KR20200109310A - Rna의 투여를 위한 제형 - Google Patents
Rna의 투여를 위한 제형 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20200109310A KR20200109310A KR1020207020125A KR20207020125A KR20200109310A KR 20200109310 A KR20200109310 A KR 20200109310A KR 1020207020125 A KR1020207020125 A KR 1020207020125A KR 20207020125 A KR20207020125 A KR 20207020125A KR 20200109310 A KR20200109310 A KR 20200109310A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- rna
- composition
- protein
- pei
- antigen
- Prior art date
Links
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 252
- 238000009472 formulation Methods 0.000 title abstract description 94
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims abstract description 79
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 claims abstract description 17
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 claims abstract description 9
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 claims abstract description 8
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 claims description 201
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 193
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 162
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 129
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 119
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 119
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 claims description 112
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 claims description 108
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 101
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 75
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims description 56
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 48
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 48
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 47
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 claims description 44
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 42
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 38
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 claims description 38
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 claims description 38
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 claims description 35
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 claims description 32
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 claims description 32
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 claims description 32
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 claims description 32
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 claims description 32
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 27
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims description 26
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 26
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 claims description 24
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 23
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- 241000710959 Venezuelan equine encephalitis virus Species 0.000 claims description 21
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 19
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 claims description 18
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 16
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 16
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 claims description 15
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 claims description 14
- 241000710961 Semliki Forest virus Species 0.000 claims description 13
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 claims description 13
- 125000004433 nitrogen atom Chemical group N* 0.000 claims description 13
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 13
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 claims description 12
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 10
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 10
- 238000002296 dynamic light scattering Methods 0.000 claims description 10
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims description 9
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims description 9
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 claims description 9
- 239000002577 cryoprotective agent Substances 0.000 claims description 9
- 229960004793 sucrose Drugs 0.000 claims description 9
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 claims description 8
- 239000000654 additive Substances 0.000 claims description 8
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 8
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 claims description 8
- 125000004437 phosphorous atom Chemical group 0.000 claims description 8
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 claims description 7
- 235000013681 dietary sucrose Nutrition 0.000 claims description 7
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 claims description 7
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 claims description 6
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 claims description 6
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 claims description 6
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 claims description 6
- NUFBIAUZAMHTSP-UHFFFAOYSA-N 3-(n-morpholino)-2-hydroxypropanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CC(O)CN1CCOCC1 NUFBIAUZAMHTSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 claims description 5
- SXGZJKUKBWWHRA-UHFFFAOYSA-N 2-(N-morpholiniumyl)ethanesulfonate Chemical compound [O-]S(=O)(=O)CC[NH+]1CCOCC1 SXGZJKUKBWWHRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 108010003533 Viral Envelope Proteins Proteins 0.000 claims description 4
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 claims description 4
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 claims description 4
- 229920000333 poly(propyleneimine) Polymers 0.000 claims description 4
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 claims description 4
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 claims description 3
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 claims description 3
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 claims description 3
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 claims description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 claims description 3
- 150000004043 trisaccharides Chemical class 0.000 claims description 3
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 235000013772 propylene glycol Nutrition 0.000 claims 2
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 claims 1
- 150000002334 glycols Chemical class 0.000 claims 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 abstract description 9
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 abstract description 5
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 473
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 166
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 154
- 241000710929 Alphavirus Species 0.000 description 143
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 108
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 107
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 107
- 108091027544 Subgenomic mRNA Proteins 0.000 description 94
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 67
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 65
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 64
- 108010026228 mRNA guanylyltransferase Proteins 0.000 description 61
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 59
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 56
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 53
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 53
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 51
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 50
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 50
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 47
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 46
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 45
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 44
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 41
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 40
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 39
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 38
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 35
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 35
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 35
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 35
- 229940074410 trehalose Drugs 0.000 description 35
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 34
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 33
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 33
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 28
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 28
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 28
- 229940078677 sarna Drugs 0.000 description 27
- 229960001484 edetic acid Drugs 0.000 description 26
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 26
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 26
- -1 trehalose Chemical class 0.000 description 26
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 25
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 25
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 24
- 210000000663 muscle cell Anatomy 0.000 description 24
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 24
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 24
- 108091036078 conserved sequence Proteins 0.000 description 23
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 23
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 22
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 22
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 21
- 241000272534 Struthio camelus Species 0.000 description 21
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 20
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 20
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 20
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 20
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 19
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 19
- 101800001758 RNA-directed RNA polymerase nsP4 Proteins 0.000 description 19
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 19
- 239000012861 aquazol Substances 0.000 description 19
- 229920006187 aquazol Polymers 0.000 description 19
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 19
- 241000894007 species Species 0.000 description 19
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 18
- 230000006870 function Effects 0.000 description 18
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 18
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 18
- 239000007987 MES buffer Substances 0.000 description 17
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 17
- 238000010668 complexation reaction Methods 0.000 description 16
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 16
- 238000001694 spray drying Methods 0.000 description 16
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 16
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 16
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 15
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 15
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 14
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 14
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 14
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 14
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 14
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 14
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 14
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 14
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 13
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 13
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 13
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 13
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 13
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 13
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 13
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 13
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 13
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 13
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 12
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 11
- 102100034170 Interferon-induced, double-stranded RNA-activated protein kinase Human genes 0.000 description 11
- 101800000515 Non-structural protein 3 Proteins 0.000 description 11
- 108091036407 Polyadenylation Proteins 0.000 description 11
- 101800000980 Protease nsP2 Proteins 0.000 description 11
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 11
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 11
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 11
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 11
- 210000003141 lower extremity Anatomy 0.000 description 11
- 230000008569 process Effects 0.000 description 11
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 11
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 11
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 11
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 11
- 241000710960 Sindbis virus Species 0.000 description 10
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 10
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 10
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 10
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 10
- 239000000047 product Substances 0.000 description 10
- 230000004044 response Effects 0.000 description 10
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 10
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 9
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 9
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 9
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 9
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 9
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 9
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 9
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 9
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 9
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 8
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 8
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 8
- 108010076039 Polyproteins Proteins 0.000 description 8
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- 230000008859 change Effects 0.000 description 8
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 8
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 8
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 8
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 8
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 8
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 8
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 8
- 108020005345 3' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 7
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 7
- 238000011725 BALB/c mouse Methods 0.000 description 7
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 7
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 7
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 7
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 7
- 239000012124 Opti-MEM Substances 0.000 description 7
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 7
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 7
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 7
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 7
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 7
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 7
- 239000003999 initiator Substances 0.000 description 7
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 7
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 7
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 7
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 7
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 7
- 108020003589 5' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 6
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 6
- 241001502567 Chikungunya virus Species 0.000 description 6
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N Isoflurane Chemical compound FC(F)OC(Cl)C(F)(F)F PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000006819 RNA synthesis Effects 0.000 description 6
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 6
- 239000013566 allergen Substances 0.000 description 6
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 6
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 6
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 6
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 6
- 238000011161 development Methods 0.000 description 6
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 6
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N dimethylselenoniopropionate Natural products CCC(O)=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 6
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 6
- 235000019688 fish Nutrition 0.000 description 6
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 6
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 6
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 6
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 6
- 229960002725 isoflurane Drugs 0.000 description 6
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 6
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 6
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 6
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 6
- NYEZZYQZRQDLEH-UHFFFAOYSA-N 2-ethyl-4,5-dihydro-1,3-oxazole Chemical compound CCC1=NCCO1 NYEZZYQZRQDLEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 5
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 5
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 5
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 5
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 5
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 5
- 230000010530 Virus Neutralization Effects 0.000 description 5
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 5
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 5
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 5
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 5
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 5
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 5
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 5
- 230000000536 complexating effect Effects 0.000 description 5
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 5
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 5
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 5
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 5
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 5
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 5
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 5
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 5
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 5
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 5
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 5
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 5
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 5
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 5
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 5
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 5
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 description 5
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 4
- IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N D-Luciferin Chemical compound OC(=O)[C@H]1CSC(C=2SC3=CC=C(O)C=C3N=2)=N1 IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N 0.000 description 4
- IAYPIBMASNFSPL-UHFFFAOYSA-N Ethylene oxide Chemical compound C1CO1 IAYPIBMASNFSPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 4
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 4
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 4
- 108091054437 MHC class I family Proteins 0.000 description 4
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 4
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 4
- 101710114167 Polyprotein P1234 Proteins 0.000 description 4
- 101710124590 Polyprotein nsP1234 Proteins 0.000 description 4
- 241001673669 Porcine circovirus 2 Species 0.000 description 4
- GOOHAUXETOMSMM-UHFFFAOYSA-N Propylene oxide Chemical compound CC1CO1 GOOHAUXETOMSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 4
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 4
- UDMBCSSLTHHNCD-KQYNXXCUSA-N adenosine 5'-monophosphate Chemical group C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O UDMBCSSLTHHNCD-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 4
- 230000002009 allergenic effect Effects 0.000 description 4
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 238000005415 bioluminescence Methods 0.000 description 4
- 230000029918 bioluminescence Effects 0.000 description 4
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 4
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 4
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 4
- 238000003114 enzyme-linked immunosorbent spot assay Methods 0.000 description 4
- 125000003916 ethylene diamine group Chemical group 0.000 description 4
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 4
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 4
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 4
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 4
- RQFCJASXJCIDSX-UUOKFMHZSA-N guanosine 5'-monophosphate Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O RQFCJASXJCIDSX-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 4
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 4
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 4
- 229940027941 immunoglobulin g Drugs 0.000 description 4
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 4
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 4
- 229960001375 lactose Drugs 0.000 description 4
- 238000003670 luciferase enzyme activity assay Methods 0.000 description 4
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 4
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 4
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 4
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 4
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 4
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 4
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 4
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 4
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 4
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 4
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 4
- 238000011146 sterile filtration Methods 0.000 description 4
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 4
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 4
- LZOIGVDSAMDBIO-LXWJMTKESA-N (2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2S)-4-amino-2-[[(2S,3S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-3-(4-hydroxyphenyl)propanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-3-methylpentanoyl]amino]-4-oxobutanoyl]amino]-3-methylpentanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-4-methylpentanoic acid Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)[C@@H](C)CC)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C1=CC=CC=C1 LZOIGVDSAMDBIO-LXWJMTKESA-N 0.000 description 3
- 102000003859 Claudin-6 Human genes 0.000 description 3
- 108090000229 Claudin-6 Proteins 0.000 description 3
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 3
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N Dehydro-luciferin Natural products OC(=O)C1=CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N Fivefly Luciferin Natural products OC(=O)C1CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 3
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 3
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 3
- 102000008949 Histocompatibility Antigens Class I Human genes 0.000 description 3
- DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N Luciferin Natural products CCc1c(C)c(CC2NC(=O)C(=C2C=C)C)[nH]c1Cc3[nH]c4C(=C5/NC(CC(=O)O)C(C)C5CC(=O)O)CC(=O)c4c3C DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010066345 MHC binding peptide Proteins 0.000 description 3
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 description 3
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 description 3
- 101710152005 Non-structural polyprotein Proteins 0.000 description 3
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 3
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 3
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 3
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 3
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 3
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 3
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 3
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 3
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 3
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 3
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 3
- 210000004900 c-terminal fragment Anatomy 0.000 description 3
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 3
- 238000003570 cell viability assay Methods 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 3
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 3
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 230000009429 distress Effects 0.000 description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 3
- 230000009881 electrostatic interaction Effects 0.000 description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 3
- 239000012537 formulation buffer Substances 0.000 description 3
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 3
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 3
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 3
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 3
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 3
- 210000004392 genitalia Anatomy 0.000 description 3
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 3
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 3
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 3
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 3
- 238000006317 isomerization reaction Methods 0.000 description 3
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 3
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 102000035085 multipass transmembrane proteins Human genes 0.000 description 3
- 108091005494 multipass transmembrane proteins Proteins 0.000 description 3
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 3
- 210000004898 n-terminal fragment Anatomy 0.000 description 3
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 3
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 3
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 3
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 3
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 3
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 235000019260 propionic acid Nutrition 0.000 description 3
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 3
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 3
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 3
- IUVKMZGDUIUOCP-BTNSXGMBSA-N quinbolone Chemical compound O([C@H]1CC[C@H]2[C@H]3[C@@H]([C@]4(C=CC(=O)C=C4CC3)C)CC[C@@]21C)C1=CCCC1 IUVKMZGDUIUOCP-BTNSXGMBSA-N 0.000 description 3
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 238000007142 ring opening reaction Methods 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 3
- 241000114864 ssRNA viruses Species 0.000 description 3
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 3
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 description 2
- URDCARMUOSMFFI-UHFFFAOYSA-N 2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(2-hydroxyethyl)amino]acetic acid Chemical compound OCCN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O URDCARMUOSMFFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LKKMLIBUAXYLOY-UHFFFAOYSA-N 3-Amino-1-methyl-5H-pyrido[4,3-b]indole Chemical compound N1C2=CC=CC=C2C2=C1C=C(N)N=C2C LKKMLIBUAXYLOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WEVYNIUIFUYDGI-UHFFFAOYSA-N 3-[6-[4-(trifluoromethoxy)anilino]-4-pyrimidinyl]benzamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=CC(C=2N=CN=C(NC=3C=CC(OC(F)(F)F)=CC=3)C=2)=C1 WEVYNIUIFUYDGI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FJKROLUGYXJWQN-UHFFFAOYSA-N 4-hydroxybenzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 FJKROLUGYXJWQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 2
- 206010001935 American trypanosomiasis Diseases 0.000 description 2
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 2
- 241000272517 Anseriformes Species 0.000 description 2
- 101001020123 Arabidopsis thaliana Eukaryotic translation initiation factor 2 subunit alpha Proteins 0.000 description 2
- 241000416162 Astragalus gummifer Species 0.000 description 2
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 2
- 241000710946 Barmah Forest virus Species 0.000 description 2
- 241000608319 Bebaru virus Species 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 2
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 2
- 102000007644 Colony-Stimulating Factors Human genes 0.000 description 2
- 108010071942 Colony-Stimulating Factors Proteins 0.000 description 2
- 108020004394 Complementary RNA Proteins 0.000 description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 description 2
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 2
- 241000710945 Eastern equine encephalitis virus Species 0.000 description 2
- 238000011510 Elispot assay Methods 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 206010014611 Encephalitis venezuelan equine Diseases 0.000 description 2
- 206010014614 Encephalitis western equine Diseases 0.000 description 2
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 description 2
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 description 2
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 description 2
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 description 2
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 2
- 241000710198 Foot-and-mouth disease virus Species 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 2
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 2
- NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N Guanosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 2
- 206010069767 H1N1 influenza Diseases 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 2
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 2
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 2
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 2
- 102100031413 L-dopachrome tautomerase Human genes 0.000 description 2
- 101710093778 L-dopachrome tautomerase Proteins 0.000 description 2
- 239000000232 Lipid Bilayer Substances 0.000 description 2
- 102100024640 Low-density lipoprotein receptor Human genes 0.000 description 2
- 102000043129 MHC class I family Human genes 0.000 description 2
- 102000043131 MHC class II family Human genes 0.000 description 2
- 108091054438 MHC class II family Proteins 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 2
- 102100028389 Melanoma antigen recognized by T-cells 1 Human genes 0.000 description 2
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 2
- 241000710949 Middelburg virus Species 0.000 description 2
- 102000003505 Myosin Human genes 0.000 description 2
- 108060008487 Myosin Proteins 0.000 description 2
- QPCDCPDFJACHGM-UHFFFAOYSA-N N,N-bis{2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl}glycine Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(=O)O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O QPCDCPDFJACHGM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 208000030852 Parasitic disease Diseases 0.000 description 2
- 241000223821 Plasmodium malariae Species 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 101800001696 Polyprotein P123 Proteins 0.000 description 2
- 101100382437 Porcine circovirus 2 Cap gene Proteins 0.000 description 2
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 2
- 201000003176 Severe Acute Respiratory Syndrome Diseases 0.000 description 2
- 101710173694 Short transient receptor potential channel 2 Proteins 0.000 description 2
- 102100038803 Somatotropin Human genes 0.000 description 2
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 2
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 2
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 2
- 229920001615 Tragacanth Polymers 0.000 description 2
- 241000223104 Trypanosoma Species 0.000 description 2
- 241000223109 Trypanosoma cruzi Species 0.000 description 2
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 2
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 description 2
- 208000002495 Uterine Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 101900001372 Vaccinia virus RNA-binding protein E3 Proteins 0.000 description 2
- 208000002687 Venezuelan Equine Encephalomyelitis Diseases 0.000 description 2
- 201000009145 Venezuelan equine encephalitis Diseases 0.000 description 2
- 208000005466 Western Equine Encephalomyelitis Diseases 0.000 description 2
- 201000005806 Western equine encephalitis Diseases 0.000 description 2
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- DPXJVFZANSGRMM-UHFFFAOYSA-N acetic acid;2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal;sodium Chemical compound [Na].CC(O)=O.OCC(O)C(O)C(O)C(O)C=O DPXJVFZANSGRMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 2
- 238000005054 agglomeration Methods 0.000 description 2
- 229940037003 alum Drugs 0.000 description 2
- 229920000469 amphiphilic block copolymer Polymers 0.000 description 2
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 2
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 description 2
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 2
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 2
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 229920001400 block copolymer Polymers 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 2
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 2
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 2
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 2
- 230000020176 deacylation Effects 0.000 description 2
- 238000005947 deacylation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 2
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 2
- VYFYYTLLBUKUHU-UHFFFAOYSA-N dopamine Chemical compound NCCC1=CC=C(O)C(O)=C1 VYFYYTLLBUKUHU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 2
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 description 2
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 2
- 229960000301 factor viii Drugs 0.000 description 2
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 2
- 235000013355 food flavoring agent Nutrition 0.000 description 2
- BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N gamma-aminobutyric acid Chemical compound NCCCC(O)=O BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 229930004094 glycosylphosphatidylinositol Natural products 0.000 description 2
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 2
- 208000007475 hemolytic anemia Diseases 0.000 description 2
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 description 2
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 2
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 2
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 2
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 2
- FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N isomaltotriose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O)O1 FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 230000005923 long-lasting effect Effects 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000012931 lyophilized formulation Substances 0.000 description 2
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 2
- 229960002160 maltose Drugs 0.000 description 2
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 2
- 238000001543 one-way ANOVA Methods 0.000 description 2
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 2
- 230000036407 pain Effects 0.000 description 2
- 229960003330 pentetic acid Drugs 0.000 description 2
- 238000011170 pharmaceutical development Methods 0.000 description 2
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 2
- 229940127557 pharmaceutical product Drugs 0.000 description 2
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 2
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 2
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 229920000447 polyanionic polymer Polymers 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 2
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 2
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 2
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 2
- 108010054624 red fluorescent protein Proteins 0.000 description 2
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 2
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 2
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 2
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 2
- FSYKKLYZXJSNPZ-UHFFFAOYSA-N sarcosine Chemical compound C[NH2+]CC([O-])=O FSYKKLYZXJSNPZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001932 seasonal effect Effects 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- WXMKPNITSTVMEF-UHFFFAOYSA-M sodium benzoate Chemical compound [Na+].[O-]C(=O)C1=CC=CC=C1 WXMKPNITSTVMEF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000004299 sodium benzoate Substances 0.000 description 2
- 235000010234 sodium benzoate Nutrition 0.000 description 2
- 235000019812 sodium carboxymethyl cellulose Nutrition 0.000 description 2
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 2
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 2
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 2
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 2
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 2
- 201000010740 swine influenza Diseases 0.000 description 2
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 2
- 201000000596 systemic lupus erythematosus Diseases 0.000 description 2
- 206010043778 thyroiditis Diseases 0.000 description 2
- 235000010487 tragacanth Nutrition 0.000 description 2
- 239000000196 tragacanth Substances 0.000 description 2
- 229940116362 tragacanth Drugs 0.000 description 2
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 2
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 2
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 2
- 238000009827 uniform distribution Methods 0.000 description 2
- 206010046766 uterine cancer Diseases 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- OGNSCSPNOLGXSM-UHFFFAOYSA-N (+/-)-DABA Natural products NCCC(N)C(O)=O OGNSCSPNOLGXSM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LGQKSQQRKHFMLI-SJYYZXOBSA-N (2s,3r,4s,5r)-2-[(3r,4r,5r,6r)-4,5,6-trihydroxyoxan-3-yl]oxyoxane-3,4,5-triol Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)CO[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)OC1 LGQKSQQRKHFMLI-SJYYZXOBSA-N 0.000 description 1
- SSOORFWOBGFTHL-OTEJMHTDSA-N (4S)-5-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-6-amino-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[2-[(2S)-2-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-6-amino-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S,3S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-6-amino-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-5-amino-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-6-amino-1-[[(2S)-6-amino-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-5-amino-1-[[(2S)-5-carbamimidamido-1-[[(2S)-5-carbamimidamido-1-[[(1S)-4-carbamimidamido-1-carboxybutyl]amino]-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxopentan-2-yl]amino]-1,5-dioxopentan-2-yl]amino]-5-carbamimidamido-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-carbamimidamido-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxohexan-2-yl]amino]-1-oxohexan-2-yl]amino]-5-carbamimidamido-1-oxopentan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-1,5-dioxopentan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-hydroxy-1-oxopropan-2-yl]amino]-3-hydroxy-1-oxopropan-2-yl]amino]-3-hydroxy-1-oxopropan-2-yl]amino]-1-oxopropan-2-yl]amino]-1-oxohexan-2-yl]amino]-3-hydroxy-1-oxopropan-2-yl]amino]-1-oxo-3-phenylpropan-2-yl]amino]-3-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-methyl-1-oxobutan-2-yl]amino]-5-carbamimidamido-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxohexan-2-yl]amino]-3-methyl-1-oxobutan-2-yl]amino]-5-carbamimidamido-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-methyl-1-oxobutan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxopropan-2-yl]amino]-5-carbamimidamido-1-oxopentan-2-yl]carbamoyl]pyrrolidin-1-yl]-2-oxoethyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)-1-oxopropan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxo-3-phenylpropan-2-yl]amino]-5-carbamimidamido-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxohexan-2-yl]amino]-3-methyl-1-oxobutan-2-yl]amino]-5-carbamimidamido-1-oxopentan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxo-3-phenylpropan-2-yl]amino]-3-(1H-imidazol-4-yl)-1-oxopropan-2-yl]amino]-3-methyl-1-oxobutan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2,6-diaminohexanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]propanoyl]amino]-5-oxopentanoic acid Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)CNC(=O)[C@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](Cc1ccccc1)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](Cc1ccccc1)NC(=O)[C@H](Cc1c[nH]cn1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CCCCN)C(C)C)C(C)C)C(C)C)C(C)C)C(C)C)C(C)C)C(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O SSOORFWOBGFTHL-OTEJMHTDSA-N 0.000 description 1
- WEYNBWVKOYCCQT-UHFFFAOYSA-N 1-(3-chloro-4-methylphenyl)-3-{2-[({5-[(dimethylamino)methyl]-2-furyl}methyl)thio]ethyl}urea Chemical compound O1C(CN(C)C)=CC=C1CSCCNC(=O)NC1=CC=C(C)C(Cl)=C1 WEYNBWVKOYCCQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IXPNQXFRVYWDDI-UHFFFAOYSA-N 1-methyl-2,4-dioxo-1,3-diazinane-5-carboximidamide Chemical compound CN1CC(C(N)=N)C(=O)NC1=O IXPNQXFRVYWDDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZIIUUSVHCHPIQD-UHFFFAOYSA-N 2,4,6-trimethyl-N-[3-(trifluoromethyl)phenyl]benzenesulfonamide Chemical compound CC1=CC(C)=CC(C)=C1S(=O)(=O)NC1=CC=CC(C(F)(F)F)=C1 ZIIUUSVHCHPIQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IEQAICDLOKRSRL-UHFFFAOYSA-N 2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-dodecoxyethoxy)ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethanol Chemical compound CCCCCCCCCCCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCO IEQAICDLOKRSRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UHTQHHLSGVOGQR-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-4-ium-1-yl]ethanesulfonate Chemical compound OCCN1CCN(CCS(O)(=O)=O)CC1.OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 UHTQHHLSGVOGQR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QIGJYVCQYDKYDW-UHFFFAOYSA-N 3-O-alpha-D-mannopyranosyl-D-mannopyranose Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(CO)OC(O)C1O QIGJYVCQYDKYDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CSDQQAQKBAQLLE-UHFFFAOYSA-N 4-(4-chlorophenyl)-4,5,6,7-tetrahydrothieno[3,2-c]pyridine Chemical compound C1=CC(Cl)=CC=C1C1C(C=CS2)=C2CCN1 CSDQQAQKBAQLLE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LGQKSQQRKHFMLI-UHFFFAOYSA-N 4-O-beta-D-xylopyranosyl-beta-D-xylopyranose Natural products OC1C(O)C(O)COC1OC1C(O)C(O)C(O)OC1 LGQKSQQRKHFMLI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940090248 4-hydroxybenzoic acid Drugs 0.000 description 1
- 102100030310 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid oxidase Human genes 0.000 description 1
- 101710163881 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid oxidase Proteins 0.000 description 1
- FVFVNNKYKYZTJU-UHFFFAOYSA-N 6-chloro-1,3,5-triazine-2,4-diamine Chemical group NC1=NC(N)=NC(Cl)=N1 FVFVNNKYKYZTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000035657 Abasia Diseases 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 101710137115 Adenylyl cyclase-associated protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 208000007887 Alphavirus Infections Diseases 0.000 description 1
- 108010039224 Amidophosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 102000052587 Anaphase-Promoting Complex-Cyclosome Apc3 Subunit Human genes 0.000 description 1
- 108700004606 Anaphase-Promoting Complex-Cyclosome Apc3 Subunit Proteins 0.000 description 1
- 208000031295 Animal disease Diseases 0.000 description 1
- 102100023003 Ankyrin repeat domain-containing protein 30A Human genes 0.000 description 1
- 108090000935 Antithrombin III Proteins 0.000 description 1
- 102100022977 Antithrombin-III Human genes 0.000 description 1
- 101000719121 Arabidopsis thaliana Protein MEI2-like 1 Proteins 0.000 description 1
- 108010078554 Aromatase Proteins 0.000 description 1
- 102000014654 Aromatase Human genes 0.000 description 1
- 241000238421 Arthropoda Species 0.000 description 1
- 102000005427 Asialoglycoprotein Receptor Human genes 0.000 description 1
- 241000178568 Aura virus Species 0.000 description 1
- 102100035526 B melanoma antigen 1 Human genes 0.000 description 1
- 241000231314 Babanki virus Species 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- 102100021663 Baculoviral IAP repeat-containing protein 5 Human genes 0.000 description 1
- 208000023328 Basedow disease Diseases 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-DCSYEGIMSA-N Beta-Lactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-DCSYEGIMSA-N 0.000 description 1
- 102000015735 Beta-catenin Human genes 0.000 description 1
- 108060000903 Beta-catenin Proteins 0.000 description 1
- 102100023995 Beta-nerve growth factor Human genes 0.000 description 1
- 241000868136 Bijou Bridge virus Species 0.000 description 1
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000409811 Bombyx mori nucleopolyhedrovirus Species 0.000 description 1
- 206010005949 Bone cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000018084 Bone neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241000588832 Bordetella pertussis Species 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 101001129912 Bos taurus Leptin Proteins 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241000231316 Buggy Creek virus Species 0.000 description 1
- 101150108242 CDC27 gene Proteins 0.000 description 1
- 101710156847 CTD small phosphatase-like protein Proteins 0.000 description 1
- 102100027674 CTD small phosphatase-like protein Human genes 0.000 description 1
- 241000868138 Cabassou virus Species 0.000 description 1
- 241000282836 Camelus dromedarius Species 0.000 description 1
- 102100025570 Cancer/testis antigen 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100039510 Cancer/testis antigen 2 Human genes 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 101710134395 Carboxy-terminal domain RNA polymerase II polypeptide A small phosphatase 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100027668 Carboxy-terminal domain RNA polymerase II polypeptide A small phosphatase 1 Human genes 0.000 description 1
- 101710134389 Carboxy-terminal domain RNA polymerase II polypeptide A small phosphatase 2 Proteins 0.000 description 1
- 102100027667 Carboxy-terminal domain RNA polymerase II polypeptide A small phosphatase 2 Human genes 0.000 description 1
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108090000538 Caspase-8 Proteins 0.000 description 1
- 102100026548 Caspase-8 Human genes 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- 102100025064 Cellular tumor antigen p53 Human genes 0.000 description 1
- 108010059892 Cellulase Proteins 0.000 description 1
- 208000024699 Chagas disease Diseases 0.000 description 1
- 241000606161 Chlamydia Species 0.000 description 1
- 206010008631 Cholera Diseases 0.000 description 1
- 102000002029 Claudin Human genes 0.000 description 1
- 108050009302 Claudin Proteins 0.000 description 1
- 102100039518 Claudin-12 Human genes 0.000 description 1
- 101710197000 Claudin-12 Proteins 0.000 description 1
- 102100022641 Coagulation factor IX Human genes 0.000 description 1
- 102100023804 Coagulation factor VII Human genes 0.000 description 1
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 1
- 208000015943 Coeliac disease Diseases 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010010144 Completed suicide Diseases 0.000 description 1
- 102100040501 Contactin-associated protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 208000034656 Contusions Diseases 0.000 description 1
- 208000011231 Crohn disease Diseases 0.000 description 1
- MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N Crotonoside Natural products C1=NC2=C(N)NC(=O)N=C2N1[C@H]1O[C@@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N 0.000 description 1
- 108010025464 Cyclin-Dependent Kinase 4 Proteins 0.000 description 1
- 102100036252 Cyclin-dependent kinase 4 Human genes 0.000 description 1
- 108010015742 Cytochrome P-450 Enzyme System Proteins 0.000 description 1
- 102000003849 Cytochrome P450 Human genes 0.000 description 1
- 102000018832 Cytochromes Human genes 0.000 description 1
- 108010052832 Cytochromes Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-CUHNMECISA-N D-Cellobiose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-CUHNMECISA-N 0.000 description 1
- NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N D-guanosine Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1OC(CO)C(O)C1O NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SQNRKWHRVIAKLP-UHFFFAOYSA-N D-xylobiose Natural products O=CC(O)C(O)C(CO)OC1OCC(O)C(O)C1O SQNRKWHRVIAKLP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100239628 Danio rerio myca gene Proteins 0.000 description 1
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 239000004375 Dextrin Substances 0.000 description 1
- 229920001353 Dextrin Polymers 0.000 description 1
- 101100216227 Dictyostelium discoideum anapc3 gene Proteins 0.000 description 1
- MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N Dioxygen Chemical compound O=O MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100037070 Doublecortin domain-containing protein 2 Human genes 0.000 description 1
- 208000006825 Eastern Equine Encephalomyelitis Diseases 0.000 description 1
- 201000005804 Eastern equine encephalitis Diseases 0.000 description 1
- 108010014258 Elastin Proteins 0.000 description 1
- 102000016942 Elastin Human genes 0.000 description 1
- 206010014587 Encephalitis eastern equine Diseases 0.000 description 1
- 208000001976 Endocrine Gland Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010066919 Epidemic polyarthritis Diseases 0.000 description 1
- 102400001368 Epidermal growth factor Human genes 0.000 description 1
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 208000000461 Esophageal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 241000465885 Everglades virus Species 0.000 description 1
- 208000010201 Exanthema Diseases 0.000 description 1
- 108010076282 Factor IX Proteins 0.000 description 1
- 108010023321 Factor VII Proteins 0.000 description 1
- 108010014173 Factor X Proteins 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 1
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 1
- 102100028043 Fibroblast growth factor 3 Human genes 0.000 description 1
- 108010022355 Fibroins Proteins 0.000 description 1
- 208000007212 Foot-and-Mouth Disease Diseases 0.000 description 1
- 241000231322 Fort Morgan virus Species 0.000 description 1
- 108091006027 G proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000030782 GTP binding Human genes 0.000 description 1
- 108091000058 GTP-Binding Proteins 0.000 description 1
- 102000030902 Galactosyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 108060003306 Galactosyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- 241000608297 Getah virus Species 0.000 description 1
- 208000032612 Glial tumor Diseases 0.000 description 1
- 206010018338 Glioma Diseases 0.000 description 1
- 108010017544 Glucosylceramidase Proteins 0.000 description 1
- 102000004547 Glucosylceramidase Human genes 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000006771 Gonadotropins Human genes 0.000 description 1
- 108010086677 Gonadotropins Proteins 0.000 description 1
- 206010018612 Gonorrhoea Diseases 0.000 description 1
- 208000015023 Graves' disease Diseases 0.000 description 1
- 102000009465 Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010009202 Growth Factor Receptors Proteins 0.000 description 1
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- 108010078321 Guanylate Cyclase Proteins 0.000 description 1
- 102000014469 Guanylate cyclase Human genes 0.000 description 1
- HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N HA peptide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)C1=CC=C(O)C=C1 HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N 0.000 description 1
- 208000030836 Hashimoto thyroiditis Diseases 0.000 description 1
- 208000005176 Hepatitis C Diseases 0.000 description 1
- 241000710948 Highlands J virus Species 0.000 description 1
- 108010088652 Histocompatibility Antigens Class I Proteins 0.000 description 1
- 208000017604 Hodgkin disease Diseases 0.000 description 1
- 208000010747 Hodgkins lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 101000757191 Homo sapiens Ankyrin repeat domain-containing protein 30A Proteins 0.000 description 1
- 101000874316 Homo sapiens B melanoma antigen 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000856237 Homo sapiens Cancer/testis antigen 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000889345 Homo sapiens Cancer/testis antigen 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000721661 Homo sapiens Cellular tumor antigen p53 Proteins 0.000 description 1
- 101000954709 Homo sapiens Doublecortin domain-containing protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000985516 Homo sapiens Hermansky-Pudlak syndrome 5 protein Proteins 0.000 description 1
- 101000614481 Homo sapiens Kidney-associated antigen 1 Proteins 0.000 description 1
- 101001051093 Homo sapiens Low-density lipoprotein receptor Proteins 0.000 description 1
- 101001134060 Homo sapiens Melanocyte-stimulating hormone receptor Proteins 0.000 description 1
- 101000578784 Homo sapiens Melanoma antigen recognized by T-cells 1 Proteins 0.000 description 1
- 101001133056 Homo sapiens Mucin-1 Proteins 0.000 description 1
- 101000874141 Homo sapiens Probable ATP-dependent RNA helicase DDX43 Proteins 0.000 description 1
- 101000880770 Homo sapiens Protein SSX2 Proteins 0.000 description 1
- 101000679365 Homo sapiens Putative tyrosine-protein phosphatase TPTE Proteins 0.000 description 1
- 101001109419 Homo sapiens RNA-binding protein NOB1 Proteins 0.000 description 1
- 101001012157 Homo sapiens Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Proteins 0.000 description 1
- 101001094545 Homo sapiens Retrotransposon-like protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000857677 Homo sapiens Runt-related transcription factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000821981 Homo sapiens Sarcoma antigen 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000665137 Homo sapiens Scm-like with four MBT domains protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000739178 Homo sapiens Secretoglobin family 3A member 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000648075 Homo sapiens Trafficking protein particle complex subunit 1 Proteins 0.000 description 1
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 description 1
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 description 1
- 101100508081 Human herpesvirus 1 (strain 17) ICP34.5 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000004354 Hydroxyethyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920000663 Hydroxyethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N Hydroxyproline Chemical compound O[C@H]1CN[C@H](C(O)=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 241001328112 Igbo Ora virus Species 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 108010001127 Insulin Receptor Proteins 0.000 description 1
- 102100036721 Insulin receptor Human genes 0.000 description 1
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 description 1
- 108050002021 Integrator complex subunit 2 Proteins 0.000 description 1
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 description 1
- 108090000172 Interleukin-15 Proteins 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 108010002586 Interleukin-7 Proteins 0.000 description 1
- 206010061252 Intraocular melanoma Diseases 0.000 description 1
- 229920001202 Inulin Polymers 0.000 description 1
- 102000037862 Ion Transporter Human genes 0.000 description 1
- 108091006671 Ion Transporter Proteins 0.000 description 1
- AYRXSINWFIIFAE-SCLMCMATSA-N Isomaltose Natural products OC[C@H]1O[C@H](OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O AYRXSINWFIIFAE-SCLMCMATSA-N 0.000 description 1
- 208000008839 Kidney Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 241000231318 Kyzylagach virus Species 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 108010001831 LDL receptors Proteins 0.000 description 1
- 229920001543 Laminarin Polymers 0.000 description 1
- 239000005717 Laminarin Substances 0.000 description 1
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 1
- 241000222722 Leishmania <genus> Species 0.000 description 1
- 102000016267 Leptin Human genes 0.000 description 1
- 235000010643 Leucaena leucocephala Nutrition 0.000 description 1
- 240000007472 Leucaena leucocephala Species 0.000 description 1
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 description 1
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 description 1
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 description 1
- 102000006830 Luminescent Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010047357 Luminescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 108010010995 MART-1 Antigen Proteins 0.000 description 1
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 1
- 101710141452 Major surface glycoprotein G Proteins 0.000 description 1
- 241000608292 Mayaro virus Species 0.000 description 1
- 241000763097 Me Tri virus Species 0.000 description 1
- 102100034216 Melanocyte-stimulating hormone receptor Human genes 0.000 description 1
- 108090000301 Membrane transport proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003939 Membrane transport proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010057081 Merozoite Surface Protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 102000016397 Methyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 241000465889 Mosso das Pedras virus Species 0.000 description 1
- 241000868135 Mucambo virus Species 0.000 description 1
- 102100034256 Mucin-1 Human genes 0.000 description 1
- 101100198353 Mus musculus Rnasel gene Proteins 0.000 description 1
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 241000608287 Ndumu virus Species 0.000 description 1
- 206010061309 Neoplasm progression Diseases 0.000 description 1
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000007530 Neurofibromin 1 Human genes 0.000 description 1
- 108010085793 Neurofibromin 1 Proteins 0.000 description 1
- 108091092724 Noncoding DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000710944 O'nyong-nyong virus Species 0.000 description 1
- DKXNBNKWCZZMJT-UHFFFAOYSA-N O4-alpha-D-Mannopyranosyl-D-mannose Natural products O=CC(O)C(O)C(C(O)CO)OC1OC(CO)C(O)C(O)C1O DKXNBNKWCZZMJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AYRXSINWFIIFAE-UHFFFAOYSA-N O6-alpha-D-Galactopyranosyl-D-galactose Natural products OCC1OC(OCC(O)C(O)C(O)C(O)C=O)C(O)C(O)C1O AYRXSINWFIIFAE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010030155 Oesophageal carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 108010026867 Oligo-1,6-Glucosidase Proteins 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102400000050 Oxytocin Human genes 0.000 description 1
- XNOPRXBHLZRZKH-UHFFFAOYSA-N Oxytocin Natural products N1C(=O)C(N)CSSCC(C(=O)N2C(CCC2)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C1CC1=CC=C(O)C=C1 XNOPRXBHLZRZKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101800000989 Oxytocin Proteins 0.000 description 1
- 102000036673 PRAME Human genes 0.000 description 1
- 108060006580 PRAME Proteins 0.000 description 1
- 102100034640 PWWP domain-containing DNA repair factor 3A Human genes 0.000 description 1
- 108050007154 PWWP domain-containing DNA repair factor 3A Proteins 0.000 description 1
- 208000016222 Pancreatic disease Diseases 0.000 description 1
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000000821 Parathyroid Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 235000019483 Peanut oil Nutrition 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010081690 Pertussis Toxin Proteins 0.000 description 1
- 241000286209 Phasianidae Species 0.000 description 1
- 102000015439 Phospholipases Human genes 0.000 description 1
- 108010064785 Phospholipases Proteins 0.000 description 1
- 102000004861 Phosphoric Diester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090001050 Phosphoric Diester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 208000007913 Pituitary Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 201000005746 Pituitary adenoma Diseases 0.000 description 1
- 206010061538 Pituitary tumour benign Diseases 0.000 description 1
- 108010001014 Plasminogen Activators Proteins 0.000 description 1
- 102000001938 Plasminogen Activators Human genes 0.000 description 1
- 241000224016 Plasmodium Species 0.000 description 1
- 241000223960 Plasmodium falciparum Species 0.000 description 1
- 206010035501 Plasmodium malariae infection Diseases 0.000 description 1
- 241001505293 Plasmodium ovale Species 0.000 description 1
- 241000223810 Plasmodium vivax Species 0.000 description 1
- RVGRUAULSDPKGF-UHFFFAOYSA-N Poloxamer Chemical compound C1CO1.CC1CO1 RVGRUAULSDPKGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100035724 Probable ATP-dependent RNA helicase DDX43 Human genes 0.000 description 1
- 102000003946 Prolactin Human genes 0.000 description 1
- 108010057464 Prolactin Proteins 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 101800004937 Protein C Proteins 0.000 description 1
- 102000017975 Protein C Human genes 0.000 description 1
- 102000055027 Protein Methyltransferases Human genes 0.000 description 1
- 108700040121 Protein Methyltransferases Proteins 0.000 description 1
- 229940096437 Protein S Drugs 0.000 description 1
- 102100037686 Protein SSX2 Human genes 0.000 description 1
- 108010067787 Proteoglycans Proteins 0.000 description 1
- 102000016611 Proteoglycans Human genes 0.000 description 1
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 description 1
- 102100022578 Putative tyrosine-protein phosphatase TPTE Human genes 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 101150027249 RL1 gene Proteins 0.000 description 1
- 229940022005 RNA vaccine Drugs 0.000 description 1
- 102100022491 RNA-binding protein NOB1 Human genes 0.000 description 1
- 239000012979 RPMI medium Substances 0.000 description 1
- 101150066717 Rara gene Proteins 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 102100030086 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Human genes 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 208000015634 Rectal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000006265 Renal cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 241000328499 Rio Negro virus Species 0.000 description 1
- 241000710942 Ross River virus Species 0.000 description 1
- 241000282849 Ruminantia Species 0.000 description 1
- 102100025373 Runt-related transcription factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 241000608282 Sagiyama virus Species 0.000 description 1
- 101800001700 Saposin-D Proteins 0.000 description 1
- 102100021466 Sarcoma antigen 1 Human genes 0.000 description 1
- 108010077895 Sarcosine Proteins 0.000 description 1
- 206010039710 Scleroderma Diseases 0.000 description 1
- 102100038689 Scm-like with four MBT domains protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 241000242583 Scyphozoa Species 0.000 description 1
- 102100037269 Secretoglobin family 3A member 2 Human genes 0.000 description 1
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 208000019802 Sexually transmitted disease Diseases 0.000 description 1
- 101710173693 Short transient receptor potential channel 1 Proteins 0.000 description 1
- 102000003838 Sialyltransferases Human genes 0.000 description 1
- 108090000141 Sialyltransferases Proteins 0.000 description 1
- 208000032023 Signs and Symptoms Diseases 0.000 description 1
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 1
- 208000000453 Skin Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- BCKXLBQYZLBQEK-KVVVOXFISA-M Sodium oleate Chemical compound [Na+].CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC([O-])=O BCKXLBQYZLBQEK-KVVVOXFISA-M 0.000 description 1
- 208000021712 Soft tissue sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 102000013275 Somatomedins Human genes 0.000 description 1
- 101001039853 Sonchus yellow net virus Matrix protein Proteins 0.000 description 1
- 241001472492 Southern elephant seal virus Species 0.000 description 1
- 101710198474 Spike protein Proteins 0.000 description 1
- 102100035748 Squamous cell carcinoma antigen recognized by T-cells 3 Human genes 0.000 description 1
- 101710185775 Squamous cell carcinoma antigen recognized by T-cells 3 Proteins 0.000 description 1
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 108010023197 Streptokinase Proteins 0.000 description 1
- 102100027918 Sucrase-isomaltase, intestinal Human genes 0.000 description 1
- 235000019486 Sunflower oil Nutrition 0.000 description 1
- 108010002687 Survivin Proteins 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 1
- 108010092262 T-Cell Antigen Receptors Proteins 0.000 description 1
- 108700026226 TATA Box Proteins 0.000 description 1
- 108700019889 TEL-AML1 fusion Proteins 0.000 description 1
- 102100033082 TNF receptor-associated factor 3 Human genes 0.000 description 1
- WPMWEFXCIYCJSA-UHFFFAOYSA-N Tetraethylene glycol monododecyl ether Chemical compound CCCCCCCCCCCCOCCOCCOCCOCCO WPMWEFXCIYCJSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 1
- 208000024770 Thyroid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- AUYYCJSJGJYCDS-LBPRGKRZSA-N Thyrolar Chemical class IC1=CC(C[C@H](N)C(O)=O)=CC(I)=C1OC1=CC=C(O)C(I)=C1 AUYYCJSJGJYCDS-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- 108090000373 Tissue Plasminogen Activator Proteins 0.000 description 1
- 102000003978 Tissue Plasminogen Activator Human genes 0.000 description 1
- 241000868137 Tonate virus Species 0.000 description 1
- 102100025256 Trafficking protein particle complex subunit 1 Human genes 0.000 description 1
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 108010033576 Transferrin Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000007238 Transferrin Receptors Human genes 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- LVTKHGUGBGNBPL-UHFFFAOYSA-N Trp-P-1 Chemical compound N1C2=CC=CC=C2C2=C1C(C)=C(N)N=C2C LVTKHGUGBGNBPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000223105 Trypanosoma brucei Species 0.000 description 1
- 102000004243 Tubulin Human genes 0.000 description 1
- 108090000704 Tubulin Proteins 0.000 description 1
- 108010065158 Tumor Necrosis Factor Ligand Superfamily Member 14 Proteins 0.000 description 1
- 102100027244 U4/U6.U5 tri-snRNP-associated protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 101710155955 U4/U6.U5 tri-snRNP-associated protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 241000608278 Una virus Species 0.000 description 1
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 201000005969 Uveal melanoma Diseases 0.000 description 1
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010047513 Vision blurred Diseases 0.000 description 1
- 241000710951 Western equine encephalitis virus Species 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- SIIZPVYVXNXXQG-KGXOGWRBSA-N [(2r,3r,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-4-[[(3s,4r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-3-hydroxyoxolan-2-yl]methyl [(2r,4r,5r)-2-(6-aminopurin-9-yl)-4-hydroxy-5-(phosphonooxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Chemical compound C1=NC2=C(N)N=CN=C2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OC2[C@@H](O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@H]2O)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)[C@@H](O)[C@H]1OP(O)(=O)OCC([C@@H](O)[C@H]1O)OC1N1C(N=CN=C2N)=C2N=C1 SIIZPVYVXNXXQG-KGXOGWRBSA-N 0.000 description 1
- YDONNITUKPKTIG-UHFFFAOYSA-N [Nitrilotris(methylene)]trisphosphonic acid Chemical compound OP(O)(=O)CN(CP(O)(O)=O)CP(O)(O)=O YDONNITUKPKTIG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- RBLJCYYOLLOBFK-RQDPQJJXSA-N acetic acid (1R,2R)-cyclohexane-1,2-diamine hydrate Chemical compound O.CC(O)=O.CC(O)=O.CC(O)=O.CC(O)=O.N[C@@H]1CCCC[C@H]1N RBLJCYYOLLOBFK-RQDPQJJXSA-N 0.000 description 1
- 238000005903 acid hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 230000033289 adaptive immune response Effects 0.000 description 1
- 102000030621 adenylate cyclase Human genes 0.000 description 1
- 108060000200 adenylate cyclase Proteins 0.000 description 1
- 201000005188 adrenal gland cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000024447 adrenal gland neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 229960003767 alanine Drugs 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-DVKNGEFBSA-N alpha-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-DVKNGEFBSA-N 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004873 anchoring Methods 0.000 description 1
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 229960004977 anhydrous lactose Drugs 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 1
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 229960005348 antithrombin iii Drugs 0.000 description 1
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 1
- 239000008365 aqueous carrier Substances 0.000 description 1
- 239000003125 aqueous solvent Substances 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 1
- 108010006523 asialoglycoprotein receptor Proteins 0.000 description 1
- 206010064097 avian influenza Diseases 0.000 description 1
- 238000010533 azeotropic distillation Methods 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 210000003651 basophil Anatomy 0.000 description 1
- 230000006399 behavior Effects 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QLTSDROPCWIKKY-PMCTYKHCSA-N beta-D-glucosaminyl-(1->4)-beta-D-glucosamine Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](N)[C@H](O)O[C@H](CO)[C@H]1O[C@H]1[C@H](N)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 QLTSDROPCWIKKY-PMCTYKHCSA-N 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-TXICZTDVSA-N beta-D-ribose Chemical group OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-TXICZTDVSA-N 0.000 description 1
- SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N beta-N-Acetyl-D-neuraminic acid Natural products CC(=O)NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 201000000053 blastoma Diseases 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 238000010322 bone marrow transplantation Methods 0.000 description 1
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 208000034526 bruise Diseases 0.000 description 1
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 229940105329 carboxymethylcellulose Drugs 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 150000003943 catecholamines Chemical class 0.000 description 1
- 241001233037 catfish Species 0.000 description 1
- 230000020411 cell activation Effects 0.000 description 1
- 230000034303 cell budding Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 238000002737 cell proliferation kit Methods 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 238000012200 cell viability kit Methods 0.000 description 1
- 210000004671 cell-free system Anatomy 0.000 description 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 1
- 229940106157 cellulase Drugs 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 239000013522 chelant Substances 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 1
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 1
- 229940107161 cholesterol Drugs 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 229940110456 cocoa butter Drugs 0.000 description 1
- 235000019868 cocoa butter Nutrition 0.000 description 1
- 206010009887 colitis Diseases 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000011970 concomitant therapy Methods 0.000 description 1
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L copper(II) sulfate Chemical compound [Cu+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000366 copper(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 1
- 208000030381 cutaneous melanoma Diseases 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000002784 cytotoxicity assay Methods 0.000 description 1
- 231100000263 cytotoxicity test Toxicity 0.000 description 1
- GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N d-alpha-tocopherol Natural products OC1=C(C)C(C)=C2OC(CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006735 deficit Effects 0.000 description 1
- 230000001934 delay Effects 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 235000019425 dextrin Nutrition 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 206010013023 diphtheria Diseases 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 238000004821 distillation Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N dl-hydroxyproline Natural products OC1C[NH2+]C(C([O-])=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003638 dopamine Drugs 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 102000010982 eIF-2 Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108010037623 eIF-2 Kinase Proteins 0.000 description 1
- 229920002549 elastin Polymers 0.000 description 1
- 201000008184 embryoma Diseases 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 206010014599 encephalitis Diseases 0.000 description 1
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 1
- 210000001163 endosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 210000003979 eosinophil Anatomy 0.000 description 1
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 201000004101 esophageal cancer Diseases 0.000 description 1
- BEFDCLMNVWHSGT-UHFFFAOYSA-N ethenylcyclopentane Chemical compound C=CC1CCCC1 BEFDCLMNVWHSGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 201000005884 exanthem Diseases 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 229960004222 factor ix Drugs 0.000 description 1
- 229940012413 factor vii Drugs 0.000 description 1
- 229940012426 factor x Drugs 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical group 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 1
- 235000003599 food sweetener Nutrition 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 244000053095 fungal pathogen Species 0.000 description 1
- 229960003692 gamma aminobutyric acid Drugs 0.000 description 1
- 239000007792 gaseous phase Substances 0.000 description 1
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 210000001156 gastric mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 1
- DLRVVLDZNNYCBX-CQUJWQHSSA-N gentiobiose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O1 DLRVVLDZNNYCBX-CQUJWQHSSA-N 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000009477 glass transition Effects 0.000 description 1
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 1
- 229940049906 glutamate Drugs 0.000 description 1
- 229960002449 glycine Drugs 0.000 description 1
- 230000002710 gonadal effect Effects 0.000 description 1
- 239000002622 gonadotropin Substances 0.000 description 1
- 208000001786 gonorrhea Diseases 0.000 description 1
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 102000028718 growth factor binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091009353 growth factor binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010072285 growth inhibitory proteins Proteins 0.000 description 1
- 229940029575 guanosine Drugs 0.000 description 1
- 108010064833 guanylyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 210000004209 hair Anatomy 0.000 description 1
- 201000010536 head and neck cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000014829 head and neck neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 201000005787 hematologic cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000024200 hematopoietic and lymphoid system neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 1
- 230000013632 homeostatic process Effects 0.000 description 1
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 1
- 230000004727 humoral immunity Effects 0.000 description 1
- 238000009652 hydrodynamic focusing Methods 0.000 description 1
- 150000002431 hydrogen Chemical class 0.000 description 1
- 235000019447 hydroxyethyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 229960002591 hydroxyproline Drugs 0.000 description 1
- 239000001866 hydroxypropyl methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010979 hydroxypropyl methyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 229920003088 hydroxypropyl methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- UFVKGYZPFZQRLF-UHFFFAOYSA-N hydroxypropyl methyl cellulose Chemical compound OC1C(O)C(OC)OC(CO)C1OC1C(O)C(O)C(OC2C(C(O)C(OC3C(C(O)C(O)C(CO)O3)O)C(CO)O2)O)C(CO)O1 UFVKGYZPFZQRLF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 230000002480 immunoprotective effect Effects 0.000 description 1
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001024 immunotherapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 108010019701 influenza virus M-protein Proteins 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000015788 innate immune response Effects 0.000 description 1
- 150000002484 inorganic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 1
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 1
- 230000017730 intein-mediated protein splicing Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 108010074108 interleukin-21 Proteins 0.000 description 1
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 1
- 239000013067 intermediate product Substances 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 238000001361 intraarterial administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 229940029339 inulin Drugs 0.000 description 1
- DLRVVLDZNNYCBX-RTPHMHGBSA-N isomaltose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O1 DLRVVLDZNNYCBX-RTPHMHGBSA-N 0.000 description 1
- 201000010982 kidney cancer Diseases 0.000 description 1
- 229960000511 lactulose Drugs 0.000 description 1
- JCQLYHFGKNRPGE-FCVZTGTOSA-N lactulose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 JCQLYHFGKNRPGE-FCVZTGTOSA-N 0.000 description 1
- PFCRQPBOOFTZGQ-UHFFFAOYSA-N lactulose keto form Natural products OCC(=O)C(O)C(C(O)CO)OC1OC(CO)C(O)C(O)C1O PFCRQPBOOFTZGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QIGJYVCQYDKYDW-LCOYTZNXSA-N laminarabiose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)OC(O)[C@@H]1O QIGJYVCQYDKYDW-LCOYTZNXSA-N 0.000 description 1
- 230000002045 lasting effect Effects 0.000 description 1
- NRYBAZVQPHGZNS-ZSOCWYAHSA-N leptin Chemical compound O=C([C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(C)C)CCSC)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O NRYBAZVQPHGZNS-ZSOCWYAHSA-N 0.000 description 1
- 229940039781 leptin Drugs 0.000 description 1
- 231100001231 less toxic Toxicity 0.000 description 1
- 231100000636 lethal dose Toxicity 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 description 1
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 206010025135 lupus erythematosus Diseases 0.000 description 1
- 230000001926 lymphatic effect Effects 0.000 description 1
- 229960003646 lysine Drugs 0.000 description 1
- 108700021021 mRNA Vaccine Proteins 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- ZLNQQNXFFQJAID-UHFFFAOYSA-L magnesium carbonate Chemical compound [Mg+2].[O-]C([O-])=O ZLNQQNXFFQJAID-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000001095 magnesium carbonate Substances 0.000 description 1
- 229910000021 magnesium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000014380 magnesium carbonate Nutrition 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 201000004792 malaria Diseases 0.000 description 1
- 208000029559 malignant endocrine neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000026045 malignant tumor of parathyroid gland Diseases 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 210000004779 membrane envelope Anatomy 0.000 description 1
- 206010027191 meningioma Diseases 0.000 description 1
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010981 methylcellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 238000000569 multi-angle light scattering Methods 0.000 description 1
- PUPNJSIFIXXJCH-UHFFFAOYSA-N n-(4-hydroxyphenyl)-2-(1,1,3-trioxo-1,2-benzothiazol-2-yl)acetamide Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1NC(=O)CN1S(=O)(=O)C2=CC=CC=C2C1=O PUPNJSIFIXXJCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000009240 nasopharyngitis Diseases 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 210000004126 nerve fiber Anatomy 0.000 description 1
- 229940053128 nerve growth factor Drugs 0.000 description 1
- 231100000956 nontoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000030648 nucleus localization Effects 0.000 description 1
- 201000002575 ocular melanoma Diseases 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- XNOPRXBHLZRZKH-DSZYJQQASA-N oxytocin Chemical compound C([C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](N)C(=O)N1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(N)=O)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 XNOPRXBHLZRZKH-DSZYJQQASA-N 0.000 description 1
- 229960001723 oxytocin Drugs 0.000 description 1
- 238000010979 pH adjustment Methods 0.000 description 1
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000003071 parasitic effect Effects 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 239000000312 peanut oil Substances 0.000 description 1
- 239000001814 pectin Substances 0.000 description 1
- 235000010987 pectin Nutrition 0.000 description 1
- 229920001277 pectin Polymers 0.000 description 1
- 108010011903 peptide receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000014187 peptide receptors Human genes 0.000 description 1
- 210000001539 phagocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000008024 pharmaceutical diluent Substances 0.000 description 1
- 229940124531 pharmaceutical excipient Drugs 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 208000021310 pituitary gland adenoma Diseases 0.000 description 1
- 229940127126 plasminogen activator Drugs 0.000 description 1
- 229940118768 plasmodium malariae Drugs 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 229920001983 poloxamer Polymers 0.000 description 1
- 229960000502 poloxamer Drugs 0.000 description 1
- 229920001992 poloxamer 407 Polymers 0.000 description 1
- 229920001987 poloxamine Polymers 0.000 description 1
- 239000003505 polymerization initiator Substances 0.000 description 1
- 230000000379 polymerizing effect Effects 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920002503 polyoxyethylene-polyoxypropylene Polymers 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 1
- 229920006316 polyvinylpyrrolidine Polymers 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 125000001844 prenyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])=C(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 238000003825 pressing Methods 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 150000003141 primary amines Chemical class 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 229940097325 prolactin Drugs 0.000 description 1
- 229960002429 proline Drugs 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 1
- 239000011814 protection agent Substances 0.000 description 1
- 239000003223 protective agent Substances 0.000 description 1
- 229960000856 protein c Drugs 0.000 description 1
- 230000009145 protein modification Effects 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 229940023143 protein vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000005588 protonation Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000011403 purification operation Methods 0.000 description 1
- 206010037844 rash Diseases 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 206010038038 rectal cancer Diseases 0.000 description 1
- 201000001275 rectum cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000014424 regulation of RNA biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 235000002020 sage Nutrition 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 1
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 1
- 235000017709 saponins Nutrition 0.000 description 1
- 229940043230 sarcosine Drugs 0.000 description 1
- 238000010845 search algorithm Methods 0.000 description 1
- 150000003335 secondary amines Chemical class 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 229960001153 serine Drugs 0.000 description 1
- 239000008159 sesame oil Substances 0.000 description 1
- 235000011803 sesame oil Nutrition 0.000 description 1
- SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N sialic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)OC1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N 0.000 description 1
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 1
- 201000000849 skin cancer Diseases 0.000 description 1
- 201000003708 skin melanoma Diseases 0.000 description 1
- 208000019116 sleep disease Diseases 0.000 description 1
- 201000002314 small intestine cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 235000010413 sodium alginate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000661 sodium alginate Substances 0.000 description 1
- 229940005550 sodium alginate Drugs 0.000 description 1
- 229920001027 sodium carboxymethylcellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- RYYKJJJTJZKILX-UHFFFAOYSA-M sodium octadecanoate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O RYYKJJJTJZKILX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000007711 solidification Methods 0.000 description 1
- 230000008023 solidification Effects 0.000 description 1
- 108010033419 somatotropin-binding protein Proteins 0.000 description 1
- 239000004334 sorbic acid Substances 0.000 description 1
- 235000010199 sorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229940075582 sorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000003549 soybean oil Substances 0.000 description 1
- 235000012424 soybean oil Nutrition 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 1
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 1
- 108020003113 steroid hormone receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005969 steroid hormone receptors Human genes 0.000 description 1
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 description 1
- 229960005202 streptokinase Drugs 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000002600 sunflower oil Substances 0.000 description 1
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 description 1
- 238000007910 systemic administration Methods 0.000 description 1
- 239000000454 talc Substances 0.000 description 1
- 229910052623 talc Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000012222 talc Nutrition 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000011285 therapeutic regimen Methods 0.000 description 1
- 239000002562 thickening agent Substances 0.000 description 1
- 239000012749 thinning agent Substances 0.000 description 1
- 150000003568 thioethers Chemical class 0.000 description 1
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 1
- 201000002510 thyroid cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000005495 thyroid hormone Substances 0.000 description 1
- 229940036555 thyroid hormone Drugs 0.000 description 1
- 229960000187 tissue plasminogen activator Drugs 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 229960001295 tocopherol Drugs 0.000 description 1
- 229930003799 tocopherol Natural products 0.000 description 1
- 235000010384 tocopherol Nutrition 0.000 description 1
- 239000011732 tocopherol Substances 0.000 description 1
- 239000008181 tonicity modifier Substances 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 102000035160 transmembrane proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005703 transmembrane proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 230000001228 trophic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002993 trophoblast Anatomy 0.000 description 1
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 description 1
- 230000005748 tumor development Effects 0.000 description 1
- 230000005751 tumor progression Effects 0.000 description 1
- 230000029069 type 2 immune response Effects 0.000 description 1
- 108010087967 type I signal peptidase Proteins 0.000 description 1
- 241000724775 unclassified viruses Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 description 1
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 1
- 210000003934 vacuole Anatomy 0.000 description 1
- 230000017613 viral reproduction Effects 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 description 1
- GVJHHUAWPYXKBD-IEOSBIPESA-N α-tocopherol Chemical compound OC1=C(C)C(C)=C2O[C@@](CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C GVJHHUAWPYXKBD-IEOSBIPESA-N 0.000 description 1
- 229930195724 β-lactose Natural products 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
- A61K31/7105—Natural ribonucleic acids, i.e. containing only riboses attached to adenine, guanine, cytosine or uracil and having 3'-5' phosphodiester links
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
- A61K35/76—Viruses; Subviral particles; Bacteriophages
- A61K35/763—Herpes virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
- A61K47/08—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing oxygen, e.g. ethers, acetals, ketones, quinones, aldehydes, peroxides
- A61K47/10—Alcohols; Phenols; Salts thereof, e.g. glycerol; Polyethylene glycols [PEG]; Poloxamers; PEG/POE alkyl ethers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
- A61K47/16—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing nitrogen, e.g. nitro-, nitroso-, azo-compounds, nitriles, cyanates
- A61K47/18—Amines; Amides; Ureas; Quaternary ammonium compounds; Amino acids; Oligopeptides having up to five amino acids
- A61K47/183—Amino acids, e.g. glycine, EDTA or aspartame
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
- A61K47/26—Carbohydrates, e.g. sugar alcohols, amino sugars, nucleic acids, mono-, di- or oligo-saccharides; Derivatives thereof, e.g. polysorbates, sorbitan fatty acid esters or glycyrrhizin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
- A61K47/34—Macromolecular compounds obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyesters, polyamino acids, polysiloxanes, polyphosphazines, copolymers of polyalkylene glycol or poloxamers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
- A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
- A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
- A61K9/19—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles lyophilised, i.e. freeze-dried, solutions or dispersions
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Virology (AREA)
- Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Mycology (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Inorganic Chemistry (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
본 발명은 비경구 투여 후, 특히 근육내 투여 후 RNA를 표적 기관 또는 표적 세포로 전달하기 위한 폴리플렉스 제형을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 더욱 정확하게는, 본 발명은, 특히 근육내 주사에 의한, 자기-복제 RNA와 같은 RNA의 투여를 위한 제형에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 제형은 단일 가닥 RNA 및 폴리알킬렌이민으로부터의 폴리플렉스 입자를 포함한다.
