, 양성자화가능한 질소의 그 인접 직선의 길이는 겨우 64이다.
도 9는 다른 N/P 비율에서 다른 순도 수준의 PEI를 사용하여 제조된 레플리콘-RNA 폴리플렉스에 의한 시험관내 C2C12 근육 세포의 형질주입을 도시한다.
도 10에 따르면, 1 (-) 및 11.6 (+)의 N/P 비율에서 레플리콘-RNA 폴리플렉스는 고순도 PEI (jetPEI) 및 보통 순도 PEI (25 kDa)로 제조하였다. 유리 RNA를 대조군으로 사용하였다. 제형을 마우스의 뒷다리에 근육주사하였다 (n=3). 발광 신호를 마우스의 근육으로부터 기록하였다.
결과 및 결론
고순도 PEI를 사용하여 제조된 폴리플렉스는 보통 순도 PEI보다 더 우수하게 시험관내 근육 세포에 형질주입시킨다. 폴리플렉스는 근육주사 후 N/P 11.6에서 생체내 가장 높은 형질주입 효능을 갖는다.
N/P 11.6에서 고순도 PEI를 갖는 양이온성 폴리플렉스는 생체내 근육 조직을 유리형태 레플리콘-RNA보다 현저하게 (4-5배의 차이) 형질주입할 수 있다.
N/P 1에서 고순도 PEI를 갖는 음이온성 폴리플렉스, N/P 1에서 보통 순도 PEI를 갖는 폴리플렉스, 및 N/P 11.6에서 보통 순도 PEI를 갖는 양이온성 폴리플렉스는 유리형태 레플리콘-RNA보다 덜 근육 조직에 형질주입시킨다.
실시예 7: 상이한 공급자 및 동결건조 폴리플렉스로부터 순수한 PEI에 의한 레플리콘-RNA의 높은 형질주입 효능
재료 및 방법
다음 고순도 PEI는 Polyplus-Transfection SA (Illkirch-Graffenstaden, France): 생체내 JetPEI, 및 Euromedex (Souffelweyersheim, France): Exgen 500 및 Polysciences Europe GmbH (Eppelheim, Germany): PEI MAX 40000에서 구입하였다.
폴리플렉스는 실시예 2에서 상술된 바와 같이 100 mg/L의 RNA 농도에서 HBGx1에서 제조하였다. 모든 제형은 HBTx1 완충액에서 제조된 동결건조 제형을 제외하고는 HBGx1 완충액에서 제조하였다. HBTx1 완충액에서의 폴리플렉스의 동결건조를 실시예 2에 상술된 바와 같이 수행하였다. 제형은 실시예 6에서 상술한 바와 같이 마우스의 뒷다리에 근육주사하고 (n=3), 발광 신호를 마우스의 근육으로부터 기록하였다.
도 11의 실험에서, 7.7 및 11.6의 N/P 비율에서 레플리콘-RNA 폴리플렉스는 고순도 PEI, 즉 jetPEI (from Polyplus), PEI-Max 40000 (from Polyscience), 및 Exgen 500 (from Eurodamex)로 제조하였다.
Figure 112019004151803-pct00013
도 12는 상이한 완충액으로 제조된 N/P 11.6에서의 JetPEI/레플리콘-RNA 폴리플렉스의 동결건조된 케이크 (cake)를 나타낸 것이다.
결과 및 결론
레플리콘-RNA의 폴리플렉스는 근육주사 후 근육 조직을 효율적으로 형질주입시킨다 (도 11). jetPEI (Polyplus사), PEI-Max 40000 (Polyscience사), 및 Exgen 500 (Eurodamex사)로부터의 고순도 PEI는 폴리플렉스의 제조를 위해 사용될 수 있다. Exgen-500 폴리플렉스는 N/P 11.6보다 N/P 7.7에서 더 잘 형질주입된다.
트레할로스에서 폴리플렉스의 동결건조물은 글루코스에서 동결건조물이 붕괴하는 동안 케이크-유사 형태를 가지며 물에 녹이기가 어렵다 (도 12).
트레할로스는 폴리플렉스의 동결건조를 위해 글루코스보다 더 바람직한다. 동결건조된 폴리플렉스는 새로 제조된 액체-폴리플렉스와 유사하게 생체내 수행된다.
실시예 8: 순수 PEI 폴리플렉스에 의한 근육 세포로의 IVT-RNA 형질주입
재료 및 방법
생체내-jetPEITM 시약, Cat. # 201-50G는 Polyplus-Transfection (Illkirch, France)에서 구입하였다. 루시퍼라아제를 암호화하는 시험관내 전사된 (IVT) mRNA, 구조물 pST1-475는 RNA Biochemistry unit (Biontech RNA Pharmaceuticals, Mainz, Germany)에 의해 제공되었다.
IVT-RNA 및 PEI의 폴리플렉스는 실시예 2에서 상술한 바와 같이 제조하였다. 다양한 N/P 비율은 RNA의 농도를 일정하게 유지시키고, PEI 농도를 증가하게 유지시켜 준비하였다.
시험관내 근육 세포의 형질주입은 실시예 2에서 상술한 바와 같이 수행하였다.
생체내 형질주입 연구는 실시예 6에서 상술한 바와 같이 수행하였다.
도 13에 따르면, C2C12 근육 세포는 루시퍼라아제를 코딩하는 IVT-RNA에 의해 시험관내 형질주입시켰다. RNA는 HBGx1 완충액에서 다른 N/P 비율로 JetPEI와 복합체화시켰다. 형질주입 24시간 후 발광 신호를 측정하였다.
도 14에 따르면, 5.8 및 11.6의 N/P 비율에서 IVT-RNA 폴리플렉스를 HBGx1 완충액 중 순수한 PEI로 제조하였다. HBGx1 완충액 중의 유리 IVT-RNA를 대조군으로 사용하였다. 제형은 주사당 2-8 μg의 RNA 용량으로 마우스(n=3)의 뒷다리에 근육주사하였다. 발광 신호는 주사 후 6시간 후에 마우스의 근육으로부터 기록 하였다.
결과 및 결론
IVT-RNA 및 고순도 PEI의 폴리플렉스는 근육 세포에 효율적으로 시험관내 형질주입시킬 수 있다. 형질주입 효율 및 N/P 비율 간에는 양의 상관 관계가 있다 (도 13). 유리 IVT-RNA는 세포에 시험관내 형질주입되지 않는다.
N/P 비율 5.8 및 11.6에서 고순도 PEI를 갖는 폴리플렉스는 생체내 근육 조직에 유리형태 IVT-RNA보다 현저하게 형질주입되었다 (도 14) .