Description
본 발명은 비경구 투여 후, 특히 근육내 투여 후 RNA를 표적 기관 또는 표적 세포로 전달하기 위한 폴리플렉스(polyplex) 제형을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 더욱 정확하게는, 본 발명은, 특히 근육내 주사에 의한, 자기-복제 RNA와 같은 RNA의 투여를 위한 제형에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 폴리플렉스 입자는 단일 가닥 RNA, 바람직하게는 자기-복제 또는 자기-증폭 RNA, 및 폴리알킬렌이민을 포함한다. RNA는 약학적 활성 단백질과 같은 관심 단백질을 인코딩할 수 있다. RNA는 세포에 의해 흡수되고, RNA는 바람직하게는 생리적 활성을 나타낼 수 있는 펩티드 또는 단백질로 번역된다. 본 발명의 조성물은 면역 반응을 유도하거나 향상시키기 위해 적용 가능하다. 이러한 조성물은 또한 단백질과 같은 항원과 관련된 질병의 예방적 및/또는 치료적 처치에 유용하다. 또한, 본 발명은 RNA-폴리플렉스 제형을 포함하는 안정한 조성물의 제조 방법에 관한 것으로, 상기 RNA-폴리플렉스 제형은 단일 가닥 RNA 및 폴리알킬렌이민을 포함한다. 본원에 기재된 RNA-폴리플렉스 입자 제형은 제품 품질의 손실 없이, 특히, RNA 활성의 실질적인 손실 없이, 동결 및 해동되거나, 탈수 및 재수화될 수 있다. 특히, 본원에 기재된 RNA-폴리플렉스 입자 제형은 동결 건조, 분무 건조 또는 관련된 방법에 의해 동결 또는 탈수될 수 있어, 액체 저장과 관련하여 제품의 연장된 저장 수명을 얻을 수 있다. 또한, 본원에 기재된 RNA-폴리플렉스 입자 제형은 약학 제품에 대한 요건을 준수할 수 있으며, 더욱 구체적으로는 GMP 제조 요건 및 비경구 적용을 위한 약학 제품의 품질에 대한 요건이 관련된다. 본원에 기재된 RNA-폴리플렉스 제형은, 예를 들어 감염성 질병에 대한, 인간 또는 동물의 백신접종에 특히 유용하다.
예방적 및 치료적 목적을 위한 하나 이상의 폴리펩티드를 인코딩하는 외래 핵산의 도입은 수년간 생물의학 연구의 목표였다. 종래 기술의 접근법은 표적 세포 또는 유기체로의 핵산 분자의 전달을 공유하지만, 핵산 분자 및/또는 전달 시스템의 유형이 상이하다: 데옥시리보핵산(DNA) 분자의 사용과 관련된 안전 문제의 영향으로 인해, 리보핵산(RNA) 분자가 최근에 주목을 받고 있다. 네이키드 RNA의 형태로, 또는 비-바이러스 또는 바이러스 전달 비히클에 포함된 것과 같은 복합체화되거나 패키징된 형태로의 단일 가닥 또는 이중 가닥 RNA의 투여를 포함하는 다양한 접근법이 제안되어 왔다. 바이러스 및 바이러스 전달 비히클에서, 핵산은 전형적으로 단백질 및/또는 지질(바이러스 입자)에 의해 캡슐화된다. 예를 들어, RNA 바이러스로부터 유래된 조작된 RNA 바이러스 입자는 식물 처리용(WO 2000/053780 A2) 또는 포유 동물의 백신접종용(Tubulekas et al., 1997, Gene, vol. 190, pp. 191-195) 전달 비히클로서 제안되었다. 안전 문제를 고려하여, 의학계 및 수의학계는 RNA 바이러스 입자를 인간 또는 동물에게 투여하는 것을 꺼린다. RNA에 적용 가능한 비-바이러스성 전달 비히클은 유전자 전달 기반 치료제의 개발을 위해 광범위하게 연구되었다. 그러나, 다양한 이유로 비-바이러스성 유전자 전달 접근법의 임상 실무로의 이행은 그다지 성공적이지 못했다. 이유는 만족스럽지 않은 유전자 발현 수준, 그러한 복잡한 제품의 약학적 개발과 관련된 기술 및 규제 문제, 및 안전상의 이유와 관련이 있을 수 있다.
따라서, 환자 및 동물에서 백신과 같은 치료적 가치를 갖는 단백질을 인코딩하는 RNA의 안전하고 효율적인 전달을 위한 위한 의약품이 필요하다. 본원에 기재된 바와 같이, 본 발명의 양태 및 구현예는 이러한 요구를 다룬다.
면역치료 전략은 예를 들어 감염성 질병 및 암 질병의 예방 및 치료를 위한 유망한 옵션을 나타낸다. 점점 더 많은 수의 병원체- 및 종양-관련 항원이 확인됨에 따라 면역요법에 적합한 광범위한 표적이 수집되었다. 본 발명은 질병의 예방 및 치료를 위한 면역요법적 처치에 적합한 항원의 효율적인 발현에 적합한 개선된 제제 및 방법을 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은,
(a) 단일 가닥 RNA; 및
(b) 폴리알킬렌이민을 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
추가의 양태에서, 본 발명은, 의약으로 사용하기 위한,
(a) 단일 가닥 RNA; 및
(b) 폴리알킬렌이민을 포함하는 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 모든 양태 중 일 구현예에서, 폴리알킬렌이민 내의 질소 원자(N) 수 대 단일 가닥 RNA 내의 인 원자(P) 수의 몰비(N:P 비)는 1.0 내지 30, 바람직하게는 2.0 내지 15.0, 더욱 바람직하게는 6.0 내지 12.0이다.
추가의 양태에서, 본 발명은,
(a) 단일 가닥 RNA; 및
(b) 폴리알킬렌이민을 포함하는 조성물에 관한 것으로,
여기서 폴리알킬렌이민 내의 질소 원자(N) 수 대 단일 가닥 RNA 내의 인 원자(P) 수의 몰비(N:P 비)는 1.0 내지 30.0, 바람직하게는 2.0 내지 15.0, 더욱 바람직하게는 6.0 내지 12.0이다.
본 발명의 모든 양태 중 일 구현예에서, 조성물의 이온 강도는 50 mM 이하이고, 바람직하게는 양 하전된 1가 이온의 농도는 25 mM 이하이고 유리 형태의 양 하전된 2가 양이온의 농도는 20 μM 이하이다.
추가의 양태에서, 본 발명은,
(a) 단일 가닥 RNA; 및
(b) 폴리알킬렌이민을 포함하는 조성물에 관한 것으로, 여기서 이온 강도는 50 mM 이하이다.
일 구현예에서, 양 하전된 1가 이온의 농도는 25 mM 이하이고, 양 하전된 2가 양이온의 농도는 20 μM 이하이다.
본 발명의 모든 양태 중 일 구현예에서, 조성물은 근육내 주사에 의한 투여와 같은 근육내 투여를 위한 것이다.
본 발명의 모든 양태 중 일 구현예에서, 단일 가닥 RNA 및 폴리알킬렌이민은 폴리플렉스 입자에 존재한다.
본 발명의 모든 양태 중 일 구현예에서, 폴리알킬렌이민은 하기 화학식 (I)을 포함한다:
여기서, R은 H, 아실기 또는 하기 화학식 (II)을 포함하는 기이고,
여기서, R1은 H 또는 하기 화학식 (III)을 포함하는 기이고,
상기 식들에서, n, m 및 l은 2 내지 10의 정수로부터 독립적으로 선택되고;
p, q, 및 r은 정수이며, 여기서 p, q, 및 r의 합은 중합체의 평균 분자량이 1.5·102 내지 107 Da, 바람직하게는 5000 내지 105 Da, 더욱 바람직하게는 10000 내지 40000 Da, 더욱 바람직하게는 15000 내지 30000 Da, 더욱더 바람직하게는 20000 내지 25000 Da이 되도록 한다.
일 구현예에서, n, m, 및 l은 독립적으로 2, 3, 4, 및 5, 바람직하게는 2 및 3으로부터 선택된다. 일 구현예에서, R1은 H이다. 일 구현예에서, R은 H 또는 아실기이다.
본 발명의 모든 양태 중 일 구현예에서, 폴리알킬렌이민은 폴리에틸렌이민 및/또는 폴리프로필렌이민, 바람직하게는 폴리에틸렌이민을 포함한다.
본 발명의 모든 양태 중 일 구현예에서, 폴리알킬렌이민에서 N 원자의 적어도 92%는 양성자화 가능하다.
본 발명의 모든 양태 중 일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 하나 이상의 첨가제를 포함한다. 일 구현예에서, 하나 이상의 첨가제는 완충 물질, 당류, 안정화제, 동결보호제, 동결건조보호제, 및 킬레이트제로 이루어진 군으로부터 선택된다. 본 발명의 모든 양태 중 일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 하나 이상의 중합체를 포함한다. 일 구현예에서, 완충 물질은 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄설폰산(HEPES), 2-(N-모폴리노)에탄설폰산(MES), 3-모폴리노-2-하이드록시프로판설폰산(MOPSO), 아세트산 완충 시스템 및 유사체, 인산 완충 시스템, 또는 시트르산 완충 시스템으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나를 포함한다. 본 발명의 모든 양태 중 일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 4 내지 8, 바람직하게는 5 내지 7.5의 pH 범위에서의 완충을 위한 완충액을 포함한다. 그러한 완충 시스템의 예로는 아세테이트 완충액 또는 HEPES 완충액 또는 포스페이트 완충액 또는 아세트산 완충액이 있다. 일 구현예에서, 당류는 단당류, 이당류, 삼당류, 올리고당류, 및 다당류로 이루어진 군, 바람직하게는 글루코스, 트레할로스, 사카로스 및 덱스트란으로부터 선택된 적어도 하나를 포함한다. 일 구현예에서, 첨가제는 1 kDa 내지 100 kDa의 평균 몰질량을 갖는 덱스트란이다. 일 구현예에서, 동결보호제는 글리콜, 예컨대 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 및 글리세롤로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나를 포함한다. 일 구현예에서, 킬레이트제는 EDTA를 포함한다. 일 구현예에서, 지질은 양이온성 지질, 중성 지질, 및 음이온성 지질로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나를 포함한다. 일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 에틸렌 옥사이드 및 프로필렌 옥사이드 빌딩 블록을 포함하는 하나 이상의 블록 공중합체를 포함한다. 일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 에틸렌 디아민기를 포함하는 공중합체를 포함한다. 일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 양친성 블록 공중합체를 포함하고, 이 공중합체는 바람직하게는 에틸렌 산화물 및 프로필렌 산화물 빌딩 블록을 포함하고, 선택적으로 에틸렌 디아민기를 또한 포함한다.
본 발명의 모든 양태 중 일 구현예에서, 조성물은 HEPES 완충된 글루코스(HBG 또는 HBGx1), MES-완충 글루코스(MBG 또는 MBGx1), 아세테이트 완충된 글루코스(ABG) 또는 HEPES 완충된 트레할로스(HBT 또는 HBTx1)를 포함한다. 본 발명의 모든 양태 중 일 구현예에서, 조성물은 0.1 mM 내지 10 mM 범위의 농도를 갖는 아세트산 완충액 중에 글루코스 또는 트레할로스 또는 사카로스를 포함한다. 본 발명의 모든 양태 중 일 구현예에서, 조성물은 0.1 mM 내지 10 mM 범위의 농도를 갖는 포스페이트 완충액 중에 글루코스 또는 트레할로스 또는 사카로스를 포함한다.
본 발명의 모든 양태 중 일 구현예에서, 입자의 z-평균 크기는 200 nm 미만, 바람직하게는 150 nm 미만, 더욱 바람직하게는 100 nm 미만이다. 일 구현예에서, 입자의 z-평균 크기는 50 nm 내지 200 nm이다. 본 발명의 모든 양태 중 일 구현예에서, 입자의 제타-전위는 20 mV 이상, 바람직하게는 25 내지 40 mV이다. 본 발명의 모든 양태 중 일 구현예에서, 입자의 전기영동 이동도(μ)는 1 내지 1.6 μm*cm/V*S이다. 본 발명의 모든 양태 중 일 구현예에서, 입자의 z-평균 크기 및/또는 제타-전위 및/또는 전기영동 이동도는 폴리플렉스 입자 및 HEPES 완충된 글루코스(HBG) 또는 HEPES 완충된 트레할로스(HBT)를 포함하는 현탁액에서 결정된다. 일 구현예에서, HBG는 5% 글루코스(w/v) 및 10 mM HEPES, pH 7.1을 포함하거나, HBT는 10% 트레할로스(w/v) 및 10 mM HEPES, pH 7.1을 포함한다. 일 구현예에서, 입자의 z-평균 크기는 동적 광산란 및 누적 알고리즘(cumulant algorithm)에 의한 데이터 분석에 의해 결정된다. 일 구현예에서, 병진 확산 계수는 동적 광산란에 의해 측정된다. 이어서, Z-평균을 계산하기 위해 Stock-Einstein 방정식이 사용된다. 일 구현예에서, 전기영동 이동도는 레이저-도플러 전기영동에 의해 측정된다. 이어서, 제타-전위를 계산하기 위해 Henry 방정식 또는 Smoluchowski 방정식이 사용된다.
본 발명의 모든 양태 중 일 구현예에서, 입자는, 바람직하게는 생리적 pH 또는 4.5 내지 7.5의 pH에서, 중성이거나 양 하전된다.
본 발명의 모든 양태 중 일 구현예에서, 단일 가닥 RNA는 6000개 내지 15000개 염기, 바람직하게는 9000개 내지 12000개 염기로 이루어진 분자이다. 본 발명의 모든 양태 중 일 구현예에서, 단일 가닥 RNA는 적어도 하나의 관심 단백질을 인코딩한다. 본 발명의 모든 양태 중 일 구현예에서, 단일 가닥 RNA는 레플리콘, 바람직하게는 자기-복제 또는 자기-증폭 RNA이다. 일 구현예에서, 레플리콘은 알파바이러스로부터의 레플리카제에 의해 복제될 수 있으며, 레플리콘은 바람직하게는 알파바이러스 또는 이의 변이체로부터의 5' 복제 인식 서열 및 알파바이러스 또는 이의 변이체로부터의 3' 복제 인식 서열을 포함한다. 본 발명의 모든 양태 중 일 구현예에서, 단일 가닥 RNA는 약학적 활성 펩티드 또는 단백질과 같은 관심 펩티드 또는 단백질을 인코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함한다.
본 발명의 모든 양태 중 일 구현예에서, 본원에 기재된 조성물은 치료에 사용하기 위한 것이다. 본 발명의 모든 양태 중 일 구현예에서, 본원에 기재된 조성물은 백신 조성물이다.
추가의 양태에서, 본 발명은 세포 내로 RNA를 도입하기 위한, 특히 세포에서 RNA를 발현하기 위한 본원에 기재된 조성물의 용도에 관한 것이다. 일 구현예에서, 세포는 근육 세포이다.
추가의 양태에서, 본 발명은 RNA의 근육내 투여를 위한 본원에 기재된 조성물의 용도에 관한 것이다.
추가의 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 조성물을 근육내 투여하는 단계를 포함하는 RNA의 근육내 투여 방법에 관한 것이다.
추가의 양태에서, 본 발명은,
(a) 단일 가닥 RNA; 및
(b) 폴리알킬렌이민을 포함하는, 동결되거나, 동결건조되거나, 분무 건조된 조성물에 관한 것으로,
여기서 조성물은 동결보호제 및/또는 동결건조보호제, 바람직하게는 트레할로스와 같은 이당류, 또는 덱스트란과 같은 다당류를 포함한다.
일 구현예에서, 조성물은 EDTA와 같은 킬레이트제를 추가로 포함한다.
일 구현예에서, 조성물은 5% 내지 20%(w/v)의 이당류 및 선택적으로 20 μM 내지 10 mM, 예컨대 80 μM 내지 5 mM의 킬레이트제를 포함하는 수성 조성물로부터 제조된다. 일 구현예에서, 수성 조성물은 트레할로스, HEPES, 및 EDTA, 예컨대 10% 트레할로스(w/v), 2.8 mM HEPES, 80 μM EDTA, pH 7.1을 포함한다.
추가의 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 동결된 조성물을 해동시키거나 본원에 기재된 동결건조되거나 분무 건조된 조성물을 재구성함으로써 얻을 수 있는 수성 조성물에 관한 것이다.
추가의 양태에서, 본 발명은,
(i) 단일 가닥 RNA, 폴리알킬렌이민 및 동결보호제 및/또는 동결건조보호제, 바람직하게는 트레할로스와 같은 이당류 또는 덱스트란과 같은 다당류를 포함하는 수성 조성물을 제조하는 단계 및
(ii) 조성물을 동결하거나, 동결건조하거나, 분무 건조하는 단계를 포함하는, 동결되거나, 동결건조되거나, 분무 건조된 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
일 구현예에서, 수성 조성물은 EDTA와 같은 킬레이트제를 추가로 포함한다. 일 구현예에서, 수성 조성물은 5% 내지 20%(w/v)의 이당류 및 선택적으로 20 μM 내지 10 mM, 예컨대 80 μM 내지 5 mM의 킬레이트제를 포함한다. 일 구현예에서, 수성 조성물은 트레할로스, HEPES, 및 EDTA, 예컨대 10% 트레할로스(w/v), 2.8 mM HEPES, 80 μM EDTA, pH 7.1을 포함한다.
추가의 양태에서, 본 발명은,
(a) 단일 가닥 RNA; 및
(b) 폴리알킬렌이민을 포함하는, 동결되거나, 동결건조되거나, 분무 건조된 조성물을 제조하기 위한 동결보호제 및/또는 동결건조보호제, 바람직하게는 트레할로스와 같은 이당류, 또는 덱스트란과 같은 다당류의 용도에 관한 것이다.
일 구현예에서, 이당류는 EDTA와 같은 킬레이트제와 조합하여 사용된다.
동결되거나, 동결건조되거나, 분무 건조된 조성물, 또는 동결되거나, 동결건조되거나, 분무 건조된 조성물을 제조하기 위한 수성 조성물은 다음 중 하나 이상을 포함할 수 있다:
(i) 비-수성 용매, 예컨대 에틸렌 글리콜, 글리세롤, 디메틸설폭시드, 및 디메틸포름아미드.
(ii) 계면활성제, 예컨대 Tween 80, Brij 35, Brij 30, Lubrol-px, Triton X-10; 폴록사머로도 알려진 Pluronic F127(폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체), 폴록사민, 및 소듐 도데실 설페이트.
(iii) 이당류, 예컨대 트레할로스, 수크로스, 락토스, 및 말토오스.
(iv) 중합체(다양한 MW를 가질 수 있음), 예컨대 폴리에틸렌 글리콜, 덱스트란, 폴리(비닐 알코올), 하이드록시프로필 메틸셀룰로스, 젤라틴, 폴리비닐피롤리딘, 하이드록시에틸 셀룰로스, 피콜(Ficoll), 및 알부민.
(v) 아미노산, 예컨대 글리신, 프롤린, 4-하이드록시프롤린, L-세린, 글루타메이트, 알라닌, 라이신, 사르코신, 및 감마-아미노부티르산.
추가의 양태에서, 본 발명은 연속 유동 펌프 및 혼합 장치를 사용함으로써 RNA 폴리플렉스 제형의 연속 유동 제조를 위한 방법에 관한 것으로, 두 수성 유체는 mm 또는 μm 크기의 채널에 의해 혼합된다.
도 1. A. 시험관내에서의 HEK-293 세포에 대한 유리 형태의 순수한 PEI의 독성. IC50 = 77 μM의 질소(유리형태). B. 시험관내에서의 HEK-293 세포에 대한 PEI/레플리콘-RNA 폴리플렉스의 독성. IC50 = 542 μM의 질소(폴리플렉스 제형).
도 2. 1주 저장 후 다양한 저장 조건으로부터의 N/P 11.6의 PEI/레플리콘-RNA 폴리플렉스와 함께 인큐베이팅한 후 C2C12 근육 세포로부터의 상대적 발광.
도 3. 2주 저장 후 다양한 저장 조건에서의 N/P 11.6의 PEI/레플리콘-RNA 폴리플렉스의 상대적 RNA 무결성.
도 4. 폴리(2-에틸-2-옥사졸린)은 개시제의 존재 하에 2-에틸-2-옥사졸린의 개환 이성질화 중합에 의해 얻어진다.
도 5. PEOZ의 산 가수분해에 의한 완전 탈아실화된 선형 PEI22, PEI87, 및 PEI217의 합성. 조건: (i) 24%(wt/vol) HCl, 110℃, 96 h; 50-kDa PEOZ의 경우 n=504, 200-kDa PEOZ의 경우 n=2,018, 및 500-kDa PEOZ의 경우 n=5,044.
도 6. 증가하는 염 농도에서의 IVT(A) 및 레플리콘(B) 폴리플렉스의 응집 역학.
도 7. 여과 전(초기) 및 여과 후(최종) 폴리플렉스의 물리화학적 파라미터. A 및 B. 폴리플렉스의 직경 및 다분산도는 DLS에 의해 측정되었다. C. 헤파린에 의해 폴리플렉스로부터 RNA를 방출시키고, 260 nm에서 UV 흡수에 의해 측정하였다. D. PEI 농도를 CuSO4 검정에 의해 측정하였다.
도 8. 고순도 PEI 및 보통 순도 PEI의 화학 구조의 비교. 25 kDa의 PEI의 경우 n=58. PEI 25 kD에서 -CH2CH2NH- 단량체의 평균 개수는 581개이며, 이는 또한 잠재적으로 양성자화 가능한 질소의 연속 스트레치의 길이이다. 보통 순도 PEI25 내에서의 N-프로피오닐 모이어티의 균일한 분포를 가정하면, 양성자화 가능한 질소의 연속 스트레치는 64개에 불과하다.
도 9. 다양한 N/P 비로 순도 수준이 상이한 PEI를 사용하여 제조된 레플리콘-RNA 폴리플렉스에 의한 시험관내에서의 C2C12 근육 세포의 트랜스펙션.
도 10. 1(-) 및 11.6(+)의 N/P 비의 레플리콘-RNA 폴리플렉스를 고순도 PEI(jetPEI) 및 보통 순도 PEI(25 kDa)로 제조하였다. 유리 형태의 RNA를 대조표준으로 사용하였다. 제형을 마우스(n=3)의 뒷다리에 i.m. 주사하였다. 마우스의 근육으로부터 발광 신호를 기록하였다.
도 11. 7.7 및 11.6의 N/P 비의 레플리콘-RNA 폴리플렉스를 고순도 PEI, 즉, jetPEI(제조사: Polyplus), PEI-Max 40000(제조사: Polyscience), 및 Exgen 500(제조사: Eurodamex)로 제조하였다. HBTx1 완충액 중에서 제조된 동결건조된 제형을 제외한 모든 제형을 HBGx1 완충액 중에서 제조하였다. 제형을 마우스(n=3)의 뒷다리에 i.m. 주사하였다. 마우스의 근육으로부터 발광 신호를 기록하였다.
도 12. 다양한 완충액으로 제조된 N/P 11.6의 JetPEI/레플리콘-RNA 폴리플렉스의 동결 건조된 케이크.
도 13. 루시퍼라아제를 인코딩하는 IVT-RNA에 의해 시험관내에서 C2C12 근육 세포를 트랜스펙션시켰다. RNA를 HBGx1 완충액 중에서 다양한 N/P 비로 JetPEI와 복합체화시켰다. 트랜스펙션 후 24시간째에 발광 신호를 측정하였다.
도 14. 5.8 및 11.6의 N/P 비의 IVT-RNA 폴리플렉스를 HBGx1 완충액 중에서 순수한 PEI로 제조하였다. HBGx1 완충액 중의 유리 형태의 IVT-RNA를 대조표준으로 사용하였다. 제형을 주사당 2 내지 8 μg의 RNA 용량으로 마우스(n=3)의 뒷다리에 i.m. 주사하였다. 주사 후 6시간째에 마우스의 근육으로부터 발광 신호를 기록하였다.
도 15. 레플리콘-RNA 및 jetPEI의 폴리플렉스를 HBGx1 완충액 중에서 11.6의 N/P 비에서 상이한 RNA 농도로 제조하였다. DLS에 의한 크기 측정을 위해, 폴리플렉스를 10 mg/l의 RNA 농도로 희석하였다.
도 16. C2C12 근육 세포를 도 16의 폴리플렉스로 시험관내에서 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션 후 24시간째에 발광 신호를 측정하였다.
도 17. 11.6의 N/P 비의 Rep-RNA 폴리플렉스를 도 16에서와 같이 상이한 RNA 농도에서 HBGx1 완충액 중에서 순수한 PEI로 제조하였다. 제형을 주사당 2 내지 8 μg의 RNA 용량으로 마우스(n=3)의 뒷다리에 i.m. 주사하였다. 마우스의 근육으로부터 발광 신호를 기록하였다.
도 18. 인간 수지상 세포(DC) 및 마우스 근육 세포(C2C12)에 대한 PEI/레플리콘-RNA 폴리플렉스를 사용한 시험관내 연구. A. 독성(폴리플렉스에 의한 처리 후 생존 세포의 %로 표현됨). B. 트랜스펙션(폴리플렉스에 의한 처리 후 발광 방출로 표현됨). 트랜스펙션 결과는 C2C12 세포에 대해서만 나타난다.
도 19. 11.6 또는 15.8의 N/P 비의 Rep-RNA 폴리플렉스를 HBGx1 또는 Hepes 10 mM 완충액 중에서 Polyplus 또는 Polytheragene으로부터의 PEI로 제조하였다. 마우스로의 주사 전에 폴리플렉스를 HBGx1 또는 Opti-MEM 완충액 중에 희석하였다. 제형을 주사당 2 μg의 RNA 용량으로 마우스(n=3)의 뒷다리에 i.m. 주사하였다. 마우스의 근육으로부터 발광 신호를 기록하였다.
도 20. A) Balb/c 마우스의 양쪽 후경골근으로의 2 μg의 루시퍼라제를 인코딩하는 비제형화된(완충 용액) 또는 제형화된 레플리콘-RNA의 근육내(i.m.) 적용 후 4일차, 7일차 및 11일차에, 동물을 비침습성 생체내 생체발광 이미지화에 적용하였다. 루시퍼라아제 단백질로부터 유래된 광자를 1분에 걸쳐 수집하였고, 이를 이미지화된 마우스의 사진과의 오버레이로 나타낸다. B) 주사 부위에서 측정된 광자/초(p/s)의 그래픽 디스플레이.
도 21. A) Balb/c 마우스의 등쪽 피부에 있는 두 주사 부위로의 2 μg의 루시퍼라제를 인코딩하는 비제형화된(완충 용액) 또는 제형화된 레플리콘-RNA의 진피내(i.d.) 적용 후 7일차에, 동물을 비침습성 생체내 생체발광 이미지화에 적용하였다. 루시퍼라아제 단백질로부터 유래된 광자를 1분에 걸쳐 수집하였고, 이를 이미지화된 마우스의 사진과의 오버레이로 나타낸다. 검은색 화살표는 주사 부위를 나타낸다. B) 주사 부위에서 측정된 광자/초(p/s)의 그래픽 디스플레이.
도 22. 백신으로서 레플리콘-RNA 제형의 유익한 효과.
도 23. 백신으로서 레플리콘-RNA 제형의 유익한 효과.
도 24. 10%(w:v) 트레할로스 중의 PEI로 제형화된 레플리콘-RNA의 분무 건조로부터의 결과.
도 25. 멸균 여과 전(제조된 경우) 및 멸균 여과 후(멸균된 경우), 상이한 N/P 비의 PEI/레플리콘-RNA 폴리플렉스와 함께 인큐베이팅한 후 C2C12 근육 세포로부터의 정규화된 발광.
도 26: 실시예 16에 따른 시험관내 트랜스펙션 효율에 대한 짧은 PEI 및 긴 PEI의 조합의 효과. 도 26의 A): 250 ng RNA/웰에서의 짧은 선형 PEI 및 긴 PEI 폴리플렉스의 트랜스펙션 효능. 도 26의 B): 250 ng RNA/웰에서의 짧은 분지형 PEI 및 긴 PEI 폴리플렉스의 트랜스펙션 효능. 벤치마크(benchmark) 생체내 Jet PEI에 비해 그리고 동일한 총 NP 비에 대해, 다양한 시간 프레임에서의 더 높은 발현 수준이 짧은 PEI(도 26의 A: 선형; 도 26의 B: 분지형) 및 긴 PEI(예를 들어, 생체내 jetPEI)의 조합으로 달성되었다.
도 27: 실시예 17에 따른 긴 Jet PEI + 짧은 PEI 폴리플렉스 대 벤치마크(즉, 생체내 JetPEI NP12)의 레플리콘-RNA 트랜스펙션 효능: 12의 총 NP에 대한 다양한 조합(NP4 + NP8 또는 NP1,15 + NP11)에서의 짧은 PEI(분지형 1,8 kDa) 및 긴 PEI.
도 28: 실시예 18에 따른 생체내에서의 레플리콘 (saRNA)-RNA 트랜스펙션 효율에 대한 염 변화(예를 들어, NaCl)의 효과. 생체발광 신호는 3일차(도 28의 A), 6일차(도 28의 B), 9일차(도 28의 C) 및 13일차(도 28의 D)에 검출되었다. 신호 강도를 도 28의 E에서 비교하였다. 마우스의 근육 영역에서의 가장 강렬한 신호는, PEI-레플리콘-RNA 폴리플렉스(예를 들어, 긴 PEI N/P 12)가 투여되고 저농도(5 내지 10 mM) 염이 첨가된 마우스에서 i.m. 주사 후 6일차에 검출될 수 있었다.
도 29: 실시예 18에 따른 레플리콘 (saRNA)-PEI 제형의 트랜스펙션 효율에 대한 pH 조정의 효과. 6.5 내지 7.1의 pH 값을 갖는 saRNA-PEI 폴리플렉스 제형으로 양호한 결과가 얻어졌다. 가장 강렬한 신호는 pH 6.5 로 조정된 saRNA-긴 PEI NP12 제형으로 검출될 수 있었다. 벤치마크로서, 비조정된 pH(BM) 또는 HBG(20 mM Hepes, pH 7.4, 5 중량% 글루코스)를 갖는 saRNA-Jet PEI 폴리플렉스 NP12가 사용되었다.
도 30: 실시예 19에 따른 다양한 pH 값으로 조정된 생체내 jetPEI/레플리콘-RNA 폴리플렉스(N/P 4)의 전기영동 이동도.
도 31: 실시예 19에 따른 4의 N/P 비 및 다양한 pH 값(pH 6.5 내지 pH 8.5)의 다양한 용량의 생체내 jetPEI/레플리콘-RNA 폴리플렉스와 함께 인큐베이팅한 후 C2C12 근육 세포로부터의 정규화된 발광.
도 32: 실시예 20에 따른 PEI 제형 중의 다양한 양의 PEI/과량의 양전하에 의한 트랜스펙션 후의 루시퍼라제 발현.
도 33: 실시예 21에 따른 2 단계 복합체화를 이용한 폴리플렉스 트랜스펙션의 최적화.
도 34: HEPES-완충 글루코스(HBG)와 비교하여 MES-완충 글루코스(MBG)로 제형화된 saRNA-폴리플렉스의 우수한 효과를 나타내는 실시예 22에 따른 면역화 실험.
도 35: 동물은 A/California/7/2009 (H1N1) 바이러스(H1N1/Cf7-HA)의 HA를 인코딩하는 PEI-제형화된 자기-증폭 RNA(saRNA)에 의한 근육내(i.m.) 면역화 후 중화 항체 면역 반응을 발생시킨다.
(A) BALB/c 마우스를, 완충액, 1/25회 용량의 인간 백신 또는 12/1의 N/P 비의 H1N1/Cf7-HA를 인코딩하는 0.1 μg의 PEI-제형화된 VEEV-saRNA 또는 SFV-saRNA로 0일차에 1회 면역화하였다. 28일 및 48일 후, 동물에서 채혈하고, 바이러스 중화 검정(VNT; n = 4)에 의해 측정된 HA에 대한 항체에 대해 혈청을 분석하였다.
(B) 사육용 새끼 돼지를, 완충액, 1회 용량의 인간 백신 또는 12/1의 N/P 비의 H1N1/Cf7-HA를 인코딩하는 90 μg의 PEI-제형화된 VEEV-saRNA 또는 SFV-saRNA로 0일차에 1회 면역화하였다. 면역화 후 14일차, 21일차, 28일차 및 35일차에 돼지에서 채혈하여 VNT(n = 8; 완충액 그룹 n = 4)를 수행함으로써 HA에 대한 중화 항체 면역 반응을 분석하였다.
제형화된 VEEV-saRNA 백신이 투여된 동물 그룹은 양성 대조표준이 주입된 동물과 유사한 면역 반응을 발생시켰다. SFV-saRNA는 또한 중화 항체 면역 반응의 발생을 가져왔지만, VEEV-saRNA 면역화 후보다 낮은 역가를 생성하였다. 평균 ± SEM이 그래프에 제시되어 있다.
도 36: 동물은 돼지 써코바이러스 2(PCV2)-cap_EU 단백질을 인코딩하는 PEI-제형화된 자기-증폭 RNA(saRNA)에 의한 근육내(i.m.) 면역화 후 항체 면역 반응을 발생시킨다.
BALB/c 마우스를, 완충액, 12/1의 N/P 비의 PCV2-cap_EU를 인코딩하는 1 μg의 PEI-제형화된 SFV-saRNA 또는 VEEV-saRNA로 0일차 및 35일차에 2회 면역화하였다. 14일차, 34일차 및 56일차에, 동물에서 채혈하고, 상업적으로 이용 가능한 ELISA 검정(INgezim Circo IgG, Ingenasa; n = 4)에 의해 결정된 바와 같은 PCV2-cap에 대한 항체에 대해 혈청을 분석하였다.
제형화된 SFV- 또는 VEEV-saRNA 백신이 투여된 동물 그룹은 PCV2-cap_EU 단백질에 대해서와 유사한 면역 반응을 발생시켰다. SFV-saRNA에 의한 단일 백신접종 후의 항체 면역 반응은 VEEV-saRNA의 경우보다 약간 더 높았다. 2회 면역화 후, 항체 반응은 두 유형의 saRNA 백신 모두의 경우 거의 동일하였다. 평균 ± SEM이 그래프에 제시되어 있다.
도 37: 레플리콘-RNA(saRNA)를 다양한 완충 시스템 및 pH 조건에서 N/P12로 복합체화시켰다. 아세테이트 또는 MES 완충액인 두 유형의 완충액은 모두 최종 농도 10 mM의 완충제 및 최종 농도 5% w/v의 D-글루코스를 함유하였다. saRNA/PEI-폴리플렉스를 다양한 기간(복합체화 후 1일, 2일, 4일 및 8일) 동안 4℃에서 각각의 완충액 중에 저장하였다. 다양한 제형의 복합체화 시, RNA 무결성을 직접 측정하였다(t=0). RNA 무결성을 모세관 전기영동을 통해 측정하였다. 폴리플렉스 중의 복합체화된 saRNA는, 중합체와의 정전기적 상호 작용을 유도하여 폴리플렉스 내에 동봉된 RNA를 방출시키는 매우 과량의 폴리음이온과 함께 RT에서 20 분 인큐베이팅한 후에 방출될 수 있다. 200 ug의 방출된 RNA는, 모세관 전기영동 검정을 위해 적절한 키트(Standard Sensitivity RNA Analysis Kit DF471)와 함께 제공된 프로토콜에 따라 엄격하게 사용된다. 각 시점에 대해, saRNA 무결성의 정량를 위해 기준 saRNA를 사용하였다.
제형 완충액 중의 더 높은 pH 값은 saRNA의 유의하게 증가된 분해를 가져온다. 복합체화 시의 saRNA의 최저 무결성 손실은 아세테이트 완충액으로 pH 4에서 달성되었다.
도 38: A/California/7/2009 (H1N1; Cf7/HA)의 HA를 인코딩하는 PEI-제형화된 saRNA-VEEV는 상업용 백신에 비해 강하고 오래 지속되는 항체 반응을 유도하지만, 단백질 기반 백신은 유도할 수 없는 강한 T 세포 반응을 추가로 유도한다.
BALB/c 마우스를, 완충액(검은색 기호), 20 μL의 계절성 인플루엔자 바이러스 균주에 대한 허가된 인간 백신(Begripal 2016/2017; hLIC; 회색 기호) 또는 Cf7/HA를 인코딩하는 0.5 μg의 PEI-제형화된 VEEV-saRNA 기반 백신(암회색 기호)으로 0일차 및 35일차에 2 회 i.m. 면역화하였다(그래프에서, 화살표로 표시됨). 다양한 시점에서, 마우스를 희생시키고, A) 비장 세포를 수집하여 단일 세포 현탁액으로 Cf7/HA-특이적 ELISpot 검정을 수행하였다. ELISpot 분석을 위해, 다양한 CF7/HA 특이적 펩티드 푸울(pool)을 사용하여, IFNy 분비에 의해 측정되는 CD8+ T 세포(좌측) 또는 CD4+ T 세포(우측) 반응을 자극하였다. 추가로, 혈청 세포 샘플을 수집하여, B) 혈청 항체에 대한 항-Cf4/HA 특이적 바이러스 중화 검정을, 바이러스 세포 감염을 억제하는 그의 기능성에 대해 수행하였다. 혈청학적 분석을 위해 A/California/4/2009(H1N1; Cf4) 바이러스가 이용되었음을 주목하고; 데이터는 평균 ± SEM을 나타낸다(완충액 그룹 n = 3; 백신 그룹 n = 4).
도 2. 1주 저장 후 다양한 저장 조건으로부터의 N/P 11.6의 PEI/레플리콘-RNA 폴리플렉스와 함께 인큐베이팅한 후 C2C12 근육 세포로부터의 상대적 발광.
도 3. 2주 저장 후 다양한 저장 조건에서의 N/P 11.6의 PEI/레플리콘-RNA 폴리플렉스의 상대적 RNA 무결성.
도 4. 폴리(2-에틸-2-옥사졸린)은 개시제의 존재 하에 2-에틸-2-옥사졸린의 개환 이성질화 중합에 의해 얻어진다.
도 5. PEOZ의 산 가수분해에 의한 완전 탈아실화된 선형 PEI22, PEI87, 및 PEI217의 합성. 조건: (i) 24%(wt/vol) HCl, 110℃, 96 h; 50-kDa PEOZ의 경우 n=504, 200-kDa PEOZ의 경우 n=2,018, 및 500-kDa PEOZ의 경우 n=5,044.
도 6. 증가하는 염 농도에서의 IVT(A) 및 레플리콘(B) 폴리플렉스의 응집 역학.
도 7. 여과 전(초기) 및 여과 후(최종) 폴리플렉스의 물리화학적 파라미터. A 및 B. 폴리플렉스의 직경 및 다분산도는 DLS에 의해 측정되었다. C. 헤파린에 의해 폴리플렉스로부터 RNA를 방출시키고, 260 nm에서 UV 흡수에 의해 측정하였다. D. PEI 농도를 CuSO4 검정에 의해 측정하였다.
도 8. 고순도 PEI 및 보통 순도 PEI의 화학 구조의 비교. 25 kDa의 PEI의 경우 n=58. PEI 25 kD에서 -CH2CH2NH- 단량체의 평균 개수는 581개이며, 이는 또한 잠재적으로 양성자화 가능한 질소의 연속 스트레치의 길이이다. 보통 순도 PEI25 내에서의 N-프로피오닐 모이어티의 균일한 분포를 가정하면, 양성자화 가능한 질소의 연속 스트레치는 64개에 불과하다.
도 9. 다양한 N/P 비로 순도 수준이 상이한 PEI를 사용하여 제조된 레플리콘-RNA 폴리플렉스에 의한 시험관내에서의 C2C12 근육 세포의 트랜스펙션.
도 10. 1(-) 및 11.6(+)의 N/P 비의 레플리콘-RNA 폴리플렉스를 고순도 PEI(jetPEI) 및 보통 순도 PEI(25 kDa)로 제조하였다. 유리 형태의 RNA를 대조표준으로 사용하였다. 제형을 마우스(n=3)의 뒷다리에 i.m. 주사하였다. 마우스의 근육으로부터 발광 신호를 기록하였다.
도 11. 7.7 및 11.6의 N/P 비의 레플리콘-RNA 폴리플렉스를 고순도 PEI, 즉, jetPEI(제조사: Polyplus), PEI-Max 40000(제조사: Polyscience), 및 Exgen 500(제조사: Eurodamex)로 제조하였다. HBTx1 완충액 중에서 제조된 동결건조된 제형을 제외한 모든 제형을 HBGx1 완충액 중에서 제조하였다. 제형을 마우스(n=3)의 뒷다리에 i.m. 주사하였다. 마우스의 근육으로부터 발광 신호를 기록하였다.
도 12. 다양한 완충액으로 제조된 N/P 11.6의 JetPEI/레플리콘-RNA 폴리플렉스의 동결 건조된 케이크.
도 13. 루시퍼라아제를 인코딩하는 IVT-RNA에 의해 시험관내에서 C2C12 근육 세포를 트랜스펙션시켰다. RNA를 HBGx1 완충액 중에서 다양한 N/P 비로 JetPEI와 복합체화시켰다. 트랜스펙션 후 24시간째에 발광 신호를 측정하였다.
도 14. 5.8 및 11.6의 N/P 비의 IVT-RNA 폴리플렉스를 HBGx1 완충액 중에서 순수한 PEI로 제조하였다. HBGx1 완충액 중의 유리 형태의 IVT-RNA를 대조표준으로 사용하였다. 제형을 주사당 2 내지 8 μg의 RNA 용량으로 마우스(n=3)의 뒷다리에 i.m. 주사하였다. 주사 후 6시간째에 마우스의 근육으로부터 발광 신호를 기록하였다.
도 15. 레플리콘-RNA 및 jetPEI의 폴리플렉스를 HBGx1 완충액 중에서 11.6의 N/P 비에서 상이한 RNA 농도로 제조하였다. DLS에 의한 크기 측정을 위해, 폴리플렉스를 10 mg/l의 RNA 농도로 희석하였다.
도 16. C2C12 근육 세포를 도 16의 폴리플렉스로 시험관내에서 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션 후 24시간째에 발광 신호를 측정하였다.
도 17. 11.6의 N/P 비의 Rep-RNA 폴리플렉스를 도 16에서와 같이 상이한 RNA 농도에서 HBGx1 완충액 중에서 순수한 PEI로 제조하였다. 제형을 주사당 2 내지 8 μg의 RNA 용량으로 마우스(n=3)의 뒷다리에 i.m. 주사하였다. 마우스의 근육으로부터 발광 신호를 기록하였다.
도 18. 인간 수지상 세포(DC) 및 마우스 근육 세포(C2C12)에 대한 PEI/레플리콘-RNA 폴리플렉스를 사용한 시험관내 연구. A. 독성(폴리플렉스에 의한 처리 후 생존 세포의 %로 표현됨). B. 트랜스펙션(폴리플렉스에 의한 처리 후 발광 방출로 표현됨). 트랜스펙션 결과는 C2C12 세포에 대해서만 나타난다.
도 19. 11.6 또는 15.8의 N/P 비의 Rep-RNA 폴리플렉스를 HBGx1 또는 Hepes 10 mM 완충액 중에서 Polyplus 또는 Polytheragene으로부터의 PEI로 제조하였다. 마우스로의 주사 전에 폴리플렉스를 HBGx1 또는 Opti-MEM 완충액 중에 희석하였다. 제형을 주사당 2 μg의 RNA 용량으로 마우스(n=3)의 뒷다리에 i.m. 주사하였다. 마우스의 근육으로부터 발광 신호를 기록하였다.
도 20. A) Balb/c 마우스의 양쪽 후경골근으로의 2 μg의 루시퍼라제를 인코딩하는 비제형화된(완충 용액) 또는 제형화된 레플리콘-RNA의 근육내(i.m.) 적용 후 4일차, 7일차 및 11일차에, 동물을 비침습성 생체내 생체발광 이미지화에 적용하였다. 루시퍼라아제 단백질로부터 유래된 광자를 1분에 걸쳐 수집하였고, 이를 이미지화된 마우스의 사진과의 오버레이로 나타낸다. B) 주사 부위에서 측정된 광자/초(p/s)의 그래픽 디스플레이.
도 21. A) Balb/c 마우스의 등쪽 피부에 있는 두 주사 부위로의 2 μg의 루시퍼라제를 인코딩하는 비제형화된(완충 용액) 또는 제형화된 레플리콘-RNA의 진피내(i.d.) 적용 후 7일차에, 동물을 비침습성 생체내 생체발광 이미지화에 적용하였다. 루시퍼라아제 단백질로부터 유래된 광자를 1분에 걸쳐 수집하였고, 이를 이미지화된 마우스의 사진과의 오버레이로 나타낸다. 검은색 화살표는 주사 부위를 나타낸다. B) 주사 부위에서 측정된 광자/초(p/s)의 그래픽 디스플레이.
도 22. 백신으로서 레플리콘-RNA 제형의 유익한 효과.
도 23. 백신으로서 레플리콘-RNA 제형의 유익한 효과.
도 24. 10%(w:v) 트레할로스 중의 PEI로 제형화된 레플리콘-RNA의 분무 건조로부터의 결과.
도 25. 멸균 여과 전(제조된 경우) 및 멸균 여과 후(멸균된 경우), 상이한 N/P 비의 PEI/레플리콘-RNA 폴리플렉스와 함께 인큐베이팅한 후 C2C12 근육 세포로부터의 정규화된 발광.
도 26: 실시예 16에 따른 시험관내 트랜스펙션 효율에 대한 짧은 PEI 및 긴 PEI의 조합의 효과. 도 26의 A): 250 ng RNA/웰에서의 짧은 선형 PEI 및 긴 PEI 폴리플렉스의 트랜스펙션 효능. 도 26의 B): 250 ng RNA/웰에서의 짧은 분지형 PEI 및 긴 PEI 폴리플렉스의 트랜스펙션 효능. 벤치마크(benchmark) 생체내 Jet PEI에 비해 그리고 동일한 총 NP 비에 대해, 다양한 시간 프레임에서의 더 높은 발현 수준이 짧은 PEI(도 26의 A: 선형; 도 26의 B: 분지형) 및 긴 PEI(예를 들어, 생체내 jetPEI)의 조합으로 달성되었다.
도 27: 실시예 17에 따른 긴 Jet PEI + 짧은 PEI 폴리플렉스 대 벤치마크(즉, 생체내 JetPEI NP12)의 레플리콘-RNA 트랜스펙션 효능: 12의 총 NP에 대한 다양한 조합(NP4 + NP8 또는 NP1,15 + NP11)에서의 짧은 PEI(분지형 1,8 kDa) 및 긴 PEI.
도 28: 실시예 18에 따른 생체내에서의 레플리콘 (saRNA)-RNA 트랜스펙션 효율에 대한 염 변화(예를 들어, NaCl)의 효과. 생체발광 신호는 3일차(도 28의 A), 6일차(도 28의 B), 9일차(도 28의 C) 및 13일차(도 28의 D)에 검출되었다. 신호 강도를 도 28의 E에서 비교하였다. 마우스의 근육 영역에서의 가장 강렬한 신호는, PEI-레플리콘-RNA 폴리플렉스(예를 들어, 긴 PEI N/P 12)가 투여되고 저농도(5 내지 10 mM) 염이 첨가된 마우스에서 i.m. 주사 후 6일차에 검출될 수 있었다.
도 29: 실시예 18에 따른 레플리콘 (saRNA)-PEI 제형의 트랜스펙션 효율에 대한 pH 조정의 효과. 6.5 내지 7.1의 pH 값을 갖는 saRNA-PEI 폴리플렉스 제형으로 양호한 결과가 얻어졌다. 가장 강렬한 신호는 pH 6.5 로 조정된 saRNA-긴 PEI NP12 제형으로 검출될 수 있었다. 벤치마크로서, 비조정된 pH(BM) 또는 HBG(20 mM Hepes, pH 7.4, 5 중량% 글루코스)를 갖는 saRNA-Jet PEI 폴리플렉스 NP12가 사용되었다.
도 30: 실시예 19에 따른 다양한 pH 값으로 조정된 생체내 jetPEI/레플리콘-RNA 폴리플렉스(N/P 4)의 전기영동 이동도.
도 31: 실시예 19에 따른 4의 N/P 비 및 다양한 pH 값(pH 6.5 내지 pH 8.5)의 다양한 용량의 생체내 jetPEI/레플리콘-RNA 폴리플렉스와 함께 인큐베이팅한 후 C2C12 근육 세포로부터의 정규화된 발광.
도 32: 실시예 20에 따른 PEI 제형 중의 다양한 양의 PEI/과량의 양전하에 의한 트랜스펙션 후의 루시퍼라제 발현.
도 33: 실시예 21에 따른 2 단계 복합체화를 이용한 폴리플렉스 트랜스펙션의 최적화.
도 34: HEPES-완충 글루코스(HBG)와 비교하여 MES-완충 글루코스(MBG)로 제형화된 saRNA-폴리플렉스의 우수한 효과를 나타내는 실시예 22에 따른 면역화 실험.
도 35: 동물은 A/California/7/2009 (H1N1) 바이러스(H1N1/Cf7-HA)의 HA를 인코딩하는 PEI-제형화된 자기-증폭 RNA(saRNA)에 의한 근육내(i.m.) 면역화 후 중화 항체 면역 반응을 발생시킨다.
(A) BALB/c 마우스를, 완충액, 1/25회 용량의 인간 백신 또는 12/1의 N/P 비의 H1N1/Cf7-HA를 인코딩하는 0.1 μg의 PEI-제형화된 VEEV-saRNA 또는 SFV-saRNA로 0일차에 1회 면역화하였다. 28일 및 48일 후, 동물에서 채혈하고, 바이러스 중화 검정(VNT; n = 4)에 의해 측정된 HA에 대한 항체에 대해 혈청을 분석하였다.
(B) 사육용 새끼 돼지를, 완충액, 1회 용량의 인간 백신 또는 12/1의 N/P 비의 H1N1/Cf7-HA를 인코딩하는 90 μg의 PEI-제형화된 VEEV-saRNA 또는 SFV-saRNA로 0일차에 1회 면역화하였다. 면역화 후 14일차, 21일차, 28일차 및 35일차에 돼지에서 채혈하여 VNT(n = 8; 완충액 그룹 n = 4)를 수행함으로써 HA에 대한 중화 항체 면역 반응을 분석하였다.
제형화된 VEEV-saRNA 백신이 투여된 동물 그룹은 양성 대조표준이 주입된 동물과 유사한 면역 반응을 발생시켰다. SFV-saRNA는 또한 중화 항체 면역 반응의 발생을 가져왔지만, VEEV-saRNA 면역화 후보다 낮은 역가를 생성하였다. 평균 ± SEM이 그래프에 제시되어 있다.
도 36: 동물은 돼지 써코바이러스 2(PCV2)-cap_EU 단백질을 인코딩하는 PEI-제형화된 자기-증폭 RNA(saRNA)에 의한 근육내(i.m.) 면역화 후 항체 면역 반응을 발생시킨다.
BALB/c 마우스를, 완충액, 12/1의 N/P 비의 PCV2-cap_EU를 인코딩하는 1 μg의 PEI-제형화된 SFV-saRNA 또는 VEEV-saRNA로 0일차 및 35일차에 2회 면역화하였다. 14일차, 34일차 및 56일차에, 동물에서 채혈하고, 상업적으로 이용 가능한 ELISA 검정(INgezim Circo IgG, Ingenasa; n = 4)에 의해 결정된 바와 같은 PCV2-cap에 대한 항체에 대해 혈청을 분석하였다.
제형화된 SFV- 또는 VEEV-saRNA 백신이 투여된 동물 그룹은 PCV2-cap_EU 단백질에 대해서와 유사한 면역 반응을 발생시켰다. SFV-saRNA에 의한 단일 백신접종 후의 항체 면역 반응은 VEEV-saRNA의 경우보다 약간 더 높았다. 2회 면역화 후, 항체 반응은 두 유형의 saRNA 백신 모두의 경우 거의 동일하였다. 평균 ± SEM이 그래프에 제시되어 있다.
도 37: 레플리콘-RNA(saRNA)를 다양한 완충 시스템 및 pH 조건에서 N/P12로 복합체화시켰다. 아세테이트 또는 MES 완충액인 두 유형의 완충액은 모두 최종 농도 10 mM의 완충제 및 최종 농도 5% w/v의 D-글루코스를 함유하였다. saRNA/PEI-폴리플렉스를 다양한 기간(복합체화 후 1일, 2일, 4일 및 8일) 동안 4℃에서 각각의 완충액 중에 저장하였다. 다양한 제형의 복합체화 시, RNA 무결성을 직접 측정하였다(t=0). RNA 무결성을 모세관 전기영동을 통해 측정하였다. 폴리플렉스 중의 복합체화된 saRNA는, 중합체와의 정전기적 상호 작용을 유도하여 폴리플렉스 내에 동봉된 RNA를 방출시키는 매우 과량의 폴리음이온과 함께 RT에서 20 분 인큐베이팅한 후에 방출될 수 있다. 200 ug의 방출된 RNA는, 모세관 전기영동 검정을 위해 적절한 키트(Standard Sensitivity RNA Analysis Kit DF471)와 함께 제공된 프로토콜에 따라 엄격하게 사용된다. 각 시점에 대해, saRNA 무결성의 정량를 위해 기준 saRNA를 사용하였다.
제형 완충액 중의 더 높은 pH 값은 saRNA의 유의하게 증가된 분해를 가져온다. 복합체화 시의 saRNA의 최저 무결성 손실은 아세테이트 완충액으로 pH 4에서 달성되었다.
도 38: A/California/7/2009 (H1N1; Cf7/HA)의 HA를 인코딩하는 PEI-제형화된 saRNA-VEEV는 상업용 백신에 비해 강하고 오래 지속되는 항체 반응을 유도하지만, 단백질 기반 백신은 유도할 수 없는 강한 T 세포 반응을 추가로 유도한다.
BALB/c 마우스를, 완충액(검은색 기호), 20 μL의 계절성 인플루엔자 바이러스 균주에 대한 허가된 인간 백신(Begripal 2016/2017; hLIC; 회색 기호) 또는 Cf7/HA를 인코딩하는 0.5 μg의 PEI-제형화된 VEEV-saRNA 기반 백신(암회색 기호)으로 0일차 및 35일차에 2 회 i.m. 면역화하였다(그래프에서, 화살표로 표시됨). 다양한 시점에서, 마우스를 희생시키고, A) 비장 세포를 수집하여 단일 세포 현탁액으로 Cf7/HA-특이적 ELISpot 검정을 수행하였다. ELISpot 분석을 위해, 다양한 CF7/HA 특이적 펩티드 푸울(pool)을 사용하여, IFNy 분비에 의해 측정되는 CD8+ T 세포(좌측) 또는 CD4+ T 세포(우측) 반응을 자극하였다. 추가로, 혈청 세포 샘플을 수집하여, B) 혈청 항체에 대한 항-Cf4/HA 특이적 바이러스 중화 검정을, 바이러스 세포 감염을 억제하는 그의 기능성에 대해 수행하였다. 혈청학적 분석을 위해 A/California/4/2009(H1N1; Cf4) 바이러스가 이용되었음을 주목하고; 데이터는 평균 ± SEM을 나타낸다(완충액 그룹 n = 3; 백신 그룹 n = 4).
본 발명이 이하에서 상세하게 설명되지만, 본 발명은 본원에 기술된 특정 방법론, 프로토콜 및 시약에 제한되지 않는 것으로 이해되어야 하는데, 이는 이러한 것들이 달라질 수 있기 때문이다. 또한, 본원에 사용된 용어는 특정 구현예를 설명하기 위함일 뿐이며, 첨부된 청구범위에 의해서만 제한되는 본 발명의 범위를 제한하려는 것이 아님을 이해해야 한다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 학술 용어는 당업자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다.
바람직하게는, 본원에 사용된 용어는 문헌["A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)", H.G.W. Leuenberger, B. Nagel, and H. Koelbl, Eds., Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland, (1995)]에 기재된 바와 같이 정의된다.
본 발명의 실시는, 달리 지시되지 않는 한, 당 분야의 문헌에 설명된 화학, 생화학, 세포 생물학, 면역학, 및 재조합 DNA 기법의 종래 방법을 사용할 것이다-(예를 들어, 문헌[Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, J. Sambrook et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989] 참조).
이하에서, 본 발명의 요소들이 설명될 것이다. 이들 요소는 특정 구현예들과 관련하여 열거되지만, 이들 구현예는 추가의 구현예를 생성하기 위해 임의의 방식 및 임의의 수로 조합될 수 있음을 이해해야 한다. 다양하게 기술된 예 및 바람직한 구현예는 단지 명시적으로 설명된 구현예로 본 발명을 제한하도록 해석되어서는 안된다. 이러한 설명은, 명시적으로 설명된 구현예를 임의의 수의 개시된 및/또는 바람직한 요소와 결합한 구현예를 개시하고 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 본 출원에서 설명된 모든 요소의 임의의 순열 및 조합은 문맥이 달리 지시하지 않는 한 이러한 설명에 의해 개시된 것으로 간주되어야 한다.
용어 "약"은 대략 또는 거의를 의미하며, 본원에 제시된 수치 또는 범위와 관련하여 바람직하게는 나열되거나 청구된 수치 또는 범위의 +/- 10%를 의미한다.
본 발명을 설명하는 것과 관련하여(특히, 청구범위와 관련하여) 사용된 단수 용어 및 유사한 언급은 본원에서 달리 지시되지 않거나 문맥에 의해 명백히 모순되지 않는 한, 단수 및 복수 둘 모두를 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 본원에서 값의 범위의 나열은 단지 범위에 속하는 각각의 별개의 값을 개별적으로 지칭하는 약기 방법으로서 기능하도록 의도된다. 본원에서 달리 지시되지 않는 한, 각각의 개별 값은 본원에서 개별적으로 나열된 것처럼 본 명세서에 포함된다. 본원에 설명된 모든 방법은 본원에서 달리 지시되지 않거나 문맥에 의해 달리 명백하게 모순되지 않는 한 임의의 적절한 순서로 수행될 수 있다. 본원에서 제공된, 임의의 및 모든 예, 또는 예시적 표현(예를 들어, "예컨대")의 사용은 단지 본 발명을 더 잘 예시하도록 의도되며, 달리 청구된 본 발명의 범위에 제한을 가하는 것이 아니다. 본 명세서에서 어떠한 표현도 발명의 실시에 필수적인 임의의 청구되지 않은 요소를 나타내는 것으로 해석되어서는 안된다.
달리 명시되지 않는 한, "포함하는"이라는 용어는 본 문서와 관련하여 "포함하는"에 의해 도입된 목록의 구성원 외에 추가의 구성원이 선택적으로 존재할 수 있음을 나타내기 위해 사용된다. 그러나, 본 발명의 특정 구현예로서, "포함하는"이라는 용어는 추가의 구성원이 존재하지 않을 가능성을 포함한다는 것이 본 발명의 특정 구현예로서 고려되며, 즉, 이 구현예의 목적상 "포함하는"은 "로 이루어진"의 의미를 갖는 것으로 이해되어야 한다.
본 명세서의 본문 전반에 걸쳐 몇몇 문서가 인용된다. (모든 특허, 특허 출원, 학술 간행물, 제조사의 사양, 지침 등을 포함하는) 상기 또는 하기에서 본원에 인용된 각각의 문서은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다. 본원의 어떠한 것도 본 발명이 그러한 개시보다 선행할 자격이 없음을 인정하는 것으로 해석되어서는 안된다.
이하에서, 본 발명의 모든 양태에 적용되는 정의가 제공될 것이다.
본원에 사용되는 바와 같은 "감소" 또는 "억제"와 같은 용어는 수준의 전반적인 감소, 바람직하게는 5% 이상, 10% 이상, 20% 이상, 더욱 바람직하게는 50% 이상, 가장 바람직하게는 75% 이상의 감소를 일으키는 능력을 의미한다. 용어 "억제" 또는 유사한 문구는 완전하거나 본질적으로 완전한 억제, 즉, 0으로의 감소 또는 본질적으로 0으로의 감소를 포함한다.
"증가" 또는 "향상"과 같은 용어는 바람직하게는 대략 적어도 약 10%, 바람직하게는 적어도 20%, 바람직하게는 적어도 30%, 더욱 바람직하게는 적어도 40%, 더욱 바람직하게는 적어도 50%, 더욱더 바람직하게는 적어도 80%, 및 가장 바람직하게는 적어도 100% 증가 또는 향상과 관련된다.
핵산 서열과 관련하여, "단편"은 핵산 서열의 일부, 즉, 5'- 및/또는 3'-말단(들)에서 단축된 핵산 서열을 나타내는 서열과 관련된다. 바람직하게는, 핵산 서열의 단편은 상기 핵산 서열로부터의 뉴클레오티드 잔기의 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%를 포함한다. 본 발명에서, RNA 안정성 및/또는 번역 효율을 유지하는 RNA 분자의 단편이 바람직하다.
아미노산 서열(펩티드 또는 단백질)과 관련하여, "단편"은 아미노산 서열의 일부, 즉, N-말단 및/또는 C-말단에서 단축된 아미노산 서열을 나타내는 서열과 관련된다. C-말단에서 단축된 단편(N-말단 단편)은, 예를 들어 오픈 리딩 프레임의 3'-말단을 결여한 트렁케이션된 오픈 리딩 프레임의 번역에 의해 얻을 수 있다. N-말단에서 단축된 단편(C-말단 단편)은, 예를 들어 오픈 리딩 프레임의 5'-말단을 결여한 트렁케이션된 오픈 리딩 프레임의 번역에 의해 얻을 수 있는데, 트렁케이션된 오픈 리딩 프레임이 번역을 개시하는 역할을 하는 시작 코돈을 포함하는 한 그러하다. 아미노산 서열의 단편은, 예를 들어 아미노산 서열로부터의 아미노산 잔기의 적어도 1%, 적어도 2%, 적어도 3%, 적어도 4%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%를 포함한다.
용어 "이온 강도"는 특정 용액에서 다양한 종류의 이온 종의 수와 이들 각각의 전하 사이의 수학적 관계를 지칭한다. 따라서, 이온 강도 I는 하기 식에 의해 수학적으로 표현된다:
여기서, c는 특정 이온 종의 몰 농도이고, z는 그 전하의 절대 값이다. 합 Σ는 용액에서 모든 다양한 종류의 이온(i)에 대해 취해진다.
본원에 기재된 조성물의 이온 강도는 50 mM 이하, 바람직하게는 25 mM 이하, 바람직하게는 20 mM 이하, 19 mM 이하, 18 mM 이하, 17 mM 이하, 16 mM 이하, 15 mM 이하, 10 mM 이하, 또는 5 mM 이하인 것이 바람직하다. 바람직하게는, 본원에 기재된 조성물의 이온 강도는 폴리플렉스 입자의 응집을 방지하기에 충분히 낮다.
본 발명에 따르면, 용어 "이온 강도"는 바람직하게는 1가 이온의 존재와 관련된다. 2가 이온, 특히 2가 양이온의 존재와 관련하여, 킬레이트제의 존재로 인한 이의 농도 또는 유효 농도(유리 이온의 존재)는 바람직하게는 RNA의 분해를 방지하기에 충분히 낮다. 특히 바람직한 일 구현예에서, 2가 이온의 농도 또는 유효 농도 는 RNA 뉴클레오티드들 사이의 포스포디에스테르 결합의 가수분해를 위한 촉매 수준 미만이다. 특히 바람직한 일 구현예에서, 유리 2가 이온의 농도는 20 μM 이하이고, 바람직하게는 유리 2가 이온이 없거나 본질적으로 없다.
본원에 기재된 조성물의 pH는 4 내지 8이고; 더욱 바람직하게는 5.5 내지 8, 예컨대 6 내지 7.5, 예를 들어 6.5 내지 7.1, 6.5 내지 7, 또는 6.5 내지 6.9인 것이 바람직하다.
용어 "이당류"는 글리코시드 결합에 의해 연결된 2개의 단당류 잔기로 구성된 탄수화물을 지칭한다. 이당류의 대표적인 예로는 트레할로스, 말토스, 수크로스, 락토스, 락툴로스, 셀로비오스, 이소말토스, 겐티비오스(gentibiose), 라미나린(laminarin) 이당류(라미나라비오스(laminarabiose)), 키토비오스, 자일로비오스(xylobiose), 이눌린 이당류 및 만노비오스 당이 있다. 본원에 기재된 조성물 중의 이당류의 바람직한 함량은 5% 내지 20%(w/v), 예컨대 5% 내지 15%(w/v), 7% 내지 15%(w/v) 또는 8% 내지 12%(w/v)이다. 본 발명에 따르면 높은 유리 전이 온도를 갖는 이당류가 바람직하다.
용어 "킬레이트제"는 금속 이온, 바람직하게는 2가 또는 다가 금속 이온과 킬레이트를 형성하는 화합물을 의미한다. 킬레이트제는 금속 이온과 고리 구조를 형성할 수 있는 복수의 기, 예를 들어, OH, -COOH를 갖는다. 킬레이트제의 예로는 에틸렌 디아민 테트라아세트산(EDTA), 디에틸렌 트리아민 펜타아세트산(DTPA), 트랜스-1,2-디아미노-사이클로헥산 테트라아세트산 모노하이드레이트, N-하이드록시에틸에틸렌 디아민 트리아세트산(HEDTA) 시트르산, 및 인산 킬레이트제(예를 들어, Dequest 2000)가 있다. 에틸렌 디아민 테트라아세트산(EDTA)이 본 발명에 따라 바람직하다. 킬레이트제는 본원에 기재된 조성물에 적어도 20 μM, 적어도 40 μM, 적어도 60 μM, 또는 적어도 80 μM의 농도로 존재하는 것이 바람직하다. 킬레이트제는 본원에 기재된 조성물에 최대 10 mM, 최대 5 mM, 최대 2 mM, 최대 1 mM, 최대 0.5 mM, 최대 0.2 mM 또는 최대 0.1 mM의 농도로 존재하는 것이 바람직하다.
용어 "동결"은, 일반적으로 열의 제거에 따른, 액체의 고화와 관련된다.
용어 "동결건조하는" 또는 "동결건조"는 물질을 동결시키고, 이어서 물질 내의 동결된 매체가 고체상에서 기체상으로 직접 승화되도록 주변 압력을 감소시킴으로써 이루어진 물질의 동결-건조를 지칭한다.
용어 "분무 건조"는 용기(분무 건조기) 내에서 세분화(분무)된 유체와 (가열된) 기체를 혼합함으로써 물질을 분무 건조하는 것을 지칭하며, 여기서 형성된 액적으로부터의 용매가 증발되어 건조 분말을 생성한다.
용어 "동결보호제"는 동결 단계 동안 활성 성분을 보호하기 위해 제형에 첨가되는 물질과 관련된다.
용어 "동결건조보호제"는 건조 단계 동안 활성 성분을 보호하기 위해 제형에 첨가되는 물질과 관련된다.
용어 "재구성"은 물과 같은 용매를 건조된 제품에 첨가하여 원래의 액체 상태와 같은 액체 상태로 되돌리는 것과 관련된다.
용어 "자가"는 동일한 대상체로부터 유래된 것을 설명하는 데 사용된다. 예를 들어, "자가 세포"는 동일한 대상체로부터 유래된 세포를 지칭한다. 대상체 내로의 자가 세포의 도입은, 이러한 세포가 그렇지 않은 경우 거부 반응을 일으키는 면역학적 장벽을 극복하기 때문에 유리하다.
용어 "동종이계(allogeneic)"는 동일한 종의 다른 개체로부터 유래된 것을 설명하는 데 사용된다. 하나 이상의 유전자좌에서 유전자가 동일하지 않은 경우 둘 이상의 개체는 서로 동종이계라고 한다.
용어 "동계(syngeneic)"는 동일한 유전자형을 갖는 개체 또는 조직, 즉, 일란성 쌍생아 또는 동일한 근교계(inbred strain)의 동물, 또는 이의 조직 또는 세포로부터 유래된 것을 설명하는 데 사용된다.
용어 "이종"은 여러 다른 요소로 이루어진 것을 설명하는 데 사용된다. 예로서, 한 개체의 세포의 다른 개체 내로의 도입은 이종 이식편을 구성한다. 이종 유전자는 대상체 이외의 공급원으로부터 유래된 유전자이다.
본 발명에 따르면, 비보호된 RNA의 불안정성으로 인해, 복합체 형태의 RNA 분자를 제공하는 것이 유리하다. 특히, 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 RNA 및 폴리알킬렌이민을 포함하는 입자를 포함한다.
본 발명에 따른 시스템이 미립자 제형으로 제형화되는 경우, 각 RNA 종(예를 들어, 레플리콘, 레플리카제 작제물, 및 IFN을 억제하기에 적합한 단백질을 인코딩하는 RNA와 같은 선택적인 추가의 RNA 종)이 개별 미립자 제형으로서 별도로 제형화되는 것이 가능하다. 이 경우, 각각의 개별 미립자 제형은 하나의 RNA 종을 포함할 것이다. 개별 미립자 제형은 별도의 엔티티(entity)로서, 예를 들어 별도의 용기에 존재할 수 있다. 이러한 제형은 입자 형성 제제와 함께 각각의 RNA 종을 별도로(전형적으로 각각 RNA-함유 용액의 형태로) 제공하여 입자의 형성을 가능하게 함으로써 얻을 수 있다. 각각의 입자는 입자가 형성될 때 제공되는 특정 RNA 종을 오로지 함유할 것이다(개별 미립자 제형).
일 구현예에서, 본 발명에 따른 조성물은 하나 초과의 개별 입자 제형을 포함한다. 각각의 조성물은 혼합된 미립자 제형으로 지칭된다. 본 발명에 따른 혼합된 미립자 제형은, 상기 기재된 바와 같은 개별 미립자 제형들을 별도로 형성한 후, 개별 미립자 제형들을 혼합하는 단계에 의해 얻을 수 있다. 혼합 단계에 의해, RNA-함유 입자들의 혼합 집단을 포함하는 제형이 얻어진다(예시를 위해, 제1 입자 집단은 레플리콘을 함유할 수 있고, 제2 입자 제형은 레플리카제 작제물을 함유할 수 있음). 개별 미립자 집단은 하나의 용기에 함께 존재할 수 있으며, 개별 미립자 제형들의 혼합 집단을 포함한다.
대안적으로, 조성물의 모든 RNA 종(예를 들어 레플리콘, 레플리카제 작제물, 및 IFN을 억제하기에 적합한 단백질을 인코딩하는 RNA와 같은 선택적인 추가의 종)은 조합된 미립자 제형으로서 함께 제형화되는 것이 가능하다. 그러한 제형은 모든 RNA 종의 조합된 제형(전형적으로 조합된 용액)을 입자-형성 제제와 함께 제공하여 입자의 형성을 가능하게 함으로써 얻을 수 있다. 혼합된 미립자 제형과 대조적으로, 조합된 미립자 제형은 전형적으로 하나 초과의 RNA 종을 포함하는 입자를 포함할 것이다. 조합된 미립자 조성물에서, 다양한 RNA 종이 전형적으로 단일 입자에 함께 존재한다.
일 구현예에서, 본 발명의 미립자 제형은 나노미립자 제형이다. 그 구현예에서, 본 발명에 따른 조성물은 나노입자 형태의 RNA를 포함한다.
일반적인 정의에서, 용어 "나노입자"는 직경이 1 nm 내지 1000 나노미터(nm)인 임의의 입자를 지칭한다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "입자"는 분자 또는 분자 복합체에 의해 형성된 구조화된 엔티티와 관련된다. 일 구현예에서, 용어 "입자"는 마이크로 또는 나노 크기의 구조체, 예컨대 마이크로 또는 나노 크기의 치밀 구조체와 관련된다.
용어 "생체내-jetPEITM", "생체내 jetPEITM", "생체내 jetPEI", "jetPEI", "jet PEI", 및 "JetPEI"은 모두 Polyplus-Transfection SA(프랑스 일키르히 소재)로부터의 상업적으로 입수 가능한 생체내-jetPEITM 시약, Cat. # 201-50G를 지칭한다.
본원에 사용되는 바와 같은 용어 "폴리플렉스"는 정전기 상호 작용을 통해 형성된 RNA와 같은 핵산과 중합체의 복합체를 지칭한다. 폴리플렉스가 RNA를 포함하는 경우, 이는 "RNA 복합체" 또는 "RNA 폴리플렉스"로도 지칭될 수 있다.
본 발명은 적어도 하나의 단일 가닥 RNA 및 적어도 하나의 폴리알킬렌이민으로 형성된 폴리플렉스 입자에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본원에 기재된 입자는 약 200 nm 미만, 바람직하게는 약 150 nm 미만, 더욱 바람직하게는 약 100 nm 미만의 평균 직경을 갖는다. 일 구현예에서, 본원에 기재된 입자는 적어도 약 30 nm, 적어도 약 40 nm, 적어도 약 50 nm, 적어도 약 60 nm, 적어도 약 70 nm, 적어도 약 80 nm, 적어도 약 90 nm, 또는 적어도 약 100 nm의 평균 직경을 갖는다.
용어 "평균 직경"은, 결과로서 길이의 차원을 갖는 소위 Z평균를 제공하는 소위 누적 알고리즘, 및 차원이 없는 다분산 지수(PI)를 사용하는 데이터 분석과 함께 동적 광산란에 의해 측정된 바와 같은 입자의 평균 유체역학적 직경을 지칭한다(문헌[Koppel, D., J. Chem. Phys. 57, 1972, pp 4814-4820, ISO 13321]). 여기서, 입자에 대한 "평균 직경", "직경" 또는 "크기"는 Z평균의 이 값과 동의어로 사용된다.
용어 "순 전하"는 전하, 예컨대 양전하 및 음전하의 총합과 관련된다. 예를 들어, 입자가 양전하보다 더 많은 수의 음전하를 포함하는 경우, 입자의 순 전하는 음이다. 입자가 음전하보다 더 많은 수의 양전하를 포함하는 경우, 입자의 순 전하는 양이다. 입자가 동일한 수의 양전하 및 음전하를 포함하는 경우, 입자의 순 전하는 중성, 특히 전기적 중성이다. 따라서, 본 발명에 따른 입자의 순 전하는 음, 양 또는 중성일 수 있다. 일 구현예에서, 입자의 순 전하는 양이다. 일 구현예에서, 입자의 순 전하는 음이다.
"하전된", "순 전하", "음 하전된" 또는 "양 하전된"과 같은 용어는 관련 pH(예를 들어, 7.1)에서 수성 완충액에 용해되거나 현탁될 때 주어진 화합물 또는 입자의 전기적 순 전하를 지칭한다.
본 발명에 따르면, 용어 "N/P 비", "NP 비", "N:P 비", "N/P" 및 "NP"는 폴리에틸렌이민 내의 질소 원자(N) 대 RNA 내의 인 원자(P)의 몰비를 지칭한다.
본 발명에 따르면, 폴리에틸렌이민 내의 질소 원자(N) 수 대 RNA 내의 인 원자(P) 수의 몰비(N/P 비)는 바람직하게는 2.0 내지 15.0, 바람직하게는 8.0 내지 12.0, 6.0 내지 14.0 또는 6.0 내지 12.0이다.
본 발명에 따르면, 본원에 기재된 조성물을 1 단계를 초과하는 단계로, 예컨대 2 단계, 3 단계, 4 단계 또는 그 초과의 단계로 최종 N/P 비로 조정하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 조성물은 제1 단계에서, 예를 들어, 긴 폴리알킬렌이민을 사용하여 최종 N/P 비보다 낮은 제1 N/P 비로 조정될 수 있다. 추가의 폴리알킬렌이민, 예를 들어, 짧은 폴리알킬렌이민 또는 긴 폴리알킬렌이민, 예컨대 제1 단계에서 사용된 긴 폴리알킬렌이민을 첨가함으로써, N/P 비는 최종 N/P 비로 조정될 수 있다. 일 구현예에서, 최종 N/P 비는 8 내지 16, 예컨대 9 내지 14, 예를 들어, 10 내지 12이다. 일 구현예에서, 제1 단계에서 생성된 N/P 비는 1 내지 6, 예컨대 2 내지 5, 예컨대 3 또는 4이다.
폴리알킬렌이민
본원에 사용되는 바와 같은 폴리알킬렌이민은 바람직하게는 하기 화학식 (I)을 포함한다:
여기서, R은 H, 아실기 또는 하기 화학식 (II)을 포함하는 기이고,
여기서, R1은 H 또는 하기 화학식 (III)을 포함하는 기이고,
상기 식들에서, n, m 및 l은 2 내지 10의 정수로부터 독립적으로 선택되고;
p, q, 및 r은 정수이며, 여기서 p, q, 및 r의 합은 중합체의 평균 분자량이 1.5·102 내지 107 Da, 바람직하게는 5000 내지 105 Da, 더욱 바람직하게는 10000 내지 40000 Da, 더욱 바람직하게는 15000 내지 30000 Da, 더욱더 바람직하게는 20000 내지 25000 Da이 되도록 한다.
일 구현예에서, n, m, 및 l은 독립적으로 2, 3, 4, 및 5, 바람직하게는 2 및 3 으로부터 선택되고, 더욱 바람직하게는 2이다. 일 구현예에서, R1은 H이다. 일 구현예에서, R은 H 또는 아실기이다.
일 구현예에서, 폴리알킬렌이민은 폴리에틸렌이민 및/또는 폴리프로필렌이민, 바람직하게는 폴리에틸렌이민을 포함한다. 바람직한 폴리알킬렌이민은 폴리에틸렌이민(PEI)이다. PEI의 평균 분자량은 바람직하게는 1.5·102 내지 107 Da, 바람직하게는 5000 내지 105 Da, 더욱 바람직하게는 10000 내지 40000 Da, 더욱 바람직하게는 15000 내지 30000 Da, 더욱더 바람직하게는 20000 내지 25000 Da이다.
본 발명에 따르면 선형 폴리알킬렌이민, 예컨대 선형 폴리에틸렌이민(PEI)이 바람직하다. 일 구현예에서, 선형 PEI는, 2-에틸-2-옥사졸린의 개환 이성질화 중합에 의해 폴리(2-에틸-2-옥사졸린)(PEOX; N-프로피오닐-PEI)을 얻고, 이어서 N-프로피오닐기를 절단하도록 이를 산-가수분해하여 PEI를 수득함으로써 얻어진다.
본 발명에 따르면, 선형 PEI는 PEOX의 완전한 또는 본질적으로 완전한 탈아실화에 의해 얻어지는 것이 바람직하다. 예를 들어, 50 kDa의 분자량을 갖는 PEOX 는 22 kDa의 분자량을 갖는 선형 PEI를 제공한다. 폴리알킬렌이민, 예컨대 폴리에틸렌이민 내의 질소 원자의 치환기 중 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 본질적으로 100%가 수소인 것이 바람직하다(즉, 상기 화학식에서 R은 H임). 따라서, 폴리알킬렌이민, 예컨대 폴리에틸렌이민 내의 질소 원자 중 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 본질적으로 100%는 양성자화 가능한 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 바람직한 폴리알킬렌이민은 폴리에틸렌이민(PEI), 특히 선형 폴리에틸렌이민이다. 이러한 선형 폴리에틸렌이민은 바람직하게는 15 kDa 내지 30 kDa의 몰 질량을 가지며, 바람직하게는 자기-복제 또는 자기-증폭 RNA와 조합하여 사용되며, 여기서 N/P 비는 바람직하게는 6 내지 15이고, 선형 폴리에틸렌이민 및 자기-복제 또는 자기-증폭 RNA는 200 nm 미만, 바람직하게는 150 nm 미만, 더욱더 바람직하게는 100 nm 미만의 크기를 갖는 폴리플렉스 입자에 존재하는 것이 바람직하다.
본 발명의 일 구현예에서, 폴리알킬렌이민은 0.6 내지 11 kDa, 바람직하게는 1 내지 6 kDa 또는 1 내지 4 kDa, 예컨대 1 내지 3 kDa의 짧은 폴리알킬렌이민, 예컨대 짧은 폴리에틸렌이민(선형 및/또는 분지형) 및 20 내지 40 kDa의 긴 폴리알킬렌이민, 예컨대 긴 폴리에틸렌이민(선형 및/또는 분기형)의 조합물이고, 여기서 총 N/P 비는 바람직하게는 8 내지 16, 예컨대 9 내지 14, 예를 들어, 10 내지 12이다. 일 구현예에서, 긴 폴리알킬렌이민과 RNA 사이의 N/P 비는 1 내지 6, 예컨대 2 내지 5, 예컨대 3 또는 4이다.
폴리에틸렌이민(PEI)은 양이온 전하 밀도가 높은 유기 거대분자이다. PEI는 세포 표면에서 음이온성 프로테오글리칸과 상호 작용하고 세포내이입에 의한 입자의 진입을 촉진할 수 있는 양 하전된 입자로 핵산을 압축할 수 있다.
PEI에 대한 몇 가지 제조 방법이 있다. 본 발명에 따르면, 선형 폴리에틸렌이민은 바람직하게는 결정된 양의 99% 초과의 순도의 단량체 2-에틸-2-옥사졸린으로부터, 상기 양의 단량체를 완전히 건조시키는 단계, 및 다음 작업에 의해 상기 양의 단량체를 중합시켜 폴리(2-에틸-2-옥사졸린)(PEOX)을 얻는 단계를 포함하는 방법에 의해 합성되고 제조된다:
- 미리 결정된 양의 아세토니트릴의 완전한 건조 후, 미리 결정된 양의 완전히 건조된 중합 반응 개시제를 첨가하면서 상기 아세토니트릴을 상기 양의 건조된 단량체에서 용매로서 사용하고, 이들을 완전히 혼합하는 작업,
- 메탄올과 디에틸에테르에 의한 적어도 3회의 연속 세척/침전 단계 및 상응하는 여과를 수행하면서 증발에 의해 상기 용매를 제거함으로써 상기 얻어진 PEOX를 정제하는 작업,
(상기 건조, 중합, 및 정제 작업은, (i) 1H NMR 시험을 수행함으로써 상기 PEOX 중합체의 정확한 확인, 1.0% 미만의 수준까지 단량체 부재의 확인 및 5.0% 미만의 수준까지 용매 부재의 확인을 달성하고, (ii) 겔 투과 크로마토그래피를 수행함으로써, 23,000 Da 미만의 평균 분자량(Mw) 및 1.5 미만의 상기 PEOX의 다분산도(Mw/Mn)를 얻도록 배열됨)
- 상기 PEOX를 염산으로 가수분해하여, 1H-NMR 시험을 수행함으로써 5% 미만의 양의 잔류 측쇄 또는 프로피온산을 갖게 하고 단일 피크로서 PEI을 확인하기에 충분히 효율적으로 상기 PEI를 얻는 작업.
특정한 양의 단량체, 아세토니트릴 또는 개시제를 완전히 건조시킴으로써, 사용 직전에 물 10 ppm 미만으로 습기 감소를 달성한다는 것을 이해해야 하며, 이는 48시간에 걸쳐 수소화칼슘으로 건조한 다음 증류를 수행하고 129℃ 초과의 온도에서 단량체를 수집함으로써 달성될 수 있다.
본 발명에 따르면 다음 특징 중 하나 이상이 바람직하다:
(i) PEOX의 평균 분자량(Mw)은 예컨대 40,000 Da < Mw < 60,000 Da임;
(ii) 단량체/개시제 비는 약 500(대략 ±5%로 이해해야 함)임;
(iii) 단량체/개시제의 비는 480임;
(iv) 단량체는 99.95% 초과의 순도임;
(v) 단량체로의 첨가 전에 개시제를 아세토니트릴과 혼합함;
(vi) 중합을 85℃ 이상의 온도에서 20시간 초과 동안 수행함;
(vii) 중합 온도는 105℃ 이상임;
(viii) 제1 여과 후, 잔류물을 MeOH와 같은 용매로 자유롭게 세척하고, 디에틸에테르의 첨가 후, 폴리(2-에틸-2-옥사졸린)을 용액으로부터 오일로서 자연적으로 분리하고, 전체 용매를 따라 내고, 진공 하에서의 건조 전에 상기 세척 및 분리를 적어도 4회 반복함;
(ix) 가수분해 단계는 1H-NMR 분광법에 의해 반응 공정을 모니터링하면서 규칙적으로 및 적어도 1일 동안 공비 증류에 의해 얻은 배출된 프로피온산을 반응 혼합물로부터 제거하는 것을 포함함;
(x) 반응 공정의 종료 시에 얻은 잔류물을 물에 희석하고 적어도 3회 증발시켜 미량의 프로피온산을 제거한 다음, 동결건조 전에 잔류물을 다시 물에 용해시키고 여과함;
(xi) 0.20 μm 내지 0.25 μm의 메쉬 치수를 갖는 멸균막, 특히 멸균 셀룰라(cellular) 아세테이트 막을 통해 여과물을 제공함.
유리하게는, 본 발명에 따라 사용하기 위한 선형 PEI는 중간체 PEOX가 40,000 < Mw < 60,000 Da와 같은 분자량 Mw를 갖는 것을 특징으로 한다.
중합도는 단량체/개시제 비 및 합성 수율에 의해 제어된다. 분자량 측정은 겔 투과 크로마토그래피(GPC)에 의해 수행될 수 있다.
본 발명에 따른 용어 "핵산"은 데옥시리보핵산(DNA), 리보핵산(RNA), 및 잠금 핵산(LNA)을 포함한다. 본 발명에 따르면, 핵산은 게놈 DNA, cDNA, mRNA, 바이러스 RNA, 재조합적으로 제조된 분자 및 화학적으로 합성된 분자를 포함한다. 본 발명에 따르면, 핵산은 단일 가닥 또는 이중 가닥 및 선형 또는 공유결합 폐환형 분자의 형태일 수 있다. 본 발명에 따른 용어 "핵산"은 또한 뉴클레오타이드 염기, 당 또는 포스페이트 상의 핵산의 화학적 유도체화, 및 비-천연 뉴클레오타이드 및 뉴클레오타이드 유사체를 함유하는 핵산을 포함한다. 기재된 핵산은 분리된 핵산 및/또는 재조합 핵산일 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같은 용어 "분리된"은 다른 분자, 예컨대 다른 세포 물질이 실질적으로 없는 분자를 지칭하도록 의도된다. "분리된 핵산"이라는 용어는 본 발명에 따르면, 핵산이 (i) 시험관내에서, 예를 들어 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 증폭되거나, (ii) 클로닝에 의해 재조합적으로 생성되거나, (iii) 예를 들어, 절단 및 겔-전기영동 분별에 의해 정제되거나, (iv) 예를 들어, 화학 합성에 의해 합성됨을 의미한다. 분리된 핵산은 재조합 기법에 의한 조작에 이용 가능한 핵산이다.
본 발명의 맥락에서 용어 "재조합"은 "유전자 조작을 통해 제조됨"을 의미한다. 바람직하게는, 본 발명의 맥락에서 "재조합 물체"는 자연적으로 발생하지 않는다.
본원에 사용되는 바와 같은 용어 "자연 발생적"은 물체가 자연계에서 발견될 수 있다는 사실을 의미한다. 예를 들어, 유기체(바이러스를 포함함)에 존재하고 자연계의 원천으로부터 분리될 수 있으며 실험실에서 인간에 의해 의도적으로 변형되지 않은 펩티드 또는 핵산은 자연 발생적인 것이다. "자연계에서 발견된"이란 용어는 "자연계에 존재하는"을 의미하며, 알려진 물체뿐만 아니라 자연계로부터 아직 발견된 적이 없고/없거나 분리된 적이 없지만, 장래에 자연 원천으로부터 발견되고/발견되거나 분리될 수 있는 물체를 포함한다.
본 발명에 따르면, "핵산 서열"은 핵산, 예를 들어 리보핵산(RNA) 또는 데옥시리보핵산(DNA) 내의 뉴클레오타이드의 서열을 지칭한다. 이 용어는 전체 핵산 분자(예컨대 전체 핵산 분자의 단일 가닥) 또는 이의 일부(예를 들어, 단편)를 지칭할 수 있다.