실시예 9: 레플리콘-RNA 폴리플렉스에 의한 형질주입에 대한 입자 크기 및 제조 조건의 효과
재료 및 방법
레플리콘-RNA 및 PEI의 폴리플렉스는 실시예 2에서 상술한 바와 같이 제조하였다. 폴리플렉스는 5가지 상이한 RNA: 100, 250, 500, 750, 1000 mg/l에서 제조하였다. 모든 제형에 대해 N/P 비율을 11.6으로 유지하기 위해 PEI 농도를 적절히 증가시켰다.
폴리플렉스의 크기는 실시예 4에서 상기한 바와 같이 측정하였다.
시험관내 근육 세포의 형질주입은 실시예 2에서 상술한 바와 같이 수행하였다.
생체내 형질주입 연구는 실시예 6에서 상술한 바와 같이 수행하였다.
도 15에 따르면, 레플리콘-RNA 및 jetPEI의 폴리플렉스는 HBGx1 완충액 중 N/P 비율 11.6에서 상이한 RNA 농도로 제조하였다. DLS에 의한 크기 측정을 위해 폴리플렉스를 10 mg/l의 RNA 농도로 희석하였다.
도 16에 따르면, C2C12 근육 세포를 도 16의 폴리플렉스로 시험관내 형질주입시켰다. 형질주입 후 24 시간 후에 발광 신호를 측정하였다.
도 17에 따르면, N/P 비율 11.6에서의 Rep-RNA 폴리플렉스는 도 16에서와 같이 상이한 RNA 농도에서 HBGx1 완충액 중의 순수한 PEI로 제조하였다. 제형은 주사당 2-8 μg의 RNA 용량으로 마우스(n=3)의 뒷다리에 근육주사하였다. 발광 신호는 마우스의 근육에서 기록하였다.
결과 및 결론
- 폴리플렉스는 레플리콘-RNA를 위한 우수한 형질주입 제제이다. 근육 조직에서 RNA의 번역 효율의 관점에서 폴리플렉스의 생체활성은 폴리플렉스 형성시 RNA 농도 (0.1-1 g/l)에 의해 영향을 받지 않는다.
- 60-200 nm 범위의 폴리플렉스 크기는 시험관내 및 생체내 (근육 주사) 폴리플렉스의 형질주입 효능에 영향을 미치지 않는다.
실시예 10: 마우스에 피하주사 또는 근육주사 후에 다른 폴리플렉스가 차별적으로 수행됨
재료 및 방법
생체내-jetPEITM 시약, Cat. # 201-50G는 Polyplus-Transfection SA (Illkirch, France)에서 구입하였다. 선형 PEI 22 kDa는 Cheradame 교수가 제공하였다 (Polytheragene, EVRY cedex, France). 루시퍼라아제를 코딩되는 RNA, 구조물 D1-824 레플리콘, ID 1600801은 RNA Biochemistry unit (Biontech RNA Pharmaceuticals, Mainz, Germany)에서 제공한 것이었다.
JetPEI를 갖는 폴리플렉스는 실시예 2에서 상술한 바와 같이, HBGx1 중에서 RNA 농도 500 mg/L에서 제조하였다.
Polytheragene-PEI를 갖는 폴리플렉스는 2가지 변형을 갖지만 JetPEI를 사용한 절차와 유사하게 제조하였다:
1. 폴리플렉스의 제조를 위해 HEPES 10 mM, pH 7.4 완충액을 HBGx1 대신 사용하였다.
2. 11.6 대신에 15.8의 N/P 비율을 사용하였다.
Polytheragene-PEI를 갖는 폴리플렉스의 제조는 하기 문헌에 따라 수행하였다: [Demoulins, Thomas, et al. "Polyethylenimine-based polyplex delivery of self-replicating RNA vaccines." Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine (2015)]
폴리플렉스를 HBGx1 또는 Opti-MEM (Cat. # 31985062, Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany) 완충액에서 시험관내 연구용 최종 RNA 농도 5 mg/l 및 생체내 연구용 최종 RNA 농도 100 mg/l로 희석하였다.
시험관내 연구는 실시예 1 및 2에서 상술한 바와 같이 수행하였다.
생체내 연구는 실시예 6에서 상술한 바와 같이 수행하였다.
결과 및 결론
도 18은 인간 수지상 세포(DCs) 및 마우스 근육 세포 (C2C12) 상에서 PEI/레플리콘-RNA 폴리플렉스로 시험관내 연구를 나타낸다. 도 18의 A: 독성 (폴리플렉스 처리 후 생존 세포의 %로 표시). 도 18의 B: 형질주입 (폴리플렉스 처리 후 발광 방출로 표시). 형질주입 결과는 C2C12 세포에서만 나타난다.
도 19의 결과에 대하여, N/P 비율 11.6 또는 15.8에서의 레플리콘-RNA 폴리플렉스는 HBGx1 또는 Hepes 10 mM 완충액 중의 Polyplus 또는 Polytheragene으로부터 PEI로 제조하였다. 마우스에 주사하기 전에 폴리플렉스를 HBGx1 또는 Opti-MEM 완충액으로 희석시켰다. 제형을 주사당 2 μg의 RNA 용량으로 마우스(n=3)의 뒷다리에 근육 주사하였다. 발광 신호는 마우스의 근육에서 기록하였다.
Figure 112019004151803-pct00014
Opti-MEM은 20 mM보다 높은 이온강도를 갖는다. Opti-MEM에서, 폴리플렉스는 빠르게 응집하여 (표 4), 이 제형은 약제의 개발에는 적합하지 않다.
본원에 기재된 폴리플렉스 (polyplus사의 PEI, N/P 11.6, HBGx1)는 상술한 폴리플렉스 (polytheagene사의 PEI, N/P 15.8, Opti-MEM)보다 매우 다른 특성을 갖는다. Opti-MEM에서, 폴리플렉스는 지름이 >1000 nm이고 복합 크기 분포를 갖는다. 본원에 기재된 폴리플렉스는 ~100 nm의 지름 및 낮은 다분산도를 갖는다.
시험관내, 모든 폴리플렉스는 근육 세포보다 수지상 세포에 더 독성을 보인다. 아마도 피하 주사 후 수지상 세포는 폴리플렉스를 흡수하는 반면, 근육 주사 후 근육 세포는 폴리플렉스에 의해 형질주입된다.
본원에 기재된 폴리플렉스에 의한 시험관내 근육 세포의 형질주입 및 상술한 폴리플렉스는 유사하다.
본원에 기재된 폴리플렉스 및 상술한 폴리플렉스에 의한 생체내 형질주입은 상이한 것이며 적용 경로에 의존한다. 본원에 기재된 폴리플렉스는 근육 주사 후에 잘 형질주입되고 피하 주사 후에는 형질주입이 악화된다. 상술한 폴리플렉스는 근육 주사 후에 전혀 형질주입되지 않는 반면, 피하 주사 후 약한 신호를 관찰하였다.
실시예 11: 마우스에 근육 주사 대 피내 주사에 의한 레플리콘 RNA의 투여
루시퍼라아제 효소를 코딩하는 레플리콘-RNA를 실시예 2에 기술된 바와 같이 HBGx1 완충액에 용해시키거나 폴리플렉스로 복합체화시켰다. 이러한 제형을 Balb/c 마우스의 후경골근 내에 RNA 2 μg의 용량으로 근육 주사하였다. 마우스는 주사 후 4일, 7일 및 10일에 이소플루레인에 의해 마취시켰다. 그 다음, 이들은 루시페린 기질로 주입하고, 근육으로부터의 발광 방출은 CCD 카메라에 의해 기록하였다.
루시퍼라아제 단백질로부터 유래된 광자를 1분에 걸쳐 수집하였고, 촬상된 마우스의 사진과 오버레이로 나타내었다 (도 20A). 도 20B는 주사 부위에서 측정 된 광자/초 (p/s)의 그래픽 표시를 도시한다.
Balb/c 마우스의 등쪽 피부에 2개의 주사 부위에 루시퍼라아제를 코딩하는 2 μg 비제형화된 HBGx1 또는 제형화된 레플리콘 레플리콘-RNA를 진피내(피내) 적용한지 7일 후, 동물로 비침습성 생체내 생체발광 촬상을 실시하였다. 루시퍼라아제 단백질로부터 유래된 광자를 1분에 걸쳐 수집하였고, 촬상된 마우스의 사진과 오버레이로 나타내었다. 검은색 화살표는 주사 부위를 나타낸다 (도 21A). 도 21B는 주사 부위에서 측정된 광자/초 (p/s)의 그래픽 표시를 도시한다.
실시예 12: 백신으로서의 RNA 제형의 유익한 효과
11.6 a의 N/P 비율을 갖는 PEI로 제형화된 H1N1 인플루엔자 바이러스 균주 A/PuertoRico/8/1934 (H1N1/PR8)의 헤마글루티닌 (HA)을 코딩하는 단일가닥 레플리콘-RNA 또는 비제형화된 단일가닥 RNA의 각각 조성물로 마우스를 시험 0일차 및 21일차에 2회 면역화시켰다. 모든 동물에게 RNA 1.25 μg의 용량을 제공하였다. 세 번째 그룹은 완충액 대조군으로서 식염수만을 제공하였다. 도 22A에 나타낸 바와 같이, 제 1 면역화 후 19일차 및 제 2 면역화 직전에, 제형화된 RNA를 받은 모든 동물은 바이러스 중화 검정법(VNT, 검출 한계치 1280)에 의해 분석된 HA에 대한 면역 반응이 발달하였다. 대조적으로, 비제형화된 RNA를 받은 8마리 중 5마리 동물만이 HA에 대해 혈청전환(seroconvert)시켰다. 도 22B에 나타낸 바와 같이, 제 1 면역화 후 35일차에, 모든 RNA-수여 동물은 HA-특이적 항체에 대해 양성이었고, HA에 대한 항체 적정농도가 증가하였다. 비제형화된 RNA 군이 아닌 제형화된 RNA 군의 동물 적정농도는 식염수 대조군과 비교하여 상당히 높아졌다. 도 22C에 나타낸 바와 같이, 면역화 후 54일차에 H1N1/PR8-HA를 코딩하는 1.25 μg 제형화된 RNA를 수여받은 마우스는 H1N1/PR8-HA를 코딩하는 비제형화된 RNA 1.25μg을 수여한 동물에 비해 유의하게 높은 항체 적정농도를 나타내었다 (일원분산분석(one-way ANOVA)을 사용하여 유의성을 계산함; * p<0.001).
특정 N/P 비율 11.6 a를 갖는 PEI로 제형화된 H1N1 인플루엔자 바이러스 균주 A/PuertoRico/8/1934 (H1N1/PR8)의 헤마글루티닌 (HA)를 코딩하는 단일가닥 레플리콘-RNA 또는 비제형화된 단일가닥 RNA의 조성물로 마우스를 시험 0일차에 면역화하였다. 모든 동물에게 0.25 μg RNA를 제공하였다. 세 번째 그룹은 완충액 대조군으로서 식염수만을 제공하였다. 도 23A에 나타낸 바와 같이, 면역화 후 54일차에, 모든 RNA-수여 동물은 HA-특이적 항체에 대해 양성이었고, 제형화된 RNA 군의 적정농도는 식염수 대조군 및 H1N1/PR8-HA를 코딩하는 비제형화된 RNA의 0.25 μg을 받은 동물에 비해 유의하게 높아졌다 (일원분산분석을 사용하여 유의성을 계산함; ** p<0.001; * p<0.05). 면역화 후 55일차에, 모든 마우스에게 H1N1/PR8의 10배 반치사량 (MLD50)으로 감염시켰다. 생존을 관찰하였다. 도 23B에 나타낸 바와 같이, 모든 대조 동물은 8일 이내에 사망하였다. H1N1/PR8-HA를 코딩하는 비제형화된 RNA를 받은 5마리 중 4마리 동물은 시험감염에 대해 생존하였다. 대조적으로, H1N1/PR8-HA를 코딩하는 제형화된 RNA를 받은 모든 마우스는 RNA/ 폴리알킬렌이민 조성물의 유익한 효과를 입증하는 시험감염에서 생존하였다.
실시예 13: PEI로 제형된 레플리콘 RNA의 분무건조
표 1에 주어진 피펫 방식에 따라 N:P 비율이 12인 제형을 2회 제조한 후 수득된 물질을 조합하였다. 그로 인해, RNA 농도가 0.1 mg/mL RNA인 5.0 mL의 레플리콘 RNA 폴리플렉스를 수득하였다.
Figure 112019004151803-pct00015
이 제형 3.5 mL를 분무건조하고, 533 mg의 물질을 수거하였다 (수율: 76.1 %). 새로 제조된 레플리콘 RNA 폴리플렉스의 입자 크기는 물질이 Buechi 데모 실험실에서 방출되었으므로 측정하지 않았다. 물로 재용해한 후의 입자 크기 (z- 평균) (혼합물: 20 mg 분무건조된 폴리플렉스 및 200 μl wfi; 10 mM 트레할로스 및 RNA 농도 0.1 mg/mL를 얻음)는 289 nm이고 PDI는 0.238 (Nicomp, 15 분)이었다. 도 24A는 분무건조 전후의 saRNA 폴리플렉스의 루시퍼라아제 발현에 대한 시험관내 연구를 보여준다. saRNA의 루시퍼라아제 활성은 분무건조 과정으로 인해 손실되지 않는다. 신호의 절대 높이의 차이는 분석의 차이로 인한 것이다.