"핵산의 3' 말단"은 본 발명에 따르면 유리 하이드록시기를 갖는 말단을 지칭한다. 이중 가닥 핵산, 특히 DNA의 도식적 표현에서, 3' 말단은 항상 우측에 있다. "핵산의 5' 말단"은 본 발명에 따르면 유리 포스페이트기를 갖는 말단을 지칭한다. 이중 가닥 핵산, 특히 DNA의 도식적 표현에서, 5' 말단은 항상 좌측에 있다.
5' 말단
5'--P-NNNNNNN-OH-3'
3' 말단
3'-HO-NNNNNNN-P--5'
"업스트림"은 핵산 분자의 제2 요소에 대한 핵산 분자의 제1 요소의 상대적인 위치를 설명하며, 여기서 두 요소는 동일한 핵산 분자에 포함되고, 제1 요소는 그 핵산 분자의 제2 요소보다 핵산 분자의 5' 말단에 더 가깝게 위치한다. 그 때, 제2 요소는 그 핵산 분자의 제1 요소의 "다운스트림"에 있다고 한다. 제2 요소의 "업스트림"에 위치한 요소는 그 제2 요소의 "5'"에 위치한다는 것과 동의어로 지칭될 수 있다. 이중 가닥 핵산 분자의 경우, "업스트림" 및 "다운스트림"과 같은 표시는 (+) 가닥에 대해 제공된다.
본 발명에 따르면, 용어 "유전자"는 하나 이상의 세포 생성물을 생성하고/생성하거나 하나 이상의 세포간 또는 세포내 기능을 달성하는 특정 핵산 서열을 지칭한다. 더욱 구체적으로, 상기 용어는 특정 단백질 또는 기능적 또는 구조적 RNA 분자를 코딩하는 핵산을 포함하는 핵산 구획(DNA 또는 RNA)과 관련된다.
용어 "벡터"는 가장 일반적인 의미로 본원에서 사용되며, 예를 들어, 상기 핵산을 원핵 및/또는 진핵 숙주 세포 내로 도입되도록 할 수 있고, 적절한 경우, 게놈 내로 통합되도록 할 수 있는 핵산에 대한 임의의 중간 비히클을 포함한다. 그러한 벡터는 바람직하게는 세포에서 복제 및/또는 발현된다. 벡터는 플라스미드, 파지미드, 바이러스 게놈, 및 이들의 분획을 포함한다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "RNA"는 리보뉴클레오타이드 잔기를 포함하는 분자와 관련되고, 바람직하게는 전적으로 또는 실질적으로 리보뉴클레오타이드 잔기로 구성되며, 본원에 기재된 모든 RNA 타입을 포함한다. 용어 "리보뉴클레오타이드"는 β-D-리보푸라노실기의 2'-위치에 하이드록실기를 갖는 뉴클레오타이드와 관련된다. 용어 "RNA"는 이중 가닥 RNA, 단일 가닥 RNA, 분리된 RNA, 예컨대 부분적으로 또는 완전히 정제된 RNA, 본질적으로 순수한 RNA, 합성 RNA, 및 재조합적으로 생성된 RNA, 예컨대 하나 이상의 뉴클레오타이드의 첨가, 결실, 치환 및/또는 변경에 의해 자연 발생적 RNA와 상이한 변형된 RNA를 포함한다. 그러한 변경은, 예컨대 RNA의 말단(들)으로 또는 내부로, 예를 들어 RNA의 하나 이상의 뉴클레오타이드에서의, 비-뉴클레오타이드 물질의 첨가를 포함할 수 있다. RNA 분자 내의 뉴클레오타이드는 또한 비-표준 뉴클레오타이드, 예컨대 비-자연 발생적 뉴클레오타이드 또는 화학적으로 합성된 뉴클레오타이드 또는 데옥시뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 이러한 변경된 RNA는 유사체, 특히 자연 발생적 RNA의 유사체로 지칭될 수 있다. 본 발명에 따라 사용된 RNA는 공지된 조성을 가질 수 있거나, RNA의 조성은 부분적으로 또는 전적으로 알려져 있지 않을 수 있다.
RNA의 "안정성"이라는 용어는 RNA의 "반감기"와 관련된다. "반감기"는 분자의 활성, 양, 또는 수의 절반을 제거하는 데 필요한 기간과 관련된다. 본 발명의 맥락에서, RNA의 반감기는 상기 RNA의 안정성을 나타낸다. RNA의 반감기는 RNA의 "발현 지속 기간"에 영향을 줄 수 있다. 반감기가 긴 RNA는 장시간에 걸쳐 발현될 것으로 예상될 수 있다.
용어 "번역 효율"은 특정 기간 내에 RNA 분자에 의해 제공된 번역 생성물의 양과 관련된다.
본 발명에 따르면, "이중 가닥 RNA" 또는 "dsRNA"는 부분적으로 또는 완전히 상보적인 2개의 가닥을 갖는 RNA를 의미한다.
본 발명에 따르면, RNA는 바람직하게는 단일 가닥 RNA(ssRNA)이다. 일반적으로 용어 "단일 가닥 RNA"는 상보적인 핵산 분자(전형적으로 상보적인 RNA 분자)가 회합되지 않은 RNA 분자를 지칭한다. 단일 가닥 RNA는, RNA의 일부가 폴딩 백(folding back)하게 하여 제한 없이 염기쌍, 스템, 스템 루프 및 벌지(bulge)를 포함한 2 차 구조 모티프를 형성하게 할 수 있는 자기-상보적 서열을 함유할 수 있다. 단일가닥 RNA는 마이너스 가닥[(-) 가닥] 또는 플러스 가닥[(+) 가닥]으로 존재할 수 있다. (+) 가닥은 유전 정보를 포함하거나 인코딩하는 가닥이다. 유전 정보는 예를 들어 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열일 수 있다. (+) 가닥 RNA가 단백질을 인코딩할 때, (+) 가닥은 번역(단백질 합성)을 위한 주형으로서 직접 작용할 수 있다. (-) 가닥은 (+) 가닥의 상보체이다. 이중 가닥 RNA의 경우, (+) 가닥 및 (-) 가닥은 2개의 별개의 RNA 분자이며, 이들 두 RNA 분자는 서로 회합하여 이중 가닥 RNA("듀플렉스 RNA")를 형성한다.
본 발명에 따른 특히 바람직한 단일 가닥 RNA는 mRNA 및 레플리콘-RNA, 예컨대 자기-복제 RNA이다. 본 발명에 따르면, RNA는 코딩 RNA, 즉, 펩티드 또는 단백질을 인코딩하는 RNA일 수 있다. 바람직하게는, RNA는 약학적 활성 RNA이다.
"약학적 활성 RNA"는 약학적 활성 펩티드 또는 단백질, 예컨대 항원 또는 면역학적 활성 화합물(항원을 인코딩하지 않음)을 인코딩하거나, 그 자체로 약학적 활성인 RNA이며, 예를 들어, 이는 약학적 활성 단백질에 대해 기술된 것과 같은 하나 이상의 약학적 활성을 갖는다.
본 발명에 따르면, 용어 "펩티드 또는 단백질을 인코딩하는 RNA"는 RNA가, 적절한 환경, 바람직하게는 세포 내에 존재하는 경우, 번역 과정 동안 펩티드 또는 단백질을 생성하기 위해 아미노산의 조립을 지시할 수 있음을 의미한다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 코딩 RNA는, 코딩 RNA의 번역이 펩티드 또는 단백질을 생성할 수 있도록 세포 번역 기구와 상호 작용할 수 있다.
본 발명에 따르면, 용어 "mRNA"는 "메신저-RNA"를 의미하고, 전형적으로 DNA 주형을 사용하여 생성되며 펩티드 또는 단백질을 인코딩하는 전사체와 관련된다. 전형적으로, mRNA는 5'-UTR, 단백질 코딩 영역, 3'-UTR, 및 폴리(A) 서열을 포함한다. mRNA는 DNA 주형으로부터 시험관내 전사에 의해 생성될 수 있다. 시험관내 전사 방법론은 당업자에게 알려져 있다. 예를 들어, 다양한 시험관내 전사 키트가 상업적으로 입수 가능하다. 본 발명에 따르면, mRNA는 변형 및 캡핑을 안정화시킴으로서 변형될 수 있다.
용어 "비번역 영역" 또는 "UTR"은 전사되지만 아미노산 서열로 번역되지 않는 DNA 분자 내의 영역, 또는 mRNA 분자와 같은 RNA 분자 내의 상응하는 영역과 관련된다. 비번역 영역(UTR)은 오픈 리딩 프레임의 5'(업스트림)(5'-UTR) 및/또는 오픈 리딩 프레임의 3'(다운스트림)(3'-UTR)에 존재할 수 있다.
3'-UTR은, 존재하는 경우, 단백질-인코딩 영역의 종결 코돈의 다운스트림에 있는 유전자의 3'-말단에 위치하지만, 용어 "3'-UTR"은 바람직하게는 폴리(A) 테일을 포함하지 않는다. 따라서, 3'-UTR은 (존재하는 경우) 폴리(A) 테일의 업스트림에 있으며, 예를 들어 폴리(A) 테일에 바로 인접해 있다. 5'-UTR은, 존재하는 경우, 단백질-인코딩 영역의 시작 코돈의 업스트림에 있는 유전자의 5' 말단에 위치한다. 5'-UTR은 (존재하는 경우) 5'-캡의 다운스트림에 있으며, 예를 들어 5'-캡에 바로 인접해 있다. 5'- 및/또는 3'-비번역 영역은, 본 발명에 따르면, 오픈 리딩 프레임과 기능적으로 연결되어, 상기 오픈 리딩 프레임을 포함하는 RNA의 안정성 및/또는 번역 효율이 증가되는 방식으로 이들 영역이 오픈 리딩 프레임과 결부되게 할 수 있다.
본 발명에 따르면, 용어 "폴리(A) 서열" 또는 "폴리(A) 테일"은 전형적으로 RNA 분자의 3' 말단에 위치한 아데닐레이트 잔기의 중단되지 않거나 중단된 서열을 지칭한다. 중단되지 않은 서열은 연속적인 아데닐레이트 잔기를 특징으로 한다. 자연계에서는, 중단되지 않은 폴리(A) 서열이 일반적이다. 폴리(A) 서열은 정상적으로는 진핵생물 DNA에서 인코딩되지 않으며, 세포 핵에서의 진핵생물 전사 동안 전사 후 주형-비의존적 RNA 중합효소에 의해 RNA의 유리 3' 말단에 부착되지만, 본 발명은 DNA에 의해 인코딩된 폴리(A) 서열을 포함한다.
"5'-캡", "캡", "5'-캡 구조", 또는 "캡 구조"라는 용어는 일부 진핵생물 1차 전사체, 예컨대 전구체 메신저 RNA의 5' 말단에서 발견되는 디뉴클레오타이드를 지칭하기 위해 동의어로 사용된다. 5'-캡은, 5' 대 5' 트리포스페이트 연결(또는 특정 캡 유사체의 경우 변형된 트리포스페이트 연결)을 통해 mRNA 분자의 첫 번째 뉴클레오타이드에 (선택적으로 변형된) 구아노신이 결합된 구조이다. 이들 용어는 종래의 캡 또는 캡 유사체를 지칭할 수 있다.
본 발명에 따른 RNA 분자는 5'-캡, 5'-UTR, 3'-UTR, 폴리(A) 서열, 및/또는 코돈 사용의 적응(adaptation)을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 따라 사용하기 위한 RNA 분자는 바람직하게는 2000개 초과의 염기, 바람직하게는 3000개 초과의 염기, 4000개 초과의 염기, 5000개 초과의 염기, 6000개 초과의 염기, 7000개 초과의 염기, 8000개 초과의 염기, 9000개 초과의 염기, 또는 10000개 초과의 염기의 크기를 갖는다. 본 발명에 따라 사용하기 위한 RNA 분자는 바람직하게는 6000개 내지 20000개의 염기, 바람직하게는 6000개 내지 15000개의 염기, 바람직하게는 9000개 내지 12000개의 염기의 크기를 갖는다.
본 발명에 따르면, 용어 "발현"은 이의 가장 일반적인 의미로 사용되며, RNA 및/또는 단백질의 생성을 포함한다. 이는 또한 핵산의 부분적 발현을 포함한다. 또한, 발현은 일시적이거나 안정적일 수 있다. RNA에 대하여, "발현" 또는 "번역"이라는 용어는, 코딩 RNA(예를 들어, 메신저 RNA)의 가닥이 아미노산 서열의 조립을 지시하여 펩티드 또는 단백질을 만드는 세포의 리보솜에서의 과정과 관련된다.
"전사" 및 "전사하는"이라는 용어는 특정 핵산 서열을 갖는 핵산 분자("핵산 주형")가 RNA 중합효소에 의해 판독되어 RNA 중합효소가 단일 가닥 RNA 분자를 생성하는 과정과 관련된다. 전사 동안, 핵산 주형의 유전 정보가 전사된다. 핵산 주형은 DNA일 수 있지만; 예를 들어, 알파바이러스 핵산 주형으로부터 전사되는 경우, 주형은 전형적으로 RNA이다. 후속하여, 전사된 RNA는 단백질로 번역될 수 있다. 본 발명에 따르면, 용어 "전사"는 "시험관내 전사"를 포함하며, 여기서 용어 "시험관내 전사"는 RNA, 특히 mRNA가 무세포 시스템에서 시험관내 합성되는 과정과 관련된다. 바람직하게는, 클로닝 벡터가 전사체의 생성을 위해 적용된다. 이러한 클로닝 벡터는 일반적으로 전사 벡터로 일컬어지며, 본 발명에 따르면 용어 "벡터"에 포함된다. 클로닝 벡터는 바람직하게는 플라스미드이다. 본 발명에 따르면, RNA는 바람직하게는 시험관내 전사된 RNA(IVT-RNA)이고 적절한 DNA 주형의 시험관내 전사에 의해 얻을 수 있다. 전사를 제어하기 위한 프로모터는 임의의 RNA 중합효소에 대한 임의의 프로모터일 수 있다. 시험관내 전사를 위한 DNA 주형은 핵산, 특히 cDNA의 클로닝, 및 시험관내 전사를 위한 적절한 벡터 내로의 이의 도입에 의해 얻을 수 있다. cDNA는 RNA의 역전사에 의해 얻을 수 있다.
전사 동안 생성된 단일 가닥 핵산 분자는 전형적으로 주형의 상보적인 서열인 핵산 서열을 갖는다.
본 발명에 따르면, 용어 "주형" 또는 "핵산 주형" 또는 "주형 핵산"은 일반적으로 복제되거나 전사될 수 있는 핵산 서열을 지칭한다.
용어 "발현 제어 서열"은 본 발명에 따르면 프로모터, 리보솜-결합 서열 및 유전자의 전사 또는 유도된 RNA의 번역을 제어하는 다른 제어 요소를 포함한다. 본 발명의 특정 구현예에서, 발현 제어 서열은 조절될 수 있다. 발현 제어 서열의 정확한 구조는 종 또는 세포 유형에 따라 다를 수 있지만, 일반적으로 전사 및 번역의 개시에 각각 관여하는 5'-비전사 및 5'- 및 3'-비번역 서열을 포함한다. 더욱 구체적으로, 5'-비전사 발현 제어 서열은 기능적으로 연결된 유전자의 전사 제어를 위한 프로모터 서열을 포함하는 프로모터 영역을 포함한다. 발현 제어 서열은 또한 인핸서 서열 또는 업스트림 활성화제 서열을 포함할 수 있다. DNA 분자의 발현 제어 서열은 일반적으로 TATA 박스, 캡핑 서열, 및 CAAT 서열 등과 같은 5'-비전사 서열 및 5'- 및 3'-비번역 서열을 포함한다. 알파바이러스 RNA의 발현 제어 서열은 서브게놈 프로모터 및/또는 하나 이상의 보존된 서열 요소(들)을 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 특정 발현 제어 서열은 본원에 기재된 바와 같은 알파바이러스의 서브게놈 프로모터이다.
용어 "프로모터" 또는 "프로모터 영역"은 RNA 중합효소에 대한 인식 및 결합 부위를 제공함으로써, 전사체, 예를 들어 코딩 서열을 포함하는 전사체의 합성을 제어하는 핵산 서열을 지칭한다. 프로모터 영역은 상기 유전자의 전사 조절에 관여하는 추가의 인자에 대한 추가의 인식 또는 결합 부위를 포함할 수 있다. 프로모터는 원핵생물 또는 진핵생물 유전자의 전사를 제어할 수 있다. 프로모터는 "유도성"이어서 유도인자에 반응하여 전사를 개시할 수 있거나, 전사가 유도인자에 의해 제어되지 않는 경우 "항시성(constitutive)"일 수 있다. 유도성 프로모터는 유도인자가 없는 경우 매우 적은 정도로만 발현되거나 전혀 발현되지 않는다. 유도인자의 존재 하에서, 유전자는 "스위치 온"되거나 전사 수준이 증가한다. 이는 일반적으로 특정 전사 인자의 결합에 의해 매개된다. 본 발명에 따른 특정 프로모터는 본원에 기재된 바와 같은 알파바이러스의 서브게놈 프로모터이다. 다른 특정 프로모터는 알파바이러스의 게놈 플러스-가닥 또는 네거티브-가닥 프로모터이다.
용어 "코어 프로모터"는 프로모터에 포함되는 핵산 서열을 지칭한다. 코어 프로모터는 전형적으로 전사를 적절히 개시하는 데 필요한 프로모터의 최소 부분이다. 코어 프로모터는 전형적으로 전사 개시 부위 및 RNA 중합효소에 대한 결합 부위를 포함한다.
본원에 특정된 핵산 서열, 특히 전사 가능 및 코딩 핵산 서열은 상기 핵산 서열과 동종이거나 이종일 수 있는 임의의 발현 제어 서열과 조합될 수 있으며, 용어 "동종"은 핵산 서열이 또한 자연적으로 발현 제어 서열에 기능적으로 연결되어 있다는 사실을 지칭하고, 용어 "이종"은 핵산 서열이 자연적으로 발현 제어 서열에 기능적으로 연결되어 있지 않다는 사실을 지칭한다.
핵산 서열, 특히 펩티드 또는 단백질을 코딩하는 핵산 서열, 및 발현 제어 서열은, 이들이 전사 가능 및/또는 코딩 핵산 서열의 전사 또는 발현이 발현 제어 서열의 제어 또는 영향을 받게 되도록 하는 방식으로 서로 공유 결합된 경우, 서로 "기능적으로" 연결된 것이다.
본 발명에 따르면, "기능적 연결" 또는 "기능적으로 연결된"은 기능적 관계 내에서의 연결과 관련된다. 핵산은, 이것이 또 다른 핵산 서열과 기능적으로 관련된 경우, "기능적으로 연결"된 것이다. 예를 들어, 프로모터는, 이것이 코딩 서열의 전사에 영향을 미치는 경우, 상기 코딩 서열에 기능적으로 연결된 것이다. 기능적으로 연결된 핵산은 전형적으로 서로 인접해 있고, 적절한 경우 추가의 핵산 서열에 의해 분리된다.
특정 구현예에서, 핵산은 본 발명에 따르면 핵산에 대해 동종이거나 이종일 수 있는 발현 제어 서열에 기능적으로 연결된다.
"중합효소"는 일반적으로 단량체 빌딩 블록으로부터 중합체 분자의 합성을 촉매할 수 있는 분자 엔티티를 지칭한다. "RNA 중합효소"는 리보뉴클레오타이드 빌딩 블록으로부터 RNA 분자의 합성을 촉매할 수 있는 분자 엔티티이다. "DNA 중합효소"는 데옥시리보뉴클레오타이드 빌딩 블록으로부터 DNA 분자의 합성을 촉매할 수 있는 분자 엔티티이다. DNA 중합효소 및 RNA 중합효소의 경우, 분자 엔티티는 전형적으로 단백질 또는 다수의 단백질의 조립체 또는 복합체이다. 전형적으로, DNA 중합효소는, 전형적으로 DNA 분자인 주형 핵산에 기초하여 DNA 분자를 합성한다. 전형적으로, RNA 중합효소는 DNA 분자(그 경우, RNA 중합효소는 DNA-의존성 RNA 중합효소인 DdRP임) 또는 RNA 분자(그 경우, RNA 중합효소는 RNA-의존성 RNA 중합효소인 RdRP임)인 주형 핵산에 기초하여 RNA 분자를 합성한다.
"RNA-의존성 RNA 중합효소" 또는 "RdRP"는 RNA 주형으로부터 RNA의 전사를 촉매하는 효소이다. 알파바이러스 RNA-의존성 RNA 중합효소의 경우, 게놈 RNA 및 (+) 가닥 게놈 RNA의 (-) 가닥 상보체의 순차적 합성은 RNA 복제를 가져온다. 따라서, 알파바이러스 RNA-의존성 RNA 중합효소는 "RNA 레플리카제"와 동의어로 지칭된다. 자연계에서, RNA-의존성 RNA 중합효소는 전형적으로 레트로바이러스를 제외한 모든 RNA 바이러스에 의해 인코딩된다. RNA-의존성 RNA 중합효소를 인코딩하는 바이러스의 전형적으로 대표적인 것은 알파바이러스이다.
본 발명에 따르면, "RNA 복제"는 일반적으로 주어진 RNA 분자(주형 RNA 분자)의 뉴클레오타이드 서열에 기초하여 합성된 RNA 분자를 지칭한다. 합성되는 RNA 분자는, 예를 들어 주형 RNA 분자와 동일하거나 상보적일 수 있다. 일반적으로, RNA 복제는 DNA 중간체의 합성을 통해 일어날 수 있거나, RNA 의존성 RNA 중합효소(RdRP)에 의해 매개되는 RNA-의존성 RNA 복제에 의해 직접 일어날 수 있다. 알파바이러스의 경우, RNA 복제는 DNA 중간체를 통해 일어나지 않고 RNA-의존성 RNA 중합효소(RdRP)에 의해 매개된다: 주형 RNA 가닥(제1 RNA 가닥) - 또는 이의 일부 -가 제1 RNA 가닥 또는 이의 일부에 상보적인 제2 RNA 가닥의 합성을 위한 주형으로서 작용한다. 제2 RNA 가닥 - 또는 이의 일부 -는 결과적으로 제2 RNA 가닥 또는 이의 일부에 상보적인 제3 RNA 가닥의 합성을 위한 주형으로서 선택적으로 작용할 수 있다. 그에 따라, 제3 RNA 가닥은 제1 RNA 가닥 또는 이의 일부와 동일하다. 따라서, RNA-의존성 RNA 중합효소는 주형의 상보적인 RNA 가닥을 직접적으로 합성할 수 있고, (상보적인 중간체 가닥을 통해) 동일한 RNA 가닥을 간접적으로 합성할 수 있다.
본 발명에 따르면, 용어 "주형 RNA"는 RNA-의존성 RNA 중합효소에 의해 전사되거나 복제될 수 있는 RNA를 지칭한다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따라 사용된 RNA는 레플리콘 RNA 또는 단순히 "레플리콘", 특히 자기-복제 RNA이다. 특히 바람직한 일 구현예에서, 레플리콘 또는 자기-복제 RNA는 ssRNA 바이러스, 특히 알파바이러스와 같은 포지티브-가닥 ssRNA 바이러스로부터 유래되거나 이로부터 유래된 요소를 포함한다.
일반적으로, RNA 바이러스는 RNA 게놈을 가진 다양한 감염성 입자의 그룹이다. RNA 바이러스는 단일 가닥 RNA(ssRNA) 및 이중 가닥 RNA(dsRNA) 바이러스로 하위-그룹화될 수 있고, ssRNA 바이러스는 일반적으로 포지티브-가닥[(+) 가닥] 및/또는 네거티브-가닥[(-) 가닥] 바이러스로 추가로 분류될 수 있다. 포지티브-가닥 RNA 바이러스는 이의 RNA가 숙주 세포에서 번역을 위한 주형으로서 직접 작용할 수 있기 때문에 일견해 볼 때 생물의학에서 전달 시스템으로서 매력적이다.
알파바이러스는 포지티브-가닥 RNA 바이러스를 전형적으로 대표한다. 알파바이러스의 숙주는 곤충, 어류 및 포유 동물, 예컨대 길들여진 동물 및 인간을 포함하는 광범위한 유기체를 포함한다. 알파바이러스는 감염된 세포의 세포질에서 복제된다(알파바이러스 생활 주기의 검토에 대해서는 문헌[Jos et al., Future Microbiol., 2009, vol. 4, pp. 837-856]을 참조함). 많은 알파바이러스의 총 게놈 길이는 전형적으로 11,000개 내지 12,000개의 뉴클레오타이드 범위이고, 게놈 RNA는 전형적으로 5'-캡 및 3' 폴리(A) 테일을 갖는다. 알파바이러스의 게놈은 비-구조 단백질(바이러스 RNA의 전사, 변형 및 복제, 및 단백질 변형에 관여함) 및 구조 단백질(바이러스 입자를 형성함)을 인코딩한다. 게놈에는 전형적으로 2개의 오픈 리딩 프레임(ORF)이 있다. 4개의 비-구조 단백질(nsP1 내지 nsP4)은 전형적으로 게놈의 5' 말단 근처에서 시작하는 제1 ORF에 의해 함께 인코딩되는 한편, 알파바이러스 구조 단백질은 제1 ORF의 다운스트림에서 발견되고 게놈의 3' 말단 근처로 연장되는 제2 ORF에 의해 함께 인코딩된다. 전형적으로, 제1 ORF는 제2 ORF보다 크며, 비는 대략 2:1이다.
알파바이러스에 의해 감염된 세포에서, 비-구조 단백질을 인코딩하는 핵산 서열만이 게놈 RNA로부터 번역되는 한편, 구조 단백질을 인코딩하는 유전 정보는 진핵생물 메신저 RNA(mRNA)와 유사한 RNA 분자인 서브게놈 전사체로부터 번역될 수 있다(문헌[Gould et al., 2010, Antiviral Res., vol. 87 pp. 111-124]). 감염 후, 즉, 바이러스 생활 주기의 초기 단계에서, (+) 가닥 게놈 RNA는 비-구조 폴리-프로테인(nsP1234)을 인코딩하는 오픈 리딩 프레임의 번역을 위한 메신저 RNA와 같이 직접적으로 작용한다. 일부 알파바이러스에서, nsP3과 nsP4의 코딩 서열 사이에 opal 정지 코돈이 존재한다: nsP1, nsP2 및 nsP3을 함유하는 폴리프로테인 P123은 번역이 opal 정지 코돈에서 종결될 때 생성되며, nsP4를 추가로 함유하는 폴리프로테인 P1234는 이 opal 코돈의 연속판독(readthrough) 시에 생성된다(문헌[Strauss & Strauss, Microbiol. Rev., 1994, vol. 58, pp. 491-562]; 문헌[Rupp et al., 2015, J. Gen. Virology, vol. 96, pp. 2483-2500]). nsP1234는 자가단백분해적으로 단편 nsP123 및 nsP4로 절단된다. 폴리펩티드 nsP123 및 nsP4는 (+) 가닥 게놈 RNA를 주형으로 사용하여 (-) 가닥 RNA를 전사하는 (-) 가닥 레플리카제 복합체를 형성하도록 회합한다. 전형적으로 후기 단계에서, nsP123 단편은 개별 단백질 nsP1, nsP2 및 nsP3으로 완전히 절단된다(문헌[Shirako & Strauss, 1994, J. Virol., vol. 68, pp. 1874-1885]). 4개의 모든 단백질은 게놈 RNA의 (-) 가닥 상보체를 주형으로 사용하여 새로운 (+) 가닥 게놈을 합성하는 (+) 가닥 레플리카제 복합체를 형성한다(문헌[Kim et al., 2004, Virology, vol. 323, pp. 153-163], 문헌[Vasiljeva et al., 2003, J. Biol. Chem. vol. 278, pp. 41636-41645]).
감염된 세포에서, 새로운 게놈 RNA뿐만 아니라 서브게놈 RNA에는 nsP1에 의해 5'-캡이 제공되고(문헌[Pettersson et al. 1980, Eur. J. Biochem. 105, 435-443]; 문헌[Rozanov et al., 1992, J. Gen. Virology, vol. 73, pp. 2129- 2134]), nsP4에 의해 폴리-아데닐레이트[폴리(A)] 테일이 제공된다(문헌[Rubach et al., Virology, 2009, vol. 384, pp. 201-208]). 따라서, 서브게놈 RNA와 게놈 RNA는 모두 메신저 RNA(mRNA)와 유사하다.
알파바이러스 구조 단백질은 전형적으로 서브게놈 프로모터의 제어를 받는 하나의 단일 오픈 리딩 프레임에 의해 인코딩된다(문헌[Strauss & Strauss, Microbiol. Rev., 1994, vol. 58, pp. 491-562]). 서브게놈 프로모터는 시스(cis)로 작용하는 알파바이러스 비-구조 단백질에 의해 인식된다. 특히, 알파바이러스 레플리카제는 게놈 RNA의 (-) 가닥 상보체를 주형으로 사용하여 (+) 가닥 서브게놈 전사체를 합성한다. (+) 가닥 서브게놈 전사체는 알파바이러스 구조 단백질을 인코딩한다(문헌[Kim et al., 2004, Virology, vol. 323, pp. 153-163], 문헌[ Vasiljeva et al., 2003, J. Biol. Chem. vol. 278, pp. 41636-41645]). 서브게놈 RNA 전사체는 하나의 폴리-프로테인으로서 구조 단백질을 인코딩하는 오픈 리딩 프레임의 번역을 위한 주형으로서 작용하고, 폴리-프로테인은 절단되어 구조 단백질을 생성한다. 숙주 세포에서의 알파바이러스 감염의 후기 단계에, nsP2의 코딩 서열 내에 위치한 패키징 신호는 구조 단백질에 의해 패키징되는 출아(budding) 비리온으로의 게놈 RNA의 선택적 패키징을 보장한다(문헌[White et al., 1998, J. Virol., vol. 72, pp. 4320-4326]).
감염된 세포에서, (-) 가닥 RNA 합성은 전형적으로 감염 후 처음 3시간 내지 4시간 내에서만 관찰되고, 후기 단계에서는 검출 가능하지 않으며, 이때에는 (+) 가닥 RNA(게놈 및 서브게놈 모두)만의 합성이 관찰된다. 문헌[Frolov et al., 2001, RNA, vol. 7, pp. 1638-1651]에 따르면, RNA 합성의 조절을 위한 유력한 모델은 비-구조 폴리-프로테인의 프로세싱에 대한 의존을 시사한다: 비-구조 폴리프로테인 nsP1234의 초기 절단은 nsP123 및 nsP4를 생성하며; nsP4는 (-) 가닥 합성에는 활성이지만 (+) 가닥 RNA 생성에는 비효율적인 RNA-의존성 RNA 중합효소(RdRp)로서 작용한다. nsP2/nsP3 접합부에서의 절단을 포함하는 폴리프로테인 nsP123의 추가 프로세싱은, (+) 가닥 RNA의 합성을 증가시키고 (-) 가닥 RNA의 합성을 감소시키거나 종결시키기 위해 레플리카제의 주형 특이성을 변화시킨다.
알파바이러스 RNA의 합성은 또한 4개의 보존된 서열 요소(CSE; 문헌[Strauss & Strauss, Microbiol. Rev., 1994, vol. 58, pp. 491-562]; 및 문헌[Frolov, 2001, RNA, vol. 7, pp. 1638-1651])를 포함하는 시스-작용 RNA 요소에 의해 조절된다.
일반적으로, 알파바이러스 게놈의 5' 복제 인식 서열은 다양한 알파바이러스 사이의 낮은 전반적 상동성을 특징으로 하지만, 보존되고 예측된 2차 구조를 갖는다. 알파바이러스 게놈의 5' 복제 인식 서열은 번역 개시에 관여할뿐만 아니라, 바이러스 RNA, CSE 1 및 CSE 2의 합성에 관여하는 2개의 보존된 서열 요소를 포함하는 5' 복제 인식 서열도 포함한다. CSE 1 및 2의 기능을 위해, 2차 구조가 선형 서열보다 더 중요한 것으로 여겨진다(문헌[Strauss & Strauss, Microbiol. Rev., 1994, vol. 58, pp. 491-562]).
대조적으로, 알파바이러스 게놈의 3' 말단 서열, 즉, 폴리(A) 서열의 바로 업스트림에 있는 서열은 보존된 1차 구조, 특히 (-) 가닥 합성의 개시에 중요한 "19-nt 보존 서열"로도 명명되는 보존된 서열 요소 4(CSE 4)를 특징으로 한다.
"접합 서열"로도 명명되는 CSE 3는 알파바이러스 게놈 RNA의 (+) 가닥 상의 보존된 서열 요소이고, (-) 가닥 상의 CSE 3의 상보체는 서브게놈 RNA 전사를 위한 프로모터로서 작용한다(문헌[Strauss & Strauss, Microbiol. Rev., 1994, vol. 58, pp. 491-562]; 문헌[Frolov et al., 2001, RNA, vol. 7, pp. 1638-1651]). CSE 3은 전형적으로 nsP4의 C-말단 단편을 인코딩하는 영역과 중첩된다.
또한, 알파바이러스 단백질 외에도, 숙주 세포 인자, 아마도 단백질은 보존된 서열 요소에 결합할 수 있다(상기 문헌[Strauss & Strauss]).
알파바이러스-유래된 벡터는 표적 세포 또는 표적 유기체 내로의 외래 유전 정보의 전달을 위해 제안되었다. 간단한 접근법에서, 알파바이러스 구조 단백질을 인코딩하는 오픈 리딩 프레임은 관심 단백질을 인코딩하는 오픈 리딩 프레임으로 대체된다. 알파바이러스-기반 트랜스-복제 시스템은 2개의 별개의 핵산 분자 상의 알파바이러스 뉴클레오타이드 서열 요소에 의존한다: 하나의 핵산 분자는 (전형적으로 폴리-프로테인 nsP1234로서) 바이러스 레플리카제를 인코딩하고, 다른 핵산 분자는 상기 레플리카제에 의해 트랜스로 복제될 수 있다(그에 따라 명칭이 트랜스-복제 시스템임). 트랜스-복제는 주어진 숙주 세포에서 이들 핵산 분자 모두의 존재를 필요로 한다. 레플리카제에 의해 트랜스로 복제될 수 있는 핵산 분자는 알파바이러스 레플리카제에 의한 인식 및 RNA 합성을 가능하게 하도록 특정 알파바이러스 서열 요소를 포함해야 한다.
본 발명에 따르면, 용어 "알파바이러스"는 광범위하게 이해되어야 하며, 알파바이러스의 특징을 갖는 임의의 바이러스 입자를 포함한다. 알파바이러스의 특징은, RNA 중합효소 활성을 포함하는, 숙주 세포에서의 복제에 적합한 유전 정보를 인코딩하는 (+) 가닥 RNA의 존재를 포함한다. 많은 알파바이러스의 추가의 특징은 예를 들어 문헌[Strauss & Strauss, Microbiol. Rev., 1994, vol. 58, pp. 491-562]에 기재되어 있다. 용어 "알파바이러스"는 자연계에서 발견되는 알파바이러스뿐만 아니라 이의 임의의 변이체 또는 유도체를 포함한다. 일부 구현예에서, 변이체 또는 유도체는 자연계에서 발견되지 않는다.
일 구현예에서, 알파바이러스는 자연계에서 발견되는 알파바이러스이다. 전형적으로, 자연계에서 발견되는 알파바이러스는 동물(인간과 같은 척추 동물 및 곤충과 같은 절지 동물을 포함함)과 같은 임의의 하나 이상의 진핵 생물에 감염성이다.
자연계에서 발견되는 알파바이러스는 바람직하게는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: 바마 포레스트(Barmah Forest) 바이러스 복합체(바마 포레스트 바이러스를 포함함); 동부 말 뇌염(Eastern equine encephalitis) 복합체(동부 말 뇌염 바이러스의 7가지 항원 유형을 포함함); 미델부르크(Middelburg) 바이러스 복합체(미델부르크 바이러스를 포함함); 두무(Ndumu) 바이러스 복합체(두무 바이러스를 포함함); 셈리키 포레스트(Semliki Forest) 바이러스 복합체(베바루(Bebaru) 바이러스, 치쿤구니야(Chikungunya) 바이러스, 마야로(Mayaro) 바이러스 및 이의 아형인 우나(Una) 바이러스, 오뇽 뇽(O'Nyong Nyong) 바이러스, 및 이의 아형인 이그보-오라(Igbo-Ora) 바이러스, 로스 리버(Ross River) 바이러스 및 이의 아형인 베바루 바이러스, 게타(Getah) 바이러스, 사기야마(Sagiyama) 바이러스, 셈리키 포레스트 바이러스 및 이의 아형인 메 트리(Me Tri) 바이러스를 포함함); 베네수엘라 말 뇌염(Venezuelan equine encephalitis) 복합체(카바쏘우(Cabassou) 바이러스, 에버글레이즈(Everglades) 바이러스, 모쏘 다스 페드라스(Mosso das Pedras) 바이러스, 무캄보(Mucambo) 바이러스, 파라마나(Paramana) 바이러스, 픽수나(Pixuna) 바이러스, 리오 네그로(Rio Negro) 바이러스, 트로카라(Trocara) 바이러스 및 이의 아형인 비조우 브릿지(Bijou Bridge) 바이러스, 베네수엘라 말 뇌염 바이러스를 포함함); 서부 말 뇌염(Western equine encephalitis) 복합체(오라(Aura) 바이러스, 바반키(Babanki) 바이러스, 키질라가흐(Kyzylagach) 바이러스, 신드비스(Sindbis) 바이러스, 옥켈보(Ockelbo) 바이러스, 와타로아(Whataroa) 바이러스, 버기 크릭(Buggy Creek) 바이러스, 포트 모간(Fort Morgan) 바이러스, 하이랜즈(Highlands) J 바이러스, 서부 말 뇌염 바이러스를 포함함); 및 연어 췌장 질환 바이러스; 수면 질환 바이러스; 남부 코끼리 바다표범 바이러스; 토네이트(Tonate) 바이러스를 포함하는 일부 미분류된 바이러스. 더욱 바람직하게는, 알파바이러스는 셈리키 포레스트 바이러스 복합체(셈리키 포레스트 바이러스를 포함하는, 상기에 나타낸 바와 같은 바이러스 유형을 포함함), 서부 말 뇌염 복합체(신드비스 바이러스를 포함하는, 상기에 나타낸 바와 같은 바이러스 유형을 포함함), 동부 말 뇌염 바이러스(상기에 나타낸 바와 같은 바이러스 유형을 포함함), 베네수엘라 말 뇌염 복합체(베네수엘라 말 뇌염 바이러스를 포함하는, 상기에 나타낸 바와 같은 바이러스 유형을 포함함)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
추가의 바람직한 구현예에서, 알파바이러스는 셈리키 포레스트 바이러스이다. 대안적인 추가의 바람직한 구현예에서, 알파바이러스는 신드비스 바이러스이다. 대안적인 추가의 바람직한 구현예에서, 알파바이러스는 베네수엘라 말 뇌염 바이러스이다.
본 발명의 일부 구현예에서, 알파바이러스는 자연계에서 발견되는 알파바이러스가 아니다. 전형적으로, 자연계에서 발견되지 않는 알파바이러스는 자연계에서 발견되는 알파바이러스의 변이체 또는 유도체이며, 이는 뉴클레오타이드 서열, 즉, 게놈 RNA에서의 적어도 하나의 돌연변이에 의해 자연계에서 발견되는 알파바이러스와 구별된다. 뉴클레오타이드 서열에서의 돌연변이는 자연계에서 발견되는 알파바이러스와 비교하여 하나 이상의 뉴클레오타이드의 삽입, 치환 또는 결실로부터 선택될 수 있다. 뉴클레오타이드 서열에서의 돌연변이는 뉴클레오타이드 서열에 의해 인코딩된 폴리펩티드 또는 단백질에서의 돌연변이와 관련되거나 관련되지 않을 수 있다. 예를 들어, 자연계에서 발견되지 않는 알파바이러스는 약독화된 알파바이러스일 수 있다. 자연계에서 발견되지 않는 약독화된 알파바이러스는 전형적으로 자연계에서 발견되는 알파바이러스와 구별되게 하는 뉴클레오타이드 서열에서의 적어도 하나의 돌연변이를 가지며, 전혀 감염성이지 않거나 감염성이지만 낮은 질병 유발 능력을 갖거나 질병 유발 능력을 전혀 갖지 않는 알파바이러스이다. 예시적인 예로서, TC83은 자연계에서 발견되는 베네수엘라 말 뇌염 바이러스(VEEV)와 구별되는 약독화된 알파바이러스이다(문헌[MyKinney et al., 1963, Am. J. Trop. Med. Hyg., 1963, vol. 12; pp. 597-603]).
알파바이러스 속의 구성원은 인간에서의 상대적인 임상 특징에 기초하여 또한 분류될 수 있다: 주로 뇌염과 관련된 알파바이러스, 및 주로 발열, 발진 및 다발성 관절염과 관련된 알파바이러스.
용어 "알파바이러스(alphaviral)"는 알파바이러스에서 발견되거나, 예를 들어 유전자 조작에 의해 알파바이러스로부터 유래되거나 알파바이러스로부터 유도됨을 의미한다.
본 발명에 따르면, "SFV"는 셈리키 포레스트 바이러스를 나타낸다. 본 발명에 따르면, "SIN" 또는 "SINV"는 신드비스 바이러스를 나타낸다. 본 발명에 따르면, "VEE" 또는 "VEEV"는 베네수엘라 말 뇌염 바이러스를 나타낸다.
본 발명에 따르면, "알파바이러스" 또는 "알파바이러스로부터 유래된"이라는 용어는 알파바이러스를 기원으로 하는 엔티티를 지칭한다. 예시를 위해, 알파바이러스의 단백질은 알파바이러스에서 발견되는 단백질 및/또는 알파바이러스에 의해 인코딩된 단백질을 지칭할 수 있고; 알파바이러스의 핵산 서열은 알파바이러스에서 발견되는 핵산 서열 및/또는 알파바이러스에 의해 인코딩된 핵산 서열을 지칭할 수 있다. 바람직하게는, "알파바이러스의" 핵산 서열은 "알파바이러스의 게놈"의 핵산 서열 및/또는 "알파바이러스의 게놈 RNA"의 핵산 서열을 지칭한다.
본 발명에 따르면, 용어 "알파바이러스 RNA"는 알파바이러스 게놈 RNA(즉, (+) 가닥), 알파바이러스 게놈 RNA의 상보체(즉, (-) 가닥), 및 서브게놈 전사체(즉, (+) 가닥) 중 임의의 하나 이상, 또는 이들 중 임의의 것의 단편을 지칭한다.
본 발명에 따르면, "알파바이러스 게놈"은 알파바이러스의 게놈 (+) 가닥 RNA를 지칭한다.
본 발명에 따르면, 용어 "천연 알파바이러스 서열" 및 유사한 용어는 전형적으로 자연 발생적 알파바이러스(자연계에서 발견되는 알파바이러스)의 (예를 들어, 핵산) 서열을 지칭한다. 일부 구현예에서, 용어 "천연 알파바이러스 서열"은 또한 약독화된 알파바이러스의 서열을 포함한다.
본 발명에 따르면, 용어 "5' 복제 인식 서열"은 바람직하게는, 알파바이러스 게놈의 5' 단편과 동일하거나 상동인, 연속적인 핵산 서열, 바람직하게는 리보핵산 서열을 지칭한다. "5' 복제 인식 서열"은 알파바이러스 레플리카제에 의해 인식될 수 있는 핵산 서열이다. 용어 5' 복제 인식 서열은 천연 5' 복제 인식 서열뿐만 아니라, 예를 들어, 자연계에서 발견되는 알파바이러스의 5' 복제 인식 서열의 기능적 변이체와 같은, 이의 기능적 동등물을 포함한다. 5' 복제 인식 서열은 알파바이러스 게놈 RNA의 (-) 가닥 상보체의 합성에 필요하고, (-) 가닥 주형에 기초한 (+) 가닥 바이러스 게놈 RNA의 합성에 필요하다. 천연 5' 복제 인식 서열은 전형적으로 적어도 nsP1의 N-말단 단편을 인코딩하지만; nsP1234를 인코딩하는 전체 오픈 리딩 프레임을 포함하지는 않는다. 천연 5' 복제 인식 서열은 전형적으로 적어도 nsP1의 N-말단 단편을 인코딩한다는 사실을 고려하여, 천연 5' 복제 인식 서열은 전형적으로 적어도 하나의 개시 코돈, 전형적으로 AUG를 포함한다. 일 구현예에서, 5' 복제 인식 서열은 알파바이러스 게놈의 보존된 서열 요소 1(CSE 1) 또는 이의 변이체 및 알파바이러스 게놈의 보존된 서열 요소 2(CSE 2) 또는 이의 변이체를 포함한다. 5' 복제 인식 서열은 전형적으로 4개의 스템 루프(SL), 즉, SL1, SL2, SL3, SL4를 형성할 수 있다. 이들 스템 루프의 번호 매김은 5' 복제 인식 서열의 5' 말단에서 시작한다.
본 발명에 따르면, 용어 "3' 복제 인식 서열"은 바람직하게는 알파바이러스 게놈의 3' 단편과 동일하거나 상동인 연속 핵산 서열, 바람직하게는 리보핵산 서열을 지칭한다. "3' 복제 인식 서열"은 알파바이러스 레플리카제에 의해 인식될 수 있는 핵산 서열이다. 용어 3' 복제 인식 서열은 천연 3' 복제 인식 서열뿐만 아니라 이의 기능적 동등물, 예를 들어 자연계에서 발견되는 알파바이러스의 3' 복제 인식 서열의 기능적 변이체를 포함한다. 3' 복제 인식 서열은 알파바이러스 게놈 RNA의 (-) 가닥 상보체의 합성에 필요하다. 일 구현예에서, 3' 복제 인식 서열은 알파바이러스 게놈의 보존된 서열 요소 4(CSE 4) 또는 이의 변이체 및 선택적으로 알파바이러스 게놈의 폴리(A) 테일을 포함한다.
"보존된 서열 요소" 또는 "CSE"라는 용어는 알파바이러스 RNA에서 발견되는 뉴클레오타이드 서열을 지칭한다. 이들 서열 요소는, 오르토로그(ortholog)들이 다양한 알파바이러스의 게놈에 존재하고 다양한 알파바이러스의 오르토로거스(orthologous) CSE가 바람직하게는 높은 서열 동일성 백분율 및/또는 유사한 2차 또는 3차 구조를 공유하기 때문에 "보존된"으로 명명된다. 용어 CSE는 CSE 1, CSE 2, CSE 3 및 CSE 4를 포함한다.
본 발명에 따르면, 용어 "CSE 1" 또는 "44-nt CSE"는 동의어로서 (-) 가닥 주형으로부터의 (+) 가닥 합성에 필요한 뉴클레오타이드 서열을 지칭한다. 용어 "CSE 1"은 (+) 가닥 상에 있는 서열을 지칭하고; ((-) 가닥 상의) CSE 1의 상보적인 서열은 (+) 가닥 합성을 위한 프로모터로서 기능한다. 바람직하게는, 용어 CSE 1은 알파바이러스 게놈의 5' 최말단 뉴클레오타이드(most 5' nucleotide)를 포함한다. CSE 1은 전형적으로 보존된 스템-루프 구조를 형성한다. 특정 이론에 구속시키고자 함이 없이, CSE 1의 경우, 2차 구조가 1차 구조, 즉, 선형 서열보다 더 중요한 것으로 여겨진다. 모델 알파바이러스인 신드비스 바이러스의 게놈 RNA에서, CSE 1은 44개 뉴클레오타이드의 연속적인 서열로 이루어져 있고, 이는 게놈 RNA의 5' 최말단 44개의 뉴클레오타이드에 의해 형성된다(문헌[Strauss & Strauss, Microbiol. Rev., 1994, vol. 58, pp. 491-562]).
본 발명에 따르면, 용어 "CSE 2" 또는 "51-nt CSE"는 동의어로서 (+) 가닥 주형으로부터의 (-) 가닥 합성에 필요한 뉴클레오타이드 서열을 지칭한다. (+) 가닥 주형은 전형적으로 알파바이러스 게놈 RNA 또는 RNA 레플리콘이다(CSE 2를 포함하지 않는 서브게놈 RNA 전사체가 (-) 가닥 합성을 위한 주형으로서 작용하지 않음에 유의함). 알파바이러스 게놈 RNA에서, CSE 2는 전형적으로 nsP1에 대한 코딩 서열 내에 위치한다. 모델 알파바이러스인 신드비스 바이러스의 게놈 RNA에서, 51-nt CSE는 게놈 RNA의 뉴클레오타이드 위치 155-205에 위치한다(문헌[Frolov et al., 2001, RNA, vol. 7, pp. 1638-1651]). CSE 2는 전형적으로 2개의 보존된 스템 루프 구조를 형성한다. 이들 스템 루프 구조는 이들이 알파바이러스 게놈 RNA의 5' 말단으로부터 카운팅하여 각각 알파바이러스 게놈 RNA의 세 번째 및 네 번째의 보존된 스템 루프이기 때문에 스템 루프 3(SL3) 및 스템 루프 4(SL4)로 표시된다. 특정 이론에 구속시키고자 함이 없이, CSE 2의 경우, 2차 구조가 1차 구조, 즉, 선형 서열보다 더 중요한 것으로 여겨진다.
본 발명에 따르면, 용어 "CSE 3" 또는 "접합 서열"은 동의어로서, 알파바이러스 게놈 RNA로부터 유래되며 서브게놈 RNA의 시작 부위를 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 지칭한다. (-) 가닥 내의 이 서열의 상보체는 서브게놈 RNA 전사를 촉진시키는 작용을 한다. 알파바이러스 게놈 RNA에서, CSE 3은 전형적으로 nsP4의 C-말단 단편을 인코딩하는 영역과 중첩되며, 구조 단백질을 인코딩하는 오픈 리딩 프레임의 업스트림에 위치한 짧은 비-코딩 영역까지 연장된다.
본 발명에 따르면, 용어 "CSE 4" 또는 "19-nt 보존서열" 또는 "19-nt CSE"는 동의어로서, 알파바이러스 게놈의 3' 비번역 영역에서 폴리(A) 서열의 바로 업스트림에 있는 알파바이러스 게놈 RNA로부터의 뉴클레오타이드 서열을 지칭한다. CSE 4는 전형적으로 19개의 연속 뉴클레오타이드로 이루어진다. 특정 이론에 구속시키고자 함이 없이, CSE 4는 (-) 가닥 합성의 개시를 위한 코어 프로모터로서 기능하는 것으로 이해되고/이해되거나(문헌[Jos et al., Future Microbiol., 2009, vol. 4, pp. 837-856]); 알파바이러스 게놈 RNA의 CSE 4 및 폴리(A) 테일은 효율적인 (-) 가닥 합성을 위해 함께 기능하는 것으로 이해된다(문헌[Hardy & Rice, J. Virol., 2005, vol. 79, pp. 4630-4639]).