추가의 실험에서, 10% (w:v) 트레할로스 중의 비복합체화된 mRNA는 분무건조하고 분무건조 후 mRNA의 무결성은 모세관 전기영동 측정에 의해 조사하였다.
2.50 mL 메신저 RNA (R36-05.2-DP; c(RNA) = 0.5 mg/mL; 10 mM Hepes; 0.1 mM EDTA; pH 7.0)를 2.50 mL 20 % (w:v) 트레할로스 용액(부피비 1:1)과 혼합하여, 다음의 조성: c(RNA) = 0.25 mg/mL; 10% (w/v) 트레할로스; 5 mM Hepes; 0.05 mM EDTA로 하였다. 분무건조 중에, 시료 물질은 얼음 상에 유지시켰다. 전체적으로 이 용액 2.5 mL를 분무건조시켰다. 분무건조 중에, 배출구 온도는 10분 이내에 33 내지 37℃로 증가하였다. 온도 상승을 낮추기 위해, 기체 유량을 98 내지 101 L/분으로 증가시켰다. 분무건조 중에 온도는 다음 60분 이내에 41℃로 추가로 증가시켰다. 완전 분무 후, 165 mg의 건조 물질을 수거 하였다 (수율: 66.0 %). RNA 무결성 분석을 위해 물질을 wfi (혼합물 : 20 mg 분무건조 RNA 및 200 μl wfi)에 용해시켰다 (혼합물: 20 mg 분무건조된 RNA 및 200 μl wfi; 트레할로스 함량 10% 및 RNA 농도 0.25 mg/mL를 수득함). 용해된 RNA는 Agilent 2100 Bioanalyzer를 사용하여 분석하였다. 이러한 분석의 결과는 도 24B에서 분무건조된 RNA의 전기영동도와 같이 도시하였다.
비복합체화된 RNA의 무결성이 유지되고 분무건조가 측정 가능한 RNA 분해를 유발하지 않는다는 것을 입증하였다.
분무건조 실험은 다음과 같이 수행하였다:
Buechi사의 Nano Spray Dryer B-90을 RNA 함유 제형의 분무건조에 사용하였다. 이들 제형의 제조를 위해, 하기 화합물을 사용하였다:
·메신저 RNA (R36-05.2-DP, c(RNA) = 0.5 mg/mL; 10 mM Hepes; 0.1 mM EDTA; pH 7.0)
·루시퍼라아제에 대해 코딩하는 레플리콘 RNA (D2 RNA-A1310 29-01 pST1-SFV4-TRON-I2m2-A30L70, wfi, c(RNA) = 1 mg/mL)
· 주사용 멸균수 (wfi)
· NaCl (wfi 중 1.5 M)
· wfi 중 트레할로스 20% (w:v) (Pfanstiehl. Lot No: 35261A)
· wfi 중 2X Hepes 완충된 트레할로스 20% (w:v) (Pfanstiehl. Lot No: 35261A, 20 mM Hepes)
· JetPEI (Polyplus; Lot. Nr.: 13081A1S; 150 mM 질소)
분무건조의 경우 다음과 같은 공정 매개변수를 선택하였다:
· 노즐: 4 μm
· 주입구 온도: 80℃
· 배출구 온도: 30℃
· 기체 유량: 98 mL/min
· 인가 전류: 15.000 V; 350 μA
모든 실험에 앞서, 장치를 RNase Zapp로 세척하고 에탄올로 닦아내고 캡을 초음파 욕조에서 세정하였다.
실시예 14: 폴리플렉스 제조를 위한 미세유체공학
제조사(1029-036)에 의해 제공된 미세유체 칩을 갖는 NanoAssemblrTM (Precision Nanosystems, BC, Vancouver, Canada)을 사용하였다. RNA의 경우, 자체 제조된 레플리콘 RNA (배치넘버 R071_1_2)을 사용하였다. 폴리에틸렌이민 (Max PEI 40)은 Polysciences (Eppelheim, Germany)에서 제조된 것이었다. Syringes BD Plastipak 1 ml; 1508006, BD Biosciences (Heidelberg, Germany)를 사용하였다. 12 ml/분의 유속을 사용하여 두 성분을 1:1의 비율로 혼합하였다. 시료는 두 가지 농도, 즉 50 mg/l 및 250 mg/l로 준비하였다.
동적광산란을 이용한 입자 크기 측정을 위해, Nicomp사(PSS Nicomp, Santa Barbara, CA)의 380 ZLS 서브미크론 입자 / 제타 전위 분석기를 사용하였다.
각 조건별로 1.5 ml를 제조하였다. 크기 측정을 위해 HBG 완충액으로 시료를 희석시켰다.
피펫팅 계획은 다음과 같았다:
Figure 112019004151803-pct00016
미세유체 혼합 실험은 표준 주사기에 제공되는 두 가지 구성 요소가 혼합된 Y-형 미세유체 혼합기를 포함하는 장치를 사용하여 수행하였다. 두 성분을 12 ml/분의 일정한 유속을 사용하여 1:1 비율로 혼합하였다. 시료를 2 가지 상이한 농도, 즉 50 mg/l 및 250 mg/l로 제조하고, 수득된 폴리플렉스의 입자 크기를 측정하였다.
폴리플렉스는 미세유체 장치로 제조하여, 업 스케일링을 위한 연속 흐름 제조 및 GMP 제조의 실현가능성을 입증하였다. 입자 형성은 문제없이 가능하였으며, 응집체 형성 또는 막힘에 대한 징후가 관찰되지 않았다. 입자 크기는 동적광산란에 의해 측정하였다. 0.05 mg/l로 제조된 폴리플렉스의 경우, 크기는 약 123 nm이었고, 0.25 mg/ml로 제조된 입자의 경우, 크기는 약 314 nm이었다. 얻은 결과의 세부 사항은 아래 표에 나와 있다.
Figure 112019004151803-pct00017
모든 시료는 (HBGx1로 희석된) RNA 농도 0.02 mg/ml에서 측정하였다
미세유체에 의한 폴리플렉스 제조의 실현가능성을 증명하였다. 간단한 Y-형 혼합기로 제조하였으며, 원활한 제작을 위해서는 유체역학적 초점 조절과 같은 특별한 절차가 필요하지 않았다. 적절한 조건에서, 기존의 GMP 준수 멸균 필터로 무균 여과가 가능하여, 200 nm보다 훨씬 작은 크기의 입자를 제조할 수 있었다. 응집 또는 막힘에 대한 징후가 나타나지 않았으므로 더 큰 제조 배치에 대한 스케일업을 문제없이 가능할 것이라고 결론지었다. 스케일업을 위한 추가 옵션은 여러 개의 동일한 장치의 병렬화를 포함한다. 요약하면, 그 결과는 PEI/RNA 폴리플렉스의 GMP 준수 미세유체 제조의 일반적인 실현가능성을 나타내는 지표로 간주될 수 있다.
실시예 15: 여과에 의한 폴리플렉스의 멸균
폴리플렉스는 "폴리플렉스의 안정성 연구" 섹션에서 이미 설명한 바와 같이 100 mg/L의 레플리콘-RNA 농도 및 11.5, 13.5 및 15.5의 N/P 비율로 준비하였다.
3개의 다른 N/P 비율에서 2.68 ml의 폴리플렉스를 갖는 3 개의 튜브를 준비하였다. 폴리플렉스 (1.34 ml)는 220 nm (Cat. # SLMPL25SS, Merck Millipore)의 공극을 갖는 무균 Millex-GP Med Syringe Filter Units을 통해 여과시켰다.
폴리플렉스는 HBGx1에서 RNA 농도 10 mg/L로 희석시켰다. 다음, 이들을 세포에 첨가하기 전 30분에 NaCl 0.9%에서 5mg/l의 RNA 농도로 희석시켰다.
C2C12 세포를 웰당 2x104 세포의 농도로 96-웰 플레이트 (평평한 바닥)에 접종하였다. 세포를 37℃ 및 7.5% CO2에서 유지시켰다. 24시간 후, 상등액을 버리고 50 μL의 DMEM 배지 (+10% FCS)로 대체하였다. 폴리플렉스는 10% FCS를 갖는 DMEM 배지에서 희석(1:5)하고 약 15분 동안 사전-인큐베이킹하였다. 그런 다음 50 μl의 폴리플렉스 용액을 100 μl의 최종 배지 부피로 세포에 첨가하였다. 추가 48시간 후, Bright-GloTM 루시퍼라아제 분석(Cat.　#E2610, Promega GmbH, Mannheim, Germany)은 지침서에 따라 수행하였다.
또한 형질주입과 병행하여 세포 증식 키트 II(XTT. Roche, #11465015001)를 사용하여 세포 수를 측정하였다. 두 가지 분석에서 각각의 폴리플렉스-시료는 생물학적인 3중(biological triplicate)으로 시험하였다. 음성 대조군으로서, 세포는 치료없이 접종될 것이다("미처리된"). 또한 XTT-분석을 위해서 백그라운드(BG)와 동일한 세포가 없는 배지는 3중으로 접종하였다. 마지막으로, 발광(Bright-GloTM)뿐만 아니라 흡광도 (XTT)를 "인피니트 200pro" 판독기(Tecan)로 측정하였다. 표준화된 발광은 발광 신호를 흡광도 (세포 수에 비례)로 나누어 계산하였다.
도 25는 PEI/레플리콘-RNA 폴리플렉스와 함께 다른 N/P 비율로 무균여과 전(미여과된)과 후(멸균된)에 인큐베이션한 후 C2C12 근육 세포로부터 정규화된 발광을 보여준다.
실린지 필터 유닛은 폴리플렉스의 멸균에 적합하다는 결론을 내릴 수 있다. 폴리플렉스의 형질주입 효능은 멸균 과정으로 인해 변화하지 않는다.
실시예 16: 짧은 PEI와 긴 PEI의 조합에 의한 폴리플렉스 형질주입을 최적화한다
루시페라아제 코딩 레플리콘-RNA는 0.6 내지 11 kDa의 (예를 들어 선형 짧은 PEI 2.5kDA 또는 분기형 짧은 PEI 1.8kDA) 짧은 PEI 및 20 내지 40 kDa의 (예를 들어 22 kDa 생체내/Jet PEI) 긴 PEI의 진정한 조합과 MBG 완충액 (최종 농도 5% w/v 글루코스, 10mM MES, pH 6.1) 중 10 또는 12의 총 NP에 대해 상이한 조합으로 복합체화하였다. 생체내/Jet PEI NP12만이 기준점으로서 사용하였다. 짧은 및 긴 PEI 폴리플렉스의 복합체화를 두 단계로 진행하였다: 첫 번째 단계에서, 레플리콘-RNA의 복합체화는 생체내/Jet PEI로 목적하는 NP로 조정하였다. 두 번째 단계에서는, 목적하는 총 NP 비율에 도달하기 위해 과량의 짧은 PEI를 제형에 첨가하고; 즉 첫 번째 숫자는 긴 PEI NP를 정의하고 두 번째 숫자는 짧은 PEI를 정의하였다 (예를 들어, NP4+8 = NP4 긴 PEI 및 NP8 짧은 PEI). 루시퍼라아제 분석은 실시예 15에서 상술한 바와 같이 수행하였다.
결과를 도 26에 나타내었다. 도 26A)는 250ng의 RNA/웰에서 짧은 선형 PEI 및 긴 생체내 Jet PEI 폴리플렉스의 형질주입 효능을 나타낸다. 도 27B)는 250ng의 RNA/웰에서 짧은 분기형 PEI 및 긴 생체내 Jet PEI 폴리플렉스의 형질주입 효능을 나타낸다.
결론: 오직 긴 PEI (예를 들어 생체내 Jet PEI)와 기준점 결과와 비교하여, 긴 PEI와 짧은 PEI의 조합을 사용하여 형질주입 효능을 상당히 향상시킬 수 있다.
흥미롭게도 선형 짧은 PEI와 조합에 대해서는 루시퍼라아제 발현 신호는 형질주입 후 첫 24시간에 피크를 찍었으나, 분기형 짧은 PEI와 조합에 대해서는 루시퍼라아제 발현 신호는 형질주입 후 첫 48시간에 피크를 찍었다. 따라서, 특정 시간대의 발현을 목적하는 상황에서, 올바른 짧은 PEI/긴 PEI 조합을 신중하게 선택하는 것이 합리적이다.