본 발명에 따르면, "서브게놈 프로모터" 또는 "SGP"라는 용어는 핵산 서열(예를 들어, 코딩 서열)의 업스트림(5')에 있는 핵산 서열을 지칭하며, 이는 RNA 중합효소, 전형적으로 RNA-의존성 RNA 중합효소, 특히 기능성 알파바이러스 비-구조 단백질에 대한 인식 및 결합 부위를 제공함으로써 상기 핵산 서열의 전사를 제어한다. SGP는 추가의 인자에 대한 추가의 인식 또는 결합 부위를 포함할 수 있다. 서브게놈 프로모터는 전형적으로 알파바이러스와 같은 양성 가닥 RNA 바이러스의 유전적 요소이다. 알파바이러스의 서브게놈 프로모터는 바이러스 게놈 RNA에 포함된 핵산 서열이다. 서브게놈 프로모터는 일반적으로 RNA-의존성 RNA 중합효소, 예를 들어 기능성 알파바이러스 비-구조 단백질의 존재 하에서 전사(RNA 합성)의 개시를 가능하게 하는 것을 특징으로 한다. RNA (-) 가닥, 즉, 알파바이러스 게놈 RNA의 상보체는 (+) 가닥 서브게놈 전사체의 합성을 위한 주형으로서 작용하고, (+) 가닥 서브게놈 전사체의 합성은 전형적으로 서브게놈 프로모터에서 또는 그 근처에서 개시된다. 본원에 사용되는 바와 같은 용어 "서브게놈 프로모터"는 그러한 서브게놈 프로모터를 포함하는 핵산에서의 임의의 특정 위치에 국한되지 않는다. 일부 구현예에서, SGP는 CSE 3과 동일하거나 CSE 3과 중첩되거나 CSE 3을 포함한다.
용어 "서브게놈 전사체" 또는 "서브게놈 RNA"는 동의어로서, RNA 분자를 주형("주형 RNA")으로 사용하여 전사의 결과로서 얻을 수 있는 RNA 분자를 지칭하며, 여기서 주형 RNA는 서브게놈 전사체의 전사를 제어하는 서브게놈 프로모터를 포함한다. 서브게놈 전사체는 RNA-의존성 RNA 중합효소, 특히 기능성 알파바이러스 비-구조 단백질의 존재 하에 얻을 수 있다. 예를 들어, "서브게놈 전사체"라는 용어는, 알파바이러스 게놈 RNA의 (-) 가닥 상보체를 주형으로 사용하여, 알파바이러스에 의해 감염된 세포에서 제조된 RNA 전사체를 지칭할 수 있다. 그러나, 본원에 사용되는 바와 같은 용어 "서브게놈 전사체"는 이에 한정되지 않고, 이종 RNA를 주형으로 사용함으로써 얻을 수 있는 전사체를 또한 포함한다. 예를 들어, 서브게놈 전사체는 또한 본 발명에 따른 SGP-함유 레플리콘의 (-) 가닥 상보체를 주형으로 사용하여 얻을 수 있다. 따라서, 용어 "서브게놈 전사체"는 알파바이러스 게놈 RNA의 단편을 전사함으로써 얻을 수 있는 RNA 분자뿐만 아니라 본 발명에 따른 레플리콘의 단편을 전사함으로써 얻을 수 있는 RNA 분자를 지칭할 수 있다.
본 발명에 따르면, 레플리카제, 바람직하게는 알파바이러스 레플리카제에 의해 복제될 수 있는 핵산 작제물은 레플리콘으로 명명된다. 본 발명에 따르면, 용어 "레플리콘"은 RNA-의존성 RNA 중합효소에 의해 복제될 수 있는 RNA 분자를 정의하며, - DNA 중간체 없이 - 하나 또는 다수의 동일하거나 본질적으로 동일한 RNA 레플리콘의 카피를 생성한다. "DNA 중간체 없이"라는 것은 레플리콘의 데옥시리보핵산(DNA) 카피 또는 상보체가 RNA 레플리콘의 카피를 형성하는 과정에서 형성되지 않고/않거나, 데옥시리보핵산(DNA) 분자가 RNA 레플리콘의 카피, 또는 이의 상보체를 형성하는 과정에서 주형으로 사용되지 않음을 의미한다. 레플리카제 기능은 전형적으로 기능성 알파바이러스 비-구조 단백질에 의해 제공된다.
본 발명에 따르면, 용어 "복제될 수 있는" 및 "복제되는 것이 가능한"은 일반적으로 핵산의 하나 이상의 동일하거나 본질적으로 동일한 카피가 제조될 수 있음을 기술한다. "레플리카제에 의해 복제되는 것이 가능한"에서와 같이 용어 "레플리카제"와 함께 사용하는 경우, 용어 "복제될 수 있는" 및 "복제되는 것이 가능한"은 레플리카제와 관련된 핵산 분자, 예를 들어 RNA 레플리콘의 기능적 특징을 기술한다. 이러한 기능적 특징은 (i) 레플리카제가 레플리콘을 인식할 수 있고 (ii) 레플리카제가 RNA-의존성 RNA 중합효소(RdRP)로서 작용할 수 있는 것 중 적어도 하나를 포함한다. 바람직하게는, 레플리카제는 (i) 레플리콘을 인식할 수 있고 (ii) RNA-의존성 RNA 중합효소로서 작용할 수 있다.
"인식할 수 있는"이라는 표현은 레플리카제가 레플리콘과 물리적으로 회합할 수 있고, 바람직하게는 레플리카제가 전형적으로 비공유적으로 레플리콘에 결합할 수 있음을 기술한다. "결합"이라는 용어는 레플리카제가 임의의 하나 이상의 보존된 서열 요소 1(CSE 1) 또는 이의 상보적인 서열(레플리콘에 포함되는 경우), 보존된 서열 요소 2(CSE 2) 또는 이의 상보적인 서열(레플리콘에 포함되는 경우), 보존된 서열 요소 3(CSE 3) 또는 이의 상보적인 서열(레플리콘에 포함되는 경우), 보존된 서열 요소 4(CSE 4) 또는 이의 상보적인 서열(레플리콘에 포함되는 경우)에 대해 결합 능력을 가짐을 의미할 수 있다. 바람직하게는, 레플리카제는 CSE 2[즉, (+) 가닥] 및/또는 CSE 4[즉, (+) 가닥]에 결합할 수 있거나, CSE 1의 상보체[즉, (-) 가닥] 및/또는 CSE 3의 상보체[즉, (-) 가닥]에 결합할 수 있다.
"RdRP로서 작용할 수 있는"이라는 표현은 레플리카제가 알파바이러스 게놈 (+) 가닥 RNA의 (-) 가닥 상보체의 합성을 촉매할 수 있고, 여기서 (+) 가닥 RNA는 주형 기능을 가짐을 의미하고/의미하거나, 레플리카제는 (+) 가닥 알파바이러스 게놈 RNA의 합성을 촉매할 수 있고, 여기서 (-) 가닥 RNA는 주형 기능을 가짐을 의미한다. 일반적으로, "RdRP로서 작용할 수 있는"이라는 표현은 또한 레플리카제가 (+) 가닥 서브게놈 전사체의 합성을 촉매할 수 있음을 포함하며, 여기서 (-) 가닥 RNA는 주형 기능을 갖고, (+) 가닥 서브게놈 전사체의 합성은 전형적으로 알파바이러스 서브게놈 프로모터에서 개시된다.
"결합할 수 있는" 및 "RdRP로서 작용할 수 있는"이라는 표현은 정상적인 생리적 조건에서의 능력을 지칭한다. 특히, 이들은 기능성 알파바이러스 비-구조 단백질을 발현하거나 기능성 알파바이러스 비-구조 단백질을 코딩하는 핵산으로 트랜스펙션된 세포 내 조건을 지칭한다. 세포는 바람직하게는 진핵 세포이다. 결합 능력 및/또는 RdRP로서 작용하는 능력은, 예를 들어 무세포 시험관내 시스템 또는 진핵 세포 내에서 실험적으로 시험될 수 있다. 선택적으로, 상기 진핵 세포는 레플리카제의 기원을 나타내는 특정 알파바이러스가 감염성인 종으로부터의 세포이다. 예를 들어, 인간에 감염성인 특정 알파바이러스로부터의 알파바이러스 레플리카제가 사용되는 경우, 정상적인 생리적 조건은 인간 세포에서의 조건이다. 더욱 바람직하게는, 진핵 세포(일례로 인간 세포)는 레플리카제의 기원을 나타내는 특정 알파바이러스가 감염성인 동일한 조직 또는 기관으로부터 유래된다.
본 발명에 따르면, "천연 알파바이러스 서열과 비교하여" 및 유사한 용어는 천연 알파바이러스 서열의 변이체인 서열을 지칭한다. 변이체는 전형적으로 천연 알파바이러스 서열 자체는 아니다.
일 구현예에서, RNA 레플리콘은 복제 인식 서열, 예컨대 5' 복제 인식 서열 및 3' 복제 인식 서열을 포함한다. 복제 인식 서열은 기능성 알파바이러스 비-구조 단백질에 의해 인식될 수 있는 핵산 서열이다. 즉, 기능성 알파 바이러스 비-구조 단백질은 복제 인식 서열을 인식할 수 있다. 바람직하게는, 5' 복제 인식 서열은 레플리콘의 5' 말단에 위치한다. 일 구현예에서, 5' 복제 인식 서열은 CSE 1 및 2로 이루어지거나 이를 포함한다. 바람직하게는, 3' 복제 인식 서열은 레플리콘의 3' 말단(레플리콘이 폴리(A) 테일을 포함하지 않는 경우) 또는 폴리(A) 테일의 바로 업스트림에 위치한다(레플리콘이 폴리(A) 테일을 포함하는 경우). 일 구현예에서, 3' 복제 인식 서열은 CSE 4로 이루어지거나 이를 포함한다.
일 구현예에서, 5' 복제 인식 서열 및 3' 복제 인식 서열은 기능성 알파바이러스 비-구조 단백질의 존재 하에 RNA 레플리콘의 복제를 지시할 수 있다. 따라서, 단독으로 존재하거나 바람직하게 함께 존재할 때, 이들 인식 서열은 기능성 알파바이러스 비-구조 단백질의 존재 하에 RNA 레플리콘의 복제를 지시한다.
기능성 알파바이러스 비-구조 단백질은 시스(레플리콘 상의 오픈 리딩 프레임에 의해 관심 단백질로서 인코딩됨) 또는 트랜스(별도의 레플리카제 상의 오픈 리딩 프레임에 의해 관심 단백질로서 인코딩됨)로 제공되는 것이, 즉, 레플리콘의 5' 복제 인식 서열 및 3' 복제 인식 서열 모두를 인식할 수 있는 것이 바람직하다. 일 구현예에서, 이는 5' 및 3' 복제 인식 서열이 기능성 알파바이러스 비-구조 단백질이 유래된 알파바이러스에 고유한 것인 경우에 달성된다. 고유한이란 이들 서열의 천연 기원이 동일한 알파바이러스임을 의미한다. 대안적인 구현예에서, 기능성 알파바이러스 비-구조 단백질이 레플리콘의 5' 복제 인식 서열 및/또는 3' 복제 인식 서열 모두를 인식할 수 있는 경우, 5' 복제 인식 서열 및/또는 3' 복제 인식 서열은 기능성 알파바이러스 비-구조 단백질이 유래된 알파바이러스에 고유하지 않다. 바꿔 말하면, 기능성 알파바이러스 비-구조 단백질은 5' 복제 인식 서열 및 3' 복제 인식 서열과 상용 가능하다. 비-천연 기능성 알파바이러스 비-구조 단백질이 각각의 서열 또는 서열 요소를 인식할 수 있는 경우, 기능성 알파바이러스 비-구조 단백질은 상용 가능하다고 한다(크로스-바이러스 상용성(cross-virus compatibility)). 크로스-바이러스 상용성이 존재하는 한, (3'/5') 복제 인식 서열 및 CSE 각각과 기능성 알파바이러스 비-구조 단백질의 임의의 조합이 가능하다. 크로스-바이러스 상용성은, RNA 복제에 적합한 조건에서, 예를 들어 적합한 숙주 세포에서, 시험하려는 기능성 알파바이러스 비-구조 단백질을 RNA와 함께 인큐베이팅함으로써 본 발명을 실시하는 당업자에 의해 용이하게 시험될 수 있고, 여기서 RNA는 시험하려는 3'- 및 5' 복제 인식 서열을 갖는다. 복제가 일어나는 경우, (3'/5') 복제 인식 서열 및 기능성 알파바이러스 비-구조 단백질은 상용 가능한 것으로 결정된다.
본 발명의 일 구현예에서, 레플리콘은 트랜스-복제 시스템의 일부이고, 그에 따라 레플리콘은 트랜스-레플리콘이다. 이 구현예에서, RNA 레플리콘은 기능성 알파바이러스 비-구조 단백질을 인코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함하지 않는 것이 바람직하다. 따라서, 이 구현예에서, 본 발명은 2개의 핵산 분자를 포함하는 시스템을 제공한다: 기능성 알파바이러스 비-구조 단백질을 발현하는(즉, 기능성 알파바이러스 비-구조 단백질을 인코딩하는) 제1 RNA 작제물; 및 제2 RNA 분자인 RNA 레플리콘. 기능성 알파바이러스 비-구조 단백질을 발현하는 RNA 작제물은 본원에서 "기능성 알파바이러스 비-구조 단백질을 발현하는 RNA 작제물" 또는 "레플리카제 작제물"과 동의어로 지칭된다. 기능성 알파바이러스 비-구조 단백질은 상기 정의된 바와 같으며, 전형적으로 레플리카제 작제물에 포함된 오픈 리딩 프레임에 의해 인코딩된다. 레플리카제 작제물에 의해 인코딩된 기능성 알파바이러스 비-구조 단백질은 레플리콘을 복제할 수 있는 임의의 기능성 알파바이러스 비-구조 단백질일 수 있다. 본 발명에 따르면, 레플리카제 작제물은 동일한 조성물 내에 레플리콘(들)과 함께 존재할 수 있으며, 예를 들어 혼합된 미립자 제형 또는 조합된 미립자 제형으로서 존재하거나, 별도의 조성물들로, 예를 들어 개별 미립자 제형들로서 존재할 수 있다. 본 발명의 시스템이 세포, 바람직하게는 진핵 세포 내로 도입될 때, 기능적 알파바이러스 비-구조 단백질을 인코딩하는 오픈 리딩 프레임이 번역될 수 있다. 번역 후, 기능적 알파바이러스 비-구조 단백질은 별도의 RNA 분자(RNA 레플리콘)를 트랜스로 복제할 수 있다.
본원에서, (예를 들어, 트랜스-작용, 트랜스-조절과 관련하여) 트랜스는 일반적으로 "상이한 분자로부터의 작용"(즉, 분자간)을 의미한다. 이는 일반적으로 "동일한 분자로부터의 작용"(즉, 분자내)을 의미하는 (예를 들어 시스-작용, 시스-조절과 관련하여) 시스와 반대이다. RNA 합성(전사 및 RNA 복제를 포함함)과 관련하여, 트랜스-작용 요소는 RNA 합성이 가능한 효소(RNA 중합효소)를 인코딩하는 유전자를 함유하는 핵산 서열을 포함한다. RNA 중합효소는 RNA의 합성을 위한 주형으로 제 2 핵산 분자, 즉, 그것이 인코딩되는 것 이외의 핵산 분자를 사용한다. RNA 중합효소 및 RNA 중합효소를 인코딩하는 유전자를 함유하는 핵산 서열 모두는 제 2 핵산 분자 상에서 "트랜스로 작용"한다고 한다. 본 발명의 맥락에서, 트랜스-작용 RNA에 의해 인코딩된 RNA 중합효소는 기능성 알파바이러스 비-구조 단백질일 수 있다. 기능성 알파바이러스 비-구조 단백질은 RNA 레플리콘의 복제를 포함하는 RNA의 합성을 위한 주형으로 RNA 레플리콘인 제 2 핵산 분자를 사용할 수 있다. 본 발명에 따라 레플리카제에 의해 트랜스로 복제될 수 있는 RNA 레플리콘은 본원에서 "트랜스-레플리콘"과 동의어로 지칭된다.
본 발명에 따르면, 기능성 알파바이러스 비-구조 단백질의 역할은, 서브게놈 프로모터가 레플리콘 상에 존재하는 경우, 레플리콘을 증폭시키고 서브게놈 전사체를 제조하는 것이다. 레플리콘이 발현을 위한 관심 유전자를 인코딩하는 경우, 관심 유전자의 발현 수준 및/또는 발현 지속 기간은 기능성 알파바이러스 비-구조 단백질의 수준을 변경시킴으로써 트랜스로 조절될 수 있다.
본 발명의 트랜스-복제 시스템은 적어도 2개의 핵산 분자를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 시스템은 정확히 2개의 RNA 분자, 즉, 레플리콘 및 레플리카제 작제물로 이루어진다. 대안적인 바람직한 구현예에서, 시스템은 하나 초과의 레플리콘을 포함하고, 각각은 바람직하게는 적어도 하나의 관심 단백질을 인코딩하고, 또한 레플리카제 작제물을 포함한다. 이러한 구현예에서, 레플리카제 작제물에 의해 인코딩된 기능성 알파바이러스 비-구조 단백질은 각각의 레플리콘 상에서 작용하여 서브게놈 전사체의 복제 및 선택적으로 생성을 각각 유도할 수 있다. 예를 들어, 각각의 레플리콘은 약학적 활성 펩티드 또는 단백질을 인코딩할 수 있다. 이는, 예를 들어 여러 다양한 항원에 대한 대상체의 백신접종이 요망되는 경우에 유리하다.
바람직하게는, 레플리카제 작제물은 (+) 가닥 주형에 기초한 (-) 가닥 합성 및/또는 (-) 가닥 주형에 기초한 (+) 가닥 합성에 필요한 적어도 하나의 보존된 서열 요소(CSE)를 결여한다. 더욱 바람직하게는, 레플리카제 작제물은 어떠한 알파바이러스의 보존된 서열 요소(CSE)도 포함하지 않는다. 특히, 알파바이러스의 4개 CSE(문헌[Strauss & Strauss, Microbiol. Rev., 1994, vol. 58, pp. 491-562]; 문헌[Jos et al., Future Microbiol., 2009, vol. 4, pp. 837-856]) 중에서, 하기 CSE 중 임의의 하나 이상이 바람직하게는 레플리카제 작제물 상에 존재하지 않는다: CSE 1; CSE 2; CSE 3; CSE 4. 특히, 임의의 하나 이상의 알파바이러스 CSE가 없는 경우, 본 발명의 레플리카제 작제물은 알파바이러스 게놈 RNA와 유사한 것보다 전형적인 진핵생물 mRNA와 훨씬 더 유사하다.
본 발명의 레플리카제 작제물은 바람직하게는, 적어도 자기-복제를 할 수 없다는 점 및/또는 서브게놈 프로모터의 제어를 받는 오픈 리딩 프레임을 포함하지 않는다는 점에서, 알파바이러스 게놈 RNA와 구별된다. 자기-복제할 수 없을 때, 레플리카제 작제물은 또한 "자살 작제물(suicide construct)"로 명명될 수 있다.
본 발명에 따른 레플리카제 작제물은 바람직하게는 단일 가닥 RNA 분자이다. 본 발명에 따른 레플리카제 작제물은 전형적으로 (+) 가닥 RNA 분자이다. 일 구현예에서, 본 발명의 레플리카제 작제물은 분리된 핵산 분자이다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 레플리콘과 같은 RNA는 관심 펩티드 또는 관심 단백질을 인코딩하는 적어도 하나의 오픈 리딩 프레임을 포함한다. 다양한 구현예에서, 관심 펩티드 또는 단백질은 이종성 핵산 서열에 의해 인코딩된다. 본 발명에 따르면, 용어 "이종성"은 핵산 서열이 자연 상태에서 알파바이러스 핵산 서열과 같은 핵산 서열에 기능적으로 또는 구조적으로 연결되어 있지 않다는 사실을 지칭한다.
본 발명에 따른 RNA는 단일 폴리펩티드 또는 다수의 폴리펩티드를 인코딩할 수 있다. 다수의 폴리펩티드는 단일 폴리 펩티드(융합 폴리펩티드) 또는 별도의 폴리펩티드들로서 인코딩될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명에 따른 RNA는 하나 초과의 오픈 리딩 프레임을 포함할 수 있으며, 이들 각각은 레플리콘의 경우 서브게놈 프로모터의 제어를 받거나 받지 않도록 독립적으로 선택될 수 있다. 대안적으로, 폴리-프로테인 또는 융합 폴리펩티드는, 선택적으로 자가촉매성 프로테아제 절단 부위(예를 들어, 구제역 바이러스 2A 단백질)에 의해 분리된 개별 폴리펩티드들, 또는 인테인을 포함한다.
관심 단백질은, 예를 들어, 리포터 단백질, 약학적 활성 펩티드 또는 단백질, 세포내 인터페론(IFN) 신호전달 억제제, 및 기능성 알파바이러스 비-구조 단백질로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명에 따르면, 용어 "펩티드"는 올리고펩티드 및 폴리펩티드를 포함하고, 펩티드 결합을 통해 서로 연결된 2개 이상, 바람직하게는 3개 이상, 바람직하게는 4개 이상, 바람직하게는 6개 이상, 바람직하게는 8개 이상, 바람직하게는 10개 이상, 바람직하게는 13개 이상, 바람직하게는 16개 이상, 바람직하게는 20개 이상이고, 바람직하게는 50개 이하, 바람직하게는 100개 이하 또는 바람직하게는 150개 이하인 연속적인 아미노산을 포함하는 물질을 지칭한다. 용어 "단백질"은 큰 펩티드, 바람직하게는 적어도 151개의 아미노산을 갖는 펩티드를 지칭하지만, 용어 "펩티드" 및 "단백질"은 본원에서 일반적으로 동의어로 사용된다.
용어 "펩티드" 및 "단백질"은 본 발명에 따르면 아미노산 성분뿐만 아니라 당 및 포스페이트 구조와 같은 비-아미노산 성분을 함유하는 물질을 포함하고, 에스테르, 티오에테르 또는 이황화물 결합과 같은 결합을 함유하는 물질을 또한 포함한다.
예를 들어 핵산 및 아미노산 서열과 관련하여 용어 "변이체"는 본 발명에 따르면 임의의 변이체, 특히 돌연변이체, 바이러스 균주 변이체, 스플라이스 변이체, 입체형태, 아이소형, 대립형질 변이체, 종 변이체 및 종 동족체, 특히 자연적으로 존재하는 것들을 포함한다. 대립형질 변이체는 중요성이 종종 불분명한 유전자의 정상적인 서열에서의 변경과 관련된다. 완전한 유전자 시퀀싱은 종종 주어진 유전자에 대한 수많은 대립형질 변이체를 확인해준다. 핵산 분자와 관련하여, 용어 "변이체"는 축퇴 핵산 서열을 포함하며, 여기서 본 발명에 따른 축퇴 핵산은 유전자 코드의 축퇴성으로 인해(예를 들어, 코돈 사용의 적응으로 인해) 코돈 서열이 기준 핵산과 상이한 핵산이다. 종 동족체는 주어진 핵산 또는 아미노산 서열과는 기원이 상이한 종의 핵산 또는 아미노산 서열이다. 바이러스 동족체는 주어진 핵산 또는 아미노산 서열과는 기원이 상이한 바이러스의 핵산 또는 아미노산 서열이다.
본 발명에 따르면, 핵산 변이체는 기준 핵산과 비교하여 단일 또는 다수의 뉴클레오타이드의 결실, 첨가, 돌연변이, 치환 및/또는 삽입을 포함한다. 결실은 기준 핵산으로부터 하나 이상의 뉴클레오타이드를 제거를 포함한다. 첨가 변이체는 하나 이상의 뉴클레오타이드, 예컨대 1개, 2개, 3개, 5개, 10개, 20개, 30개, 50개 이상의 뉴클레오타이드의 5'- 및/또는 3'-말단 융합을 포함한다. 치환의 경우, 서열 내의 적어도 하나의 뉴클레오타이드가 제거되고 적어도 하나의 다른 뉴클레오타이드가 그 자리에 삽입된다(예컨대, 전환 및 전이). 돌연변이는 무염기 부위(abasic site), 가교된 부위, 및 화학적으로 변경되거나 변형된 염기를 포함한다. 삽입은 기준 핵산 내로의 적어도 하나의 뉴클레오타이드의 첨가를 포함한다.
본 발명에 따르면, "뉴클레오타이드 변화"는 기준 핵산과 비교하여 단일 또는 다수의 뉴클레오타이드의 결실, 첨가, 돌연변이, 치환 및/또는 삽입을 지칭할 수 있다. 일부 구현예에서, "뉴클레오타이드 변화"는 기준 핵산과 비교하여 단일 뉴클레오타이드의 결실, 단일 뉴클레오타이드의 첨가, 단일 뉴클레오타이드의 돌연변이, 단일 뉴클레오타이드의 치환 및/또는 단일 뉴클레오타이드의 삽입으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 본 발명에 따르면, 핵산 변이체는 기준 핵산과 비교하여 하나 이상의 뉴클레오타이드 변화를 포함할 수 있다.
특정 핵산 서열의 변이체는 바람직하게는 상기 특정 서열의 적어도 하나의 기능적 특성을 가지며, 바람직하게는 상기 특정 서열, 예를 들어 특정 핵산 서열과 동일하거나 유사한 특성을 나타내는 핵산 서열과 기능적으로 동등하다.
바람직하게는 주어진 핵산 서열과 상기 주어진 핵산 서열의 변이체인 핵산 서열 사이의 동일성 정도는 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 75%, 바람직하게는 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 85%, 더욱더 바람직하게는 적어도 90%, 또는 가장 바람직하게는 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%일 것이다. 동일성 정도는 바람직하게는 적어도 약 30개, 적어도 약 50개, 적어도 약 70개, 적어도 약 90개, 적어도 약 100개, 적어도 약 150개, 적어도 약 200개, 적어도 약 250개, 적어도 약 300개, 또는 적어도 약 400개의 뉴클레오타이드의 영역에 대하여 주어진다. 바람직한 구현예에서, 동일성 정도는 기준 핵산 서열의 전장에 대하여 주어진다.
"서열 유사성"은 동일하거나 보존적 아미노산 치환을 나타내는 아미노산의 백분율을 나타낸다. 두 폴리펩티드 또는 핵산 서열들 사이의 "서열 동일성"은 서열들 간에 동일한 아미노산 또는 뉴클레오타이드의 백분율을 나타낸다.
용어 "% 동일"은 특히 비교하려는 두 서열 사이의 최적 정렬에서 동일한 뉴클레오타이드의 백분율을 지칭하며, 상기 백분율은 순수하게 통계적인 것이고, 두 서열 사이의 차이는 서열의 전장에 걸쳐 무작위적으로 분포될 수 있고, 비교하려는 서열은 두 서열 사이의 최적 정렬을 달성하기 위해 기준 서열과 비교하여 첨가 또는 결실을 포함할 수 있다. 두 서열의 비교는 일반적으로, 서열들의 국소 영역들을 확인하기 위해, 최적 정렬 후 세그먼트 또는 "비교 윈도우"에 대하여 상기 서열들을 비교함으로써 수행된다. 비교를 위한 최적 정렬은 수동으로 수행되거나, 문헌[Smith and Waterman, 1981, Ads App. Math. 2, 482]에 따른 국소 상동성 알고리즘의 도움으로, 문헌[Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48, 443]에 따른 국소 상동성 알고리즘의 도움으로, 및 문헌[Pearson and Lipman, 1988, Proc. Natl Acad. Sci. USA 85, 2444]에 따른 유사성 검색 알고리즘으로 도움으로 또는 상기 알고리즘을 사용하는 컴퓨터 프로그램(미국 위스콘신주 매디슨 575 사이언스 드라이브 소재의 Genetics Computer Group의 위스콘신 제네틱스 소프트웨어 패키지(Wisconsin Genetics Software Package) 내의 GAP, BESTFIT, FASTA, BLAST P, BLAST N 및 TFASTA)의 도움으로 수행될 수 있다.
동일성 백분율은 비교하려는 서열들이 일치하는 동일한 위치의 수를 결정하고, 이 수를 비교된 위치의 수로 나누고, 이 결과에 100을 곱함으로써 얻어진다.
예를 들어, 웹사이트 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/wblast2.cgi에서 이용 가능한 BLAST 프로그램인 "BBLAST 2 sequences"가 사용될 수 있다.
두 서열이 서로 상보적인 경우, 하나의 핵산은 또 다른 핵산에 "하이브리드화될 수" 있거나 "하이브리드화"된다. 두 서열이 서로 안정적인 듀플렉스를 형성할 수 있는 경우, 하나의 핵산은 또 다른 핵산에 대해 "상보적"이다. 본 발명에 따르면, 하이브리드화는 바람직하게는 폴리뉴클레오타이드들 사이의 특이적 하이브리드화를 가능하게 하는 조건(엄격한 조건) 하에서 수행된다. 엄격한 조건은, 예를 들어, 문헌 [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook et al., Editors, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989] 또는 [Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., Editors, John Wiley & Sons, Inc., New York]에 기술되어 있고, 예를 들어, 하이브리드화 완충액(3.5 x SSC, 0.02% Ficoll, 0.02% 폴리비닐피롤리돈, 0.02% 소 혈청 알부민, 2.5 mM NaH2PO4(pH 7), 0.5% SDS, 2 mM EDTA) 중의 65℃에서의 하이브리드화를 지칭한다. SSC는 0.15 M 염화나트륨/0.15 M 시트르산나트륨, pH 7이다. 하이브리드화 후, DNA가 전달된 막을, 예를 들어, 실온에서 2 x SSC로 세척하고, 이어서 68℃ 이하의 온도에서 0.1 내지 0.5 x SSC/0.1 x SDS로 세척한다.
상보성 퍼센트는 제2 핵산 서열과 수소 결합(예를 들어, 왓슨-크릭 염기쌍)을 형성할 수 있는 핵산 분자 내의 연속된 잔기들의 백분율을 나타낸다(예를 들어, 10개 중 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개는 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 및 100% 상동성임). "완전히 상보적인" 또는 "전적으로 상보적인"이라 함은 핵산 서열의 모든 연속된 잔기가 제2 핵산 서열 내의 동일한 수의 연속된 잔기와 수소 결합을 형성함을 의미한다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 상보성 정도는 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 75%, 바람직하게는 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 85%, 더욱더 바람직하게는 적어도 90% 또는 가장 바람직하게는 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%이다. 가장 바람직하게는, 본 발명에 따른 상보성 정도는 100%이다.
"유도체"라는 용어는 뉴클레오타이드 염기, 당 또는 포스페이트 상에서의 핵산의 임의의 화학적 유도체화를 포함한다. "유도체"라는 용어는 또한 자연적으로 발생하지 않는 뉴클레오타이드 및 뉴클레오타이드 유사체를 함유하는 핵산을 포함한다. 바람직하게는, 핵산의 유도체화는 그의 안정성을 증가시킨다.
본 발명에 따르면, "핵산 서열로부터 유래된 핵산 서열"은 그것이 유래된 핵산의 변이체일 수 있는 핵산을 지칭한다
일 구현예에서, 오픈 리딩 프레임은 리포터 단백질을 인코딩한다. 그 구현예에서, 오픈 리딩 프레임은 리포터 유전자를 포함한다. 특정 유전자는 이러한 유전자가 이를 발현하는 세포 또는 유기체에 부여하는 특징이 쉽게 확인하고 측정될 수 있기 때문에 또는 이러한 유전자가 선택 가능한 마커이기 때문에 리포터로 선택될 수 있다. 리포터 유전자는 종종 특정 유전자가 세포 또는 유기체 집단에 의해 흡수되었거나 그곳에서 발현되었는지 여부를 나타내는 지표로 사용된다. 바람직하게는, 리포터 유전자의 발현 생성물은 시각적으로 검출 가능하다. 일반적인 시각적으로 검출 가능한 리포터 단백질은 전형적으로 형광 또는 발광 단백질을 보유한다. 특정 리포터 유전자의 예에는, 그것을 발현하는 세포가 청색광 하에서 녹색 빛을 내게 하는 해파리 녹색 형광 단백질(GFP), 루시페린과의 반응을 촉매하여 빛을 생성하는 효소인 루시퍼라아제, 및 적색 형광 단백질(RFP)을 인코딩하는 유전자가 포함된다. 이러한 특정 리포터 유전자의 임의의 변이체가 가능한데, 변이체가 시각적으로 검출 가능한 특성을 갖는 한 그러하다. 예를 들어, eGFP는 GFP의 점돌연변이 변이체이다.
본 발명에 따르면, 일 구현예에서, RNA는 약학적 활성 RNA를 포함하거나 이로 이루어진다. "약학적 활성 RNA"는 약학적 활성 펩티드 또는 단백질을 인코딩하는 RNA일 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 RNA는 약학적 활성 펩티드 또는 단백질을 인코딩한다. 바람직하게는, 오픈 리딩 프레임은 약학적 활성 펩티드 또는 단백질을 인코딩한다. 바람직하게는, RNA는, 선택적으로 서브게놈 프로모터의 제어를 받는 RNA 레플리콘의 경우, 약학적 활성 펩티드 또는 단백질을 인코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함한다.
"약학적 활성 펩티드 또는 단백질"은 대상체에게 치료적 유효량으로 투여될 때 대상체의 질환 또는 질병 상태에 대해 긍정적이거나 유리한 효과를 갖는다. 바람직하게는, 약학적 활성 펩티드 또는 단백질은 치유적 또는 완화적 특성을 가지며, 질병 또는 장애의 하나 이상의 증상을 개선하거나, 완화하거나, 경감시키거나, 역전시키거나, 그의 발생을 지연시키거나, 중증도를 감소시키기 위해 투여될 수 있다. 약학적 활성 펩티드 또는 단백질은 예방적 특성을 가질 수 있으며, 질병의 발병을 지연시키거나 그러한 질병 또는 병리학적 질환의 중증도를 감소시키기 위해 사용될 수 있다. 용어 "약학적 활성 펩티드 또는 단백질"은 전체 단백질 또는 폴리펩티드를 포함하며, 또한 그의 약학적 활성 단편을 지칭할 수 있다. 이는 또한 펩티드 또는 단백질의 약학적 활성 유사체를 포함할 수 있다. "약학적 활성 펩티드 또는 단백질"이라는 용어는 항원인 펩티드 및 단백질을 포함하며, 즉, 펩티드 또는 단백질은 치료적이거나 부분적으로 또는 완전히 보호적일 수 있는 면역 반응을 대상체에서 유도한다.
일 구현예에서, 약학적 활성 펩티드 또는 단백질은 면역학적 활성 화합물 또는 항원 또는 에피토프이거나 이를 포함한다.
본 발명에 따르면, 용어 "면역학적 활성 화합물"은, 바람직하게는 면역 세포의 성숙을 유도 및/또는 억제하고/억제하거나, 사이토카인 생합성을 유도 및/또는 억제하고/억제하거나, B 세포에 의한 항체 생산을 자극함에 의해 체액성 면역을 변경시킴으로써, 면역 반응을 변경시키는 임의의 화합물과 관련된다. 일 구현예에서, 면역 반응은 항체 반응(일반적으로 면역글로불린 G(IgG)를 포함함) 및/또는 T 세포 반응과 같은 세포 반응의 자극을 포함한다. 면역학적 활성 화합물은 항바이러스 및 항암 활성을 포함하지만 이로 제한되지 않는 강력한 면역자극 활성을 보유할 수 있고, 또한 면역 반응의 다른 양상을 하향 조절할 수 있으며, 예를 들어 면역 반응을 TH2 면역 반응으로부터 멀리 이동시키는데, 이는 광범위한 TH2 매개 질병을 치료하는 데 유용하다.
본 발명에 따르면, 용어 "항원" 또는 "면역원"은 면역 반응을 유도하는 임의의 물질을 포함한다. 특히, "항원"은 항체 또는 T-림프구(T-세포)와 특이적으로 반응하는 임의의 물질과 관련된다. 본 발명에 따르면, 용어 "항원"은 하나 이상의 에피토프를 포함하는 임의의 분자를 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 맥락에서 항원은, 선택적으로 프로세싱 후, 바람직하게 항원에 특이적인 면역 반응을 유도하는 분자이다. 본 발명에 따르면, 면역 반응의 후보인 임의의 적합한 항원이 사용될 수 있으며, 여기서 면역 반응은 체액성 면역 반응뿐만 아니라 세포성 면역 반응일 수 있다. 본 발명의 구현예와 관련하여, 항원은 세포에 의해, 바람직하게는 MHC 분자와 관련하여 항원 제시 세포에 의해 제시되며, 이는 항원에 대한 면역 반응을 가져온다. 항원은 바람직하게는 자연 발생적 항원에 상응하거나 이로부터 유래된 생성물이다. 그러한 자연 발생적 항원은 알레르겐, 바이러스, 박테리아, 진균, 기생충 및 다른 감염성 인자 및 병원체를 포함하거나 이로부터 유래될 수 있거나 항원은 또한 종양 항원일 수 있다. 본 발명에 따르면, 항원은 자연 발생적 생성물, 예를 들어, 바이러스 단백질, 또는 이의 일부에 상응할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 항원은 표면 폴리펩티드, 즉, 세포, 병원체, 박테리아, 바이러스, 진균, 기생충, 알레르겐, 또는 종양의 표면 상에 자연적으로 디스플레이된 폴리펩티드이다. 항원은 세포, 병원체, 박테리아, 바이러스, 진균, 기생충, 알레르겐, 또는 종양에 대해 면역 반응을 유도할 수 있다.
"질병-관련 항원"이라는 용어는 질병과 관련된 임의의 항원을 지칭하는 가장 광범위한 의미로 사용된다. 질병-관련 항원은 숙주의 면역계를 자극하여 질병에 대한 세포성 항원-특이적 면역 반응 및/또는 체액성 항체 반응을 일으키는 에피토프를 함유하는 분자이다. 따라서, 질병-관련 항원은 치료 목적으로 사용될 수 있다. 질병-관련 항원은 바람직하게는 미생물, 전형적으로 미생물 항원에 의한 감염과 관련되거나, 암, 전형적으로 종양과 관련된다.
"병원체"라는 용어는 유기체, 바람직하게는 척추 동물 유기체에서 질병을 일으킬 수 있는 병원성 생물학적 물질을 지칭한다. 병원체에는 미생물, 예컨대 박테리아, 단세포 진핵 유기체(원생 동물), 진균뿐만 아니라 바이러스가 포함된다.
용어 "에피토프", "항원 펩티드", "항원 에피토프", "면역원성 펩티드" 및 "MHC 결합 펩티드"는 본원에서 상호 교환적으로 사용되며, 항원과 같은 분자 내의 항원 결정기, 즉, 면역계에 의해 인식되는, 예를 들어, 특히 MHC 분자와 관련하여 제시될 때 T 세포에 의해 인식되는, 면역학적 활성 화합물 내의 일부 또는 그의 단편을 지칭한다. 단백질의 에피토프는 바람직하게는 상기 단백질의 연속 또는 불연속 부분을 포함하며, 길이가 바람직하게는 5개 내지 100개, 바람직하게는 5개 내지 50개, 더욱 바람직하게는 8개 내지 30개, 가장 바람직하게는 10개 내지 25개의 아미노산이고, 예를 들어, 에피토프는 길이가 바람직하게는 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 또는 25개의 아미노산일 수 있다. 본 발명에 따르면, 에피토프는 MHC 분자, 예컨대 세포 표면 상의 MHC 분자에 결합할 수 있으며, 그에 따라 "MHC 결합 펩티드" 또는 "항원 펩티드"일 수 있다. 용어 "주요 조직 적합성 복합체" 및 약어 "MHC"는 MHC 클래스 I 및 MHC 클래스 II 분자를 포함하며 모든 척추 동물에 존재하는 유전자의 복합체와 관련된다. MHC 단백질 또는 분자는 면역 반응에서 림프구와 항원 제시 세포 또는 질환 세포 사이의 신호전달에 중요하며, 여기서 MHC 단백질 또는 분자는 펩티드와 결합하여 T 세포 수용체에 의한 인식을 위해 이를 제시한다. MHC에 의해 인코딩된 단백질은 세포의 표면에서 발현되고, 자기-항원(세포 자체로부터의 펩티드 단편) 및 비-자기 항원(예를 들어, 침입 미생물의 단편) 모두를 T 세포에 디스플레이한다. 바람직한 그러한 면역원성 부분은 MHC 클래스 I 또는 클래스 II 분자에 결합한다. 본원에 사용되는 바와 같이, 그러한 결합이 당업계에 공지된 임의의 검정을 사용하여 검출 가능한 경우, 면역원성 부분은 MHC 클래스 I 또는 클래스 II 분자에 "결합"한다고 한다. 용어 "MHC 결합 펩티드"는 MHC 클래스 I 및/또는 MHC 클래스 II 분자에 결합하는 펩티드와 관련된다. 클래스 I MHC/펩티드 복합체의 경우, 결합 펩티드는 8개 내지 10개의 아미노산 길이이지만, 더 길거나 더 짧은 펩티드가 효과적일 수 있다. 클래스 II MHC/펩티드 복합체의 경우, 결합 펩티드는 전형적으로 10개 내지 25개의 아미노산 길이이고, 특히 13개 내지 18개의 아미노산 길이이지만, 더 길고 더 짧은 펩티드가 효과적일 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 관심 단백질은 표적 유기체의 백신접종에 적합한 에피토프를 포함한다. 당업자는 면역생물학 및 백신접종의 원리 중 하나가 치료하려는 질병에 대하여 면역학적으로 관련된 항원으로 유기체를 면역화함으로써 질병에 대한 면역보호 반응이 생성된다는 사실에 기초한다는 것을 알 것이다. 본 발명에 따르면, 항원은 자기-항원 및 비-자기-항원을 포함하는 군으로부터 선택된다. 비-자기-항원은 바람직하게는 박테리아 항원, 바이러스 항원, 진균 항원, 알레르겐 또는 기생충 항원이다. 항원은 표적 유기체에서 면역 반응을 유도할 수 있는 에피토프를 포함하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 에피토프는 박테리아, 바이러스, 진균, 기생충, 알레르겐, 또는 종양에 대한 면역 반응을 유도할 수 있다.
일부 구현예에서, 비-자기-항원은 박테리아 항원이다. 일부 구현예에서, 항원은 조류, 어류 및 길들여진 동물을 포함한 포유 동물을 포함하는 동물을 감염시키는 박테리아에 대한 면역 반응을 유도한다. 바람직하게는, 면역 반응을 유도하는 박테리아는 병원성 박테리아이다.
일부 구현예에서, 비-자기-항원은 바이러스 항원이다. 바이러스 항원은, 예를 들어 바이러스 표면 단백질로부터의 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드, 예를 들어 막-결합 당단백질, 캡시드 단백질 또는 폴리펩티드 또는 스파이크 단백질 또는 폴리펩티드일 수 있다. 일부 구현예에서, 항원은 조류, 어류 및 길들여진 동물을 포함한 포유 동물을 포함하는 동물을 감염시키는 바이러스에 대한 면역 반응을 유도한다. 바람직하게는, 면역 반응을 유도하는 바이러스는 병원성 바이러스이다.
일부 구현예에서, 비-자기-항원은 진균으로부터의 폴리펩티드 또는 단백질이다. 일부 구현예에서, 항원은 조류, 어류 및 길들여진 동물을 포함한 포유 동물을 포함하는 동물을 감염시키는 진균에 대한 면역 반응을 유도한다. 바람직하게는, 면역 반응을 유도하는 진균은 병원성 진균이다.
일부 구현예에서, 비-자기-항원은 단세포성 진핵생물 기생충으로부터의 폴리펩티드 또는 단백질이다. 일부 구현예에서, 항원은 단세포성 진핵생물 기생충, 바람직하게는 병원성 단세포성 진핵생물 기생충에 대한 면역 반응을 유도한다. 병원성 단세포성 진핵생물 기생충은, 예를 들어 플라스모디움(Plasmodium) 속에 속하는 것, 예를 들어 플라스모디움 팔시파룸(P. falciparum), 플라스모디움 비박스(P. vivax), 플라스모디움 말라리아에(P. malariae) 또는 플라스모디움 오발레(P. ovale), 레슈마니아(Leishmania) 속에 속하는 것, 또는 트리파노소마(Trypanosoma) 속에 속하는 것, 예를 들어 트리파노소마 크루지(T. cruzi) 또는 트리파노소마 브루세이(T. brucei)일 수 있다.
일부 구현예에서, 비-자기-항원은 알레르겐성 폴리펩티드 또는 알레르겐성 단백질이다. 알레르겐성 단백질 또는 알레르겐성 폴리펩티드는 저감작(hypo-sensitization)으로도 알려진 알레르겐 면역요법에 적합하다.
일부 구현예에서, 항원은 자기-항원, 특히 종양 항원이다. 종양 항원 및 그의 결정은 당업자에게 알려져 있다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "종양 항원" 또는 "종양-관련 항원"은 제한된 수의 조직 및/또는 기관에서 또는 특정 발달 단계에서 정상적인 조건 하에서 특이적으로 발현되는 단백질과 관련되며, 예를 들어, 종양 항원은 위 조직, 바람직하게는 위 점막, 생식 기관, 예를 들어, 고환, 영양막 조직, 예를 들어, 태반, 또는 생식선 세포에서 정상적인 조건 하에서 특이적으로 발현될 수 있고, 하나 이상의 종양 또는 암 조직에서 발현되거나 비정상적으로 발현된다. 이와 관련하여, "제한된 수"는 바람직하게는 3개 이하, 더욱 바람직하게는 2개 이하를 의미한다. 본 발명의 맥락에서 종양 항원은, 예를 들어 분화 항원, 바람직하게는 세포 유형 특이적 분화 항원, 즉, 특정 분화 단계에서 특정 세포 유형에서 정상적인 조건 하에서 특이적으로 발현되는 단백질, 암/고환 항원, 즉, 고환 및 때로는 태반에서 정상적인 조건 하에서 특이적으로 발현되는 단백질, 및 생식선 특이적 항원을 포함한다. 본 발명의 맥락에서, 종양 항원은 바람직하게는 암 세포의 세포 표면과 관련되고, 바람직하게는 정상 조직에서는 발현되지 않거나 단지 드물게 발현된다. 바람직하게는, 종양 항원 또는 종양 항원의 비정상적 발현은 암 세포를 확인해준다. 본 발명의 맥락에서, 대상체, 예를 들어, 암 질환을 앓고 있는 환자에서 암 세포에 의해 발현되는 종양 항원은 바람직하게는 상기 대상체에서 자가-단백질이다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 맥락에서 종양 항원은 비필수적인 조직 또는 기관, 즉, 면역계에 의해 손상될 때 대상체의 사망을 초래하지 않는 조직 또는 기관, 또는 면역계가 접근할 수 없거나 거의 접근할 수 없는 신체의 기관 또는 구조에서 정상적인 조건 하에서 특이적으로 발현된다. 바람직하게는, 종양 항원의 아미노산 서열은 정상 조직에서 발현되는 종양 항원과 암 조직에서 발현되는 종양 항원 사이에 동일하다.
본 발명에서 유용할 수 있는 종양 항원의 예로는 p53, ART-4, BAGE, 베타-카테닌/m, Bcr-abL CAMEL, CAP-1, CASP-8, CDC27/m, CDK4/m, CEA, 클라우딘 계열의 세포 표면 단백질, 예컨대 CLAUDIN-6, CLAUDIN-18.2 및 CLAUDIN-12, cMYC, CT, Cyp-B, DAM, ELF2M, ETV6-AML1, G250, GAGE, GnT-V, Gap100, HAGE, HER-2/neu, HPV-E7, HPV-E6, HAST-2, hTERT(또는 hTRT), LAGE, LDLR/FUT, MAGE-A, 바람직하게는 MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE-A7, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-A11, 또는 MAGE-A12, MAGE-B, MAGE-C, MART1/Melan-A, MC1R, Myosin/m, MUC1, MUM-1, MUM-2, MUM-3, NA88-A, NF1, NY-ESO-1, NY-BR-1, p190 마이너(minor) BCR-abL, Pm1/RARa, PRAME, 프로테이나제 3, PSA, PSM, RAGE, RU1 또는 RU2, SAGE, SART-1 또는 SART-3, SCGB3A2, SCP1, SCP2, SCP3, SSX, SURVIVIN, TEL/AML1, TPI/m, TRP-1, TRP-2, TRP-2/INT2, TPTE 및 WT가 있다. 특히 바람직한 종양 항원은 CLAUDIN-18.2(CLDN18.2) 및 CLAUDIN-6(CLDN6)를 포함한다.
본 발명에 따르면, 항원을 전달하기 위한 PEI-제형화된 자기-복제(자기-증폭) RNA를 사용한 면역화에 의해 효율적인 면역 반응이 유도될 수 있는 것으로 관찰되었다. 베네수엘라 말 뇌염 바이러스(VEEV)로부터 유래된 PEI-제형화된 자기-복제 RNA는 막 단백질인 항원을 전달하는 데 특히 효과적이었다.
본 발명에 따르면, 용어 "막 단백질"은 세포막과 관련되거나 세포막에 결합된 단백질과 관련된다. 이러한 단백질은 영구적으로 고정되거나 막의 일부인 내재성 막 단백질 및 지질 이중층 또는 다른 내재성 단백질에 단지 일시적으로 부착된 표재성 막 단백질을 포함한다. 내재성 막 단백질은 막을 가로지르는 막관통 단백질 및 막의 한쪽에만 부착되는 내재성 모노토픽(monotopic) 단백질로 분류된다. 예를 들어, 막 단백질은 다양한 일반적인 유형으로 분류될 수 있다:
1) I형 막 단백질: 이러한 단백질은 성숙 단백질에서 단일 막관통 도메인을 갖는다. N-말단은 세포외에 있고, C-말단은 세포질에 있다. 단백질의 N-말단은 특징적으로 ER로 임포트(import)되도록 단백질을 유도하는 전형적 신호 펩티드 서열을 갖는다. 단백질은 la형(절단 가능한 신호 서열을 함유함) 및 lb형(절단 가능한 신호 서열이 없음)로 세분된다. I형 막 단백질의 예에는 인플루엔자 HA, 인슐린 수용체, 글리코포린, LDL 수용체, 및 바이러스 G 단백질이 포함되지만 이로 제한되지는 않는다.