실시예 17: 긴 PEI의 양을 감소시킴으로써 폴리플렉스 형질주입을 최적화한다
선별된 나노-루시퍼라아제 코딩 레플리콘-RNA는 짧은 PEI (예를 들어 분기형 1.8kDA) 및 긴 PEI (예를 들어 생체내/Jet PEI)의 진정한 조합과 MBG 완충액 (최종 농도 5% w/v 글루코스, 10mM MES, pH 6.1) 중 12의 총 NP에 대해 상이한 조합으로 복합체화하였다. 생체내/Jet PEI NP12를 기준점으로 사용하였다. 짧은 + 긴 PEI 폴리플렉스의 복합체화는 두 단계로 진행하였다: 첫 번째 단계에서, 레플리콘-RNA의 복합체화는 생체내/Jet PEI로 목적하는 NP로 조정하였다. 두 번째 단계에서는,목적원하는 총 NP 비율에 도달하기 위해 과량의 짧은 PEI를 제형에 첨가하고; 즉 첫 번째 숫자는 긴 PEI NP를 정의하고 두 번째 숫자는 짧은 PEI를 정의하였다 (예를 들어 NP4+8 = NP4 긴 PEI 및 NP8 짧은 PEI). 선별된 루시퍼라아제는 125ng 또는 RNA/웰에서 제조사 프로토콜(Nano-GLO, Promega, USA)에 따라 측정하였다. 세포 생존 검정법은 실시예 15에 상술한 바와 같이 수행하였다.
그 결과를 도 27에 나타내었다. 기준점과 비교하고 동일한 총 NP 비에 대해, 예를 들어 NP4+8 및 NP1.15+11과 같은 조합으로 높은 발현 수준을 달성하였다. 따라서, 형질주입 효능은 제형에서 긴 PEI의 농도를 감소시키고 독성이 적은 짧은 PEI (예를 들어 분기형 1.8kDa)의 농도를 증가시킴으로써 상당히 증가시킬 수 있다.
실시예 18: 생체내 형질주입 효율에 대한 염 변화 및/또는 pH의 효과
BALB/c 마우스는 Janvier Laboratories에서 구입하여 8주된 연령을 실험에 사용하였다. 지시된 시험 항목을 사전 주사한 후, 마우스를 이소플루레인 마취하고, 전기면도기를 사용하여 뒷다리에서 털을 제거하였다. 이어서, 2 μg의 RNA 용량으로 레플리콘-RNA (saRNA)-PEI-폴리플렉스 (예를 들어 saRNA-생체내 Jet PEI 폴리플렉스 NP12)를 그룹당 3마리의 마우스의 각 후경골근에 20 μL 총 부피로 근육내 적용하였다. 제형은 pH 및/또는 염 농도 (예를 들어 NaCl)에 따라 다양하였다. 지시된 시점에서 마우스에게 D-루시페린 용액 (100 mg/kg 체중)으로 복강내 주사하고 생체발광은 IVIS® 스펙트럼 장치 (Perkin Elmer)를 통해 1분 동안 이소플루레인 마취된 마우스에서 비침습적으로 캡쳐하였다. 그래프는 총 6개의 값/그룹으로 이들 사진에서 마우스의 근육 (주사 부위)과 관련하여 수동으로 정의된 목적 영역 (ROI)에서 Living Image® 소프트웨어 (Perkin Elmer)를 통해 결정된 생체발광 신호의 초당 광자[p/s]를 표시한 것이다.
형질주입 효율에 대한 염 변화 (예를 들어 NaCl)의 효과가 도 28에 나타나있다. 다른 N/P 비율에서 레플리콘-RNA-PEI 폴리플렉스의 근육내 주사는 3일, 6일, 9일 및 13일차에 측정한 후 마우스의 근육 영역에서 오래 지속되는 생체발광 신호를 유도하였다. 검출된 신호 강도는 적용 후 3일 내지 6일차(피크)까지 증가했지만 13일차에도 검출 가능하였다. 마우스의 근육 영역에서 가장 강한 신호는 레플리콘-RNA-PEI 폴리플렉스 (예를 들어 긴 PEI N/P 12)를 수여하고 저농도 (5 내지 10 mM) 염을 첨가한 마우스에서 근육 주사 후 6일차에 검출될 수 있었다.
형질주입 효율에 대한 pH 변화의 효과가 도 29에 도시되어 있다. 6.5 내지 7.1, 바람직하게는 6.5 내지 6.9의 pH 값을 갖는 레플리콘 RNA (saRNA)-PEI 폴리플렉스 제형으로 양호한 결과를 수득하였다. 가장 강렬한 신호는 pH 6.5로 조정된 레플리콘-RNA-긴 PEI NP12 제형으로 검출할 수 있다. 기준점으로서, 미조정된 pH (BM) 또는 HBG (20 mM HEPES, pH 7.4, 5 wt. % 글루코스)를 갖는 레플리콘-RNA-Jet PEI 폴리플렉스 NP12을 사용하였다.
실시예 19: 시험관내 PEI 폴리플렉스의 전기영동 이동성에 대한 pH 의존성 효과 및 형질주입 효율
루시퍼라아제 코딩 레플리콘-RNA를 HBG 완충액 (최종 농도 4.5% w/v 글루코스, 10mM HEPES, pH 7.1) 중 4의 N/P 비율에서 긴 PEI (예를 들어 생체내 jet PEI)와 15분간 실온에서 복합체화하고 11개의 시료로 분액하였다. 시료의 pH는 시험될 최종 벌크 pH에 따라 HCl 또는 NaOH의 첨가에 의해 조정하였다. 전기영동 이동도 (μ)의 측정은 실시예 5에 기술된 바와 같이 수행하였다. C2C12 마우스 근육 세포의 시험관내 형질주입, 루시퍼라아제 및 세포 생존능 검정을 실시예 15에서 상술한 바와 같이 수행하였다.
시험관내 PEI 폴리플렉스의 전기영동 이동도에 대한 pH 의존성 효과 및 형질주입 효율을 도 30 및 31에 나타내었다. 도 30은 상이한 pH 값으로 조정된 생체내 jetPEI/레플리콘-RNA 폴리플렉스 (N/P 4)의 전기영동 이동도를 나타낸다. 도 31은 N/P 비율이 4이고 상이한 pH 값 (pH 6.5-pH 8.5)에서 상이한 투여량의 생체내 jetPEI/레플리콘-RNA 폴리플렉스와 인큐베이션한 후 C2C12 근육 세포로부터의 정규화된 발광을 도시한다.
폴리플렉스의 전기영동 이동성은 부정적으로 pH와 상관 관계가 있다. 중성 폴리플렉스는 약 pH 8.9에서 수득하였다. 폴리플렉스의 벌크 pH를 바람직하게는 pH 값을 6.5 내지 7.1로 감소시킴으로써 PEI 폴리플렉스 상에서 양전하 밀도를 증가시키는 것은 세포 생존에 영향을 미치지 않고 C2C12 세포의 높은 형질주입 효율을 초래하였다. PEI 중합체는 일차 및 이차 아민을 포함하며, 그의 양성자화 상태는 벌크 pH에 의존한다. 따라서, 결과는 벌크 pH를 조정하고 최적화함으로써 폴리플렉스의 전하 및 이들의 형질주입 효율을 제어하는 효율적인 방법을 제시한다.