2) II형 막 단백질: 이러한 단일 막 도메인 단백질의 경우, C-말단은 세포외에 있고, N- 말단은 세포질에 있다. N-말단은 신호 고정 서열을 가질 수있다. 이 단백질 유형의 예에는 인플루엔자 뉴라미니다제, 골지 갈락토실트랜스퍼라제, 골지 시알릴트랜스퍼라제, 수크라제-이소말타제 전구체, 아시알로당단백질 수용체, 및 트랜스페린 수용체가 포함되지만, 이로 제한되지는 않는다.
3) 멀티패스(multipass) 막관통 단백질: I형 및 II형 막 단백질에서, 폴리펩티드는 지질 이중층을 한 번 가로지르는 반면, 멀티패스 막 단백질에서 폴리펩티드는 막을 여러 번 가로지른다. 멀티패스 막관통 단백질은 또한 IIIa형 및 IIIb형으로 세분된다. IIIa형 단백질은 절단 가능한 신호 서열을 갖는다. IIIb형 단백질은 아미노 말단이 막의 외부 표면에 노출되어 있지만, 절단 가능한 신호 서열을 갖지 않는다. IIIa형 단백질은 광반응 중심을 지닌 M 및 L 펩티드를 포함하지만, 이로 제한되지는 않는다. Illb형 단백질은 시토크롬 P450 및 대장균의 리더(leader) 펩티다제를 포함하지만, 이로 제한되지는 않는다. 멀티패스 막관통 단백질의 추가의 예로는 막 수송체, 예컨대 당 수송체(글루코스, 자일로스), 및 이온 수송체이다.
4) 지질 사슬 고정된 막 단백질: 이러한 단백질은 하나 이상의 공유 결합된 지방산 사슬 또는 프레닐기라 불리는 다른 유형의 지질 사슬에 의해 막 이중층과 관련된다.
5) GPI-고정 막 단백질: 이러한 단백질은 글리코실포스파티딜이노시톨(GPI) 앵커에 의해 막에 결합된다.
6) 표재성 막 단백질: 이러한 단백질은 다른 막 단백질과의 비공유적 상호 작용에 의해 막에 간접적으로 결합된다.
본원에 사용되는 바와 같은 용어 "막 단백질"은 인간 또는 비-인간 세포의 세포막 단백질뿐만 아니라 바이러스 외피 단백질을 포함한다. 막 단백질의 구현예는 인플루엔자 바이러스의 표면에서 발견되는 당단백질인 인플루엔자 헤마글루티닌(HA)이다. 이는 막 상에 시알산을 갖는 세포, 예컨대 상기도에 존재하는 세포 또는 적혈구에 바이러스를 결합시키는 역할을 한다. 이는 또한 pH가 감소된 후 바이러스 외피와 엔도솜 막의 융합을 담당한다. 다른 인플루엔자 바이러스 막 단백질은 세포 표면에서 풍부하게 발현되는 M2 단백질, 및 뉴라미니다제(NA)이다.
따라서, 일 양태에서, 본 발명은,
(a) 항원 또는 에피토프를 포함하는 펩티드 또는 단백질을 인코딩하는 단일 가닥의 자기-복제 RNA; 및
(b) 폴리알킬렌이민을 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
추가의 양태에서, 본 발명은, 의약으로 사용하기 위한,
(a) 항원 또는 에피토프를 포함하는 펩티드 또는 단백질을 인코딩하는 단일 가닥의 자기-복제 RNA; 및
(b) 폴리알킬렌이민을 포함하는 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 모든 양태 중 일 구현예에서, 폴리알킬렌이민 내의 질소 원자(N) 수 대 단일 가닥 RNA 내의 인 원자(P) 수의 몰비(N:P 비)는 1.0 내지 30, 바람직하게는 2.0 내지 15.0, 더욱 바람직하게는 6.0 내지 12.0이다.
추가의 양태에서, 본 발명은,
(a) 항원 또는 에피토프를 포함하는 펩티드 또는 단백질을 인코딩하는 단일 가닥의 자기-복제 RNA; 및
(b) 폴리알킬렌이민을 포함하는 조성물에 관한 것으로,
여기서 폴리알킬렌이민 내의 질소 원자(N) 수 대 단일 가닥 RNA 내의 인 원자(P) 수의 몰비(N:P 비)는 1.0 내지 30.0, 바람직하게는 2.0 내지 15.0, 더욱 바람직하게는 6.0 내지 12.0이다.
본 발명의 모든 양태 중 일 구현예에서, 조성물의 이온 강도는 50 mM 이하이고, 바람직하게는 양 하전된 1가 이온의 농도는 25 mM 이하이고 유리 형태의 양 하전된 2가 양이온의 농도는 20 μM 이하이다.
추가의 양태에서, 본 발명은,
(a) 항원 또는 에피토프를 포함하는 펩티드 또는 단백질을 인코딩하는 단일 가닥의 자기-복제 RNA; 및
(b) 폴리알킬렌이민을 포함하는 조성물에 관한 것으로, 여기서 이온 강도는 50 mM 이하이다.
일 구현예에서, 양 하전된 1가 이온의 농도는 25 mM 이하이고, 양 하전된 2가 양이온 이온의 농도는 20 μM 이하이다.
본 발명의 모든 양태 중 일 구현예에서, 단일 가닥의 자기-복제 RNA는 시스-레플리콘이다.
일 구현예에서, 단일 가닥의 자기-복제 RNA는 베네수엘라 말 뇌염 바이러스(VEEV)로부터 유래된다. 일 구현예에서, 단일 가닥의 자기-복제 RNA는 VEEV의 게놈 RNA 또는 이의 약독화된 형태에 상응하거나 본질적으로 상응하며, 여기서 구조 단백질을 인코딩하는 오픈 리딩 프레임은 항원 또는 에피토프를 포함하는 펩티드 또는 단백질을 인코딩하는 오픈 리딩 프레임으로 대체된다. 일 구현예에서, 항원, 또는 항원 또는 에피토프를 포함하는 펩티드 또는 단백질은 바이러스 외피 단백질과 같은 막 단백질이다. 일 구현예에서, 항원은 인플루엔자 헤마글루티닌이다.
일 구현예에서, 단일 가닥의 자기-복제 RNA는 셈리키 포레스트 바이러스(SFV)로부터 유래된다. 일 구현예에서, 단일 가닥의 자기-복제 RNA는 SFV의 게놈 RNA 또는 이의 약독화된 형태에 상응하거나 본질적으로 상응하며, 여기서 구조 단백질을 인코딩하는 오픈 리딩 프레임은 항원 또는 에피토프를 포함하는 펩티드 또는 단백질을 인코딩하는 오픈 리딩 프레임으로 대체된다. 일 구현예에서, 항원, 또는 항원 또는 에피토프를 포함하는 펩티드 또는 단백질은 막 단백질이 아니다. 일 구현예에서, 항원은 바이러스 캡시드 단백질이다.
본 발명의 모든 양태 중 일 구현예에서, 조성물은 근육내 주사와 같은 근육내 투여를 위한 것이다.
본 발명의 모든 양태 중 일 구현예에서, 단일가닥 RNA 및 폴리알킬렌이민은 폴리플렉스 입자에 존재한다.
본 발명의 모든 양태 중 일 구현예에서, 폴리알킬렌이민은 하기 화학식 (I)을 포함한다:
여기서, R은 H, 아실기 또는 하기 화학식 (II)을 포함하는 기이고,
여기서, R1은 H 또는 하기 화학식 (III)을 포함하는 기이고,
상기 식들에서, n, m 및 l은 2 내지 10의 정수로부터 독립적으로 선택되고;
p, q, 및 r은 정수이며, 여기서 p, q, 및 r의 합은 중합체의 평균 분자량이 1.5·102 내지 107 Da, 바람직하게는 5000 내지 105 Da, 더욱 바람직하게는 10000 내지 40000 Da, 더욱 바람직하게는 15000 내지 30000 Da, 더욱더 바람직하게는 20000 내지 25000 Da이 되도록 한다.
일 구현예에서, n, m, 및 l은 독립적으로 2, 3, 4, 및 5, 바람직하게는 2 및 3으로부터 선택된다. 일 구현예에서, R1은 H이다. 일 구현예에서, R은 H 또는 아실기이다.
본 발명의 모든 양태 중 일 구현예에서, 폴리알킬렌이민은 폴리에틸렌이민 및/또는 폴리프로필렌이민, 바람직하게는 폴리에틸렌이민을 포함한다.
본 발명의 모든 양태 중 일 구현예에서, 폴리알킬렌이민에서 N 원자의 적어도 92%는 양성자화 가능하다.
본 발명의 모든 양태 중 일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 하나 이상의 첨가제를 포함한다. 일 구현예에서, 하나 이상의 첨가제는 완충 물질, 당류, 안정화제, 동결보호제, 동결건조보호제, 및 킬레이트제로 이루어진 군으로부터 선택된다. 본 발명의 모든 양태 중 일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 하나 이상의 중합체를 포함한다. 일 구현예에서, 완충 물질은 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄설폰산(HEPES), 2-(N-모폴리노)에탄설폰산(MES), 3-모폴리노-2-하이드록시프로판설폰산(MOPSO), 아세트산 완충 시스템 및 유사체, 인산 완충 시스템, 또는 시트르산 완충 시스템으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나를 포함한다. 본 발명의 모든 양태 중 일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 4 내지 6.5, 3 내지 5, 또는 3,5 내지 4.5의 pH 범위에서의 완충을 위한 완충액을 포함한다. 그러한 완충 시스템의 예로는 아세테이트 완충액 또는 HEPES 완충액 또는 포스페이트 완충액 또는 아세트산 완충액이 있다. 일 구현예에서, 당류는 단당류, 이당류, 삼당류, 올리고당류, 및 다당류로 이루어진 군, 바람직하게는 글루코스, 트레할로스, 사카로스 및 덱스트란으로부터 선택된 적어도 하나를 포함한다. 일 구현예에서, 첨가제는 1 kDa 내지 100 kDa의 평균 몰질량을 갖는 덱스트란이다. 일 구현예에서, 동결보호제는 글리콜, 예컨대 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 및 글리세롤로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나를 포함한다. 일 구현예에서, 킬레이트제는 EDTA를 포함한다. 일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 에틸렌 옥사이드 및 프로필렌 옥사이드 빌딩 블록을 포함하는 하나 이상의 블록 공중합체를 포함한다. 일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 에틸렌 디아민기를 포함하는 공중합체를 포함한다. 일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 양친성 블록 공중합체를 포함하고, 이 공중합체는 바람직하게는 에틸렌 산화물 및 프로필렌 산화물 빌딩 블록을 포함하고, 선택적으로 에틸렌 디아민기를 또한 포함한다.
본 발명의 모든 양태 중 일 구현예에서, 조성물은 HEPES 완충된 글루코스(HBG 또는 HBGx1), MES-완충 글루코스(MBG 또는 MBGx1), 아세테이트 완충된 글루코스 또는 HEPES 완충된 트레할로스(HBT 또는 HBTx1)를 포함한다. 본 발명의 모든 양태 중 일 구현예에서, 조성물은 0.1 mM 내지 10 mM 범위의 농도를 갖는 아세트산 완충액 중에 글루코스 또는 트레할로스 또는 사카로스를 포함한다. 본 발명의 모든 양태 중 일 구현예에서, 조성물은 0.1 mM 내지 10 mM 범위의 농도를 갖는 포스페이트 완충액 중에 글루코스 또는 트레할로스 또는 사카로스를 포함한다.
본 발명의 모든 양태 중 일 구현예에서, 입자의 z-평균 크기는 200 nm 미만, 바람직하게는 150 nm 미만, 더욱 바람직하게는 100 nm 미만이다. 일 구현예에서, 입자의 z-평균 크기는 50 nm 내지 200 nm이다. 본 발명의 모든 양태 중 일 구현예에서, 입자의 제타-전위는 20 mV 이상, 바람직하게는 25 내지 40 mV이다. 본 발명의 모든 양태 중 일 구현예에서, 입자의 전기영동 이동도(μ)는 1 내지 1.6 μm*cm/V*S이다. 본 발명의 모든 양태 중 일 구현예에서, 입자의 z-평균 크기 및/또는 제타-전위 및/또는 전기영동 이동도는 폴리플렉스 입자 및 HEPES 완충된 글루코스(HBG) 또는 HEPES 완충된 트레할로스(HBT)를 포함하는 현탁액에서 결정된다. 일 구현예에서, HBG는 5% 글루코스(w/v) 및 10 mM HEPES, pH 7.1을 포함하거나, HBT는 10% 트레할로스(w/v) 및 10 mM HEPES, pH 7.1을 포함한다. 일 구현예에서, 입자의 z-평균 크기는 동적 광산란 및 누적 알고리즘에 의한 데이터 분석에 의해 결정된다. 일 구현예에서, 병진 확산 계수는 동적 광산란에 의해 측정된다. 이어서, Z-평균을 계산하기 위해 Stock-Einstein 방정식이 사용된다. 일 구현예에서, 전기영동 이동도는 레이저-도플러 전기영동에 의해 측정된다. 이어서, 제타-전위를 계산하기 위해 Henry 방정식 또는 Smoluchowski 방정식이 사용된다.
일 구현예에서, MBG는 5% 글루코스(w/v) 및 10 mM MES를 포함한다. 일 구현예에서, 아세테이트 완충된 글루코스는 5% 글루코스(w/v) 및 10 mM 아세테이트를 포함한다.
본 발명의 모든 양태 중 일 구현예에서, 입자는, 바람직하게는 생리적 pH 또는 4.5 내지 7.5의 pH에서, 중성이거나 양 하전된다.
본 발명의 모든 양태 중 일 구현예에서, 단일 가닥 RNA는 6000개 내지 15000개 염기, 바람직하게는 9000개 내지 12000개 염기로 이루어진 분자이다.
본 발명의 모든 양태 중 일 구현예에서, 본원에 기재된 조성물은 치료에 사용하기 위한 것이다. 본 발명의 모든 양태 중 일 구현예에서, 본원에 기재된 조성물은 백신 조성물이다.
추가의 양태에서, 본 발명은 면역 반응을 유도하기 위한 본원에 기재된 조성물에 관한 것이다. 일 구현예에서, 조성물은 근육내 투여에 의해 투여된다. 일 구현예에서, 면역 반응은 항원 또는 에피토프에 대해 유도된다.
추가의 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 면역 반응을 유도하는 방법에 관한 것이다. 일 구현예에서, 조성물은 근육내 투여에 의해 투여된다. 일 구현예에서, 면역 반응은 항원 또는 에피토프에 대해 유도된다.
일부 구현예에서, 약학적 활성 펩티드 또는 단백질은 면역 반응을 유도하는 항원일 필요는 없다. 적합한 약학적 활성 단백질 또는 펩티드는 사이토카인 및 면역계 단백질, 예컨대 면역학적 활성 화합물(예를 들어, 인터류킨, 콜로니 자극 인자(CSF), 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF), 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 에리트로포이에틴, 종양 괴사 인자(TNF), 인터페론, 인테그린, 어드레신(addressin), 셀레틴(seletin), 호우밍(homing) 수용체, T 세포 수용체, 면역글로불린), 호르몬(인슐린, 갑상선 호르몬, 카테콜아민, 성선자극호르몬, 자극 호르몬(trophic hormone), 프로락틴, 옥시토신, 도파민, 소 소마토트로핀(bovine somatotropin), 및 렙틴 등), 성장 호르몬(예를 들어, 인간 성장 호르몬), 성장 인자(예를 들어, 표피 성장 인자, 신경 성장 인자, 및 인슐린-유사 성장 인자 등), 성장 인자 수용체, 효소(조직 플라스미노겐 활성제, 스트렙토키나제, 콜레스테롤 생합성 또는 분해, 스테로이드 생성 효소, 키나제, 포스포디에스테라제, 메틸라제, 데-메틸라제, 데하이드로게나제, 셀룰라아제, 프로테아제, 리파제, 포스포리파제, 아로마타제, 시토크롬, 아데닐레이트 또는 구아닐레이트 시클라제 및 뉴라미다제 등), 수용체(스테로이드 호르몬 수용체, 펩티드 수용체), 결합 단백질(성장 호르몬 또는 성장 인자 결합 단백질 등), 전사 및 번역 인자, 종양 성장 억제 단백질(예를 들어, 혈관생성을 억제하는 단백질), 구조 단백질(예컨대 콜라겐, 피브로인, 피브리노겐, 엘라스틴, 튜불린, 액틴, 및 미오신), 혈액 단백질(트롬빈, 혈청 알부민, 인자 VII, 인자 VIII, 인슐린, 인자 IX, 인자 X, 조직 플라스미노겐 활성제, 단백질 C, 폰빌레브란트 인자, 항트롬빈 III, 글루코세레브로시다제, 에리트로포이에틴, 과립구 콜로니 자극 인자(GCSF) 또는 변형된 인자 VIII, 항응고제 등)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명에 따른 약학적 활성 단백질은 림프 항상성의 조절에 관여하는 사이토카인, 바람직하게는 T 세포의 발달, 프라이밍(priming), 확장, 분화 및/또는 생존에 관여하고 바람직하게는 이를 유도하거나 향상시키는 사이토카인이다. 일 구현예에서, 사이토카인은 인터류킨, 예를 들어 IL-2, IL-7, IL-12, IL-15, 또는 IL-21이다.
오픈 리딩 프레임에 의해 인코딩된 추가의 적합한 관심 단백질은 인터페론(IFN) 신호전달 억제제이다. 발현을 위해 RNA가 도입된 세포의 생존율이 감소될 수 있다고 보고되었지만, 특히 세포가 RNA로 여러 번 트랜스펙션된 경우, IFN 억제제는 RNA가 발현되어야 하는 세포의 생존율을 향상시키는 것으로 밝혀졌다(WO 2014/071963 A1). 바람직하게는, 억제제는 IFN 타입 I 신호전달 억제제이다. 세포외 IFN에 의한 IFN 수용체의 결합을 방지하고 세포에서 세포내 IFN 신호전달을 억제하면 세포에서 RNA의 안정한 발현을 가능하게 한다. 대안적으로 또는 추가로, 세포외 IFN에 의한 IFN 수용체의 결합을 방지하고 세포내 IFN 신호전달을 억제하면, 특히, 세포가 RNA로 반복적으로 트랜스펙션되는 경우, 세포의 생존을 향상시킨다. 이론에 구속시키고자 함이 없이, 세포내 IFN 신호전달은 번역의 억제 및/또는 RNA 분해를 가져올 수 있는 것으로 생각된다. 이는 하나 이상의 IFN-유도성 항바이러스 활성 이펙터 단백질을 억제함으로써 해결될 수 있다. IFN-유도성 항바이러스 활성 이펙터 단백질은 RNA-의존성 단백질 키나아제(PKR), 2',5'-올리고아데닐레이트 합성효소(OAS) 및 RNaseL로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 세포내 IFN 신호전달을 억제하는 것은 PKR-의존성 경로 및/또는 OAS-의존성 경로를 억제하는 것을 포함할 수 있다. 적합한 관심 단백질은 PKR-의존성 경로 및/또는 OAS-의존성 경로를 억제할 수 있는 단백질이다. PKR-의존성 경로를 억제하는 것은 eIF2-알파 인산화를 억제하는 것을 포함할 수 있다. PKR을 억제하는 것은 세포를 적어도 하나의 PKR 억제제로 처리하는 것을 포함할 수 있다. PKR 억제제는 PKR의 바이러스 억제제일 수 있다. PKR의 바람직한 바이러스 억제제는 백시니아 바이러스 E3이다. 펩티드 또는 단백질(예컨대 E3, K3)이 세포내 IFN 신호전달을 억제하는 것인 경우, 펩티드 또는 단백질의 세포내 발현이 바람직하다. 백시니아 바이러스 E3는 PKR과 OAS의 활성화를 방지하기 위해 dsRNA와 결합하여 이를 격리하는 25 kDa dsRNA-결합 단백질(유전자 E3L에 의해 인코딩됨)이다. E3는 PKR에 직접 결합하여 이의 활성을 억제하며, 이는 eIF2-알파의 감소된 인산화를 가져온다. IFN 신호전달의 다른 적합한 억제제는 단순 포진 바이러스 ICP34.5, 토스카나 바이러스 NSs, 봄빅스 모리(Bombyx mori) 뉴클레오폴리헤데로바이러스(nucleopolyhedrovirus) PK2 및 HCV NS34A이다.
일 구현예에서, 세포내 또는 세포외 IFN 신호전달 억제제는 레플리콘에 의해 인코딩된다. 레플리콘은 알파바이러스 레플리카제에 의한 복제를 가능하게 하는 핵산 서열 요소, 전형적으로 CSE 1, CSE 2 및 CSE 4; 및 바람직하게는 또한, 전형적으로 CSE 3을 포함하는, 서브게놈 전사체, 즉, 서브게놈 프로모터의 생성을 가능하게 하는 핵산 서열 요소를 포함한다. 레플리콘은 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 비-폴리펩티드-서열 개질 변형, 예를 들어 캡, 폴리(A) 서열, 코돈 사용의 적응을 추가로 포함할 수 있다. 다수의 오픈 리딩 프레임이 레플리콘 상에 존재하는 경우, 세포내 IFN 신호전달 억제제는 선택적으로 서브게놈 프로모터의 제어를 받거나 받지 않으며 이들 중 어느 하나에 의해 인코딩될 수 있다. 바람직한 일 구현예에서, 세포내 IFN 신호전달 억제제는 RNA 레플리콘의 가장 업스트림에 있는 오픈 리딩 프레임에 의해 인코딩된다. 세포내 IFN 신호전달 억제제가 RNA 레플리콘의 가장 업스트림에 있는 오픈 리딩 프레임에 의해 인코딩될 때, 세포내 IFN 신호전달 억제제를 인코딩하는 유전 정보는 숙주 세포 내로의 RNA 레플리콘의 도입 후 초기에 번역될 것이고, 생성된 단백질은 후속하여 세포내 IFN 신호전달을 억제할 수 있다.
오픈 리딩 프레임에 의해 인코딩된 추가의 적합한 단백질은 기능성 알파바이러스 비-구조 단백질이다. "알파바이러스 비-구조 단백질"이란 용어는 알파바이러스 비-구조 단백질의 탄수화물-변형된(예컨대 글리코실화된) 형태 및 지질-변형된 형태를 비롯한 각각의 모든 번역과 동시에 또는 번역후 변형된 형태를 포함한다.
일부 구현예에서, 용어 "알파바이러스 비-구조 단백질"은 알파바이러스 기원의 개별적인 비-구조 단백질(nsP1, nsP2, nsP3, nsP4) 중 임의의 하나 이상을 지칭하거나, 알파바이러스 기원의 하나 초과의 비-구조 단백질의 폴리펩티드 서열을 포함하는 폴리-프로테인을 지칭한다. 일부 구현예에서, "알파바이러스 비-구조 단백질"은 nsP123 및/또는 nsP4를 지칭한다. 다른 구현예에서, "알파바이러스 비-구조 단백질"은 nsP1234를 지칭한다. 일 구현예에서, 오픈 리딩 프레임에 의해 인코딩된 관심 단백질은, 선택적으로 절단 가능한, 하나의 단일 폴리-프로테인인 nsP1234로서 nsP1, nsP2, nsP3 및 nsP4 모두로 이루어진다. 일 구현예에서, 오픈 리딩 프레임에 의해 인코딩된 관심 단백질은, 선택적으로 절단 가능한, 하나의 단일 폴리-프로테인인 nsP123으로서 nsP1, nsP2 및 nsP3로 이루어진다. 그 구현예에서, nsP4는 추가의 관심 단백질일 수 있으며, 추가의 오픈 리딩 프레임에 의해 인코딩될 수 있다.
일부 구현예에서, 알파바이러스 비-구조 단백질은, 예를 들어 숙주 세포에서 복합체 또는 회합체를 형성할 수 있다. 일부 구현예에 있어서, "알파바이러스 비-구조 단백질"은 nsP123(P123와 동의어임) 및 nsP4의 복합체 또는 회합체를 지칭한다. 일부 구현예에서, "알파바이러스 비-구조 단백질"은 nsP1, nsP2 및 nsP3의 복합체 또는 회합체를 지칭한다. 일부 구현예에서, "알파바이러스 비-구조 단백질"은 nsP1, nsP2, nsP3 및 nsP4의 복합체 또는 회합체를 지칭한다. 일부 구현예에서, "알파바이러스 비-구조 단백질"은 nsP1, nsP2, nsP3 및 nsP4로 이루어진 군에서 선택된 임의의 하나 이상의 복합체 또는 회합체를 지칭한다. 일부 구현예에서, 알파바이러스 비-구조 단백질은 적어도 nsP4를 포함한다.
용어 "복합체" 또는 "회합체"는 공간적으로 근접한 2개 이상의 동일하거나 상이한 단백질 분자를 지칭한다. 복합체의 단백질들은 바람직하게는 서로 직접 또는 간접적인 물리적 또는 물리화학적 접촉을 이룬다. 복합체 또는 회합체는 다수의 상이한 단백질(이종다합체(heteromultimer)) 및/또는 다수의 카피의 하나의 특정 단백질(동종다합체(homomultimer))로 이루어질 수 있다. 알파바이러스 비-구조 단백질과 관련하여, 용어 "복합체 또는 회합체"는 다수의 적어도 2개의 단백질 분자를 나타내며, 그 중 적어도 하나는 알파바이러스 비-구조 단백질이다. 복합체 또는 회합체는 다수의 카피의 하나의 특정 단백질(동종다합체) 및/또는 다수의 상이한 단백질(이종다합체)로 이루어질 수 있다. 다합체와 관련하여, "다(multi)"는 1개 초과, 예컨대 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 또는 10개 초과를 의미한다.
"기능성 알파바이러스 비-구조 단백질"이란 용어는 레플리카제 기능을 갖는 알파바이러스 비-구조 단백질을 포함한다. 따라서, "기능성 알파바이러스 비-구조 단백질"은 알파바이러스 레플리카제를 포함한다. "레플리카제 기능"은 RNA-의존성 RNA 중합효소(RdRP), 즉, (+) 가닥 RNA 주형에 기초하여 (-) 가닥 RNA의 합성을 촉매할 수 있고/있거나 (-) 가닥 RNA 주형에 기초하여 (+) 가닥 RNA의 합성을 촉매할 수 있는 효소를 포함한다. 따라서, "기능성 알파바이러스 비-구조 단백질"이라는 용어는 (+) 가닥(예를 들어, 게놈) RNA를 주형으로 사용하여 (-) 가닥 RNA를 합성하는 단백질 또는 복합체, 게놈 RNA의 (-) 가닥 상보체를 주형으로 사용하여 새로운 (+) 가닥 RNA를 합성하는 단백질 또는 복합체, 및/또는 게놈 RNA의 (-) 가닥 상보체의 단편을 주형으로 사용하여 서브게놈 전사체를 합성하는 단백질 또는 복합체를 지칭할 수 있다. 기능성 알파바이러스 비-구조 단백질은 하나 이상의 추가 기능, 예를 들어, 프로테아제(자가-절단을 위한 것), 헬리카제, 말단 아데닐릴트랜스퍼라제(폴리(A) 테일 추가를 위한 것), 메틸트랜스퍼라제 및 구아닐릴트랜스퍼라제(5'-캡을 핵산에 제공하기 위한 것), 핵 국재화 부위(nuclear localization site), 트리포스파타제와 같은 하나 이상의 추가 기능을 추가로 가질 수 있다(문헌[Gould et al., 2010, Antiviral Res., vol. 87 pp. 111-124]; 문헌[Rupp et al., 2015, J. Gen. Virol., vol. 96, pp. 2483-500]).
본 발명에 따르면, 용어 "알파바이러스 레플리카제"는, 자연 발생적 알파바이러스(자연계에서 발견되는 알파바이러스)로부터의 RNA-의존성 RNA 중합효소 및 알파바이러스의 변이체 또는 유도체, 예컨대 약독화된 알파바이러스로부터의 RNA-의존성 RNA 중합효소를 포함한, 알파바이러스 RNA-의존성 RNA 중합효소를 지칭한다. 본 발명의 맥락에서, 용어 "레플리카제" 및 "알파바이러스 레플리카제"는 임의의 특정 레플리카제가 알파바이러스 레플리카제가 아니라고 문맥이 지시하지 않는 한 상호 교환적으로 사용된다.
"레플리카제"라는 용어는 알파바이러스-감염된 세포에 의해 발현되거나 알파바이러스 레플리카제를 코딩하는 핵산으로 트랜스펙션된 세포에 의해 발현되는 알파바이러스 레플리카제의 모든 변이체, 특히 번역후 변형된 변이체, 입체형태, 아이소형 및 동족체를 포함한다. 또한, 용어 "레플리카제"는 재조합 방법에 의해 생성된 및 생성될 수 있는 모든 형태의 레플리카제를 포함한다. 예를 들어, 실험실에서 레플리카제의 검출 및/또는 정제를 용이하게 하는 태그, 예를 들어 myc-태그, HA-태그 또는 올리고히스티딘 태그(His-태그)를 포함하는 레플리카제는 재조합 방법에 의해 생성될 수 있다.
선택적으로, 알파바이러스 레플리카제는 알파바이러스 보존된 서열 요소 1(CSE 1) 또는 이의 상보적 서열, 보존된 서열 요소 2(CSE 2) 또는 이의 상보적 서열, 보존된 서열 요소 3(CSE 3) 또는 이의 상보적 서열, 보존된 서열 요소 4(CSE 4) 또는 이의 상보적 서열 중 임의의 하나 이상에 결합하는 능력에 의해 추가로 기능적으로 정의된다. 바람직하게는, 레플리카제는 CSE 2[즉, (+) 가닥] 및/또는 CSE 4[즉, (+) 가닥]에 결합할 수 있거나, CSE 1의 상보체[즉, (-) 가닥] 및/또는 CSE 3의 상보체[즉, (-) 가닥]에 결합할 수 있다.
레플리카제의 기원은 임의의 특정 알파바이러스로 제한되지 않는다. 바람직한 일 구현예에서, 알파바이러스 레플리카제는, 자연 발생적 셈리키 포레스트 바이러스 및 셈리키 포레스트 바이러스의 변이체 또는 유도체, 예컨대 약독화된 셈리키 포레스트 바이러스를 포함한, 셈리키 포레스트 바이러스로부터의 비-구조 단백질을 포함한다. 대안적인 바람직한 구현예에서, 알파바이러스 레플리카제는, 자연 발생적 신드비스 바이러스 및 신드비스 바이러스의 변이체 또는 유도체, 예컨대 약독화된 신드비스 바이러스를 포함한, 신드비스 바이러스로부터의 비-구조 단백질을 포함한다. 대안적인 바람직한 구현예에서, 알파바이러스 레플리카제는, 자연 발생적 베네수엘라 말 뇌염 바이러스(VEEV) 및 VEEV의 변이체 또는 유도체, 예컨대 약독화된 VEEV를 포함한, VEEV로부터의 비-구조 단백질을 포함한다. 대안적인 바람직한 구현예에서, 알파바이러스 레플리카제는, 자연 발생적 치쿤구니야 바이러스(CHIKV) 및 CHIKV의 변이체 또는 유도체, 예컨대 약독화된 CHIKV를 포함한, CHIKV로부터의 비-구조 단백질을 포함한다.
레플리카제는 하나 초과의 알파바이러스의 비-구조 단백질을 또한 포함할 수 있다. 따라서, 알파바이러스 비-구조 단백질을 포함하고 레플리카제 기능을 갖는 이종 복합체 또는 회합체는 동일하게 본 발명에 포함된다. 단지 예시 목적으로, 레플리카제는 제1 알파바이러스로부터의 하나 이상의 비-구조 단백질(예를 들어, nsP1, nsP2), 및 제2 알파바이러스로부터의 하나 이상의 비-구조 단백질(nsP3, nsP4)을 포함할 수 있다. 하나 초과의 상이한 알파바이러스로부터의 비-구조 단백질은 별도의 오픈 리딩 프레임에 의해 인코딩될 수 있거나, 폴리-프로테인, 예를 들어 nsP1234로서 단일 오픈 리딩 프레임에 의해 인코딩될 수 있다.
일부 구현예에서, 기능성 알파바이러스 비-구조 단백질은 기능성 알파바이러스 비-구조 단백질이 발현되는 세포에서 막성 복제 복합체 및/또는 액포를 형성할 수 있다.
기능성 알파바이러스 비-구조 단백질, 즉, 레플리카제 기능을 갖는 알파바이러스 비-구조 단백질이 본 발명에 따른 핵산 분자에 의해 인코딩된 경우, 레플리콘의 서브게놈 프로모터는, 존재하는 경우, 상기 레플리카제와 상용 가능한 것이 바람직하다. 이러한 맥락에서 상용 가능한이란, 알파바이러스 레플리카제가 존재하는 경우 서브게놈 프로모터를 인식할 수 있다는 것을 의미한다. 일 구현예에서, 이는 서브게놈 프로모터가 레플리카제가 유래된 알파바이러스에 고유한 것인 경우, 즉, 이들 서열의 자연적 기원이 동일한 알파바이러스인 경우에 달성된다. 대안적인 구현예에서, 알파바이러스 레플리카제가 서브게놈 프로모터를 인식할 수 있는 경우, 서브게놈 프로모터는 알파바이러스 레플리카제가 유래되는 알파바이러스에 고유한 것이 아니다. 바꿔 말하면, 레플리카제는 서브게놈 프로모터와 상용 가능하다(크로스-바이러스 상용성). 다양한 알파바이러스로부터 유래하는 서브게놈 프로모터 및 레플리카제에 관한 크로스-바이러스 상용성의 예는 당업계에 알려져 있다. 크로스-바이러스 상용성이 존재하는 한 서브게놈 프로모터와 레플리카제의 임의의 조합이 가능하다. 크로스-바이러스 상용성은, 서브게놈 프로모터로부터의 RNA 합성에 적합한 조건에서 시험하려는 레플리카제를 RNA와 함께 인큐베이팅함으로써 본 발명을 실시하는 당업자에 의해 용이하게 시험될 수 있고, 여기서 RNA는 시험하려는 서브게놈 프로모터를 갖는다. 서브게놈 전사체가 제조되는 경우, 서브게놈 프로모터와 레플리카제는 상용 가능한 것으로 결정된다. 크로스-바이러스 상용성의 다양한 예가 알려져 있다(문헌[Strauss & Strauss, Microbiol. Rev., 1994, vol. 58, pp. 491-562]에서 검토됨).
본 발명에서, 기능성 알파바이러스 비-구조 단백질을 인코딩하는 오픈 리딩 프레임은 RNA 레플리콘 상에 제공될 수 있거나, 대안적으로, 별도의 핵산 분자, 예를 들어 mRNA 분자로서 제공될 수 있다. 별도의 mRNA 분자는 선택적으로, 예를 들어 캡, 5'-UTR, 3'-UTR, 폴리(A) 서열, 및/또는 코돈 사용의 적응을 포함한다. 별도의 mRNA 분자는 본원에 기재된 바와 같이 트랜스로 제공될 수 있다.
기능성 알파바이러스 비-구조 단백질을 인코딩하는 오픈 리딩 프레임이 RNA 레플리콘 상에 제공될 때, 레플리콘은 바람직하게는 기능성 알파바이러스 비-구조 단백질에 의해 복제될 수 있다. 특히, 기능성 알파바이러스 비-구조 단백질을 인코딩하는 RNA 레플리콘은 레플리콘에 의해 인코딩된 기능성 알파바이러스 비-구조 단백질에 의해 복제될 수 있다. 이 구현예는 기능성 알파바이러스 비-구조 단백질을 인코딩하는 핵산 분자가 트랜스로 제공되지 않을 때 매우 바람직하다. 이 구현예에서, 레플리콘의 시스-복제를 목표로 한다. 바람직한 구현예에서, RNA 레플리콘은 기능성 알파바이러스 비-구조 단백질을 인코딩하는 오픈 리딩 프레임뿐만 아니라 관심 단백질을 인코딩하는 적어도 하나의 추가의 오픈 리딩 프레임을 포함하고, 기능성 알파바이러스 비-구조 단백질에 의해 복제될 수 있다.
다수의 오픈 리딩 프레임이 레플리콘 상에 존재하는 경우, 기능성 알파바이러스 비-구조 단백질은, 선택적으로 서브게놈 프로모터의 제어를 받거나 받지 않으며, 바람직하게는 서브게놈 프로모터의 제어를 받지 않으며, 이들 중 어느 하나에 의해 인코딩될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 기능성 알파바이러스 비-구조 단백질은 RNA 레플리콘의 가장 업스트림에 있는 오픈 리딩 프레임에 의해 인코딩된다. 기능성 알파바이러스 비-구조 단백질이 RNA 레플리콘의 가장 업스트림에 있는 오픈 리딩 프레임에 의해 인코딩될 때, 기능성 알파바이러스 비-구조 단백질을 인코딩하는 유전 정보는 숙주 세포 내로의 RNA 레플리콘의 도입 후 초기에 번역될 것이고, 생성된 단백질은 후속하여 숙주 세포에서 서브게놈 전사체의 복제 및 선택적으로 생성을 유도할 수 있다.
레플리콘에 포함되거나 트랜스로 제공되는 별도의 핵산 분자에 포함되는 기능성 알파바이러스 비-구조 단백질을 인코딩하는 오픈 리딩 프레임의 존재는, 레플리콘이 복제될 수 있게 하고, 결과적으로, 레플리콘에 의해 인코딩된 관심 유전자가, 선택적으로 서브게놈 프로모터의 제어를 받으며 높은 수준으로 발현되게 할 수 있다.
RNA 레플리콘은, 선택적으로 서브게놈 프로모터의 제어를 받는, 관심 펩티드 또는 관심 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 유전자의 발현에 적합하다. 다양한 구현예가 가능하다. 관심 펩티드 또는 관심 단백질을 각각 인코딩하는 하나 이상의 오픈 리딩 프레임이 RNA 레플리콘 상에 존재할 수 있다. RNA 레플리콘의 가장 업스트림에 있는 오픈 리딩 프레임은 "제1 오픈 리딩 프레임"으로 지칭된다. 일부 구현예에서, "제1 오픈 리딩 프레임"은 RNA 레플리콘의 유일한 오픈 리딩 프레임이다. 선택적으로, 하나 이상의 추가의 오픈 리딩 프레임이 제1 오픈 리딩 프레임의 다운스트림에 존재할 수 있다. 제1 오픈 리딩 프레임의 다운스트림에 있는 하나 이상의 추가의 오픈 리딩 프레임은, 제1 오픈 리딩 프레임의 다운스트림에 존재하는 순서(5'에서 3')로, "제2 오픈 리딩 프레임", "제3 오픈 리딩 프레임" 등으로 지칭될 수 있다. 바람직하게는, 각각의 오픈 리딩 프레임은 시작 코돈(염기 트리플릿(triplet), 전형적으로 (각각의 DNA 분자 내의) ATG에 상응하는 (RNA 분자 내의) AUG를 포함한다.
레플리콘이 3' 복제 인식 서열을 포함하는 경우, 모든 오픈 리딩 프레임이 3' 복제 인식 서열의 업스트림에 위치하는 것이 바람직하다.
하나 이상의 오픈 리딩 프레임을 포함하는 RNA 레플리콘이 숙주 세포 내로 도입될 때, 레플리콘은 제1 오픈 리딩 프레임의 번역을 위한 주형으로서 직접 작용할 수 있다. 바람직하게는, 레플리콘은 5'-캡을 포함한다. 이는 레플리콘으로부터 직접 제1 오픈 리딩 프레임에 의해 인코딩되는 유전자의 발현에 도움이 된다.
일부 구현예에서, 레플리콘의 적어도 하나의 오픈 리딩 프레임은 서브게놈 프로모터, 바람직하게는 알파바이러스 서브게놈 프로모터의 제어를 받는다. 알파바이러스 서브게놈 프로모터는 매우 효율적이며, 그에 따라 높은 수준의 이종 유전자 발현에 적합하다. 바람직하게는, 서브게놈 프로모터는 알파바이러스의 서브게놈 전사체에 대한 프로모터이다. 이는 서브게놈 프로모터가 알파바이러스에 고유하며 바람직하게는 상기 알파바이러스에서 하나 이상의 구조 단백질을 인코딩하는 오픈 리딩 프레임의 전사를 제어하는 것임을 의미한다. 대안적으로, 서브게놈 프로모터는 알파바이러스의 서브게놈 프로모터의 변이체이고; 숙주 세포에서 서브게놈 RNA 전사를 위한 프로모터로서 기능하는 임의의 변이체가 적합하다. 레플리콘이 서브게놈 프로모터를 포함하는 경우, 레플리콘은 보존된 서열 요소 3(CSE 3) 또는 이의 변이체를 포함하는 것이 바람직하다.
바람직하게는, 서브게놈 프로모터의 제어를 받는 적어도 하나의 오픈 리딩 프레임은 서브게놈 프로모터의 다운스트림에 위치한다. 바람직하게는, 서브게놈 프로모터는 오픈 리딩 프레임의 전사체를 포함하는 서브게놈 RNA의 생성을 제어한다.
일부 구현예에서, 제1 오픈 리딩 프레임은 서브게놈 프로모터의 제어를 받는다. 제1 오픈 리딩 프레임이 서브게놈 프로모터의 제어를 받을 때, 그 위치는 알파바이러스의 게놈에서 구조 단백질을 인코딩하는 오픈 리딩 프레임의 위치와 유사하다. 제1 오픈 리딩 프레임이 서브게놈 프로모터의 제어를 받을 때, 제1 오픈 리딩 프레임에 의해 인코딩된 유전자는 레플리콘뿐만 아니라 이의 서브게놈 전사체로부터 발현될 수 있는 것이 바람직하다(후자는 기능성 알파바이러스 비-구조 단백질의 존재 하에 이루어짐). 각각 서브게놈 프로모터의 제어를 받는 하나 이상의 추가의 오픈 리딩 프레임은 서브게놈 프로모터의 제어를 받는 제1 오픈 리딩 프레임의 다운스트림에 존재할 수 있다. 하나 이상의 추가의 오픈 리딩 프레임, 예를 들어 제2 오픈 리딩 프레임에 의해 인코딩된 유전자는, 각각 서브게놈 프로모터의 제어를 받는 하나 이상의 서브게놈 전사체로부터 번역될 수 있다. 예를 들어, RNA 레플리콘은 관심 제2 단백질을 인코딩하는 전사체의 생성을 제어하는 서브게놈 프로모터를 포함할 수 있다.
다른 구현예에서, 제1 오픈 리딩 프레임은 서브게놈 프로모터의 제어를 받지 않는다. 제1 오픈 리딩 프레임이 서브게놈 프로모터의 제어를 받지 않을 때, 제1 오픈 리딩 프레임에 의해 인코딩된 유전자는 레플리콘으로부터 발현될 수 있다. 각각 서브게놈 프로모터의 제어를 받는 하나 이상의 추가의 오픈 리딩 프레임은 제1 오픈 리딩 프레임의 다운스트림에 존재할 수 있다. 하나 이상의 추가의 오픈 리딩 프레임에 의해 인코딩된 유전자는 서브게놈 전사체로부터 발현될 수 있다.
본 발명에 따른 레플리콘을 포함하는 세포에서, 레플리콘은 기능성 알파바이러스 비-구조 단백질에 의해 증폭될 수 있다. 또한, 레플리콘이 서브게놈 프로모터의 제어를 받는 하나 이상의 오픈 리딩 프레임을 포함하는 경우, 하나 이상의 서브게놈 전사체는 기능성 알파바이러스 비-구조 단백질에 의해 제조될 것으로 예상된다. 기능성 알파바이러스 비-구조 단백질은 트랜스로 제공되거나, 레플리콘의 오픈 리딩 프레임에 의해 인코딩될 수 있다.
레플리콘이 관심 단백질을 인코딩하는 하나 초과의 오픈 리딩 프레임을 포함하는 경우, 각각의 오픈 리딩 프레임은 상이한 단백질, 예를 들어 상이한 약학적 활성 펩티드 또는 단백질을 인코딩하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 제2 오픈 리딩 프레임에 의해 인코딩된 단백질은 제1 오픈 리딩 프레임에 의해 인코딩된 단백질과 상이하다.
일부 구현예에서, 제1 및/또는 추가의 오픈 리딩 프레임, 바람직하게는 제1 오픈 리딩 프레임에 의해 인코딩된 관심 단백질은 기능성 알파바이러스 비-구조 단백질 또는 IFN 신호전달 억제제, 예를 들어 E3이다. 일부 구현예에서, 제1 및/또는 추가의 오픈 리딩 프레임, 예를 들어 제2 오픈 리딩 프레임에 의해 인코딩된 관심 단백질은 약학적 활성 펩티드 또는 단백질, 또는 리포터 단백질이다.
일 구현예에서, 제1 오픈 리딩 프레임에 의해 인코딩된 관심 단백질은 기능성 알파바이러스 비-구조 단백질이다. 그 구현예에서, 레플리콘은 바람직하게는 5'-캡을 포함한다. 특히, 제1 오픈 리딩 프레임에 의해 인코딩된 관심 단백질이 기능성 알파바이러스 비-구조 단백질일 때, 그리고 바람직하게는 레플리콘이 5'-캡을 포함할 때, 기능성 알파바이러스 비-구조 단백질을 인코딩하는 핵산 서열은 레플리콘으로부터 효율적으로 번역될 수 있고, 생성된 단백질은 후속하여 레플리콘의 복제를 유도하고 서브게놈 전사체(들)의 합성을 유도할 수 있다. 이 구현예는 기능성 알파바이러스 비-구조 단백질을 인코딩하는 추가적인 핵산 분자가 레플리콘과 함께 사용되지 않거나 존재하지 않을 때 바람직할 수 있다. 이 구현예에서, 레플리콘의 시스-복제를 목표로 한다.
본원에 기재된 조성물은 본원에 기재된 것과 같은 질병, 예를 들어 투여되는 RNA에 의해 인코딩되는 항원과 관련된 질병을 치료하기 위해 투여될 수 있다.
용어 "질병"은 개체의 신체에 영향을 미치는 비정상적인 상태를 지칭한다. 질병은 종종 특정 증상 및 징후와 관련된 의학적 상태로 해석된다. 질병은 감염성 질병과 같은 외부 원천을 기원으로 하는 인자에 의해 야기될 수 있거나, 자가면역 질병과 같은 내부 기능 장애에 의해 유발될 수 있다. 인간의 경우, "질병"은 앓고 있는 개체에게 통증, 기능 장애, 고통, 사회적 문제 또는 사망을 야기하거나, 개체와 접촉하는 사람들에게 유사한 문제를 야기하는 임의의 상태를 지칭하기 위해 종종 더욱 광범위하게 사용된다. 이러한 더 광범위한 의미에서, 이는 때로는 손상, 무능력(disability), 장애, 증후군, 감염, 고립성 증상, 일탈 행동, 구조와 기능의 비정형 변화를 포함하는 한편, 다른 맥락에서 및 다른 목적을 위해 이들은 구별 가능한 범주로 간주될 수 있다. 질병은 일반적으로 신체적뿐만 아니라 감정적으로도 개체에게 영향을 미치는데, 이는 많은 질병에 걸리고 질병이 있는 상태로 삶을 사는 것은 인생에 대한 시각 및 성격을 변화시킬 수 있다.
"항원과 관련된 질병" 또는 "항원을 포함하는 질병"이란 용어는 항원과 관련된 임의의 질병, 예를 들어 항원의 존재를 특징으로 하는 질병을 지칭한다. 항원과 관련된 질병은 감염성 질병, 자가면역 질병, 또는 암 질환 또는 단순히 암일 수 있다. 앞서 언급된 바와 같이, 항원은 질병-관련 항원, 예컨대 종양-관련 항원, 바이러스 항원, 또는 박테리아 항원일 수 있다.
"감염성 질병"이란 용어는 개체에서 개체로 또는 유기체에서 유기체로 전염될 수 있고 미생물 작용제(예를 들어, 일반 감기)에 의해 유발되는 임의의 질병을 지칭한다. 감염성 질병은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 바이러스 질병, 박테리아 질병 또는 기생충 질병을 포함하며, 이러한 질병은 각각 바이러스, 박테리아 및 기생충에 의해 유발된다. 이와 관련하여 감염성 질병은, 예를 들어, 간염, 성병(예를 들어, 클라미디아 또는 임질), 결핵, HIV/후천성 면역 결핍 증후군(AIDS), 디프테리아, B형 간염, C형 간염, 콜레라, 중증 급성 호흡기 증후군(SARS), 조류 독감, 인플루엔자, 구제역과 같은 동물 질병, 가성우역(Peste de petits ruminants), 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 또는 기생충 질병, 예컨대 샤가스병, 말라리아 등일 수 있다.
"자가면역 질병"이란 용어는 신체가 자신의 조직의 일부 구성 요소에 대해 면역원성(즉, 면역계) 반응을 생성하는 임의의 질병을 지칭한다. 바꿔 말하면, 면역계는 신체 내의 일부 조직 또는 시스템을 자기(self)로서 인식하는 능력을 상실하고, 그것이 외래인 것처럼 표적화하고 공격한다. 자가면역 질병은 주로 하나의 기관이 영향을 받는 질병(예를 들어, 용혈성 빈혈 및 항-면역 갑상선염) 및 자가면역 질병 과정이 많은 조직을 통해 확산되는 질병(예를 들어, 전신성 홍반성 루푸스)으로 분류될 수 있다. 예를 들어, 다발성 경화증은 뇌 및 척수의 신경 섬유를 둘러싸는 집(sheath)을 공격하는 T 세포에 의해 유발되는 것으로 생각된다. 이는 조정 능력의 상실, 약화 및 시야 흐림을 가져온다. 자가면역 질병은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 하시모토 갑상선염, 그레이브스병, 루푸스, 다발성 경화증, 류마티스 관절염, 용혈성 빈혈, 항-면역 갑상선염, 전신성 홍반성 루푸스, 셀리악병, 크론병, 대장염, 당뇨병, 경피증, 건선 등을 포함한다.
용어 "암 질환" 또는 "암"은 전형적으로 조절되지 않은 세포 성장을 특징으로 하는 개체의 생리적 상태를 지칭하거나 기술한다. 암의 예에는 암종, 림프종, 모세포종, 육종, 및 백혈병이 포함되지만 이로 제한되지 않는다. 더욱 상세하게는, 이러한 암의 예에는 골암, 혈액암, 폐암, 간암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 또는 안구내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문 주위암, 위암, 결장암, 유방암, 전립선암, 자궁암, 성기 및 생식기의 암종, 호지킨병, 식도암, 소장암, 내분비계 암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 방광암, 신장암, 신장세포 암종, 신우 암종, 중추신경계(CNS) 신생물, 신경외배엽 암, 척수 축 종양, 신경교종, 뇌수막종, 및 뇌하수체 선종이 포함된다. 본 발명에 따른 용어 "암"은 또한 암 전이를 포함한다.