실시예 20: 긴 PEI 제형에서 양전하 초과의 영향
분비된 나노-루시퍼라아제 코딩 레플리콘-RNA를 MBP 완충액 (최종 농도 5% w/v 글루코스, 10mM MES, pH 6.1) 중 2-12의 상이한 NP 비율에서 복합체화하였다. 분비된 루시퍼라아제는 125ng 또는 RNA/웰에서 제조사 프로토콜(Nano-GLO, Promega, USA)에 따라 측정하였다. 초과량의 양전하는 긴 PEI (즉 생체내/Jet PEI)-레플리콘 RNA NP 비율 및 총 복합체화가 이 레플리콘-RNA & 생체내 Jet PEI에 대해 발생하는 정확한 NP 비율에 기반하여 계산하였다. 총 복합체화에 대해 사용된 NP 비율과 공지된 NP 비율 간의 차이로 제형에서 초과량의 양전하를 계산할 수 있다.
예를 들어, RNA 250ng에서 생체내 Jet PEI 폴리플렉스로 형질주입시킨 결과는 도 32에 나와 있다. 일반적으로, 제형에서 양전하 농도를 증가시키는 것은 루시퍼라아제 발현 수준에 지수적으로 비례한다. PEI의 양을 증가시켜 양전하 30 nM 이하를 초과하는 것이 유익한 것으로 입증하였다.
실시예 21: 2-단계 복합체화를 사용하여 하나의 성분 PEI 폴리플렉스 형질주입을 최적화한다
하나의 PEI 변이체(예를 들어 긴 PEI와 같은)만을 사용하는 경우, 2-단계 복합체화 방법을 사용하여 형질주입 효율을 향상시킬 수 있다. 분비된 나노-루시퍼라아제 코딩 레플리콘-RNA를 MBG 완충액 (최종 농도 5% w/v 글루코스, 10mM MES, pH 6.1) 중 총 NP가 12인 것에 대해 2 단계로 복합체화하였다. 생체내/Jet PEI NP12 1-단계 복합체화를 기준점으로서 사용하였다. 예를 들어, 생체내 Jet PEI를 사용하는 2단계에서 복합체화는 다음과 같이 진행하였다: 첫 번째 단계에서, 레플리콘-RNA의 복합체를 목적하는 초기 NP에 맞게 조정하였다. 두 번째 단계에서, 과량의 생체내/Jet PEI를 제형에 첨가하여 목적하는 총 NP 비율에 도달시키고; 즉 첫 번째 숫자는 초기 PEI NP를 정의하고 두 번째 숫자는 두 번째 단계 상에서 주어진 생체내 Jet PEI의 초과를 정의하였다 (예를 들어 NP4+8: 첫 번째 단계에서 NP4 Jet PEI 및 두 번째 단계에서 NP8 Jet PEI). 분비된 루시퍼라아제를 125ng 또는 RNA/웰에서 제조자 프로토콜 (Nano-GLO, Promega, USA)에 따라 측정하였다. 세포 생존능 분석은 실시예 15에서 상술한 바와 같이 수행하였다.
2 단계 복합체화 결과를 도 33에 나타내었다. 생체내/Jet PEI NP12 1-단계 복합체화 기준점 및 동일한 총 NP 비율에 비해, 보다 높은 발현 수준은 2 단계 복합체화로 달성하였다.
실시예 22: 면역화 효율에 대한 폴리플렉스 제형 완충액의 효과
생체내-jetPE를 이용하여 saRNA를 폴리플렉스로 제형화하였다. Hepes-완충된 글루코스 (HBG) 또는 MES-완충된 글루코스 (MBG) (5% D-글루코스, 10mM MES, pH 6.1)를 사용하여 폴리플렉스를 생산하였다. 마우스를 한번의 실험으로 0일차에 근육주사로 면역화시켰다. 면역화 후 45일차에 혈청을 채취하고, 혈청 중의 Cf07-HA 특이적 항체의 양을 HA-특이적 ELISA를 사용하여 분석하였다. 혈청 희석액의 종점 적정을 수행하고 곡선하면적 (AUC)을 측정하였다. 100%로 설정된 HBG-생산된 폴리플렉스와 비교하여 MBG-생산된 폴리플렉스의 곡선하면적 백분율 증가가 나타났다
결과를 도 34에 나타내었다. HBG로 제형화된 폴리플렉스와 비교하여, MES- 완충된 글루코스를 사용하여 생성된 폴리플렉스는 마우스의 단발 백신접종 후 훨씬 높은 ELISA 신호를 생성한다.
약어 및 정의의 리스트
ATM 기압
C 농도
CSS NaAcetate 0.1M, pH 5.4의 100 ml 중 CuSO4 23 mg의 용액
DLS 동적광산란
EDTA 에틸렌디아민테트라아세트산
FCS 신생우아혈청
h 시간
HBGx1 HEPES 10mM 완충된 (pH 7.1) 글루코스 5%
HBGx2 HEPES 20mM 완충된 (pH 7.1) 글루코스 10%
HBTx1 HEPES 10mM 완충된 (pH 7.1) 트레할로스 10%
HBTx2 HEPES 20mM 완충된 (pH 7.1) 트레할로스 20%
HBTx1+EDTA EDTA 80 μM 와 HEPES 2.8mM 완충된 (pH 7.1) 트레할로스 10%
HEPES 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산
IVI Institute of Virology and immunology, Mittelhaeusern, Switzerland
IVT 시험관내 전사된 mRNA
kDa 1000 달톤
Lyo 동결건조
min 분
MBGx1 5% D-글루코스, 10mM MES, pH 6.1
MES 2-(N-모폴리노)에탄술폰산
N/P PEI에서 아민기 및 RNA에서 포스페이트기의 수 사이의 비율.
PEI 폴리에틸렌이민
RNA 리보핵산
UV 자외선

Claims (51)

  1. (a) 단일가닥 RNA; 및 (b) 폴리알킬렌이민을 포함하고,
    상기 폴리알킬렌이민에서의 질소원자(N) 수 대 단일가닥 RNA에서 인원자(P) 수의 몰비(N:P 비율)는 2.0 내지 15.0이고,
    입자의 동적광산란 측정으로부터 유래된 z-평균은 200 nm 미만인 약학 조성물.
  2. 삭제
  3. 제 1항에 있어서,
    폴리알킬렌이민에서의 질소원자(N) 수 대 단일가닥 RNA에서 인원자(P) 수의 몰비(N:P 비율)가 6.0 내지 12.0인 조성물.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제 1항에 있어서,
    이온강도가 50 mM 이하인 조성물.
  7. 제 1 항에 있어서,
    1가 양이온의 농도가 25 mM 이하이고, 2가 양이온의 농도가 20 μM 이하인 조성물.