용어 "면역 반응"은 면역원성 유기체, 예컨대 박테리아 또는 바이러스, 세포 또는 물질에 대한 것과 같은 면역계의 반응과 관련된다. 용어 "면역 반응"은 선천 면역 반응 및 적응 면역 반응을 포함한다. 바람직하게는, 면역 반응은 면역 세포의 활성화, 사이토카인 생합성의 유도 및/또는 항체 생산과 관련된다.
본 발명의 조성물에 의해 유도된 면역 반응은 수지상 세포 및/또는 대식세포와 같은 항원 제시 세포의 활성화 단계, 상기 항원 제시 세포에 의한 항원 또는 이의 단편의 제시 단계 및 이러한 제시로 인한 세포독성 T 세포의 활성화 단계를 포함하는 것이 바람직하다.
용어 "면역 세포"는 개체의 신체를 방어하는 데 관여하는 면역계의 세포를 지칭한다. "면역 세포"라는 용어는, 대식세포, 단핵구(대식세포의 전구체), 과립구, 예컨대 호중구, 호산구 및 호염구, 수지상 세포, 비만 세포, 및 림프구, 예컨대 B 세포, T 세포 및 자연 살해(NK) 세포를 포함하는, 백혈구를 비롯한 특정 유형의 면역 세포 및 이의 전구체를 포함한다. 대식세포, 단핵구(대식세포의 전구체), 호중구, 수지상 세포, 및 비만 세포는 포식 세포이다.
용어 "면역요법"은 면역 반응의 유도, 향상, 또는 억제에 의한 질병 또는 질환의 치료와 관련된다. 면역 반응을 유도하거나 증폭시키기 위해 고안된 면역요법은 활성화 면역요법으로 분류되는 한편, 면역 반응을 감소시키거나 억제하는 면역요법은 억제 면역요법으로 분류된다. 용어 "면역요법"은 항원 면역화 또는 항원 백신접종, 종양 면역화 또는 종양 백신접종을 포함한다. 용어 "면역요법"은 또한 류마티스 관절염, 알레르기, 당뇨병 또는 다발성 경화증과 같은 자가면역 질병과 관련하여 부적절한 면역 반응이 더 적절한 것으로 조정되도록 하는 면역 반응의 조작과 관련된다.
용어 "면역화" 또는 "백신접종"은, 예를 들어, 치료적 또는 예방적 이유로 면역 반응을 유도하기 위해 개체에게 항원을 투여하는 과정을 기술한다.
용어 "치료적 처치" 또는 단순히 "처치"는 개체의 건강 상태를 개선시키고/개선시키거나 개체의 수명을 연장(증가)시키는 임의의 처치와 관련된다. 상기 처치는 개체에서 질병을 제거하고/하거나, 개체에서 질병의 전개를 정지시키거나 늦추고/늦추거나, 개체에서 질병의 전개를 억제하거나 늦추고/늦추거나, 개체에서 증상의 빈도 또는 중증도를 감소시키고/감소시키거나, 현재 질병에 걸려 있거나 이전에 질병에 걸린 적이 있는 개체에서 재발을 감소시킬 수 있다.
용어 "예방적 처치" 또는 "방지적 처치"는 개체에서 발생하는 질병을 예방하도록 의도되는 임의의 처치와 관련된다. 용어 "예방적 처치" 또는 "방지적 처치"는 본원에서 상호 교환적으로 사용된다.
용어 "보호", "예방", "예방적", "방지적", 또는 "보호적"은 개체에서 질병, 예를 들어 종양의 발생 및/또는 전파의 예방 또는 처치와 관련된다. 예를 들어, 본 발명의 조성물을 투여함으로써 이루어지는 바와 같은 면역요법의 예방적 적용은, 투여받은 개체를 종양의 발달로부터 보호할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조성물을 투여함으로써 이루어지는 바와 같은 면역요법의 치료적 적용은, 질병의 전개를 중지시킬 수 있으며, 예를 들어 종양의 진행/성장의 억제를 가져올 수 있다. 이것은 종양의 진행/성장의 감속, 특히 종양 진행의 중단을 포함하며, 이는 바람직하게 종양의 제거로 이어진다. 면역요법의 치료적 적용은 개체를, 예를 들어 기존 종양의 파종 또는 전이로부터 보호할 수 있다.
"개체" 및 "대상체"라는 용어는 척추 동물, 특히 포유 동물과 관련된다. 예를 들어, 본 발명의 맥락에서 포유 동물은 인간, 비-인간 영장류, 길들여진 포유 동물, 예컨대 개, 고양이, 양, 소, 염소, 돼지, 말 등, 실험실 동물, 예컨대 마우스, 래트, 토끼, 기니피그 등뿐만 아니라, 감금 상태의 동물, 예컨대 동물원의 동물이다. "대상체"라는 용어는 또한 조류(특히 닭, 오리, 거위, 칠면조와 같은 길들여진 조류)와 같은 비-포유류 척추 동물 및 어류(특히 연어 또는 메기와 같은 양식 어류)와 관련된다. 본원에 사용되는 바와 같은 용어 "동물"은 또한 인간을 포함한다.
본원에 기재된 폴리플렉스 입자와 같은 제제는 임의의 적합한 약학 조성물의 형태로 투여될 수 있다. 용어 "약학 조성물"은 치료적으로 유효한 제제 또는 이의 염을, 바람직하게는 완충제, 방부제 및 등장성 조절제와 같은 약학적 부형제와 함께 포함하는 제형과 관련된다. 상기 약학 조성물은 개체로의 상기 약학 조성물의 투여에 의해 질병 또는 장애를 치료하거나, 예방하거나, 이의 중증도 감소시키는 데 유용하다. 약학 조성물은 또한 약학 제형으로 당업계에 알려져 있다. 약학 조성물은 국소적으로 또는 전신적으로 투여될 수 있다. 본 발명의 맥락에서, 약학 조성물은 본원에 기재된 입자를 포함한다.
용어 "전신 투여"는 치료적으로 유효한 제제가 유의한 양으로 개체의 신체 내에 광범위하게 분포되어 생물학적 효과를 나타내도록 하는 그러한 제제의 투여를 지칭한다. 본 발명에 따르면, 투여는 비경구 투여에 의해 이루어지는 것이 바람직하다.
용어 "비경구 투여"는 치료적으로 유효한 제제가 장을 통과하지 않도록 하는 그러한 제제의 투여를 지칭한다. 용어 "비경구 투여"는 정맥내 투여, 피하 투여, 진피내 투여 또는 동맥내 투여를 포함하지만, 이로 제한되지 아니다.
특히 바람직한 일 구현예에서, 본 발명에 따른 조성물은 골격근과 같은 근육 조직에 투여된다. 따라서, 근육내 주사에 의해 이루어지는 바와 같은 근육내 투여가 바람직한 투여 경로이다.
투여는 다양한 방법으로 달성될 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명에 따른 조성물은 주사에 의해 투여된다. 바람직한 구현예에서, 주사는 바늘을 통해 이루어진다. 무바늘 주사가 대안으로 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 적어도 하나의 보조제를 포함할 수 있다. 용어 "보조제"는 개체에게 항원 또는 항원 펩티드와 조합하여 투여될 때 면역 반응을 연장시키거나 향상시키거나 촉진시키는 화합물과 관련된다. 보조제는 항원 표면의 증가, 신체 내에서의 항원 보유의 연장, 항원 방출의 지연, 대식세포로의 항원의 표적화, 항원 흡수의 증가, 항원 프로세싱의 향상, 사이토카인 방출의 자극, 면역 세포, 예컨대 B 세포, 대식세포, 수지상 세포, T 세포의 자극 및 활성화 및 면역 세포의 비특이적 활성화를 포함하는 하나 이상의 메커니즘에 의해 생물학적 활성을 발휘한다고 추정된다. 보조제는 오일 에멀젼(예를 들어, 프로인트 보조제), 무기 화합물(예컨대 명반), 박테리아 생성물(예컨대 보르데텔라 퍼투시스 독소), 또는 면역-자극 복합체와 같은 이질적 그룹의 화합물을 포함한다. 보조제의 예에는 사포닌, 불완전 프로인트 보조제, 완전 프로인트 보조제, 토코페롤 또는 명반이 포함되지만, 이로 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 일반적으로 "약학적 유효량" 및 "약학적으로 허용되는 제조물"로 적용된다.
용어 "약학적 유효량"은 요망되는 반응 또는 요망되는 효과를 단독으로 또는 추가 용량과 함께 달성하는 양을 지칭한다. 특정 질병의 치료의 경우, 요망되는 반응은 바람직하게는 질병의 경과의 억제와 관련된다. 이는 질병의 진행을 늦추고, 특히 질병의 진행을 중단시키거나 역전시키는 것을 포함한다. 질병의 치료에서 요망되는 반응은 또한 상기 질병 또는 상기 질환의 발병 지연 또는 발병 예방일 수 있다. 본원에 기재된 조성물의 유효량은 치료하려는 질환, 질병의 중증도, 연령, 생리적 상태, 크기 및 체중을 포함하는 환자의 개인적 파라미터, 치료 기간, (존재하는 경우) 동반 요법의 유형, 특정 투여 경로, 및 유사한 요인에 좌우될 것이다. 따라서, 본원에 기재된 조성물의 투여량은 다양한 그러한 파라미터에 좌우될 수 있다. 환자에서의 반응이 초기 용량으로 불충분한 경우, 더 많은 용량(또는 상이한 더욱 국소화된 투여 경로에 의해 달성되는 효과적으로 더 많은 용량)이 사용될 수 있다.
용어 "약학적으로 허용되는"은 약학 조성물의 활성 성분의 작용과 상호 작용하지 않는 물질의 비독성을 지칭한다.
본 발명의 약학 조성물은 염, 완충제, 보존제, 담체 및 선택적으로 다른 치료제를 함유할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 약학 조성물은 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 희석제 및/또는 부형제를 포함한다.
용어 "부형제"는 결합제, 윤활제, 증점제, 표면 활성제, 방부제, 유화제, 완충제, 착향제, 또는 착색제와 같은 활성 성분이 아닌 약학 조성물 내의 모든 물질을 나타내도록 의도된다.
용어 "희석제"는 희석시키는 제제 및/또는 감점제(thinning agent)와 관련된다. 또한, 용어 "희석제"는 유체, 액체 또는 고체 현탁액 및/또는 혼합 매체 중 임의의 하나 이상을 포함한다.
용어 "담체"는 인간에게 투여하기에 적합한 하나 이상의 상용 가능한 고체 또는 액체 충전제 또는 희석제와 관련된다. 용어 "담체"는 활성 성분의 적용을 용이하게 하기 위해 활성 성분과 조합된 천연 또는 합성 유기 또는 무기 성분과 관련된다. 바람직하게는, 담체 성분은, 미네랄 오일, 땅콩유, 대두유, 참기름, 해바라기유 등과 같은 동물 또는 식물로부터 유래된 것을 포함하는, 물 또는 오일과 같은 멸균 액체이다. 염 용액 및 수성 덱스트로스 및 글리세린 용액은 또한 수성 담체 화합물로서 사용될 수 있다.
치료 용도를 위한 약학적으로 허용되는 담체 또는 희석제는 약학 분야에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R Gennaro edit. 1985)]에 기재되어 있다. 적합한 담체의 예에는, 예를 들어, 탄산마그네슘, 스테아르산마그네슘, 활석, 당, 락토스, 펙틴, 덱스트린, 전분, 젤라틴, 트라가칸트, 메틸셀룰로스, 소듐 카르복시메틸셀룰로스, 저융점 왁스, 및 코코아 버터 등이 포함된다. 적합한 희석제의 예에는 에탄올, 글리세롤 및 물이 포함된다.
약학적 담체, 부형제 또는 희석제는 의도된 투여 경로 및 표준 약학 실무와 관련하여 선택될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 담체(들), 부형제(들) 또는 희석제(들)로서 또는 그에 부가하여 임의의 적합한 결합제(들), 윤활제(들), 현탁제(들), 코팅제(들), 및/또는 가용화제(들)을 포함할 수 있다. 적합한 결합제의 예에는 전분, 젤라틴, 천연 당, 예컨대 글루코스, 무수 락토스, 자유-유동 락토스, 베타-락토스, 옥수수 감미료, 천연 및 합성 검, 예컨대 아카시아, 트라가칸트 또는 소듐 알기네이트, 카르복시메틸 셀룰로스 및 폴리에틸렌 글리콜이 포함된다. 적합한 윤활제의 예에는 올레산나트륨, 스테아르산나트륨, 스테아르산마그네슘, 벤조산나트륨, 아세트산나트륨, 및 염화나트륨 등이 포함된다. 방부제, 안정화제, 염료 및 심지어 착향제가 약학 조성물에 제공될 수 있다. 방부제의 예에는 벤조산나트륨, 소르브산 및 p-하이드록시벤조산의 에스테르가 포함된다. 산화방지제 및 현탁제가 또한 사용될 수 있다.
일 구현예에서, 조성물은 수성 조성물이다. 수성 조성물은 선택적으로 용질, 예를 들어 염을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 조성물은 동결-건조된 조성물의 형태이다. 동결-건조된 조성물은 각각의 수성 조성물을 동결-건조시킴으로써 얻을 수 있다.
본원에 제공된 제제 및 조성물은 단독으로 또는 수술, 조사, 화학요법 및/또는 골수 이식(자가, 동계, 동종이계 또는 비혈연간)과 같은 다른 치료 요법과 조합하여 사용될 수 있다.
본 발명은 상세히 설명되고, 예시 목적으로만 사용되며 제한하고자 하는 것이 아닌 도면 및 실시예에 의해 예시된다. 상세한 설명 및 실시예로 인해, 본 발명에 마찬가지로 포함되는 추가의 구현예들은 당업자가 접근 가능한 것이다.
실시예
실시예 1: 폴리플렉스의 시험관내 독성
재료 및 방법
생체내-jetPEITM 시약, Cat. # 201-50G를 Polyplus-Transfection(프랑스 일키르히 소재)에서 구입하였다. 생체내-jetPEITM를 무발열원성 멸균수 중에 150 mM(질소 잔류물의 농도로 표현됨)으로 제공한다. JetPEI를 HEPES 10 mM, pH 7.1, 글루코스 5%(HBGx1) 완충액 중에서 요망되는 농도(질소 잔류물의 농도로 표현됨)로 희석하였다.
시험관내 세포독성 검정
HEK-293 세포를 웰당 2x104개 세포의 농도로 96-웰 플레이트(평평한 바닥)에 시딩하였다. 세포를 37℃ 및 7.5% CO2에서 유지시켰다. 24시간 후, 상등액을 버리고 50 μL의 DMEM 배지(+10% FCS)로 교체하였다. PEI를 10% FCS 가 함유된 RPMI 배지 중에 희석시키고(1:5), 약 15분 동안 사전 인큐베이팅하였다. 이어서, 50 μl의 PEI 용액을 100 μl의 최종 배지 부피까지 세포에 첨가하였다. 추가 18시간 후, 매뉴얼 지침에 따라 XTT-Assay(독일 프랑크푸르트 소재의 New England Biolabs GmbH의 XTT Cell Viability Kit # 9095)를 수행하였다. PEI 농도의 함수로서의 세포 사멸 데이터를 하기 S자형 방정식을 사용하여 피팅하였다:
도 1의 A는 시험관내에서의 HEK-293 세포에 대한 유리 형태의 순수한 PEI의 독성을 도시한다. IC50 = 77 μM의 질소(유리 형태). 도 1의 B는 시험관내에서의 HEK-293 세포에 대한 PEI/레플리콘-RNA 폴리플렉스의 독성을 도시한다. IC50 = 542 μM 의 질소(폴리플렉스 제형).
결과 및 결론
유리 형태의 PEI는 18 μM 초과의 질소 농도에서 세포 사멸을 가져온다(도 1의 A). 독성 문제를 피하기 위해 세포 배지에서 유리 형태의 PEI의 최종 농도는 전술한 한계 미만이어야 한다.
폴리플렉스는 유리 형태의 PEI보다 적은 세포 사멸을 유발하지만 PEI 농도가 증가할 때 이의 독성도 증가한다(도 1의 B). 폴리플렉스의 첨가 후 세포 사멸은 하기 방정식을 사용하여 계산될 수 있다:
세포 사멸 % = 21.13 + 78.59/(1+10^((-0.27-log(농도))*3.13))
N/P 11.6의 폴리플렉스(10 mg/l의 RNA 농도, PEI = 348 μM)의 경우, 세포 사멸은 36.8%인 한편, N/P 15.8의 폴리플렉스의 경우 세포 사멸은 52.3%이다.
실시예 2: 폴리플렉스의 안정성 연구
재료 및 방법
실시예 1으로부터의 생체내-jetPEITM 시약을 사용하였다. 루시퍼라아제를 인코딩하는 RNA인 작제물 D1-824 레플리콘, ID R076 1를 RNA Biochemistry unit(독일 마인츠 소재의 BioNTech RNA Pharmaceuticals GmbH)에서 제공받았다.
폴리플렉스의 제조
제조 전에, 생체내 jetPEITM 및 당 용액을 실온에서 평형화시켰다. 생체내-jetPEITM/RNA 복합체의 제조는 멸균 당 용액을 사용하여 층류 후드(laminar flow hood)에서 수행하였다(표 1). 제형 중 당의 최종 농도는 5 내지 10% w/v였다.
모든 제형을 250 mg/l의 RNA 농도 및 11.6의 N/P 비로 제조하였다.
제조 단계는 다음과 같았다:
1. 농축된 당 완충액(HBGx2, MBGx2 또는 HBTx2)을 사용하여 RNA를 희석하여 최종 부피의 1/2인 용액을 제조하였다. 약한 볼텍싱을 적용하였다.
2. 동일한 당 완충액 및 멸균수를 사용하여 생체내 jetPEITM 시약을 희석하여 최종 부피의 3/5인 용액을 제조하였다. 약한 볼텍싱을 적용하였다.
3. 희석된 생체내 jetPEITM으로부터의 부피의 절반을 한꺼번에 희석된 RNA에 신속하게 첨가하고, 약한 볼텍싱을 적용하였다.
4. 폴리플렉스를 15분 내지 20분 동안 실온에서 인큐베이팅하고, 이어서 적절한 저장 조건으로 옮겼다.
[표 1] 폴리플렉스의 제조 및 저장을 위한 매체
폴리플렉스의 동결건조
제형을 벤치탑 매니폴드 동결-건조기 Epsilon 2-4 LSCplus(독일 오스터로데 소재의 Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH)에 넣었다.
샘플을 1 ATM에서 -40℃(약 2℃/분)로 동결시켰다. 60분 내지 90분이 소요되었다.
-40℃에서 10분 동안 0.2 ATM까지 압력을 감소시켰다.
샘플을 0.2 ATM 및 -40℃에서 4시간 동안 건조시켰다.
샘플을 0.2 ATM에서 2시간 동안 -16℃까지 가열하였다(램프(ramp)).
샘플을 -16℃ 및 0.2 ATM에서 4시간 동안 계속 건조시켰다.
-16℃에서 10분 동안 0.01 ATM까지 압력을 감소시켰다.
샘플을 -16℃ 및 0.01 ATM에서 4시간 동안 계속 건조시켰다.
샘플을 0.01 ATM에서 2시간 20℃까지 가열하였다(램프).
샘플을 20℃ 및 0.01 ATM에서 8시간 동안 계속 건조시켰다.
폴리플렉스로부터의 RNA 방출
표 2에 따라 90 μl의 샘플이 함유된 12개의 시험관을 준비하였다.
[표 2] RNA 무결성 및 농도 측정을 위한 샘플 준비
NaCl 500 mM 중 50 g/l의 헤파린 10 μL을 각각의 튜브에 첨가하였다. 혼합물을 300 rpm의 진탕 속도로 볼텍싱 기계에서 30℃에서 20 분 동안 인큐베이팅하였다.
RNA 무결성
방출된 RNA 5 μl를 Bioanalyzer 측정에 사용하였다. RNA를 5 μl의 포름아미드와 혼합하였다. RNA 무결성 정량화를 Agilent 2100 Bioanalyzer 기기로 수행하였다. Agilent RNA 6000 Nano Kit를 실온에서 30분간 평형화시켰다. "나노 겔 매트릭스(Nano Gel Matrix)" 400 μl를 1500 g에서 10분 동안 원심분리하였다. 상등액 65 μL를 잘 볼텍싱된 "나노 염료 농축액(Nano Dye Concentrate)" 1 μL와 혼합하고 15000g에서 10분 동안 원심분리하여, "겔-염료-믹스(Gel-Dye-Mix)"를 얻었다. 준비한 샘플을 70℃에서 10분 동안 가열함으로써 변성시키고, "나노 래더(Nano Ladder)"를 또한 동일한 온도에서 2분 동안 가열하였다. "프라이밍 스테이션(Priming Station)"을 사용하여 칩을 프라이밍하였는데, 마킹된 G 위치에 "겔-염료-믹스(Gel-Dye-Mix)" 9 μL를 첨가하고 30초 동안 칩을 가압함으로써 프라이밍하였다. 이어서, "겔-염료-믹스(Gel-Dye-Mix)" 9 μL를 다른 G 위치 모두에 첨가하였다. "마커(Marker)" 7.5 μL를 래더 위치에 첨가하고 5 μL를 모든 샘플 위치에 첨가하였다. 변성된 "나노 래더(Nano Ladder)"(1.5 μL)를 래더 위치에 첨가한 후, 1 μL의 샘플을 모든 12개의 샘플 웰에 첨가하였다(사용하지 않은 웰에는 1 μL의 H2O를 첨가함). 칩을 IKA Vortex 기계에 놓고 2000 rpm에서 1분 동안 볼텍싱을 적용하였다. 이 칩을 기기에서 측정하였고, 레플리콘 RNA 피크가 47초 내지 57초에 검출되었다. RNA 무결성은, 레플리콘 RNA 영역을 선택함으로써 Smear 분석을 사용하여 Expert 2100 소프트웨어에서 계산하였다.
상대 RNA 무결성 %는 다음 방정식을 사용하여 계산하였다:
시험관내 트랜스펙션 검정
C2C12 세포를 웰당 2x104개 세포의 농도로 96-웰 플레이트(평평한 바닥)에 시딩하였다. 세포를 37℃ 및 7.5% CO2에서 유지시켰다. 24시간 후, 상등액을 버리고 50 μL의 DMEM 배지(+10% FCS)로 교체하였다. 폴리플렉스를 10% FCS가 함유된 DMEM 배지 중에 희석(1:5)시키고, 약 15분 동안 사전 인큐베이팅시켰다. 이어서, 50 μl의 폴리플렉스 용액을 100 μl의 최종 배지 부피까지 세포에 첨가하였다. 추가 48시간 후, Bright-GloTM 루시퍼라아제 검정 Cat. #E2610(독일 만하임 소재의 Promega GmbH)을 매뉴얼 지침에 따라 수행하였다.
상대 발광 %는 다음 방정식을 사용하여 계산하였다:
도 2는 1주 저장 후 다양한 저장 조건으로부터 N/P 11.6의 PEI/레플리콘-RNA 폴리플렉스와 함께 인큐베이팅한 후 C2C12 근육 세포로부터의 상대 발광을 도시한다.
도 3은 2주 저장 후 다양한 저장 조건에서 N/P 11.6의 PEI/레플리콘-RNA 폴리플렉스의 상대 RNA 무결성을 도시한다.
결과 및 결론
폴리플렉스는 액체 상태(4℃ 및 25℃)에서 불량한 저장 안정성을 갖는다. 폴리플렉스의 안정성은 액체 상태보다 고체 상태(동결되거나 동결건조됨)에서 유의하게 우수하다. 고체 상태에서의 HBT+EDTA 완충액 중의 폴리플렉스의 저장 안정성은 HBGx1 완충액 중의 저장 안정성보다 유의하게 우수하다.
HBGx1 중의 폴리플렉스의 경우, 고체 상태의 긴 저장 안정성이 가능한 반면, HBT+EDTA 중의 폴리플렉스의 경우, 액체 상태의 긴 저장 안정성이 거의 없다.
레플리콘-RNA를 갖는 폴리플렉스 제형은 다음의 첨가에 의해 안정화될 수 있다: 트레할로스 5% 내지 20%(w/v), EDTA 80 μM 내지 5 mM.
실시예 3: 선형 PEI의 Mw 계산에 관한 설명
선형 PEI를 2-에틸-2-옥사졸린으로부터 2 단계로 합성하였다: 먼저, 개시제의 존재 하에서 2-에틸-2-옥사졸린의 개환 이성질화 중합에 의해 폴리(2-에틸-2-옥사졸린)을 얻는다(도 4). 이어서, PEOX(N-프로피오닐-PEI)를 산-가수분해하여 N-프로피오닐기를 절단함으로써 PEI를 얻는다(도 5).
50 kDa의 분자량을 갖는 PEOX(N-프로피오닐-PEI)의 완전한 탈아실화는 22 kDa의 분자량을 갖는 선형 PEI를 제공한다. 중간 생성물(PEOX)의 분자량의 결정은, 굴절률 검출기(Refractive Index Detector) 또는 다각도 광산란 검출기(Multi-angle Light Scattering Detector)와 함께 겔 투과 크로마토그래피에 의해 수행한다. 전체 기술 세부 사항은 문헌[Adib, Abdennaji, Fabrice Stock, and Patrick Erbacher. "Method for Manufacturing Linear Polyethylenimine (PEI) for Transfection Purpose and Linear PEI Obtained with Such Method."] 미국 특허 출원 제12/671,312호에 기술되어 있다.
본 발명에 따르면, 40 내지 60 kDa의 MW 범위를 갖는 PEOX로부터 합성된 PEI는 레플리콘-RNA를 위한 강력한 트랜스펙션 시약이다.
본 발명에 따라 사용하기 위한 PEI는 Polyplus-Transfection SA(프랑스 일키르히 소재: 생체내 JetPEI), Polysciences Europe GmbH(독일 에펠하임 소재: PEI MAX 40000) 및 Euromedex(프랑스 주펠바이어스하임 소재: Exgen 500)에서 구입할 수 있다.
실시예 4: 폴리플렉스의 응집 역학
재료 및 방법
앞서 실시예 2에 기술된 바와 같이 폴리플렉스를 HBGx1 중에 200 mg/L의 RNA 농도로 제조하였다. 이러한 폴리플렉스를 HBGx1 및 포스페이트 완충된 식염수 pH 7.4(PBS) 중에 10 mg/l의 RNA 농도로 희석하였다. 용액의 이온 강도를 증가시키기 위해 PBS를 사용하였다. 희석된 폴리플렉스를 플레이트에 첨가하기 전에 여과된 공기로 96 웰 플레이트를 세정하였다. 크기는 WYATT technology GmbH(독일 데른바흐 소재)의 DynaPro 플레이트 판독기 II 기기에 의해 측정하였다. 단일모드 샘플의 크기 계산에는 누적 피트(cumulant fit)를 사용하는 한편, 다중모드 샘플의 경우에는 정규화 피트(regularization fit)를 사용하였다.
도 6은 증가하는 염 농도에서 JetPEI를 갖는 IVT(A) 및 레플리콘(B) 폴리플렉스의 응집 역학을 도시한다.
결과 및 결론
높은 이온 강도는 폴리플렉스의 크기 증가를 가져온다(도 6). 폴리플렉스 제형의 이온 강도는 폴리플렉스의 응집을 방지하기 위해 20 mM 이하이어야 한다.
실시예 5: 여과에 의한 폴리플렉스의 멸균
재료 및 방법
폴리플렉스는 100mg/L의 RNA 농도 및 11.5, 13.5 및 15.5의 N/P 비로 앞서 "폴리플렉스의 안정성 연구" 섹션에 기술된 바와 같이 제조하였다.
RNA 농도 및 무결성
헤파린과 함께 인큐베이팅함으로써 RNA를 폴리플렉스로부터 방출시켰다. 90 μl의 유리 형태의 RNA(100 mg/l) 또는 폴리플렉스를 Hepes 10 mM, pH 7.4, EDTA 1 mM 중에서 20 g/l의 헤파린 10 μl와 혼합하였다. 혼합물을 볼텍싱 기계에서 30℃에서 20분 동안 인큐베이팅하였다. 이 혼합물 5 μl를 포름아미드 5 μl와 혼합하였다. 다음으로, RNA 무결성을 피코-칩을 갖는 Bioanalyzer에 의해 측정하였다. 실시예 2에서 기술된 바와 같이 RNA 무결성을 계산하였다. RNA 농도는, 고감도 방법을 위한 제조자 지침에 따라, "Quant-iT RiboGreen RNA Reagent and Kit"(Cat. # R11490, Thermo Fischer Scientifi c)를 사용하여 Ribogreen 검정에 의해 측정하였다. 간략하게 말하면, 헤파린과 폴리플렉스의 혼합물을 Tris 10 mM, pH 7.5, EDTA 1 mM 완충액 중에서 Ribogreen 형광단과 함께 인큐베이팅하였다. Ribogreen의 형광을 485 nm의 여기 파장 및 535 nm의 방출 파장에서 측정하였다.
PEI 농도
Na아세테이트 0.1 M, pH 5.4(CSS 시약) 100 ml 중의 CuSO4 23 mg(무수) 용액을 준비하였다. CSS 시약 600 μl를 폴리플렉스와 혼합하고 주위 온도에서 5분 동안 인큐베이팅하였다. 각 용액의 흡수는 1 cm 큐벳을 사용하여 블랭크에 대해 UV 분광광도계로 285 nm에서 측정하였다. 알려진 PEI 농도(0 내지 1.55 mM)를 사용한 검량선을 작성하고, 미지의 샘플 중의 PEI 농도를 계산하는 데 사용했다. 유리 형태의 RNA의 백그라운드 흡수를 모든 샘플로부터 공제했다.
전기영동 이동도(μ) 측정
폴리플렉스는 3.1 ml의 HBGx1 중에 20 mg/l의 RNA 농도로 희석하였다. 다음으로, 이러한 폴리플렉스를 600 g에서 2분 동안 원심분리하였다. 1.05 ml의 3개의 샘플을 플라스틱 큐벳에 각각의 제형에 대해 준비하였다. 폴리플렉스의 전기영동 이동도는 ζ-Wallis 기기(프랑스 소재의 Corduan technologies)를 사용하여 레이저 도플러 전기영동(laser dopler electrophoresis)에 의해 측정하였다. 각 샘플에 대해 10회 실행의 1 시퀀스(sequence)를 갖는 중분해능 측정(medium resolution measurement)을 사용하였다. 낮은 신호 대 잡음 비, 또는 극단적인 μ(>3 또는 <-3 μm*cm/V*S)을 보인 측정은 최종 분석에서 제외하였다. 모든 제형을 3중으로 측정하였다.
폴리플렉스의 여과
3개의 상이한 N/P 비의 폴리플렉스 2.68 ml를 갖는 3개의 튜브를 준비하였다. 220 nm의 공극을 갖는 멸균 Millex-GP Med Syringe Filter Units(Cat. # SLMPL25SS, Merck Millipore)을 통해 폴리플렉스(1.34 ml)를 여과시켰다. 여과 전후의 물리화학적 특성을 측정하였다.
도 7은 여과 전(준비된 경우) 및 여과 후(여과된 경우) 폴리플렉스의 물리화학적 파라미터를 도시한다. A 및 B. 헤파린에 의해 폴리플렉스로부터 RNA를 방출시켰다. 이어서, 레플리콘-RNA 무결성(A)을 바이오애널라이저(bioanalyzer) 기기로 모세관 전기영동에 의해 측정하였다. 레플리콘-RNA 농도(B)를 Ribogreen 형광에 의해 측정하였다. C. PEI 농도를 CuSO4 검정에 의해 측정하였다. D. 전기영동 이동도(μ)를 레이저 도플러 전기영동에 의해 측정하였다.
결과 및 결론
Syringe Filter Units는 폴리플렉스의 멸균에 적합한 방법이다. 폴리플렉스는 여과에 의한 멸균을 위해 120 nm보다 작아야 한다. N/P 비 11.6에서, 폴리플렉스의 물리화학적 특성은 여과에 의해 변하지 않는다.
이어서 N/P 비가 11.6을 초과하여 증가할 때, 여과 동안 RNA가 손실된다.
실시예 6: 레플리콘-RNA/PEI 제형의 트랜스펙션에 대한 PEI 순도의 효과
재료 및 방법
다음의 고순도 PEI를 Polyplus-Transfection SA(프랑스 일키르히-그라펜슈타덴 소재: 생체내 JetPEI) 및 Polysciences Europe GmbH(독일 에펠하임 소재: PEI MAX 40000)에서 구입하였다.
다음의 보통-순도 PEI를 Polysciences Europe GmbH(독일 에펠하임 소재: PEI 25000)에서 구입하였다.
폴리플렉스는 앞서 실시예 2에 기술된 바와 같이 HBGx1 중에 100 mg/L의 RNA 농도로 제조하였다.
생체내 트랜스펙션
마우스를 이소플루란으로 마취시키고 뒷다리의 후측부(posterior side)를 면도하고 70% EtOH-용액으로 소독하였다. 20 μL의 연구된 제형을 크기가 30G인 캐뉼라가 미리 장착된 인슐린-주사기로 후경골근 내로 주사하였다. 통증, 괴로움 및 고통의 징후에 대해 의식을 회복할 때까지 마우스를 관찰하였다.
측정 당일에, 마우스에게 루시페린-용액을 i.p. 주사하였다. 후속하여, 마우스를 이소플루란으로 마취시키고, 개별 마취 마스크를 통해 이소플루란/산소를 일정하게 공급하는 IVIS® Spectrum(Perkin Elmer) 이미지화 챔버 내부의 열 매트(heat mat)(37℃) 상에 두었다. 루시페린 주사 후 5분째에, 카메라를 통해 1분에 걸쳐 생물발광 광의 검출을 수행하였다. 생성된 이미지는 소프트웨어인 "LivingImage"(Perkin Elmer)를 사용하여 분석하였다.
도 8은 고순도 PEI 및 보통 순도 PEI의 화학 구조를 비교한 도면이다. 25 kDa의 PEI에 대해 n = 58이다. PEI 25 kD 중의 -CH2CH2NH- 단량체의 평균 개수는 581개이며, 이는 또한 잠재적으로 양성자화 가능한 질소의 연속 스트레치의 길이이다. 보통 순도 PEI25 내에서의 N-프로피오닐 잔기의 균일한 분포를 가정하면, 양성자화 가능한 질소의 연속 스트레치는 64개에 불과하다.
도 9는 다양한 N/P 비로 순도 수준이 상이한 PEI를 사용하여 제조된 레플리콘-RNA 폴리플렉스에 의한 시험관내에서의 C2C12 근육 세포의 트랜스펙션을 도시한다.
도 10에 따르면, 1 (-) 및 11.6 (+)의 N/P 비의 레플리콘-RNA 폴리플렉스를 고순도 PEI(jetPEI) 및 보통 순도 PEI(25 kDa)로 제조하였다. 유리 형태의 RNA를 대조표준으로 사용하였다. 제형을 마우스(n=3)의 뒷다리에 i.m. 주사하였다. 발광 신호를 마우스의 근육으로부터 기록하였다.
결과 및 결론
고순도 PEI를 사용하여 제조된 폴리플렉스는 보통 순도 PEI보다 더 우수하게 시험관내에서 근육 세포를 트랜스펙션시킨다. 폴리플렉스는 i.m. 주사 후 N/P 11.6에서 생체내에서 가장 높은 트랜스펙션 효능을 갖는다.
N/P 11.6의 고순도 PEI를 갖는 양이온성 폴리플렉스는 유리 형태의 레플리콘-RNA보다 훨씬 우수하게(4배 내지 5배 차이) 생체내에서 근육 조직을 트랜스펙션시킬 수 있다.
N/P 1의 고순도 PEI를 갖는 음이온성 폴리플렉스, N/P 1의 보통 순도 PEI를 갖는 폴리플렉스, 및 N/P 11.6의 보통 순도 PEI를 갖는 양이온성 폴리플렉스는 유리 형태의 레플리콘-RNA보다 불량하게 근육 조직을 트랜스펙션시킨시킨다.
실시예 7: 다양한 공급업체로부터의 순수한 PEI 및 동결건조된 폴리플렉스에 의한 레플리콘-RNA의 높은 트랜스펙션 효능
재료 및 방법
다음의 고순도 PEI를 Polyplus-Transfection SA(프랑스 일키르히-그라펜슈타인 소재: 생체내 JetPEI), 및 Euromedex Euromedex(프랑스 주펠바이어스하임 소재: Exgen 500) 및 Polysciences Europe GmbH(독일 에펠하임 소재: PEI MAX 40000)에서 구입하였다.
앞서 실시예 2에서 기술된 바와 같이 폴리플렉스를 HBGx1 중에 100 mg/L의 RNA 농도로 제조하였다. HBTx1 완충액 중에서 제조된 동결건조된 제형을 제외한 모든 제형을 HBGx1 완충액 중에서 제조하였다. HBTx1 완충액 중의 폴리플렉스의 동결건조를 앞서 실시예 2에 기술된 바와 같이 수행하였다. 앞서 실시예 6에 기술된 바와 같이, 제형을 마우스(n=3)의 뒷다리에 i.m. 주사하고, 발광 신호를 마우스의 근육으로부터 기록하였다.
도 11의 실험을 위해, 7.7 및 11.6의 N/P 비의 레플리콘-RNA 폴리플렉스를 고순도 PEI인 jetPEI(Polyplus), PEI-Max 40000(Polyscience), 및 Exgen 500(Eurodamex)로 제조하였다.
[표 3] 도 11의 제형들 사이의 차이의 통계적 유의성(P-값)에 대한 양측 맨 휘트니(Mann Whitney) 검정.
도 12는 다양한 완충액으로 제조된 N/P 11.6의 JetPEI/레플리콘-RNA 폴리플렉스의 동결건조된 케이크를 도시한다.
결과 및 결론
레플리콘-RNA의 폴리플렉스는 i.m. 주사 후 근육 조직을 효율적으로 트랜스펙션시킨다(도 11). 고순도 PEI인 jetPEI(Polyplus), PEI-Max 40000(Polyscience, 및 Exgen 500(Eurodamex)를 폴리플렉스의 제조를 위해 사용할 수 있다. Exgen-500 폴리플렉스는 N/P 11.6보다 N/P 7.7에서 더 우수하게 트랜스펙션된다.
트레할로스 중의 폴리플렉스의 동결건조물은 케이크-유사 형태를 가지는 한편, 글루코스 중에서 동결건조물은 붕괴되며, 이를 물에 용해시키기는 어렵다(도 12).
폴리플렉스의 동결건조를 위해서는 글루코스보다 트레할로스가 바람직하다. 동결건조된 폴리플렉스는 새로 제조된 액체-폴리플렉스와 유사하게 생체내에서 성능을 발휘한다.
실시예 8: 순수한 PEI 폴리플렉스에 의한 IVT-RNA의 근육 세포로의 트랜스펙션
재료 및 방법
생체내-jetPEITM 시약, Cat. # 201-50G를 Polyplus-Transfection(프랑스 일키르히 소재)에서 구입하였다. 루시퍼라제를 인코딩하는 시험관내 전사된(IVT) mRNA인 작제물 pST1-475를 RNA Biochemistry unit(독일 마인츠 소재의 Biontech RNA Pharmaceuticals)에서 제공받았다.
IVT-RNA 및 PEI의 폴리플렉스를 앞서 실시예 2에 기술된 바와 같이 제조하였다. RNA 농도를 일정하게 유지하고 PEI 농도를 증가시킴으로써 다양한 N/P 비를 준비하였다.
시험관내에서의 근육 세포의 트랜스펙션을 앞서 실시예 2에 기술된 바와 같이 수행하였다.
생체내 트랜스펙션 연구는 앞서 실시예 6에 기술된 바와 같이 수행하였다.
도 13에 따르면, 루시퍼라제를 인코딩하는 IVT-RNA에 의해 C2C12 근육 세포를 시험관내에서 트랜스펙션시켰다. RNA를 HBGx1 완충액 중에서 다양한 N/P 비로 JetPEI와 복합체화시켰다. 트랜스펙션 후 24시간째에 발광 신호를 측정하였다.
도 14에 따르면, 5.8 및 11.6의 N/P 비의 IVT-RNA 폴리플렉스를 HBGx1 완충액 중에서 순수한 PEI로 제조하였다. HBGx1 완충액 중의 유리 형태의 IVT-RNA를 대조표준으로 사용하였다. 제형을 주사당 2 내지 8 μg의 RNA 용량으로 마우스(n= 3)의 뒷다리에 i.m. 주사하였다. 주사 후 6시간째에 마우스의 근육으로부터 발광 신호를 기록하였다.
결과 및 결론
IVT-RNA 및 고순도 PEI의 폴리플렉스는 시험관내에서 근육 세포를 효율적으로 트랜스펙션시킬 수 있다. 트랜스펙션 효율 및 N/P 비 사이에 양의 상관 관계가 존재한다(도 13). 유리 형태의 IVT-RNA는 시험관내에서 세포를 트랜스펙션시키지 않는다.
N/P 비 5.8 및 11.6의 고순도 PEI를 갖는 폴리플렉스는 유리 형태의 IVT-RNA보다 훨씬 불량하게 생체내에서 근육 조직를 트랜스펙션시킨다(도 14).
실시예 9: 레플리콘-RNA 폴리플렉스에 의한 트랜스펙션에 대한 입자 크기 및 제조 조건의 효과
재료 및 방법
레플리콘-RNA 및 PEI의 폴리플렉스를 앞서 실시예 2에 기술된 바와 같이 제조하였다. 폴리플렉스를 5가지 상이한 RNA인 100, 250, 500, 750, 1000 mg/l로 제조하였다. 모든 제형에 대해 N/P 비를 11.6으로 유지하기 위해 PEI 농도를 적절히 증가시켰다.
폴리플렉스의 크기를 앞서 실시예 4에 기술된 바와 같이 측정하였다.
시험관내에서의 근육 세포의 트랜스펙션을 앞서 실시예 2에 기술된 바와 같이 수행하였다.
생체내 트랜스펙션 연구를 앞서 실시예 6에 기술된 바와 같이 수행하였다.
도 15에 따르면, 레플리콘-RNA 및 jetPEI의 폴리플렉스를 HBGx1 완충액 중에서 N/P 비 11.6에서 상이한 RNA 농도로 제조하였다. DLS에 의한 크기 측정을 위해, 폴리플렉스를 10 mg/l의 RNA 농도로 희석하였다.
도 16에 따르면, C2C12 근육 세포를 도 16의 폴리플렉스로 시험관내에서 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션 후 24 시간째에 발광 신호를 측정하였다.
도 17에 따르면, 11.6의 N/P 비의 Rep-RNA 폴리플렉스를 도 16에서와 같이 상이한 RNA 농도에서 HBGx1 완충액 중에서 순수한 PEI로 제조하였다. 제형을 주사당 2 내지 8 μg의 RNA 용량으로 마우스(n=3)의 뒷다리에 i.m. 주사하였다. 마우스의 근육으로부터 발광 신호를 기록하였다.
결과 및 결론
- 폴리플렉스는 레플리콘-RNA에 대한 우수한 트랜스펙션 제제이다. 근육 조직에서 RNA-번역 효율의 관점에서의 폴리플렉스의 생체활성은 폴리플렉스 형성 시 RNA 농도(0.1 내지 1 g/l)에 의해 영향을 받지 않는다.
- 60 내지 200 nm 범위의 폴리플렉스의 크기는 시험관내 및 생체내(i.m. 주사)에서의 폴리플렉스의 트랜스펙션 효능에 영향을 미치지 않는다.
실시예 10: 다양한 폴리플렉스는 마우스 내로의 s.c. 또는 i.m. 주사 후 상이하게 성능을 발휘한다
재료 및 방법
생체내-jetPEITM 시약, Cat. # 201-50G를 Polyplus-Transfection SA(프랑스 일키르히 소재)에서 구입하였다. 선형 PEI 22 kDa를 Cheradame 교수(프랑스 에브리 세덱스 소재의 Polytheragene)로부터 제공받았다. 루시퍼라제를 인코딩되는 RNA인 작제물 D1-824 레플리콘, ID 1600801을 RNA Biochemistry unit(독일 마인츠 소재의 Biontech RNA Pharmaceuticals)에서 제공받았다.
JetPEI를 갖는 폴리플렉스를, 앞서 실시예 2에 기술된 바와 같이, HBGx1 중에서 500 mg/L의 RNA 농도로 제조하였다. Polytheragene-PEI를 갖는 폴리플렉스를 JetPEI를 사용한 절차와 유사하게 제조하였지만, 2가지 수정을 가하였다:
1. 폴리플렉스의 제조를 위해 HBGx1 대신 HEPES 10 mM, pH 7.4 완충액을 사용하였다.
2. N/P 비는 11.6 대신에 15.8을 사용하였다.
Polytheragene-PEI를 갖는 폴리플렉스의 제조는 하기 논문에 따라 수행하였다: [Dmoulins, Thomas, et al. "Polyethylenimine-based polyplex delivery of self-replicating RNA vaccines." Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine (2015)].
폴리플렉스를 시험관내 연구의 경우에는 5 mg/l의 최종 RNA 농도로 그리고 생체내 연구의 경우에는 100 mg/l의 최종 RNA 농도로 HBGx1 또는 Opti-MEM (Cat. # 31985062, 독일 슈베르테 소재의 Thermo Fisher Scientific) 완충액 중에 희석하였다.
시험관내 연구는 앞서 실시예 1 및 2에 기술된 바와 같이 수행하였다.
생체내 연구는 앞서 실시예 6에 기술된 바와 같이 수행하였다.
결과 및 결론
도 18은 인간 수지상 세포(DC) 및 마우스 근육 세포(C2C12)에 대한 PEI/레플리콘-RNA 폴리플렉스를 사용한 시험관내 연구를 도시한다. A. 독성(폴리플렉스에 의한 처리 후 생존 세포의 %로 표현됨). B. 트랜스펙션(폴리플렉스에 의한 처리 후 발광 방출로서 표현됨). 트랜스펙션 결과는 C2C12 세포에 대해서만 나타난다.
도 19의 결과를 위해, 11.6 또는 15.8의 N/P 비의 레플리콘-RNA 폴리플렉스를 HBGx1 또는 Hepes 10 mM 완충액 중에서 Polyplus 또는 Polytheragene으로부터의 PEI로 제조하였다. 마우스로의 주사 전에 폴리플렉스를 HBGx1 또는 Opti-MEM 완충액 중에 희석하였다. 제형을 주사당 2 μg의 RNA 용량으로 마우스(n=3)의 뒷다리에 i.m. 주사하였다. 마우스의 근육으로부터 발광 신호를 기록하였다.
결과 및 결론
[표 4] 다양한 폴리플렉스의 크기 비교
Opti-MEM은 20 mM보다 높은 이온 강도를 갖는다. Opti-MEM에서, 폴리플렉스는 빠르게 응집하며(표 4), 그에 따라 이 제형은 약학적 개발에 적합하지 않다.
본원에 기재된 폴리플렉스(polyplus의 PEI, N/P 11.6, HBGx1)는 전술한 폴리플렉스(polytheagene의 PEI, N/P 15.8, Opti-MEM)와는 매우 다른 특성을 갖는다. Opti-MEM에서, 폴리플렉스는 1000 nm 초과의 직경 및 다중모드 크기 분포를 갖는다. 본원에 기재된 폴리플렉스는 약 100 nm의 직경 및 낮은 다분산도를 갖는다.
시험관내에서, 모든 폴리플렉스는 근육 세포보다 수지상 세포에 더 큰 독성을 보인다. 아마도, 수지상 세포는 s.c. 주사 후 폴리플렉스를 흡수하는 반면, 근육 세포는 i.m. 주사 후 폴리플렉스에 의해 트랜스펙션된다.
본원에 기재된 폴리플렉스 및 이전에 기재된 폴리플렉스에 의한 시험관내에서의 근육 세포의 트랜스펙션은 유사하다.
본원에 기재된 폴리플렉스 및 이전에 기재된 폴리플렉스에 의한 생체내에서의 트랜스펙션은 상이하며 이는 적용 경로에 좌우된다. 본원에 기재된 폴리플렉스는 i.m. 주사 후 우수하게 트랜스펙션되고 s.c. 주사 후에는 불량하게 트랜스펙션된다. 이전에 기재된 폴리플렉스는 i.m. 주사 후 전혀 트랜스펙션되지 않는 반면, 피하 주사 후에는 약한 신호가 관찰되었다.
실시예 11: 마우스 내로의 i.m. 대 i.d. 주사에 의한 레플리콘 RNA의 투여
루시퍼라제 효소를 인코딩하는 레플리콘-RNA를 실시예 2에 기술된 바와 같이 HBGx1 완충액에 용해시키거나 폴리플렉스로 복합체화시켰다. 이러한 제형을 2㎍의 RNA의 용량으로 Balb/c 마우스의 후경골근 내로 i.m. 주사하였다. 마우스는 주사 후 4일차, 7일차 및 10일차에 이소플루란에 의해 마취시켰다. 이어서, 이러한 마우스에 루시페린 기질을 주사하고, 근육으로부터의 발광 방출을 CCD 카메라에 의해 기록하였다.
루시퍼라제 단백질로부터 유래된 광자를 1분에 걸쳐 수집하였고, 이를 이미지화된 마우스의 사진과의 오버레이로 나타낸다(도 20의 A). 도 20의 B는 주사 부위에서 측정된 광자/초(p/s)의 그래픽 디스플레이를 도시한다.
Balb/c 마우스의 등쪽 피부에 있는 두 곳의 주사 부위로의 2 μg의 비제형화된 HBGx1 또는 제형화된 레플리콘-RNA를 진피내(i.d.) 적용 후 7일차에, 동물을 비침습성 생체내 생체발광 이미지화에 적용하였다. 루시퍼라제 단백질로부터 유래된 광자를 1분에 걸쳐 수집하였고, 이미지화된 마우스의 사진과의 오버레이로 나타낸다. 검은색 화살표는 주사 부위를 나타낸다(도 21의 A). 도 21의 B는 주사 부위에서 측정된 광자/초(p/s)의 그래픽 디스플레이를 도시한다.