  8. 제 1 항, 제 3항, 제 6항 및 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
    근육내 주사를 포함하는 근육내 투여용인 조성물.
  9. 제 1 항, 제 3항, 제 6항 및 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
    단일가닥 RNA 및 폴리알킬렌이민이 폴리플렉스 입자 중에 존재하는 조성물.
  10. 제 1 항, 제 3항, 제 6항 및 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
    폴리알킬렌이민은 하기 일반화학식 (I)을 포함하는 조성물:
    Figure 112021138427103-pct00018

    일반화학식 (I);
    여기서, R이 H, 아실기 또는 하기 일반화학식 (II)을 포함하는 기이고;
    Figure 112021138427103-pct00019

    일반화학식 (II);
    여기서 R1이 H 또는 하기 일반화학식 (III)을 포함하는 기이고;
    Figure 112021138427103-pct00020

    일반화학식 (III);
    n, m, 및 l이 2 내지 10의 정수로부터 독립적으로 선택되고;
    p, q, 및 r이 정수이고, 여기서 p, q, 및 r의 합은 중합체의 평균 분자량이 1.5·102 내지 107 Da인 조성물.
  11. 제 10 항에 있어서,
    n, m 및 l은 독립적으로 2, 3, 4, 및 5로부터 선택되는 조성물.
  12. 제 10 항에 있어서,
    R1은 H인 조성물.
  13. 제 10 항에 있어서,
    R이 H 또는 아실기인 조성물.
  14. 제 10 항에 있어서,
    폴리알킬렌이민은 폴리에틸렌이민 및/또는 폴리프로필렌이민을 포함하는 조성물.
  15. 제 10 항에 있어서,
    폴리알킬렌이민에서 N 원자의 적어도 92%는 양성자화가능한 것인 조성물.
  16. 제 10 항에 있어서,
    하나 이상의 첨가제를 추가로 포함하는 조성물.
  17. 제 16 항에 있어서,
    하나 이상의 첨가제는 완충 물질, 당류, 안정화제, 동결방지제, 동결건조보호제, 및 킬레이트제로 이루어진 군으로부터 선택되는 조성물.
  18. 제 17 항에 있어서,
    완충 물질은 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산 (HEPES), 3-모폴리노-2-하이드록시프로판술폰산 (MOPSO), 아세트산, 아세테이트 완충액 및 유사체, 인산 및 포스페이트 완충액, 및 시트르산 및 시트레이트 완충액으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나를 포함하는 조성물.
  19. 제 17 항에 있어서,
    당류는 단당류, 이당류, 삼당류, 올리고당류, 및 다당류로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하는 조성물.
  20. 제 17 항에 있어서,
    동결방지제는 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 및 글리세롤을 포함하는 글리콜로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하는 조성물.
  21. 제 17 항에 있어서,
    킬레이트제는 EDTA를 포함하는 조성물
  22. 제 17 항에 있어서,
    지질을 추가로 포함하고, 상기 지질은 양이온성 지질, 중성 지질, 및 음이온성 지질로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하는 조성물.
  23. 제 17 항에 있어서,
    조성물은 HEPES 완충된 글루코스 (HBG) 또는 HEPES 완충된 트레할로스 (HBT)를 포함하는 조성물.
  24. 제 9 항에 있어서,
    입자의 동적광산란 측정으로부터 유래된 다분산지수는 0.5 미만인 조성물.
  25. 제 9 항에 있어서,
    입자의 제타-전위는 20 mV 이상인 조성물.
  26. 제 23 항에 있어서,
    HBG는 5% 글루코스 (w/v) 및 10 mM HEPES, pH 7.1을 포함하는 조성물.
  27. 제 23 항에 있어서,
    HBT는 10% 트레할로스 (w/v) 및 10 mM HEPES, pH 7.1을 포함하는 조성물.
  28. 제 9 항에 있어서,
    입자는 생리적 pH에서 중성 또는 양전하인 조성물.
  29. 제 1 항, 제 3항, 제 6항 및 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
    단일가닥 RNA는 6000 내지 15000개의 염기의 염기 분자인 조성물.
  30. 제 1 항, 제 3항, 제 6항 및 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
    단일가닥 RNA는 적어도 하나의 목적 단백질을 코딩하는 조성물.
  31. 제 1 항, 제 3항, 제 6항 및 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
    단일가닥 RNA는 레플리콘인 조성물.
  32. 제 31 항에 있어서,
    레플리콘은 알파바이러스로부터 복제효소에 의해 복제될 수 있는 조성물.
  33. 제 1 항, 제 3항, 제 6항 및 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
    단일가닥 RNA는 펩티드 또는 약학적 활성 펩티드 또는 단백질을 포함하는 목적 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함하는 조성물.
  34. 제 1 항, 제 3항, 제 6항 및 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
    조성물은 치료법에서 사용하기 위한 조성물.
  35. 제 1 항, 제 3항, 제 6항 및 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
    조성물은 백신 조성물인 조성물.
  36. 제 10항에 있어서,
    p, q, 및 r의 합은 중합체의 평균 분자량이 5000 내지 105 Da이거나 10000 내지 40000 Da이거나 15000 내지 30000 Da이거나, 20000 내지 25000 Da인 조성물.
  37. 제 11 항에 있어서,
    n, m 및 l은 독립적으로 2 및 3으로부터 선택되는 조성물.
  38. 제 14항에 있어서,
    폴리알킬렌이민은 폴리에틸렌이민을 포함하는 조성물.
  39. 제 19에 있어서,
    당류는 글루코스, 트레할로스, 및 사카로스로부터 선택되는 조성물.
  40. 제 24항에 있어서,
    입자의 동적광산란 측정으로부터 유래된 다분산지수는 0.3 미만인 조성물.
  41. 제 24항에 있어서,
    입자의 동적광산란 측정으로부터 유래된 다분산지수는 0.2 미만인 조성물.
  42. 제 25 항에 있어서,
    입자의 제타-전위는 25 내지 40 mV인 조성물.
  43. 제 29항에 있어서,
    단일가닥 RNA는 9000 내지 12000개의 염기 분자인 조성물.
  44. 제 31항에 있어서,
    단일가닥 RNA는 자가-복제 또는 자가-증폭 RNA인 조성물.
  45. 제 32항에 있어서,
    레플리콘은 알파바이러스 또는 이의 변이체로부터의 5' 복제인식서열, 및 알파바이러스 또는 이의 변이체로부터의 3' 복제인식서열을 포함하는 조성물.


  46. 삭제
  47. 삭제
  48. 삭제
  49. 삭제
  50. 삭제
  51. 삭제
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