실시예 12: 백신으로서 RNA 제형의 유익한 효과
11.6의 N/P 비를 갖는 PEI로 제형화된 H1N1 인플루엔자 바이러스 균주 A/PuertoRico/8/1934(H1N1/PR8)의 헤마글루티닌(HA)을 인코딩하는 단일 가닥 레플리콘-RNA 또는 비제형화된 단일 가닥 RNA의 조성물로 마우스를 시험 0일차 및 21일차에 2회 면역화하였다. 모든 동물에게 1.25 μg RNA의 용량을 투여하였다. 세 번째 그룹에는 완충액 대조 그룹으로서 식염수만을 투여하였다. 도 22의 A에 도시된 바와 같이, 제1 면역화 후 19일차 및 제2 면역 화 직전에, 제형화된 RNA가 투여된 모든 동물은 바이러스 중화 검정(VNT, 검출 한계 1280)에 의해 분석된 HA에 대한 면역 반응을 발생시켰다. 대조적으로, 비제형화된 RNA가 투여된 8마리 동물 중 5마리만이 HA에 대해 혈청전환되었다. 도 22의 B에 도시된 바와 같이, 제1 면역화 후 35일차에, 모든 RNA-투여 동물은 HA-특이적 항체에 대해 양성이었고, HA에 대한 항체 역가는 증가하였다. 비제형화된 RNA 그룹이 아닌 제형화된 RNA 그룹의 동물 역가는 식염수 대조 그룹과 비교하여 유의하게 높아졌다. 도 22C에 도시된 바와 같이, 면역화 후 54일 차에, H1N1/PR8-HA를 인코딩하는 1.25 μg의 제형화된 RNA가 투여된 마우스는 1.25 μg의 H1N1/PR8-HA를 인코딩하는 비제형화된 RNA가 투여된 동물과 비교하여 유의하게 높은 항체 역가를 발생시켰다(유의성은 일원 분산 분석을 사용하여 계산됨; * p≤0.001).
11.6의 특정 N/P 비를 갖는 PEI로 제형화된 H1N1 인플루엔자 바이러스 균주 A/PuertoRico/8/1934(H1N1/PR 8)의 헤마글루티닌(HA)을 인코딩하는 단일 가닥 레플리콘-RNA 또는 비제형화된 단일 가닥 RNA의 조성물로 마우스를 시험 0일차에 면역화하였다. 모든 동물에게 0.25 μg RNA를 투여하였다. 세 번째 그룹에는 완충액 대조 그룹으로서 식염수만을 투여하였다. 도 23의 A에 도시된 바와 같이, 면역화 후 54일차에, 모든 RNA-투여 동물은 HA-특이적 항체에 대해 양성이었고, 제형화된 RNA 그룹의 역가는 식염수 대조 그룹 및 0.25 μg의 H1N1/PR8-HA를 인코딩하는 비제형화된 RNA가 투여된 동물과 비교하여 유의하게 높아졌다(유의성은 일원 분산 분석을 사용하여 계산되었음; ** p≤0.001; * p≤0.05). 면역화 후 55일차에, 모든 마우스를 10배 반수 치사량(MLD50)의 H1N1/PR8로 감염시켰다. 생존을 관찰하였다. 도 23의 B에 도시된 바와 같이, 모든 대조 동물은 8일 이내에 사망하였다. H1N1/PR8-HA를 인코딩하는 비제형화된 RNA가 투여된 5 마리 동물 중 4마리는 시험감염(challenge infection)에서 생존하였다. 대조적으로, H1N1/PR8-HA를 인코딩하는 제형화된 RNA가 투여된 모든 마우스는 시험감염에서 생존하였으며, 이는 RNA/폴리알킬렌이민 조성물의 유익한 효과를 나타낸다.
실시예 13: PEI로 제형화된 레플리콘 RNA의 분무 건조
표 1에 주어진 피펫 계획(pipet scheme)을 2회 수행한 후 얻어진 물질을 배합하여 N:P 비가 12인 제형을 제조하였다. 이에 의해, RNA 농도가 0.1 mg/mL RNA인 5.0 mL의 레플리콘 RNA 폴리플렉스를 얻었다.
이 제형 3.5 mL를 분무 건조하고, 533 mg의 물질을 수집하였다(수율: 76.1%). 새로 제조된 레플리콘 RNA 폴리플렉스의 입자 크기는 결정되지 않았는데, 이는 물질이 Buechi 데모 실험실에서 배출되었기 때문이었다. 물로 재구성된 후의 입자 크기(z-평균)(혼합물: 20 mg의 분무 건조된 폴리플렉스 및 200 μl의 wfi; 10 mM 트레할로스 및 0.1 mg/mL의 RNA 농도를 생성함)는 289 nm였고, PDI는 0.238(Nicomp, 15분)이었다. 도 24의 A는 분무 건조 전후의 saRNA 폴리플렉스의 루시퍼라제 발현에 관한 시험관내 연구를 도시한다. saRNA의 루시퍼라제 활성은 분무 건조 공정으로 인해 손실되지 않는다. 신호의 절대 높이의 차이는 검정의 차이로 인한 것이다.
추가의 실험에서, 10%(w:v) 트레할로스 중의 비복합체화된 mRNA를 분무 건조하고, 분무 건조 후 mRNA의 무결성을 모세관 전기영동 측정에 의해 조사하였다.
2.50 mL의 메신저 RNA(R36-05.2-DP; c(RNA) = 0.5 mg/mL; 10 mM Hepes; 0.1 mM EDTA; pH 7.0)를 2.50 mL의 20%(w:v) 트레할로스 용액과 혼합하였고(1:1의 부피 비), 이는 다음의 조성을 가져왔다: c(RNA) = 0.25 mg/mL; 10%(w/v) 트레할로스; 5 mM Hepes; 0.05 mM EDTA. 분무 건조 동안, 샘플 물질을 얼음에서 유지시켰다. 모두 합하여, 이 용액 2.5 mL를 분무 건조하였다. 분무 건조 동안, 출구 온도는 10분 이내에 33℃에서 37℃로 증가하였다. 온도 증가를 낮추기 위해, 가스 유량을 98 L/분에서 101 L/분으로 증가시켰다. 분무 건조 동안, 온도는 그 다음 60분 이내에 41℃로 추가로 증가하였다. 완전한 분무 후, 165 mg의 건조된 물질을 수집하였다(수율: 66.0%). RNA 무결성의 분석을 위해, 물질을 wfi에 용해시켰다(혼합물: 20 mg의 분무 건조된 RNA 및 200 μl의 wfi; 10%의 트레할로스 함량 및 0.25 mg/mL의 RNA 농도를 생성함). Agilent 2100 Bioanalyzer를 사용하여 용해된 RNA를 분석하였다. 이러한 분석의 결과를 도 24의 B에서 분무 건조된 RNA의 전기영동도로서 나타낸다.
비복합체화된 RNA의 무결성이 유지되고, 분무 건조는 측정 가능한 RNA 분해를 가져오지 않는 것으로 입증되었다.
분무 건조 실험을 다음과 같이 수행하였다:
Buechi의 Nano Spray Dryer B-90을 RNA 함유 제형의 분무 건조에 사용하였다. 이러한 제형의 제조를 위해, 하기 화합물을 사용하였다:
· 메신저 RNA(R36-05.2-DP, c(RNA) = 0.5 mg/mL; 10 mM Hepes; 0.1 mM EDTA; pH 7.0)
· 루시퍼라제를 인코딩하는 레플리콘 RNA(D2 RNA-A1310 29-01 pST1-SFV4-TRON-I2m2-A30L70, wfi, c(RNA) = 1 mg/mL)
· 주사용수(wfi)
· NaCl(wfi 중의 1.5 M)
· wfi 중의 트레할로스 20%(w:v)(Pfanstiehl. Lot No: 35261A)
· wfi 중의 2X Hepes 완충된 트레할로스 20%(w:v)(Pfanstiehl. Lot No: 35261A, 20 mM Hepes)
· JetPEI(Polyplus; Lot. Nr.: 13081A1S; 150 mM 질소)
분무 건조를 위해, 다음과 같은 공정 파라미터를 선택하였다:
· 노즐: 4 μm
· 입구 온도: 80℃
· 출구 온도: 30℃
· 가스 유량: 98 mL/min
· 인가 전류: 15.000 V; 350 μA
모든 실험에 앞서, 장치를 RNase Zapp로 세정하고 에탄올로 닦아내고, 캡을 초음파 욕조에서 세정하였다.
실시예 14: 폴리플렉스 제조를 위한 미세유체역학
제조사에 의해 제공된 미세유체 칩(Microfluidic Chip)(1029-036)을 갖는 NanoAssemblrTM(캐나다 밴쿠버 소재의 Precision Nanosystems, BC)을 사용하였다. RNA의 경우, 인 하우스(in house) 제조된 레플리콘 RNA(배치 번호(Batch No) R071_1_2)을 사용하였다. 폴리에틸렌이민(Max PEI 40)은 Polysciences(독일 에펠하임 소재)에서 제조된 것이었다. 시린지로서는 BD Plastipak 1 ml; 1508006(BD Biosciences(독일 하이델베르크 소재))을 사용하였다. 12 ml/분의 유속을 사용하여 두 성분을 1:1의 비로 혼합하였다. 샘플을 두 가지 농도, 즉, 50 mg/l 및 250 mg/l로 제조하였다.
동적 광산란을 이용한 입자 크기 측정을 위해, Nicomp(미국 캘리포니아주 산타바바라 소재)의 380 ZLS 서브미크론 입자/제타 전위 분석기(PSS Nicomp)를 사용하였다.
각 조건에 대해, 1.5 ml를 제조하였다. 크기 측정을 위해 샘플을 HBG 완충액으로 희석하였다.
피펫팅 계획은 다음과 같았다:
표준 시린지에 제공되는 두 성분이 혼합되는 Y-형 미세유체 혼합기를 포함하는 장치를 사용하여 미세유체 혼합 실험을 수행하였다. 12 ml/분의 일정한 유속을 사용하여 두 성분을 1:1 비로 혼합하였다. 샘플을 2 가지 상이한 농도, 즉, 50 mg/l 및 250 mg/l로 제조하고, 얻어진 폴리플렉스의 입자 크기를 측정하였다.
폴리플렉스를 미세유체 장치로 제조하였고, 이는 업스케일링을 위한 연속 흐름 제조 및 GMP 제조의 실행 가능성을 나타낸다. 입자 형성은 문제없이 가능하였으며, 응집체 형성 또는 막힘에 대한 징후는 관찰되지 않았다. 입자 크기를 동적 광산란에 의해 측정하였다. 0.05 mg/l로 제조된 폴리플렉스의 경우, 크기는 약 123 nm였고, 0.25 mg/ml로 제조된 입자의 경우, 크기는 약 314 nm였다. 얻어진 결과의 세부 사항은 아래 표에 제공된다.
모든 샘플을 (HBGx1로 희석된) 0.02 mg/ml의 RNA 농도에서 측정하였다.
미세유체역학에 의한 폴리플렉스 제조의 실행가능성이 입증되었다. 간단한 Y-형 혼합기로 제조를 수행하였으며, 원활한 제조를 가능하게 하기 위해 유체역학적 포커싱(hydrodynamic focusing)과 같은 특정 절차가 필요하지 않았다. 적합한 조건 하에서, 200 nm보다 훨씬 작은 크기를 갖는 입자가 제조될 수 있으며, 이는 확립된 및 GMP 준수 멸균 필터를 사용한 말단 멸균 여과를 가능하게 한다. 응집 또는 막힘에 대한 징후가 주목되지 않음에 따라, 더 큰 제조 배치로의 업스케일링이 문제없이 가능할 것이라고 결론지어 진다. 업스케일링을 위한 추가 옵션은 여러 개의 동일한 장치의 병렬화를 포함한다. 요약하면, 결과는 PEI/RNA 폴리플렉스의 GMP 준수 미세유체역학적 제조의 일반적인 실행가능성을 나타내는 지표로 간주될 수 있다.
실시예 15: 여과에 의한 폴리플렉스의 멸균
폴리플렉스는 앞서 "폴리플렉스의 안정성 연구" 섹션에 기술된 바와 같이 100 mg/L의 레플리콘-RNA 농도 및 11.5, 13.5 및 15.5의 N/P 비로 제조하였다.
3가지 상이한 N/P 비의 2.68 ml의 폴리플렉스를 갖는 3개의 튜브를 준비하였다. 폴리플렉스(1.34 ml)를 220 nm의 공극을 갖는 멸균 Millex-GP Med Syringe Filter Units(Cat. # SLMPL25SS, Merck Millipore)을 통해 여과시켰다.
폴리플렉스를 HBGx1 중에 10 mg/L의 RNA 농도로 희석하였다. 이어서, 세포에 첨가하기 30분 전에 이러한 폴리플렉스를 NaCl 0.9% 중에 5mg/l의 RNA 농도로 희석하였다.
C2C12 세포를 웰당 2x104개 세포의 농도로 96-웰 플레이트(평평한 바닥)에 시딩하였다. 세포를 37℃ 및 7.5% CO2에서 유지시켰다. 24시간 후, 상등액을 버리고 50 μL의 DMEM 배지(+10% FCS)로 교체하였다. 폴리플렉스는 10% FCS가 함유된 DMEM 배지 중에 희석하고(1:5), 약 15분 동안 사전-인큐베이팅하였다. 이어서, 50 μl의 폴리플렉스 용액을 100 μl의 최종 배지 부피로 세포에 첨가하였다. 추가 48시간 후, Bright-GloTM 루시퍼라제 검정(Cat. #E2610, 독일 만하임 소재의 Promega GmbH)을 지침 매뉴얼에 따라 수행하였다.
트랜스펙션과 병행하여, 세포 증식 키트 II(XTT. Roche, #11465015001)를 사용하여 세포 수를 또한 측정하였다. 두 검정 모두에서, 각각의 폴리플렉스-샘플을 생물학적 3중으로 시험하였다. 음성 대조표준으로서, 세포는 처리 없이 시딩될 것이다("미처리됨"). XTT-검정을 위해, 백그라운드(BG)와 동등한 세포가 없는 배지를 또한 3중으로 시딩하였다. 마지막으로, 발광(Bright-GloTM)뿐만 아니라 흡광도(XTT)를 "인피니트(infinite) 200pro" 판독기(Tecan)로 측정하였다. 정규화된 발광은 발광 신호를 흡광도(세포 수에 비례함)로 나눔으로써 계산하였다.
도 25는 멸균 여과 전(제조된 경우) 및 멸균 여과 후(멸균된 경우) 다양한 N/P 비의 PEI/Replicon-RNA 폴리플렉스와 함께 인큐베이팅한 후 C2C12 근육 세포로부터의 정규화된 발광을 도시한다.
Syringe Filter Units은 폴리플렉스의 멸균에 적합하다고 결론지어질 수 있다. 폴리플렉스의 트랜스펙션 효능은 멸균 공정으로 인해 변하지 않는다.
실시예 16: 짧은 PEI 및 긴 PEI의 조합에 의한 폴리플렉스 트랜스펙션의 최적화
루시페라아제 인코딩 레플리콘-RNA를, MBG 완충액(최종 농도 5% w/v 글루코스, 10 mM MES, pH 6.1) 중에서 10 또는 12의 총 NP에 대해 다양한 조합으로 0.6 내지 11 kDa의 짧은 PEI(예를 들어, 선형의 짧은 PEI 2.5 kDa 또는 분지형의 짧은 PEI 1.8 kDa) 및 20 내지 40 kDa의 긴 PEI(예를 들어, 22 kDa의 생체내/Jet PEI)의 진정한 조합물과 복합체화시켰다. 생체내/Jet PEI NP12 단독을 벤치마크로서 사용하였다. 짧은 및 긴 PEI 폴리플렉스의 복합체화를 두 단계로 수행하였다: 제1 단계에서, 레플리콘-RNA의 복합체화를 요망되는 NP에 대해 생체내/Jet PEI로 조정하였다. 제2 단계에서, 과량의 짧은 PEI를 제형에 첨가하여 요망되는 총 NP 비를 달성하였으며; 즉, 첫 번째 숫자는 긴 PEI NP를 규정하고 두 번째 숫자는 짧은 PEI를 규정한다(예를 들어, NP4+8 = NP4인 긴 PEI 및 NP8인 짧은 PEI). 루시퍼라제 검정은 앞서 실시예 15에 기술된 바와 같이 수행하였다. 결과는 도 26에 도시되어 있다. 도 26의 A는 웰당 250ng의 RNA의 짧은 선형 PEI 및 긴 생체내 Jet PEI 폴리플렉스의 트랜스펙션 효능을 나타낸다. 도 27의 B는 웰당 250 ng의 RNA의 짧은 분지형 PEI 및 긴 생체내 Jet PEI 폴리플렉스의 트랜스펙션 효능을 나타낸다.
결론: 긴 PEI(예를 들어, 생체내 Jet PEI)만을 사용한 벤치마크 결과와 비교하여, 긴 PEI와 짧은 PEI의 조합을 사용함으로써 트랜스펙션 효능이 유의하게 개선될 수 있다.
흥미롭게도, 선형의 짧은 PEI와의 조합과 관련하여 루시퍼라제 발현 신호는 트랜스펙션 후 처음 24시간 내에 피크에 도달한 반면, 분지형의 짧은 PEI와의 조합과 관련하여 루시퍼라제 발현 신호는 트랜스펙션 후 처음 48시간 내에 피크에 도달하였다. 따라서, 특정 시간대에서의 발현이 요망되는 상황에서는, 올바른 짧은 PEI/긴 PEI 조합의 신중한 선택이 합리적이다.
실시예 17: 긴 PEI 양을 감소시킴에 의한 폴리플렉스 트랜스펙션의 최적화
분비된 나노-루시퍼라제 인코딩 레플리콘-RNA를, MBG 완충액(최종 농도 5% w/v 글루코스, 10 mM MES, pH 6.1) 중에서 12의 총 NP에 대해 다양한 조합으로 짧은 PEI(예를 들어, 분지형 1.8 kDa) 및 긴 PEI(예를 들어, 생체내/Jet PEI)의 진정한 조합물과 복합체화시켰다. 생체내/Jet PEI NP12를 벤치마크로서 사용하였다. 짧은 + 긴 PEI 폴리플렉스의 복합체화를 두 단계로 수행하였다: 제1 단계에서, 레플리콘-RNA의 복합체화를 요망되는 NP에 대해 생체내/Jet PEI로 조정하였다. 제2 단계에서, 과량의 짧은 PEI를 제형에 첨가하여 요망되는 총 NP 비를 달성하였으며; 즉, 첫 번째 숫자는 긴 PEI NP를 규정하고 두 번째 숫자는 짧은 PEI를 규정한다(예를 들어, NP4+8 = NP4인 긴 PEI 및 NP8인 짧은 PEI). 분비된 루시퍼라제를 웰당 125 ng의 RNA로 제조사 프로토콜(미국 Promega의 Nano-GLO)에 따라 측정하였다. 세포 생존율 검정을 앞서 실시예 15에 기술된 바와 같이 수행하였다.
결과는 도 27에 도시되어 있다. 벤치마크와 비교하여 그리고 동일한 총 NP 비에 대해, NP4+8 및 NP1.15+11과 같은 조합으로 높은 발현 수준이 달성되었다. 따라서, 트랜스펙션 효능은 제형 중의 긴 PEI의 농도를 감소시키고 독성이 적은 짧은 PEI(예를 들어, 분지형 1.8kDa)의 농도를 증가시킴으로써 유의하게 증가될 수 있다.
실시예 18: 생체내 트랜스펙션 효율에 대한 염 변화 및/또는 pH의 효과
BALB/c 마우스를 Janvier Laboratories에서 구입하여 8주령째에 실험에 사용하였다. 지시된 시험 항목의 주사 전에, 마우스를 이소플루란 마취에 적용하고, 전기 면도기를 사용하여 뒷다리에서 털을 제거하였다. 이어서, 2 μg의 RNA 용량의 레플리콘-RNA(saRNA)-PEI-폴리플렉스(예를 들어 saRNA-생체내 Jet PEI 폴리플렉스 NP12)를 그룹당 3마리의 마우스의 후경골근 각각에 20 μL의 총 부피로 근육내로 적용하였다. 제형은 pH 및/또는 염 농도(예를 들어, NaCl)와 관련하여 차이가 있었다. 지시된 시점에서, 마우스에 D-루시페린 용액(100 mg/kg 체중)을 복강내 주사하고, 생체발광을 IVIS® 스펙트럼 장치(Perkin Elmer)를 통해 1분 동안 이소플루란 마취된 마우스에서 비침습적으로 포착하였다. 그래프는 그룹당 총 6개의 값을 갖는 이러한 사진에서 마우스의 근육(주사 부위)과 관련하여 수동으로 정의된 관심 영역(ROI)에서 Living Image® 소프트웨어(Perkin Elmer)를 통해 결정된 생체발광 신호의 초당 광자[p/s]를 디스플레이한다.
트랜스펙션 효율에 대한 염 변화(예를 들어, NaCl)의 효과는 도 28에 도시되어 있다. 다양한 N/P 비의 레플리콘-RNA-PEI 폴리플렉스의 근육내 주사는 3일차, 6일차, 9일차 및 13일차의 측정 후 마우스의 근육 영역에서 오래 지속되는 생체발광 신호를 생성시켰다. 검출된 신호 강도는 적용 후 3일차에서 6일차(피크에 도달함)까지 증가했지만 13일차에도 검출 가능하였다. 마우스의 근육 영역에서 가장 강렬한 신호는 레플리콘-RNA-PEI 폴리플렉스(예를 들어, 긴 PEI N/P 12)가 투여되고 저농도(5 내지 10 mM)의 염이 첨가된 마우스에서 i.m. 주사 후 6일차에 검출될 수 있었다.
트랜스펙션 효율에 대한 pH 변화의 효과는 도 29에 도시되어 있다. 6.5 내지 7.1, 바람직하게는 6.5 내지 6.9의 pH 값을 갖는 레플리콘 RNA(saRNA)-PEI 폴리플렉스 제형으로 양호한 결과가 얻어졌다. 가장 강렬한 신호는 pH 6.5로 조정된 레플리콘-RNA-긴 PEI NP12 제형으로 검출될 수 있었다. 벤치마크로서, 미조정된 pH(BM) 또는 HBG(20 mM HEPES, pH 7.4, 5 중량% 글루코스)를 갖는 레플리콘-RNA-Jet PEI 폴리플렉스 NP12을 사용하였다.
실시예 19: 시험관내에서의 PEI 폴리플렉스의 전기영동 이동도 및 트랜스펙션 효율에 대한 pH 의존성 효과
루시퍼라제 인코딩 레플리콘-RNA를 HBG 완충액(최종 농도 4.5% w/v 글루코스, 10 mM HEPES, pH 7.1) 중에서 4의 N/P 비로 긴 PEI(예를 들어, 생체내 jet PEI)와 실온에서 15분 동안 복합체화시키고, 11개의 샘플로 분취하였다. 시험하려는 최종 벌크 pH에 따라 HCl 또는 NaOH를 첨가하여 샘플의 pH를 조정하였다. 전기영동 이동도(μ)의 측정은 실시예 5에 기술된 바와 같이 수행하였다. C2C12 마우스 근육 세포의 시험관내 트랜스펙션, 루시퍼라제 및 세포 생존율 검정을 앞서 실시예 15에 기술된 바와 같이 수행하였다.
시험관내 PEI 폴리플렉스의 전기영동 이동도 및 트랜스펙션 효율에 대한 pH 의존성 효과는 도 30 및 도 31에 도시되어 있다. 도 30은 다양한 pH 값으로 조정된 생체내 jetPEI/레플리콘-RNA 폴리플렉스(N/P 4)의 전기영동 이동도를 나타낸다. 도 31은 4의 N/P 비 및 다양한 pH 값(pH 6.5 내지 pH 8.5)의 다양한 용량의 생체내 jetPEI/레플리콘-RNA 폴리플렉스와 함께 인큐베이팅한 후 C2C12 근육 세포로부터의 정규화된 발광을 도시한다.
폴리플렉스의 전기영동 이동도는 pH와 음의 상관 관계가 있었다. 중성 폴리플렉스는 약 pH 8.9에서 얻어진다. 폴리플렉스의 벌크 pH를, 바람직하게는 6.5 내지 7.1의 pH 값으로 감소시킴으로써 PEI 폴리플렉스 상의 양전하 밀도를 증가시키면 세포 생존율에 영향을 미치지 않으면서 C2C12 세포의 높은 트랜스펙션 효율을 가져왔다. PEI 중합체는 1차 및 2차 아민을 함유하며, 이의 양성자화 상태는 벌크 pH에 좌우된다. 따라서, 결과는 벌크 pH를 조정하고 최적화함으로써 폴리플렉스의 전하 및 이의 트랜스펙션 효율을 제어하는 효율적인 방법을 시사한다.
실시예 20: 긴 PEI 제형에서 양전하 초과의 영향
분비된 나노-루시퍼라제 인코딩 레플리콘-RNA를 MBP 완충액(최종 농도 5% w/v 글루코스, 10mM MES, pH 6.1) 중에서 2 내지 12의 다양한 NP 비로 복합체화시켰다. 분비된 루시퍼라제는 웰당 125 ng의 RNA에서 제조사 프로토콜(미국 Promega의 Nano-GLO)에 따라 측정한다. 과량의 양전하는 긴 PEI(즉, 생체내/Jet PEI)-레플리콘 RNA NP 비 및 총 복합체화가 이 레플리콘-RNA 및 생체내 Jet PEI에 대해 일어나는 정확한 NP 비에 기초하여 계산된다. 총 복합체화에 대한 사용된 NP 비와 알려진 NP 비 사이의 차이는 제형에서 과량의 양전하를 계산할 수 있게 한다.
예로서, 250 ng의 RNA의 생체내 Jet PEI 폴리플렉스를 사용한 트랜스펙션에 관한 결과는 도 32에 도시되어 있다. 일반적으로, 제형에서 양전하 농도를 증가시키는 것은 루시퍼라제 발현 수준에 지수적으로 비례한다. PEI의 양을 증가시켜 양전하를 30 nM까지 과량으로 하는 것이 유익한 것으로 판명되었다.
실시예 21: 2-단계 복합체화를 사용한 일 성분 PEI 폴리플렉스 트랜스펙션의 최적화
(예를 들어, 긴 PEI와 같은) 단지 하나의 PEI 변이체가 사용되는 경우, 트랜스펙션 효율은 2-단계 복합체화 방법을 이용하여 개선될 수 있다. 분비된 나노-루시퍼라제 인코딩 레플리콘-RNA를 MBG 완충액(최종 농도 5% w/v 글루코스, 10 mM MES, pH 6.1) 중에서 12의 총 NP에 대해 2 단계로 복합체화시켰다. 생체내/Jet PEI NP12 1-단계 복합체화를 벤치마크로서 사용하였다. 예를 들어, 생체내 Jet PEI를 사용한 2단계 복합체화를 다음과 같이 수행하였다: 제1 단계에서, 레플리콘-RNA의 복합체화를 요망되는 초기 NP에 대해 조정하였다. 제2 단계에서, 과량의 생체내/Jet PEI를 제형에 첨가하여 요망되는 총 NP 비를 달성하였으며; 즉, 첫 번째 숫자는 초기 PEI NP를 규정하고 두 번째 숫자는 제2 단계에서 주어진 생체내 Jet PEI의 과량를 규정한다(예를 들어, NP4+8: 제1 단계에서의 NP4 Jet PEI 및 제2 단계에서의 NP8 Jet PEI). 분비된 루시퍼라제를 웰당 125 ng의 RNA에서 제조자 프로토콜(미국 Promega의 Nano-GLO)에 따라 측정하였다. 세포 생존율 검정은 앞서 실시예 15에 기술된 바와 같이 수행하였다.
2 단계 복합체화의 결과는 도 33에 도시되어 있다. 생체내/Jet PEI NP12 1-단계 복합체화 벤치마크와 비교하여 그리고 동일한 총 NP 비에 대해, 2 단계 복합체화로 높은 발현 수준이 달성되었다.
실시예 22: 면역화 효율에 대한 폴리플렉스 제형 완충액의 효과
생체내-jetPEI를 사용하여 saRNA를 폴리플렉스로 제형화하였다. Hepes-완충된 글루코스(HBG) 또는 MES-완충된 글루코스(MBG)(5% D-글루코스, 10 mM MES, pH 6.1)를 사용하여 폴리플렉스를 생성하였다. 마우스를 원샷(one shot) 실험으로 0일차에 i.m. 면역화하였다. 면역화 후 45일차에 혈청을 수집하고, 혈청 중의 Cf07-HA 특이적 항체의 양을 HA-특이적 ELISA를 사용하여 분석하였다. 혈청희석물의 종말점 적정을 수행하고, 곡선하 면적(AUC)을 결정하였다. 100%로 설정된 HBG-생성된 폴리플렉스와 비교하여 MBG-생성된 폴리플렉스의 곡선하 면적의 백분율 증가가 나타난다.
결과는 도 34에 도시되어 있다. HBG로 제형화된 폴리플렉스와 비교하여, MES-완충된 글루코스를 사용하여 생성된 폴리플렉스는 마우스의 원샷 백신접종 후 훨씬 높은 ELISA 신호를 생성한다.
실시예 23: 동물은 A/California/7/2009(H1N1) 바이러스(H1N1/Cf7-HA)의 HA를 인코딩하는 PEI-제형화된 자기-증폭 RNA(saRNA)를 사용한 근육내(i.m.) 면역화 후 중화 항체 면역 반응을 발생시킨다
BALB/c 마우스를 완충액, 1/25회 용량의 인간 백신 또는 12/1의 N/P 비의 H1N1/Cf7-HA를 인코딩하는 0.1 μg의 PEI-제형화된 VEEV-saRNA 또는 SFV-saRNA로 0일차에 1회 면역화하였다. 28일 및 48일 후, 동물에서 채혈하고, 바이러스 중화 검정(VNT; n = 4)에 의해 측정된 HA에 대한 항체에 대해 혈청을 분석하였다. 결과는 도 35의 A에 도시되어 있다.
사육용 새끼 돼지를 완충액, 1회 용량의 인간 백신 또는 12/1의 N/P 비의 H1N1/Cf7-HA를 인코딩하는 90 μg의 PEI-제형화된 VEEV-saRNA 또는 SFV-saRNA로 0일차 1회 면역화하였다. 면역화 후 14일차, 21일차, 28일차 및 35일차에 돼지에서 채혈하여 VNT(n = 8; 완충액 그룹 n = 4)를 수행함으로써 HA에 대한 중화 항체 면역 반응을 분석하였다. 결과는 도 35의 B에 도시되어 있다.
제형화된 VEEV-saRNA 백신이 투여된 동물 그룹은 양성 대조표준이 주입된 동물과 유사한 면역 반응을 발생시켰다. SFV-saRNA는 또한 중화 항체 면역 반응의 발생을 가져왔지만, VEEV-saRNA 면역화 후보다 낮은 역가를 생성하였다. 평균 ± SEM이 그래프에 제시되어 있다.
실시예 24: 동물은 돼지 써코바이러스 2(PCV2)-cap_EU 단백질을 인코딩하는 PEI-제형화된 자기-증폭 RNA(saRNA)를 사용한 근육내(i.m.) 면역화 후 항체 면역 반응을 발생시킨다
BALB/c 마우스를 완충액, 12/1의 N/P 비의 PCV2-cap_EU를 인코딩하는 1 μg의 PEI-제형화된 SFV-saRNA 또는 VEEV-saRNA로 0일차 및 35일차에 2회 면역화하였다. 14일차, 34일차 및 56일차에, 동물에서 채혈하고, 상업적으로 입수 가능한 ELISA 검정(INgezim Circo IgG, Ingenasa; n = 4)에 의해 결정된 바와 같은 PCV2-cap에 대한 항체에 대해 혈청을 분석하였다.
도 36에 도시된 바와 같이, 제형화된 SFV-saRNA 또는 VEEV-saRNA 백신이 투여된 동물 그룹은 PCV2-cap_EU 단백질에 대해서와 유사한 항체 반응을 발생시켰다. SFV-saRNA에 의한 단일 백신접종 후의 항체 면역 반응은 VEEV-saRNA의 경우보다 약간 더 높았다. 2회 면역화 후, 항체 반응은 두 유형의 saRNA 백신 모두의 경우 거의 동일하였다. 평균 ± SEM이 그래프에 제시되어 있다.
실시예 25: 자기-증폭 RNA(saRNA)의 안정성에 대한 pH의 영향
레플리콘-RNA(saRNA)를 다양한 완충 시스템 및 pH 조건에서 N/P12로 복합체화시켰다. 아세테이트 또는 MES 완충액인 두 유형의 완충액은 모두 최종 농도 10 mM의 완충제 및 최종 농도 5% w/v의 D-글루코스를 함유하였다. saRNA/PEI-폴리플렉스를 다양한 기간(복합체화 후 1일, 2일, 4일 및 8일) 동안 4℃에서 각각의 완충액 중에 저장하였다. 다양한 제형의 복합체화 시, RNA 무결성을 직접 측정하였다(t=0). RNA 무결성을 모세관 전기영동을 통해 측정하였다. 폴리플렉스 중의 복합체화된 saRNA는, 중합체와의 정전기적 상호 작용을 유도하여 폴리플렉스 내에 동봉된 RNA를 방출시키는 매우 과량의 폴리음이온과 함께 RT에서 20 분 인큐베이팅한 후에 방출될 수 있다. 200 ug의 방출된 RNA는, 모세관 전기영동 검정을 위해 적절한 키트(Standard Sensitivity RNA Analysis Kit DF471)와 함께 제공된 프로토콜에 따라 엄격하게 사용된다. 각 시점에 대해, saRNA 무결성의 정량를 위해 기준 RNA를 사용하였다.
도 37에 도시된 바와 같이, 제형 완충액 중의 더 높은 pH 값은 saRNA의 유의하게 증가된 분해를 가져온다. 복합체화 시의 saRNA의 최저 무결성 손실은 아세테이트 완충액으로 pH 4에서 달성되었다.
실시예 26: A/California/7/2009(H1N1; Cf7/HA)의 HA를 인코딩하는 PEI-제형화된 saRNA-VEEV는 상업용 백신과 비교하여 강하고 더 오래 지속되는 항체 반응을 유도하지만, 단백질 기반 백신이 유도하지 못하는 강한 T 세포 반응을 추가로 유도한다.
도 38에서, BALB/c 마우스를, 완충액(검은색 기호), 20 μL의 계절성 인플루엔자 바이러스 균주에 대한 허가된 인간 백신(Begripal 2016/2017; hLIC; 회색 기호) 또는 Cf7/HA를 인코딩하는 0.5 μg의 PEI-제형화된 VEEV-saRNA 기반 백신(암회색 기호)으로 0일차 및 35일차에 2 회 i.m. 면역화하였다(그래프에서, 화살표로 표시됨). 다양한 시점에서, 마우스를 희생시키고, A) 비장 세포를 수집하여 단일 세포 현탁액으로 Cf7/HA-특이적 ELISpot 검정을 수행하였다. ELISpot 분석을 위해, 다양한 CF7/HA 특이적 펩티드 푸울을 사용하여, IFNy 분비에 의해 측정되는 CD8+ T 세포(좌측) 또는 CD4+ T 세포(우측) 반응을 자극하였다. 추가로, 혈청 세포 샘플을 수집하여, B) 혈청 항체에 대한 항-Cf4/HA 특이적 바이러스 중화 검정을, 바이러스 세포 감염을 억제하는 그의 기능성에 대해 수행하였다. 혈청학적 분석을 위해 A/California/4/2009(H1N1; Cf4) 바이러스가 이용되었음을 주목하고; 데이터는 평균 ± SEM을 나타낸다(완충액 그룹 n = 3; 백신 그룹 n = 4).
약어 및 정의 목록
ATM
대기압
C
농도
CSS
0.1 M Na아세테이트 100 ml 중의 CuSO4 23 mg의 용액, pH 5.4
DLS
동적 광산란
EDTA
에틸렌디아민테트라아세트산
FCS
우태아 혈청
h
시간
HBGx1
HEPES 10 mM 완충된(pH 7.1) 글루코스 5%
HBGx2
HEPES 20 mM 완충된(pH 7.1) 글루코스 10%
HBTx1
HEPES 10 mM 완충된(pH 7.1) 트레할로스 10%
HBTx2
HEPES 20 mM 완충된(pH 7.1) 트레할로스 20%
HBTx1 + EDTA
HEPES 2.8 mM 완충된(pH 7.1) 트레할로스 10%, EDTA 80 μM
HEPES
4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄설폰산
IVI
스위스 미텔호이젠 소재의 Institute of Virology and immunology
IVT
시험관내 전사된 mRNA
KDa
1000 달톤
Lyo
동결건조
min
분
MBGx1
5% D-글루코스, 10 mM MES, pH 6.1
MES
2-(N-모르폴리노)에탄설폰산
N/P
PEI 내의 아민기 수와 RNA 내의 포스페이트기 수의 비
PEI
폴리에틸렌이민
RNA
리보핵산
UV
자외선
Claims (44)
- (a) 항원 또는 에피토프를 포함하는 펩티드 또는 단백질을 인코딩하는 단일 가닥의 자기-복제 RNA; 및
(b) 폴리알킬렌이민을 포함하는, 약학 조성물. - 의약으로 사용하기 위한,
(a) 항원 또는 에피토프를 포함하는 펩티드 또는 단백질을 인코딩하는 단일 가닥의 자기-복제 RNA; 및
(b) 폴리알킬렌이민을 포함하는, 조성물. - 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 폴리알킬렌이민 내의 질소 원자(N) 수 대 상기 단일 가닥 RNA 내의 인 원자(P) 수의 몰비(N:P 비)는 2.0 내지 15.0, 바람직하게는 6.0 내지 12.0인, 조성물.
- (a) 항원 또는 에피토프를 포함하는 펩티드 또는 단백질을 인코딩하는 단일 가닥의 자기-복제 RNA; 및
(b) 폴리알킬렌이민을 포함하는, 조성물로서,
상기 폴리알킬렌이민 내의 질소 원자(N) 수 대 상기 단일 가닥 RNA 내의 인 원자(P) 수의 몰비(N:P 비)는 2.0 내지 15.0, 바람직하게는 6.0 내지 12.0인, 조성물. - 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 이온 강도는 50 mM 이하이며, 바람직하게는 1가 양이온의 농도는 25 mM 이하이고 2가 양이온의 농도는 20 μM 이하인, 조성물.
- (a) 항원 또는 에피토프를 포함하는 펩티드 또는 단백질을 인코딩하는 단일 가닥의 자기-복제 RNA; 및
(b) 폴리알킬렌이민을 포함하는, 조성물로서,
이온 강도는 50 mM 이하인, 조성물. - 제6항에 있어서, 1가 양이온의 농도는 25 mM 이하이고 2가 양이온의 농도는 20 μM 이하인, 조성물.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단일 가닥의 자기-복제 RNA는 시스-레플리콘인, 조성물.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단일 가닥의 자기-복제 RNA는 베네수엘라 말 뇌염 바이러스(VEEV)로부터 유래되는, 조성물.
- 제9항에 있어서, 상기 단일 가닥의 자기-복제 RNA는 VEEV의 게놈 RNA 또는 이의 약독화된 형태에 상응하거나 본질적으로 상응하며, 여기서 구조 단백질을 인코딩하는 오픈 리딩 프레임은 상기 항원 또는 에피토프를 포함하는 펩티드 또는 단백질을 인코딩하는 오픈 리딩 프레임으로 대체되는, 조성물.
- 제9항 또는 제10항에 있어서, 상기 항원 또는 상기 항원 또는 에피토프를 포함하는 펩티드 또는 단백질은 바이러스 외피 단백질과 같은 막 단백질인, 조성물.
- 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원은 인플루엔자 헤마글루티닌인, 조성물.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단일 가닥의 자기-복제 RNA는 셈리키 포레스트 바이러스(Semliki Forest virus, SFV)로부터 유래되는, 조성물.
- 제13항에 있어서, 상기 단일 가닥의 자기-복제 RNA는 SFV의 게놈 RNA 또는 이의 약독화된 형태에 상응하거나 본질적으로 상응하며, 여기서 구조 단백질을 인코딩하는 오픈 리딩 프레임은 상기 항원 또는 에피토프를 포함하는 펩티드 또는 단백질을 인코딩하는 오픈 리딩 프레임으로 대체되는, 조성물.
- 제13항 또는 제14항에 있어서, 상기 항원 또는 상기 항원 또는 에피토프를 포함하는 펩티드 또는 단백질은 막 단백질이 아닌, 조성물.
- 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원은 바이러스 캡시드 단백질인, 조성물.
- 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 근육내 주사에 의한 투여와 같은 근육내 투여를 위한, 조성물.
- 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단일 가닥 RNA 및 상기 폴리알킬렌이민은 폴리플렉스(polyplex) 입자에 존재하는, 조성물.
- 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리알킬렌이민은 하기 화학식 I을 포함하는, 조성물:
,
여기서, R은 H, 아실기 또는 하기 화학식 (II)을 포함하는 기이고,
,
여기서, R1은 H 또는 하기 화학식 (III)을 포함하는 기이고,
,
상기 식들에서, n, m 및 l은 2 내지 10의 정수로부터 독립적으로 선택되고;
p, q, 및 r은 정수이며, 여기서 p, q, 및 r의 합은 중합체의 평균 분자량이 1.5·102 내지 107 Da, 바람직하게는 5000 내지 105 Da, 더욱 바람직하게는 10000 내지 40000 Da, 더욱 바람직하게는 15000 내지 30000 Da, 더욱더 바람직하게는 20000 내지 25000 Da이 되도록 함. - 제19항에 있어서, n, m 및 l은 2, 3, 4 및 5, 바람직하게는 2 및 3으로부터 독립적으로 선택되는, 조성물.
- 제19항 또는 제20항에 있어서, R1은 H인, 조성물.
- 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, R은 H 또는 아실기인, 조성물.
- 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리알킬렌이민은 폴리에틸렌이민 및/또는 폴리프로필렌이민, 바람직하게는 폴리에틸렌 이민을 포함하는, 조성물.
- 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리알킬렌이민 내의 N 원자의 92% 이상은 양성자화 가능한, 조성물.
- 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 첨가제를 추가로 포함하는, 조성물.
- 제25항에 있어서, 상기 하나 이상의 첨가제는 완충 물질, 당류, 안정화제, 동결보호제, 동결건조보호제, 및 킬레이트제로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조성물.
- 제26항에 있어서, 상기 완충 물질은 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄설폰산(HEPES), 2-(N-모폴리노)에탄설폰산(MES), 3-모폴리노-2-하이드록시프로판설폰산(MOPSO), 아세트산, 아세테이트 완충액 및 유사체, 인산 및 포스페이트 완충액, 및 시트르산 및 시트레이트 완충액으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나를 포함하는, 조성물.
- 제26항 또는 제27항에 있어서, 상기 당류는 단당류, 이당류, 삼당류, 올리고당류, 및 다당류로 이루어진 군, 바람직하게는 글루코스, 트레할로스, 및 사카로스로부터 선택된 적어도 하나를 포함하는, 조성물.
- 제26항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 동결보호제는 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 및 글리세롤과 같은 글리콜로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나를 포함하는, 조성물.
- 제26항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 킬레이트제는 EDTA를 포함하는, 조성물.
- 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 HEPES 완충된 글루코스(HBG), MES-완충 글루코스(MBG), 아세테이트 완충된 글루코스 또는 HEPES 완충된 트레할로스(HBT)를 포함하는, 조성물.
- 제18항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 입자의 동적 광산란 측정으로부터 유도된 바와 같은 z-평균은 200 nm 미만, 바람직하게는 150 nm 미만, 더욱 바람직하게는 100 nm 미만이고/이거나, 상기 입자의 동적 광산란 측정으로부터 유도된 바와 같은 다분산 지수는 0.5 미만, 바람직하게는 0.3 미만, 더욱 바람직하게는 0.2 미만인, 조성물.
- 제18항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 입자의 제타-전위는 20 mV 이상, 바람직하게는 25 내지 40 mV인, 조성물.
- 제31항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 HBG는 5% 글루코스(w/v) 및 10 mM HEPES, pH 7.1을 포함하는, 조성물.
- 제31항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 HBT는 10% 트레할로스(w/v) 및 10 mM HEPES, pH 7.1을 포함하는, 조성물.
- 제18항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 입자는 생리적 pH에서 중성이거나 양 하전된, 조성물.
- 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단일 가닥 RNA는 6000개 내지 15000개 염기, 바람직하게는 9000개 내지 12000개 염기로 이루어진 분자인, 조성물.
- 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 치료에 사용하기 위한, 조성물.
- 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 백신 조성물인, 조성물.
- 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 반응을 유도하기 위한, 조성물.
- 제40항에 있어서, 근육내 투여에 의해 투여되는, 조성물.
- 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 면역 반응을 유도하는 방법.
- 제42항에 있어서, 상기 조성물은 근육내 투여에 의해 투여되는, 방법.
- 제40항 또는 제41항, 또는 제42항 또는 제43항에 있어서, 상기 면역 반응은 상기 항원 또는 에피토프에 대해 유도되는, 조성물 또는 방법.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP2018050672 | 2018-01-11 | ||
EPPCT/EP2018/050672 | 2018-01-11 | ||
PCT/EP2019/050551 WO2019137999A1 (en) | 2018-01-11 | 2019-01-10 | Formulation for administration of rna |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
KR20200109310A true KR20200109310A (ko) | 2020-09-22 |
Family
ID=65234527
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
KR1020207020125A KR20200109310A (ko) | 2018-01-11 | 2019-01-10 | Rna의 투여를 위한 제형 |
Country Status (11)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20210023100A1 (ko) |
EP (1) | EP3737386A1 (ko) |
JP (2) | JP2021516660A (ko) |
KR (1) | KR20200109310A (ko) |
CN (1) | CN111601605A (ko) |
AU (1) | AU2019207761A1 (ko) |
BR (1) | BR112020013974A8 (ko) |
CA (1) | CA3087442A1 (ko) |
IL (1) | IL275639A (ko) |
MX (1) | MX2020007477A (ko) |
WO (1) | WO2019137999A1 (ko) |
Families Citing this family (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
TW202043256A (zh) | 2019-01-10 | 2020-12-01 | 美商健生生物科技公司 | 前列腺新抗原及其用途 |
WO2021001023A1 (en) * | 2019-07-02 | 2021-01-07 | Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh | Rna formulations suitable for therapy |
AU2020406084A1 (en) * | 2019-12-17 | 2022-06-30 | Universiteit Gent | Non-viral vectors comprising polypropyleneimine |
EP4103228A1 (en) | 2020-02-13 | 2022-12-21 | Institut Pasteur | Nucleic acid vaccine against the sars-cov-2 coronavirus |
US20230029453A1 (en) * | 2020-07-06 | 2023-02-02 | Janssen Biotech, Inc. | Prostate Neoantigens And Their Uses |
JP2024518335A (ja) | 2021-04-26 | 2024-05-01 | アンスティチュ パスツール | SARS-CoV-2に対するヒト中和モノクローナル抗体、及びそれらの使用 |
CN117070464A (zh) * | 2022-05-16 | 2023-11-17 | 上海行深生物科技有限公司 | 蛋白包裹自复制rna及其制备方法 |
WO2024084462A1 (en) * | 2022-10-21 | 2024-04-25 | BioNTech SE | Nucleic acid complexes and uses thereof |
Family Cites Families (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2002537842A (ja) | 1999-03-09 | 2002-11-12 | ラージ スケール バイオロジー コーポレイション | 外来の配列を発現するための多成分rnaベクター系 |
WO2008119827A1 (en) * | 2007-04-02 | 2008-10-09 | Fit Biotech Oy | Transreplicase constructs |
WO2014071963A1 (en) | 2012-11-09 | 2014-05-15 | Biontech Ag | Method for cellular rna expression |
EP3034539A1 (en) * | 2014-12-19 | 2016-06-22 | Ethris GmbH | Compositions for introducing nucleic acid into cells |
JP6991977B2 (ja) * | 2015-09-23 | 2022-02-03 | マサチューセッツ インスティテュート オブ テクノロジー | 修飾デンドリマーナノ粒子ワクチン送達用組成物及び方法 |
WO2018010815A1 (en) * | 2016-07-15 | 2018-01-18 | Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh | Formulation for administration of rna |
-
2019
- 2019-01-10 EP EP19701783.3A patent/EP3737386A1/en active Pending
- 2019-01-10 CN CN201980007852.4A patent/CN111601605A/zh active Pending
- 2019-01-10 BR BR112020013974A patent/BR112020013974A8/pt unknown
- 2019-01-10 MX MX2020007477A patent/MX2020007477A/es unknown
- 2019-01-10 JP JP2020538130A patent/JP2021516660A/ja active Pending
- 2019-01-10 KR KR1020207020125A patent/KR20200109310A/ko not_active Application Discontinuation
- 2019-01-10 AU AU2019207761A patent/AU2019207761A1/en active Pending
- 2019-01-10 US US16/957,898 patent/US20210023100A1/en active Pending
- 2019-01-10 WO PCT/EP2019/050551 patent/WO2019137999A1/en active Application Filing
- 2019-01-10 CA CA3087442A patent/CA3087442A1/en active Pending
-
2020
- 2020-06-24 IL IL275639A patent/IL275639A/en unknown
-
2023
- 2023-03-30 JP JP2023056036A patent/JP2023082121A/ja active Pending
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN111601605A (zh) | 2020-08-28 |
JP2023082121A (ja) | 2023-06-13 |
MX2020007477A (es) | 2020-11-12 |
CA3087442A1 (en) | 2019-07-18 |
IL275639A (en) | 2020-08-31 |
BR112020013974A8 (pt) | 2022-10-18 |
JP2021516660A (ja) | 2021-07-08 |
EP3737386A1 (en) | 2020-11-18 |
BR112020013974A2 (pt) | 2020-12-08 |
AU2019207761A1 (en) | 2020-07-02 |
WO2019137999A1 (en) | 2019-07-18 |
US20210023100A1 (en) | 2021-01-28 |
RU2020126457A (ru) | 2022-02-11 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US20220313811A1 (en) | Formulation for administration of rna | |
KR20200109310A (ko) | Rna의 투여를 위한 제형 | |
JP7465310B2 (ja) | 多用途性且つ効率的な遺伝子発現のためのrnaレプリコン | |
JP7421256B2 (ja) | トランス複製型rna | |
Nagatomo et al. | Cholesteryl pullulan encapsulated TNF‐α nanoparticles are an effective mucosal vaccine adjuvant against influenza virus | |
CA3142984A1 (en) | Rna formulations suitable for therapy | |
Li et al. | Advances in mRNA vaccines | |
JP2020511145A (ja) | 改良されたliワクチンアジュバント | |
RU2797147C2 (ru) | Рецептура для введения рнк | |
BR112018077163B1 (pt) | Composições de vacina para administração de rna com polietilenoimina linear e seu processo de preparo | |
JP2023527910A (ja) | 多用途かつ効率的な遺伝子発現のためのrnaレプリコン |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
E902 | Notification of reason for refusal |